JP7097382B2 - 乳酸菌、その方法及び使用 - Google Patents

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Description

DSMZ DSM27131 DSMZ DSM32465
本発明は、乳酸菌、特にヒト及び動物における障害又は症状に対して有益な作用を有する乳酸菌、ならびにプロバイオティクスとしての前記乳酸菌の使用に関する。より具体的には、本発明は、乳酸菌のヒトへの投与時に、ヒトの健康に有益である乳酸菌における特定の生物学的活性の活性化に関する。
宿主と微生物との間の相互作用が健康と疾患の基本をなすことは十分に確立されている。マイクロバイオータは、宿主に栄養素を供給する代謝産物を生じ、さらに免疫応答ならびに免疫系の調節及び開発に関与している。組織の微小環境がマイクロバイオータの組成を決定し、このことは順に、マイクロバイオータの組成に影響しかつこれを変化させる１つの方法が、食事（細菌のエネルギー源として機能する砂糖、脂肪、繊維など）の変更によることを意味する。遺伝的変化又は同時感染のいずれかの結果、及びその結果的としての抗生物質の使用による宿主免疫の変化もまた、腸内のマイクロバイオータに影響し得る。
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）などの他の乳酸産生細菌は、様々な種類の食品、例えばヨーグルトにおいてプロバイオティクスとして一般的に使用されている。有害な微生物の増殖及びコロニー形成は、乳酸産生細菌による、哺乳動物の表面又はその内部での乳酸産生細菌自体のコロニー形成によって、バイオフィルムの形成によって、利用可能な栄養素の競合及びさらに過酸化水素、バクテリオシン、又はｐＨを下げる有機酸（乳酸及び酢酸を含む）などの特定の物質の産生によって防ぐことができる。
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）は、ロイテリンとも呼ばれる抗菌物質３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（ＨＰＡ）を産生することが知られている細菌である。
原核生物の細胞は原始的と見なされてきたが、細菌細胞内部に原始的なオルガネラとして機能すると思われる微小区画（ＭＣＳ）として知られる稀なエンクロージャーを含むものもある。カルボキシソーム（これは、二酸化炭素の固定に関与している）は、３０年近くの間、微生物細胞内で認められている唯一の微小区画であった。２００５年に、Ｔｏｄｄ Ｏ．Ｙｅａｔｅｓ教授とその同僚は、細菌の微小区画の最初の構造的詳細を明らかにした。細菌の微小区画タンパク質の最初の高解像度の構造によって、いくつかのウイルスに見られるものと非常に類似した構成原理が明らかになる。６つの同一のタンパク質サブユニットが一緒になって六量体ユニットを形成し、それが殻のための構成要素を構成する。これらの六量体ユニットは、一緒になって密にまとまって、小さな細孔のみを含む分子層を形成する。この密なまとまりは、細孔を通る場合を除いて、微小区画の中への及びそれから外への分子の移動を制限すると思われる。
微生物の微小区画特異的タンパク質の相同体のクラスター分析は、そのようなエンクロージャーが様々な細菌種における７つもの異なる代謝過程に関与し得ることを示唆している（Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｂｏｂｉｋ．２００７．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅ．１：２５－３１）。細菌の微小区画の構成要素はタンパク質及び糖タンパク質のみである。電子顕微鏡検査（微小区画を観察するのに必要とされる）では、そのような微小区画を取り囲んで、それらを生細胞における唯一の既知のタンパク質ベースの代謝区画にする脂質単層も二重層（真核生物の小胞におけるような）も示されない。
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）を含む細菌属のメンバーは、それらの微小区画にエタノールアミンを分解するのに必要な成分を含んでいる。微小区画の別の特性は、細菌自体にとって有毒な基質のための容器としてそれらが作用できることであると考えられている。
エタノールアミンは、膜リン脂質ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の分解生成物であり、胃腸管内に広く分布している。エタノールアミンは、この化合物を異化することができる細菌によって窒素（そして場合によっては、炭素）の供給源として使用され得る。この能力は、例えば、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）を含む、重大な胃腸病原体と結びついている。エタノールアミンはまた、細菌がその毒性プログラムを開始するためのシグナルでもあり得る。（Ｇａｒｓｉｎ ＤＡ．２０１２．Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ａ ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｃｏｍｍｅｎｃｅ ａ ｈｏｓｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ？ ｍＢｉｏ ３（４）：ｅ００１７２－１２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００１７２－１２．）
抗菌物質耐性の高まりと新たな抗生物質の発見の減少により、世界的な感染症医療危機のリスクが高まっている。抗生物質耐性菌対策ナショナルアクションプラン（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎ ｔｏ Ｃｏｍｂａｔ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｂａｃｔｅｒｉａ ＴＦｆＣＡ－Ｒ（ｅｄ）．２０１５．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎ ｆｏｒ Ｃｏｍｂａｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ Ｗｈｉｔｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）では、抗菌物質使用に関連する耐性及び疾患と戦うための新しい抗生物質及び代替療法の開発を進めるために努力が必要であることが強調されている。その結果、非限定的に、プロバイオティクス、免疫療法、及び毒素結合剤を含む、多くの新たな療法が研究されている。
ほとんどの病原性細菌は、持続性（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ）を有して留まり、さまざまな状況で宿主の微小環境を利用するための賢い方法を開発しているため、新しい抗生物質療法を見つけるのは簡単なことではない。例えば、病原性細菌サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、炎症を起こした腸内の宿主組織細胞によって放出される物質であるエタノールアミンを利用することができるので、他の細菌よりも独特の増殖上の利点を示す。しかしながら、これまでは、エタノールアミンが有益な細菌によって利用され得るとは考えられていなかったか、又は少なくとも示されていなかった。参照：例えば（Ｔｈｉｅｎｎｉｍｉｔｒ Ｐら、Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｌｌｏｗｓ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｏ ｕｓｅ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｔｏ ｃｏｍｐｅｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１１）。
したがって、当該技術分野では、病原性細菌に対抗する新規な方法を特定する必要性、及び特に社会における抗生物質耐性のさらなる発展に寄与しない新規な治療法を特定する必要性が依然として存在する。
上記目的は、今では、本明細書にて、エタノールアミンを利用することができる乳酸菌の新規な株、さらなるエタノールアミン利用乳酸菌を選択する方法、エタノールアミンを利用するように誘導されたエタノールアミン利用乳酸菌を製造する方法、ならびに前記エタノールアミン利用乳酸菌を含む種々の組成物及び使用を提供することによって、解決又は少なくとも緩和された。
したがって、本発明は、いくつかの乳酸菌がエタノールアミンを基質として利用することができるという驚くべき発見にある。理論に拘束されることを望むものではないが、この発見により、そのような細菌が同じ基質を利用する病原性細菌と競合する手段が提供されると考えられる。したがって、そのような病原性細菌が、該基質を利用できる感染した個体の胃腸管内に存在する場合、有益なエタノールアミン利用細菌を投与することにより、該細菌が病原性細菌の生存を悪化させ、さらにそれらの毒性効果を減少させる可能性を付与できる。エタノールアミン利用細菌によって既に使用されている他の機構が、エタノールアミン利用機構と相互作用し、それによって、本明細書に提示されているような改善された抗菌作用を提供できることもまた考えられる。したがって、これは、個体の胃腸管に存在するエタノールアミン利用病原性細菌を標的とする有用な抗菌物質の代替物を提示する。続いて、この発見にはまた、病原性感染に応答した抗生物質の過剰な使用を減少させる可能性があるとも考えられる。さらに、エタノールアミンを利用する際に乳酸菌によって産生されるアセトアルデヒドは、それ自体が抗菌作用を有し得る。
したがって、本明細書にて、エタノールアミンを利用することができる乳酸菌株を選択する方法であって、前記方法が、
ｉ） 培養培地に乳酸菌株の細菌を供給し、前記細菌の培養物を増殖させる工程、
ｉｉ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する工程、及び
ｉｉｉ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができる場合、前記乳酸菌株を選択する工程、
を含み、
前記培養培地が、ある量又は濃度のエタノールアミンを含み、及び／又はある量又は濃度のエタノールアミンが、工程ｉ）の前記培養物に、工程ｉｉ）の前のある時点にて添加される、上記方法を提供する。
別の態様では、さらに、乳酸菌の遺伝子プロファイルを決定することを含む、エタノールアミンを利用することができる前記乳酸菌株を選択する方法であって、前記方法が、
ｉ） スクリーニングを受けるべき乳酸菌株の細菌を提供する工程、
ｉｉ） 前記乳酸菌株の最初のスクリーニングを実施して、前記乳酸菌株中における以下のタンパク質をコードする遺伝子の細菌相同体の１つ以上の存在について決定する工程、
１． エタノールアミンアンモニアリアーゼラージサブユニットＥｕｔＢ、
２． 微小区画構造タンパク質ＥｕｔＬ、及び／又は
３． エタノールアミン利用タンパク質ＥｕｔＨ、
ｉｉｉ） 前記遺伝子の１つ以上が前記乳酸菌株に存在する場合、前記細菌がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する工程、並びに
ｉｖ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができる場合、前記乳酸菌株を選択する工程、
を含む、上記方法を提供する。
任意選択的に、前記乳酸菌株の第二以降のスクリーニング、すなわち遺伝子スクリーニングを、上記方法の工程ｉｉ）の一部として、工程ｉｉ）の前、又は工程ｉｉ）の後かつ工程ｉｉｉ）の前などに行って、以下のタンパク質をコードする遺伝子の細菌相同体の１つ以上の存在について決定することができる：
１． ｐｆａｍ０３３５８タンパク質ファミリーに属するＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮレダクターゼ及び／又は
２． ｐｆａｍ１３３５０タンパク質ファミリーに属するタンパク質－チロシン－ホスファターゼ。
前記第二のスクリーニングの前記遺伝子は、最初のスクリーニングでスクリーニングされた上述の遺伝子と同じ遺伝子クラスター又は同じオペロンにさえ存在し得る。好ましくは、前記遺伝子は、同じ遺伝子クラスター又は同じオペロンにさえ存在する。
さらに、エタノールアミンを利用するように誘導された乳酸菌の製造方法であって、前記方法が、
ｉ） 培養培地にエタノールアミンを利用することができる乳酸菌を供給する工程、
ｉｉ） 工程ｉ）の前記培養培地に、第一の量又は濃度のエタノールアミンを第一の時点で添加し、前記培養物を増殖させる工程、
ｉｉｉ） 任意選択的に、工程ｉｉ）の前記培養物に、第二の量又は濃度のエタノールアミンを第二の時点で添加し、前記培養物を増殖させる工程、その後、
ｉｖ） 前記培養培地から前記乳酸菌を回収する工程、
を含む、上記方法もまた提供する。
本明細書に開示された方法によって選択又は製造された乳酸菌もまた、本開示、ならびにその様々な使用に包含される。別の態様では、前記乳酸菌を含む培養物の増殖中にエタノールアミンによって誘導されたエタノールアミン利用乳酸菌を含む組成物もまた提供される。
前述のように、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）の新規な菌株、すなわち、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１の生物学的に純粋な培養物及びラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５の生物学的に純粋な培養物もまた提供される。これらの菌株は、エタノールアミンを利用することができる乳酸菌株として選択されてきた。これらの菌株はまた、エタノールアミンを利用するように誘導された乳酸菌を製造する方法において、ならびに本明細書に記載されるエタノールアミン利用細菌を包含する様々な他の使用及び方法において使用され得る。また、ラクトバチルス・ロイテリのようなエタノールアミン利用乳酸菌の凍結又は凍結乾燥組成物、例えば、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１の生物学的に純粋な培養物及び／又はラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５の生物学的に純粋な培養物を含む凍結又は凍結乾燥組成物であって、少なくとも抗凍結剤又は凍結防止剤をさらに含む組成物もまた提供される。当該技術分野で知られているような様々な抗凍結剤（例えばグリセロール、スクロース、ラクトースもしくはトレハロース）又は凍結防止剤（例えばスクロース、ラクトース、トレハロースもしくはマルトデキストリン）あるいは他の添加剤もまた本文脈において考えられる。
さらに、エタノールアミン利用病原体によって引き起こされる又はそれに関連する症状又は障害の治療に使用するためのような、医薬として使用するための、本明細書に開示されている方法、又は本明細書に記載されている他のものによって選択される、又はそれらによって製造される、新規な菌株である乳酸菌が提供される。そのような病原体の例は本明細書にさらに開示されている。１つ以上の病原性細菌の増殖を阻害する際の前記乳酸菌又は菌株の使用もまた提供される。より具体的には、これらの組成物は、例えば胃腸管内の病原体によって誘発された障害をより効率的に治療する目的で、ヒト又は動物に投与することを意図している。
図１は、エタノールアミン利用乳酸菌によるアセトアルデヒドの産生を示す。アセトアルデヒドの産生は、（赤い）太い線、及び前記太い線周囲の広がった（赤い）ゾーンとして視覚化される。太い線にはまた細菌ストリークも含まれる。Ａ）Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８の細菌ストリーク周囲には太い線も赤い（すなわち拡大した）ゾーンも見られない。Ｂ）Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１のコロニー周囲には太い線の細菌ストリーク形成部分の各側に約３ｍｍ、延びる赤い（すなわち拡大した）ゾーンが見られ、さらに、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２４６５のストリーク周囲にも赤い（拡大した）ゾーンが見られる（Ｃ、細菌ストリークである太い線の前記細菌ストリーク形成部分の各側に約１．５ｍｍ、延びる）。
図２は、胆汁耐性アッセイを示し、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１の野生型株（灰色／縞模様のバーで）及び改良されたＬ．ロイテリＤＳＭ３２４６５株（黒色バーで）の生存率の低下を示す。
図３は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）分析により、１０ｍＭエタノールアミンと共にプレインキュベートしたＬ．ロイテリＤＳＭ２７１３１によるＣ．ディフィシルの阻害の増強を確認する。Ｃ．ディフィシルＣＤ２０１５のエクスビボ増殖を、無菌マウスの糞内容物で測定した。２４時間インキュベートした後のＣ．ディフィシル及びＬ．ロイテリＤＳＭ２７１３１と一緒のＣ．ディフィシルについての生存可能なコロニー形成単位の結果。データは平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
発明の詳細な説明
定義
本明細書では、用語「治療」は、症状の緩和と症状の発症の防止の両方を包含し得る。したがって、この用語は、症状又は障害の防止、軽減及び予防などを含む。用語「障害」はまた疾患を含み得る。
用語「細菌」が本明細書で使用されるときはいつでも、（病原体が意図されない限り）これは乳酸菌株を含むことを意図し、いかなる特定の菌株にも限定されない。
エタノールアミンを「利用する」という用語は、本明細書では、当該技術分野で知られている方法に従って、乳酸菌がエタノールアミンを使用かつ代謝してさらなる活性代謝物にすることができることを指すことを意図している。エタノールアミンを「利用する」という用語はまた、いくつかの文脈では、当該技術分野で知られている他の方法に従って、乳酸菌がエタノールアミンを使用かつ代謝してさらに活性な分泌代謝物にすることができることも指し得る。
乳酸菌株
ラクトバチルス・ロイテリ株ＤＳＭ２７１３１は、ブダペスト条約下でｔｈｅ Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ，Ｄ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に２０１３年４月１８日に寄託された。
ラクトバチルス・ロイテリ株ＤＳＭ３２４６５は、ブダペスト条約下でｔｈｅ Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ，Ｄ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に２０１７年３月２１日に寄託された。
詳細な説明への導入
本明細書で前述したように、本発明者らは、エタノールアミンを利用することができる新規な非病原性乳酸菌株を初めて特定した。エタノールアミンは、膜リン脂質ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の分解生成物であり、胃腸管に広く分布している。エタノールアミンは、この化合物を異化させることができる細菌によって、窒素源、場合によっては炭素源として使用することができる。しかしながら、これまでのところ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）のような病原性細菌のみがエタノールアミンを利用することができると考えられていた。非病原性細菌におけるそのような利用は、例えば、寒天プレート上のコロニーにおいてエタノールアミンから生じるアセトアルデヒドを特定することによって検出することができる。
これらの発見によって、前記細菌のエタノールアミン利用特性の存在の決定に基づいて、さらなる乳酸菌を特定及び選択することもまた可能になるであろう。したがって、エタノールアミン利用乳酸菌の選択方法、エタノールアミンで誘導されたエタノールアミン利用乳酸菌の製造方法、ならびに前記新規な菌株及び細菌を含む他の使用、組成物及び方法もまた、これらの発見の結果であり、したがって本明細書にて提供される。これらの態様については、以下でさらに説明する。
選択方法
したがって、より詳細には、本明細書にて、エタノールアミンを利用することができる乳酸菌株を選択する方法であって、前記方法が、
ｉ） 培養培地に乳酸菌株の細菌を供給し、前記細菌の培養物を増殖させる工程、
ｉｉ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する工程、及び
ｉｉｉ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができる場合、前記乳酸菌株を選択する工程、
を含み、
前記培養培地が、ある量又は濃度のエタノールアミンを含み、及び／又はある量又は濃度のエタノールアミンが、工程ｉ）の前記培養物に、工程ｉｉ）の前のある時点で添加される、上記方法を提供する。
培養培地には、細菌細胞の増殖を補助する栄養素及び他の成分が含有されており、それは当業者に周知である。本文脈における培養培地の例には、例えば、寒天（寒天プレート）が含まれるが、液体培養培地もまた考えられる。培養物はまた細菌培養物とも呼ばれ、及び／又は培地（単数又は複数）はまた細菌培養培地（複数）／細菌培養培地（単数）とも呼ばれ得る。
エタノールアミンを含む培地中での前記乳酸菌の培養は、嫌気性条件下で、約３５℃から約４５℃、例えば約３７℃の温度で行うことができる。一般に、細菌は、約１４から約７２時間、例えば約２０から約６０時間、約１４から約１６時間又は約４８時間で増殖させることができる。他の類似の条件、例えば、空気中よりも少ない酸素を含む微好気性条件（例えば、約５％の酸素）もまた考えられる。
乳酸菌株がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する方法において、例えば、寒天プレートを使用する場合、エタノールアミンを培養培地に乳酸菌と共に直接添加してもよいが、培養物をしばらくの間インキュベートした後で、そのとき存在する培養物に、例えば、より後の時点で添加するなど、後続して添加してもよい。そのような後の時点とは、例えば、培養物が特定の濃度又は密度に、例えば、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）として測定した場合に約０．３～２ユニットに達したときである。
本明細書で、例えば、エタノールアミンの「量又は濃度」への言及は、例えば、該方法が小規模又は大規模で実施され得ることを例証するために、ならびに適切な量及び濃度のエタノールアミンが本開示の方法において使用され及び考えられ得ることを例証するために使用される。通常、エタノールアミンは、ある濃度で乳酸菌株を含有する培養培地に添加されると記載されるが、そのときのその濃度とは、エタノールアミンがそれに添加されたときの前記培地中のエタノールアミンの総濃度のことであり、もちろん、これは、ある量のエタノールアミンが前記培養培地に添加された結果として前記濃度になることもまた意味する。当業者には、細菌培養物を誘導及び／又は活性化するのに必要とされるエタノールアミンの量又は濃度がわかるであろう。
この方法は、工程ｉ）の培養物に、さらなる量又は濃度のエタノールアミンを、第一の量のエタノールアミンを添加した後の第二の時点で添加すること、ならびに前記方法の工程ｉｉ）及びｉｉｉ）を実施する前に、前記培養物を増殖させることをさらに含み得る。本明細書で前記したように、さらなる量又は濃度のエタノールアミンを乳酸菌の培養物に添加して、前記細菌によるエタノールアミンの利用の誘導をさらに促進し、及び／又は前記細菌によるアセトアルデヒドの産生をさらに促進することができる。寒天培地を使用した場合には、細菌は一般的にエタノールアミンの存在下で既に一定期間インキュベートされている。その場合は、任意の第二の量又は濃度のエタノールアミンを、細菌を含有する前記寒天プレート上に上層として添加し得る。
方法の実例は実験の部で提示する。
本明細書で提供される選択方法はまた、さらなる工程を含んでもよく、この工程は、乳酸菌がエタノールアミンに曝露される前に行われ得る。これは、前記乳酸菌の特定の遺伝子プロファイルを決定し、前記細菌がエタノールアミンを基質として利用する傾向があるかどうかを示すことを含む工程である。より具体的には、そのような方法は、選択方法の工程ｉ）に先行するか、又は工程ｉ）に関連して行われるさらなる工程を含み、これには、前記乳酸菌に、エタノールアミンアンモニアリアーゼラージサブユニットＥｕｔＢ、微小区画構造タンパク質ＥｕｔＬ及びエタノールアミン利用タンパク質ＥｕｔＨからなる群から選択されるタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の１つ以上の細菌相同体をコードする１つ以上の遺伝子（単数又は複数）の存在について前記乳酸菌の最初のスクリーニングを行うことが含まれる。
遺伝子は既知であり、公的に入手可能であり、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／にて、以下の情報に従って見つけることができる：
１． エタノールアミンアンモニアリアーゼラージサブユニットＥｕｔＢ
例：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＯＪ５６７１２、
２． 微小区画構造タンパク質ＥｕｔＬ
例：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＥＯＪ５６７１０、
３． エタノールアミン利用タンパク質ＥｕｔＨ、エタノールアミントランスポーター
例：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＯＪ５６７０２。
任意選択的に、ｐｆａｍ０３３５８タンパク質ファミリーに属するＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はｐｆａｍ１３３５０タンパク質ファミリーに属するタンパク質－チロシン－ホスファターゼをコードする遺伝子の細菌相同体の存在もまた前記方法にて決定することができ、第二以降の遺伝子スクリーニングと本明細書中で呼ばれることもある。前記遺伝子は、最初のスクリーニングでスクリーニングされた上述の遺伝子と同じ遺伝子クラスター又はオペロン中に存在し得る。好ましくは、前記遺伝子は、最初のスクリーニングの遺伝子と同じ遺伝子クラスターに、そして同じオペロンにさえ存在する場合がある。
本明細書に記載の第二以降の遺伝子スクリーニングを実施することによって、遺伝子プロファイルの決定を含むエタノールアミンを利用できる乳酸菌株の選択方法は、さらに改善することができ、これらの遺伝子又はすべての遺伝子が共にエタノールアミンの利用に関して特に有益であると考えられる。
ｐｆａｍ０３３５８タンパク質に属するＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮレダクターゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＷＰ＿０７５９１３９２８によって例示され得るが、これに限定されない。
ｐｆａｍ１３３５０タンパク質ファミリーに属するタンパク質－チロシン－ホスファターゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＷＰ＿０５４２７７０７４によって例示され得るが、これに限定されない。
本明細書で前述したように、前記第一又は最初の及び前記第二以降のスクリーニングの上述の遺伝子は、同じ遺伝子クラスターに存在し得、又は同じオペロンにさえ存在し得る。いくつかの態様では、上記の遺伝子は、同じ遺伝子クラスター又は同じオペロンに存在する。
前記乳酸菌株のゲノム中に上述の遺伝子の１つ以上が存在することにより、前記菌株がエタノールアミンを使用できることが示され、もしその場合、その後に、前記菌株がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定又は確認する次の工程を、例えば、アセトアルデヒドの産生について決定することによって実施し得る。
前記１つ以上の遺伝子（単数又は複数）の存在についてのスクリーニングは、遺伝情報を分析する一般的に知られている方法によって、例えば、完全な又は部分的なゲノム配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイなどによって実施し得る。これらはすべて当業者に周知かつ容易に検索可能な技術である。
選択方法はさらに工程を含み、ここで、工程ｉｉ）は、前記乳酸菌がエタノールアミンを利用するときアセトアルデヒドを産生することができるかどうかについて、前記細菌培養物からの培養物試料中のアセトアルデヒドの量又は濃度を測定することによって決定することを含む。乳酸菌株がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する方法の例は、実験の部の例１に見出される（結果は図１に示される）。そこでは、該利用は、エタノールアミンからのアセトアルデヒドの産生として分かり、寒天プレート上の赤いゾーン（矢印で印を付けており、さらに太い線を含んでいることがわかる）として可視化された。図１を参照されたい。エタノールアミン利用細菌とエタノールアミンを利用しない細菌との間の結果の違いは明らかであり、当業者が決定するのは容易である。対照標準として、本明細書で述べた遺伝子プロファイルを持たないと特定された菌株のようなエタノールアミンを利用することができない乳酸菌株を使用し得る。
したがって、本明細書では、乳酸菌株がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて、拡張又は広がりを分析することによって、さらにまた、図１に示すような細菌ストリークを含む太い線を囲む拡大した（赤い）ゾーンの幅を測定することによっても決定することができる。本明細書で前述したように、いくつかの態様では、アセトアルデヒドの存在を示す明確な赤い領域又はゾーンが細菌ストリーク上及び／又はその周囲に観察される場合、乳酸菌株はエタノールアミン利用性であると決定される。より具体的には、ゾーンの「幅」を測定し得、そして太い線又は細菌ストリークの各側に少なくとも約０．５ｍｍ、延びて、アセトアルデヒドの存在を示し得る場合もある。このことはまたさらに例１において示され、表１に例示される。
本明細書では、工程ｉ）の前記培養培地中の、又はそれに添加されるエタノールアミンの量又は濃度は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭ、例えば、約１ｍＭから約５０ｍＭ、例えば、約１ｍＭから約３０ｍＭ、例えば、約０．５ｍＭから約１５ｍＭであり得る。これは、エタノールアミンの第一の量又は濃度とも呼ばれ得る。さらに、前記培養物に添加されるエタノールアミンのさらなる量又は濃度は、約１ｍＭから約１Ｍ、例えば、約３０ｍＭから約１Ｍ、又は約１０ｍＭから約１００ｍＭであり得る。これはまた、エタノールアミンの第二の量又は濃度とも呼ばれ得る。第一又は第二の量のエタノールアミンの添加は、必ずしも必要ではないが、エタノールアミン利用乳酸菌の機構において異なる目的を果たし得る。
本明細書において、そしてすべての文脈において、乳酸菌はラクトバチルス属の細菌であり得る。これは、本明細書に開示されているすべての態様、使用及び方法に実際に適用可能である。前記乳酸菌はまた、ラクトバチルス・ロイテリ種の細菌でもあり得る。これもまた本明細書において一般的に適用可能である。
本開示の一態様では、本明細書の選択方法によって選択された乳酸菌株の乳酸菌を提供するが、前記細菌はエタノールアミンを利用することができるものである。
製造方法
本明細書に定義した乳酸菌を含む製造方法もまた提供する。より具体的には、エタノールアミンを利用するように誘導された乳酸菌を製造する方法が提供され、前記方法が、
ｉ） 培養培地にエタノールアミンを利用することができる乳酸菌を供給する工程、
ｉｉ） 工程ｉ）の培養物に、第一の有効量又は濃度のエタノールアミンを第一の時点で添加し、前記培養物を増殖させる工程、
ｉｉｉ） 任意選択的に、工程ｉｉ）の培養物に、第二の有効量又は濃度のエタノールアミンを第二の時点で添加し、前記培養物を増殖させる工程、その後、
ｉｖ） 前記培養培地から乳酸菌を回収する工程、
を含む。
前記方法によって製造された乳酸菌はさらにロイテリン産生性でもあり、さらに基質グリセロール又は１，２－プロパンジオール（１，２－ＰＤ）について病原性細菌と競合することができ、これにより、病原性細菌によるこのような基質の利用可能性を制限し、さらに基質エタノールアミンについても制限する。本明細書で前述したように、さらにまた、エタノールアミンを利用する能力を含めて、乳酸菌機構の様々なメカニズム及びその部分が相互作用し、それによって抗菌作用が改善され得ると考えられる。
さらに、エタノールアミンを利用するように誘導された乳酸菌を製造する方法に関して、第一及び任意選択的に第二の量又は濃度のエタノールアミンを前記培養物に添加又は供給することができる。これはまた、エタノールアミンの培養物又は培養培地への第一の及び第二の添加と呼ばれ得る。また、工程ｉ）の前記培養培地中の、又はそれに添加されるエタノールアミンの量又は濃度は、約１から約３０ｍＭであり得るか、又は本明細書の他の箇所で例示される通りである。これはまた、エタノールアミンの第一の量又は濃度とも呼ばれ得る。また、前記培養物に添加されるエタノールアミンのさらなる量又は濃度は、約３０ｍＭから約１Ｍであり得るか、又は本明細書の他の箇所に例示される通りであり得る。これはまた、第二の量又は濃度のエタノールアミンとも呼ばれる。第一又は第二の量のエタノールアミンの添加は、必ずしも必要ではないが、エタノールアミン利用乳酸菌の機構において異なる目的を果たし得る。
選択方法に関して前述したように、使用される乳酸菌は、ラクトバチルス属の細菌であり得る。さらに前述のように、前記乳酸菌はラクトバチルス・ロイテリ種の細菌であり得る。これは本明細書のすべての態様に等しく適用可能である。
本明細書に開示される方法によって製造された乳酸菌は、続いて、保存に適した形態に、そして続いてヒト又は動物の対象への投与に適した製品に作られ得る。製品は、満足のいく貯蔵安定性を達成するために（例えば、前記組成物に防湿剤を添加することによって）水分を実質的に含有しないようにすべきである。乳酸菌の培養物は、凍結又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ／ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）形態で保存することができる。
当然ながら、本明細書の任意の組成物に使用される乳酸菌は、たとえ乾燥又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ／ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）形態などであっても生存可能な細菌である。
したがって、本明細書では、本明細書に開示された方法によって製造された乳酸菌、ならびに前記乳酸菌を含む任意の組成物もまた提供する。そのような組成物は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ／ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）することができ、そして任意選択的に、１種以上の凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）、凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ａｇｅｎｔ）及び／又は防湿剤のようなさらなる添加剤又は成分を含有させることができる。
遺伝子プロファイリング
本明細書で前述したように、別の態様では、本明細書で以前に提供した選択方法に関して、乳酸菌の遺伝子プロファイルを決定することを含む、エタノールアミンを利用することができる前記乳酸菌株を選択する方法であって、前記方法が：
ｉ） スクリーニングを受けるべき乳酸菌株の細菌を供給する工程、
ｉｉ） 前記乳酸菌株の最初のスクリーニングを実施して、前記乳酸菌株における以下のタンパク質をコードする遺伝子の細菌相同体の１つ以上の存在について決定する工程、
ａ）エタノールアミンアンモニアリアーゼラージサブユニットＥｕｔＢ、
ｂ）微小区画構造タンパク質ＥｕｔＬ、及び／又は
ｃ）エタノールアミン利用タンパク質ＥｕｔＨ、
ｉｉｉ） 前記遺伝子の１つ以上が前記乳酸菌株に存在する場合、前記細菌がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する工程、並びに
ｉｖ） 前記乳酸菌がエタノールアミンを利用することができる場合、前記乳酸菌株を選択する工程、
を含む、上記方法を提供する。
任意選択的に、前記乳酸菌株の第二以降のスクリーニング、すなわち遺伝子スクリーニングを、上述の方法の工程ｉｉ）の一部として、工程ｉｉ）の前、又は工程ｉｉ）の後かつ工程ｉｉｉ）の前などに行って、以下のタンパク質、すわなち、ｐｆａｍ０３３５８タンパク質ファミリーに属するＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮレダクターゼ及び／又はｐｆａｍ１３３５０タンパク質ファミリーに属するタンパク質－チロシン－ホスファターゼをコードする遺伝子の細菌相同体の１つ以上の存在について決定し得る。前記遺伝子は、最初のスクリーニングでスクリーニングされた上述の遺伝子と同じ遺伝子クラスターに、又は同じオペロンにさえ存在し得る。好ましくは、前記遺伝子は同じ遺伝子クラスターに、又は同じオペロンにさえ存在する。本明細書に記載の第二の遺伝子スクリーニングを実施することによって、遺伝子プロファイルを決定することを含むエタノールアミンを利用できる乳酸菌株の選択方法をさらに改善することができ、これらの遺伝子又は全ての遺伝子が共にエタノールアミン利用に関連して有益であると考えられる。
前記方法を実施するための遺伝子及び基準は、選択及び／又は製造方法に関して本明細書中で前記した通りである。
本明細書の方法によって選択され、又はそれによって製造された乳酸菌の使用、及びエタノールアミン利用乳酸菌を含む組成物
さらに別の態様では、個体の胃腸管内の病原性細菌の増殖を阻害するのに使用するための、本明細書の方法によって選択され、又は製造された乳酸菌を提供する。同様に、病原性細菌の増殖を阻害するための、本明細書の方法によって選択され、又は製造された乳酸菌の使用を提供する。選択され又は製造された乳酸菌のこの特徴の背後にあると示唆される機構は、本明細書で前記されており、同じ基質に対する病原性細菌と乳酸菌との競合による。これらの病原体の増殖を阻害することによって、病原体によって引き起こされるか又はすでにそれによって引き起こされたいかなる有害な影響も、それを必要とする個体に乳酸菌を提供することによって、間接的に予防又は少なくとも緩和され得る。
したがって、それによって、医薬として使用するための、そのような乳酸菌もまた本明細書で提供される。さらに、そのような乳酸菌は、エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害の治療において使用するために提供される。述べたように、そのような効果は、侵入する病原性細菌の病因に対する前記乳酸菌の阻害作用によって実現され得る。本明細書に示されるように、例３及び図３において、エタノールアミン利用乳酸菌は病原体Ｃ．ディフィシルの増殖をうまく阻害することができた。
本明細書では、前記エタノールアミン利用病原体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）（例えば、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、及びブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）からなる群から選択され得る。しかしながら、他のエタノールアミン利用病原体もまた考えられ得る。
エタノールアミン利用病原性細菌に関連した症状の例は、例えば、腸内細菌叢異常（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）（微生物の不均衡又は体の表面又は内部の不適応）、リステリア症、サルモネラ症、炎症性腸疾患の原因となる細菌感染症、病原性シュードモナス感染症（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅｓ）（感染創傷）、及び旅行者下痢症である。
前記乳酸菌を含む細胞培養物の増殖中にエタノールアミンによって誘導されるエタノールアミン利用乳酸菌を含む組成物もまた提供される。本明細書において前記したように、本明細書に記載の組成物は、ラクトバチルス属の乳酸菌を含み得る。前記ラクトバチルスはまた、ラクトバチルス・ロイテリ種の細菌でもあり得る。本明細書の組成物は、エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害の治療に使用するためのものであり得る。本明細書の組成物はまた、個体の胃腸管内の１つ以上の病原性細菌の増殖を阻害するのに使用するためのものでもあり得る。同様に、それらは、エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害の治療のために、そして個体の胃腸管内の１つ以上の病原性細菌の増殖を阻害するために使用され得る。
当然のことながら、プロバイオティックを使用するための前記エタノールアミン利用乳酸菌又は乳酸菌株が本明細書で提供される。本明細書で提示されるすべての態様において、前記乳酸菌又は乳酸菌株を含むプロバイオティック組成物もまた提供される。
新規な乳酸菌株
以下の新規な乳酸菌株もまた提供される：
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１の生物学的に純粋な培養物、及び
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５の生物学的に純粋な培養物。
その一態様では、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１株及びラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５株のいずれか１つの生物学的に純粋な培養物を含む凍結又は凍結乾燥組成物（単数又は複数）が提供される。
本明細書では、少なくとも以下のものを含有するラクトバチルス・ロイテリの新規な凍結又は凍結乾燥製品もまた提供される：
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１の生物学的に純粋な培養物、又は
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５の生物学的に純粋な培養物。
本明細書では、少なくともグリセロールなどの凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む、以下のラクトバチルス・ロイテリの新規な凍結製品も提供される：
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１の生物学的に純粋な培養物、又は
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５の生物学的に純粋な培養物。
本明細書では、少なくとも二糖類などの凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含有する、以下のラクトバチルス・ロイテリの新規な凍結乾燥製品も提供される：
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１の生物学的に純粋な培養物、又は
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５の生物学的に純粋な培養物。
本明細書では、製品及び組成物という用語は、前記乳酸菌に関して互換的に使用され得る。
本明細書で前述したように、エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はこれに関連する症状又は障害の治療に使用するために、及び／又は個体の胃腸管内の１つ以上の病原性細菌の増殖を阻害するのに使用するために、本明細書で前記したように、本明細書に記載の新規なラクトバチルス・ロイテリ株、又は前記株を含むか又は含有する組成物又は製品が提供される。エタノールアミン利用病原体は、本明細書の他の箇所に例示されており、本文脈において等しく適用可能である。
個体におけるエタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害の治療方法であって、前記方法が、前記個体に有効量の乳酸菌、新規な乳酸菌株、若しくは組成物を、又は前記個体に本明細書の他の箇所に記載の製品を投与することを含む、上記方法もまた提供される。本明細書で定義されるエタノールアミン利用乳酸菌を投与して、前記病原性細菌の増殖を阻害することによる、病原性エタノールアミン利用細菌による感染症に罹患している個体の治療方法もまた提供される。熟練した実施者によって決定される、薬学的に有効な量の前記乳酸菌が、前記個体に投与される。
下記の例（例２）にてさらに記載すように、優性選択による胆汁へのラクトバチルス・ロイテリなどのラクトバチルス株の改善－胆汁耐性のための方法も提供される。したがって、例２では、野生型株であるラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１から改変されたラクトバチルス・ロイテリ株ＤＳＭ３２４６５が、野生型株よりも胆汁に対してより耐性があることが示される。これにより、特定の症状、使用及び適応症のためのプロバイオティックとして使用するためのＬ．ロイテリ株ＤＳＭ３２４６５のさらなる利点が提示される。
次に、本発明を以下の実験の部により説明するが、それに限定することを意図するものではない。
例１
エタノールアミンを利用することができる細菌株の選択
細菌株
ラクトバチルス・ロイテリの異なる菌株を試験した。すなわち、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１、Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８、及びＬ．ロイテリＤＳＭ３２４６５である。すべての株はＢｉｏＧａｉａ ＡＢから得た。
方法
細菌を、３７℃の嫌気性雰囲気中で、４８時間、ＭＲＳ寒天プレート（１０ｍＭエタノールアミンを含む）上で増殖させた。次に、該プレートに５００ｍＭエタノールアミン寒天（１％寒天）を重層し、３７℃で１時間、インキュベートした。アセトアルデヒドは、５ｍｌの２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（２Ｍ ＨＣｌ中０．１％）の添加により検出された。３分間、インキュベートした後、溶液を捨て、５ｍｌの５Ｍ ＫＯＨを加えた。細菌ストリーク周囲の赤いゾーンは、アセトアルデヒドの存在を示した。
結果
Ｌ．ロイテリのすべての菌株について、アセトアルデヒドが産生されたと考えられる、それらのエタノールアミンの利用の可能性を試験した。Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８は陰性であったが、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１及びＬ．ロイテリＤＳＭ３２４６５はこのアッセイにおいて陽性であった。図１を参照されたい。したがって、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１及びＬ．ロイテリＤＳＭ３２４６５の周囲に拡大した（赤い）ゾーンが見られた。Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８の周囲には拡大した（赤い）ゾーンは見られなかった。図１のアセトアルデヒド含有ゾーンのおおよその幅を以下の表１に示す。
Figure 0007097382000001
選択工程
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ２７１３１及びラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５を選択した。
例２
優性選択によるラクトバチルス・ロイテリの改良－胆汁耐性
細菌株
ラクトバチルス・ロイテリ株ＤＳＭ２７１３１を使用した。
方法
細菌をＭＲＳブロス中で３７℃にて一晩（ＯＮ）増殖させた。次いでチューブを３０００×ｇで１０分間、遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、ブタ胆汁（０．５％ｗ／ｖ）を添加した等量のＭＲＳに再懸濁した。２００μｌのアリコートを調製し、２本のチューブについて生存率アッセイのために直接採取した（開始値）。連続１０倍希釈液をこれらのチューブについて作製し、滴下平板法（ｄｒｏｐ－ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、ＭＲＳ寒天プレート上にプレーティングした。簡単に説明すると、１０μｌの各希釈液を６つのゾーンに分割したＭＲＳプレートに滴下し、放置して乾燥させた後、３７℃の嫌気性雰囲気中で一晩（ＯＮ）インキュベートした。残りのアリコートを３７℃でインキュベートし、２本のチューブについて３０分毎に生存率アッセイのために４時間まで採取した。
一晩（ＯＮ）インキュベーションした後、細菌数を決定して、細菌の生存率を確定した。生存率に応じて適切な時点から、異なるサイズのコロニーを収集し、Ｌ．ロイテリの同じ株の新しい変種として保存した。
選択工程
該新しい変種ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５を選択した。
結果
Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１を用いた初期試験では、濃度１及び５％ではブタの胆汁に対する耐性が低いことが示された。０．５％のブタの胆汁を用いて追加の実験を行い、以前と同じ結果を得たが、最初の２つの時点からコロニーを選び、新しい変種として保存した。ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２４６５を、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１と同じ方法で０．５％の胆汁を用いて試験したところ、胆汁耐性の有意な改善が示された（図２）。Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１の低い開始値は、野生型がブタの胆汁に対していかに感受性が高いかを示し、数分のうちに約５・１０８ＣＦＵ／ｍｌから１０６未満に低下する。
例３
結果
エクスビボ実験は、エタノールアミン利用株Ｌ．ロイテリ株ＤＳＭ２７１３１がＣ．ディフィシルの増殖を完全に阻害する一方、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉＤＳＭ１７９３８（データは示さず）は同じ実験条件下でＣ．ディフィシルの増殖を阻害しなかったことを示す（図３）。
材料と方法
細菌株と培養条件
ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ培地（ＭＲＳ；Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＹ）中のラクトバチルス・ロイテリ株１７９３８及びＤＳＭ２７１３１ならびに２％Ｄ－グルコース（ｗ／ｖ）含有ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地（ＢＨＩ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中のＣ．ディフィシルの通常の培養を、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２、及び８５％Ｎ２の混合物を供給した嫌気性チャンバー（Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＳ－５８０、カリフォルニア州モーガンヒル）中で３７℃にて１６～１８時間、行った。
ＧＩの糞内容物におけるエクスビボ増殖研究
無菌マウスの糞内容物におけるＣ．ディフィシルのＬ．ロイテリ１７９３８又はＬ．ロイテリＤＳＭ２７１３１に対する感受性を以下のようにして決定した。無菌の７～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから糞ペレットを収集し、ＰＢＳに１：２で再懸濁し、２００μＬの試料にアリコートした。各アリコートにＣ．ディフィシルＣＤ２０１５（１０４／ｍＬ）を接種し、次いで３ｍＭグリセロールを含有するＰＢＳでインキュベートし、Ｌ．ロイテリ１７９３８（１０７／ｍＬ）又はＬ．ロイテリＤＳＭ２７１３１（１０７／ｍＬ、１０ｍＭエタノールアミンで一晩、プレインキュベートした）で処理した。懸濁液を３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートした。試料を０及び２４時間で採取し、Ｃ．ディフィシル及びＬ．ロイテリ細菌を、タウロコール酸ナトリウムを含む予め還元した選択性のシクロセリン－セフォキシチン－フルクトース寒天（ＴＣＣＦＡ）又はＭＲＳ培地上でそれぞれ一晩培養することにより定量した。プレートを３７℃で４８時間、嫌気的にインキュベートし、コロニー形成単位を数えた。
例４
本明細書に提示される遺伝子スクリーニング方法の遺伝子の細菌相同体の部分的配列決定
細菌株Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１におけるドラフトゲノム配列を、当該技術分野で知られている方法を使用して得た。この分析の結果から、エタノールアミン利用に関与するタンパク質をコードする以下の遺伝子が細菌株Ｌ．ロイテリＤＳＭ２７１３１において見出されたことが示される。
１． エタノールアミンアンモニアリアーゼラージサブユニットＥｕｔＢ
２． 微小区画構造タンパク質ＥｕｔＬ
３． エタノールアミン利用タンパク質ＥｕｔＨ
４． ｐｆａｍ０３３５８タンパク質ファミリーに属するＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮレダクターゼ
５． ｐｆａｍ１３３５０タンパク質ファミリーに属するタンパク質－チロシン－ホスファターゼ
上記の全ての遺伝子は同じ遺伝子クラスターに、おそらく、さらには同じオペロンに存在した。

Claims (31)

  1. エタノールアミンを利用することができ、かつエタノールアミン利用病原体と、基質であるエタノールアミンを競合することによって、エタノールアミン利用病原体の増殖を阻害することができる乳酸菌株を選択する方法であって、前記方法が、
    ｉ） 培養培地に乳酸菌株の細菌を供給し、かつ前記細菌の培養物を増殖させる工程、
    ｉｉ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができるかどうかについて決定する工程、及び
    ｉｉｉ） 前記細菌がエタノールアミンを利用することができる場合、前記乳酸菌株を選択する工程、
    を含み、
    前記培養培地が、ある量又は濃度のエタノールアミンを含み、及び／又はある量又は濃度のエタノールアミンが、工程ｉ）の前記培養物に工程ｉｉ）の前のある時点にて添加される、上記方法。
  2. 前記方法が、工程ｉ）の前記培養物にさらなる量又は濃度のエタノールアミンを第二の時点にて添加すること、及び前記培養物を前記方法の工程ｉｉ）及びｉｉｉ）を実施する前に増殖させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 工程ｉ）が、前記乳酸菌におけるエタノールアミンアンモニアリアーゼラージサブユニットＥｕｔＢ、微小区画構造タンパク質ＥｕｔＬ及びエタノールアミン利用タンパク質ＥｕｔＨからなる群から選択されるタンパク質のいずれかをコードする１つ以上の遺伝子の細菌相同体をコードする１つ以上の遺伝子の存在についての前記乳酸菌の最初のスクリーニングを実施することによって先行される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記方法が、ｐｆａｍ０３３５８タンパク質ファミリーに属するＮＡＤＰＨ依存性ＦＭＮレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はｐｆａｍ１３３５０タンパク質ファミリーに属するタンパク質－チロシン－ホスファターゼをコードする遺伝子の細菌相同体の存在について決定するためのスクリーニングを実施することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 工程ｉ）の前記培養培地中の、又は工程ｉ）の前記培養培地に添加されるエタノールアミンの前記量又は濃度が、約０．１ｍＭから約５０ｍＭ、又は約１から約３０ｍＭである、並びに／或いは前記培養物に添加されるエタノールアミンの追加の量又は濃度が、約１ｍＭから約１Ｍ、又は約３０ｍＭから約１Ｍである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）種の細菌である、請求項６に記載の方法。
  8. エタノールアミン利用病原体と、基質であるエタノールアミンを競合することによって個体におけるエタノールアミン利用病原体の増殖を阻害するのに使用するための、請求項７に記載の方法によって選択されたラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）種の細菌を含む組成物。
  9. エタノールアミンを利用するように誘導され、かつエタノールアミン利用病原体と、基質であるエタノールアミンを競合することによってエタノールアミン利用病原体の増殖を阻害することができる乳酸菌の製造方法であって、前記方法が、
    ｉ） 培養培地にエタノールアミンを利用することができる乳酸菌を供給する工程、
    ｉｉ） 工程ｉ）の前記培養培地に第一の量又は濃度のエタノールアミンを第一の時点にて添加し、かつ前記培養物を増殖させる工程、
    その後、
    ｉｖ） 前記乳酸菌を前記培養培地から回収する工程、
    を含む、上記方法。
  10. 工程ｉｉ）の前記培養物に第二の量又は濃度のエタノールアミンを第二の時点にて添加し、かつ前記培養物を増殖させる工程のｉｉｉ）をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 工程ｉｉ）で前記培養物に添加されるエタノールアミンの前記第一の量又は濃度が、約０．１ｍＭから約５０ｍＭ、又は約１ｍＭから約３０ｍＭである、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 工程ｉｉｉ）で前記培養物に添加されるエタノールアミンの前記第二の量又は濃度が、約１ｍＭから約１Ｍ、又は約３０ｍＭから約１Ｍである、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌である、請求項９から１２に記載の方法。
  14. 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）種の細菌である、請求項１３に記載の方法。
  15. エタノールアミン利用病原体と、基質であるエタノールアミンを競合することによって個体におけるエタノールアミン利用病原体の増殖を阻害するのに使用するための、請求項１４に記載の方法によって製造されたラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）種の細菌を含む組成物。
  16. 個体の胃腸管におけるエタノールアミン利用病原体の増殖を阻害するのに使用するための、請求項８又は１５に記載の組成物。
  17. 医薬として使用するための、請求項８又は１５に記載の組成物。
  18. エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害の治療に使用するための、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記エタノールアミン利用病原体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、及びブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
  20. エタノールアミン利用病原体と、基質であるエタノールアミンを競合することによって個体におけるエタノールアミン利用病原体の増殖を阻害するのに使用するための、エタノールアミンを利用するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）を含む培養物の増殖中にエタノールアミンによって誘導された前記ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）を含む組成物。
  21. 前記エタノールアミンを利用するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ２７１３１又はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ３２４６５である、請求項２０に記載の組成物。
  22. ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ２７１３１又はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ３２４６５。
  23. ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ２７１３１又はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ３２４６５を含む医薬。
  24. エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害の治療に使用するための、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ２７１３１又はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ３２４６５を含む医薬。
  25. 凍結した又は凍結乾燥したラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ２７１３１又はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ３２４６５を含む組成物。
  26. エタノールアミン利用病原体と、基質であるエタノールアミンを競合することによって個体における１つ以上のエタノールアミン利用病原体の増殖を阻害するのに使用するための、請求項２５に記載の組成物。
  27. エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害を、エタノールアミン利用病原体の生存を悪化させ、及び/又は該病原体の毒性効果を減少させることにより治療することにおいて使用するための、エタノールアミンを利用するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）を含む組成物。
  28. エタノールアミン利用病原体によって引き起こされるか又はそれに関連する症状又は障害を、エタノールアミン利用病原体の生存を悪化させ、及び/又は該病原体の毒性効果を減少させることにより治療することにおいて使用するための、請求項２０、２１又は２５に記載の組成物。
  29. 前記エタノールアミン利用病原体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、及びブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の組成物。
  30. 前記エタノールアミン利用病原体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、及びフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の組成物。
  31. 前記エタノールアミン利用病原体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）である、請求項２７又は２８に記載の組成物。
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