JP2009242275A - 生菌剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)及びラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)の生菌体を有効成分として含む。あるいは、本発明の生菌剤は、ラクトバチルス・ロイテリCE5株及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む。
【選択図】図2
Description
[材料及び方法]
(1) 鶏からの乳酸菌株の分離
SPF鶏の盲腸内容物を採取し、これにリン酸緩衝食塩水(PBS)を加えて階段希釈した液を変法LBS寒天培地に塗抹した。37℃で48時間嫌気培養(三菱ガス化学、アネロパックケンキ)後、生じたコロニーをMRS寒天培地(Merck)上に画線塗抹し、37℃で48時間嫌気培養した。分離後の菌はグリセロールストックとして−80℃で保存した。
分離株の中でグラム陽性、非運動性、カタラーゼ活性陰性の桿菌であるものを、Lactobacillus sp.と同定した。Lactobacillus sp.と同定された株について、ガス産生の有無、15℃での発育の有無および糖の発酵性(リボース、ガラクトース、セロビオース、ラクトース、トレハロース、メリビオース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール)を試験し、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 2 (1986)に記載されている各乳酸菌種の性状と比較して菌種(属)を同定した。同定試験の参考株としてL. reuteri JCM 1112Tを用いた。
初生ひなに1日間、抗生物質(アンフォテリシンB 2.5μg/mL、ストレプトマイシン 100μg/mL、ペニシリン 100U/mL)を添加した水のみを与えた後、ネンブタール0.3mLを腹腔内に注射し安楽死させた。ついでそ嚢および盲腸を摘出し、長軸方向に開いた。これから、直径約5mmの切片を切り出し、直径15mmの円形カバーガラス(松浪ガラス)上に管腔側を上にして瞬間接着剤で固定した。円形カバーガラス1枚当たり、3枚の切片を固定した。切片を固定した円形カバーガラスを24穴マルチプレート(住友ベークライト)に入れ、実験まで-30℃で保存した。本実験は弘前大学動物実験委員会の承認を得て行った。
乳酸菌としてSPF鶏盲腸内容物から分離した10株、成鶏糞便から分離した1株(理研バイオリソースセンターより入手)、および理化学研究所微生物系統保存施設(JCM)から購入した3株の合わせて14株の乳酸菌を用いた。
付着率(%)=付着菌数(CFU/well)/負荷菌数(CFU/well)
菌懸濁液は前項と同様にして調製した。但し、総菌数として乳酸桿菌の濃度は2×109/mLおよび2×1010/mLに、サルモネラの濃度は2×108/mLに調整した。
[結果及び考察]
(1) SPF鶏盲腸内容物から分離した乳酸菌株の同定
糖の発酵パターンから分離菌株10株を表1のように同定した。
+:陽性 −:陰性
※ 運動性、カタラーゼ活性、ガス産生、15℃発育、好気性発育
+:陽性 −:陰性
※ グルコン酸の資化性、糖分解性状
菌の発育度に合わせて−、+、++及び+++で示した。
表2に示したように、L. reuteri CE5のみで高い付着率(20.6%)を示した。一方、Lactobacillus salivarius/agilis CE10および菌株保存機関から入手したすべての乳酸菌株(4株)については低い付着率(1.0%以下)であった。これ以外のSPF鶏盲腸内容物分離株は中程度の付着率(5〜10%)を示した。
乳酸菌ではそ嚢切片に高い付着率を示したL. reuteri CE5および低い付着率を示したL. crispatus JCM 5810を用いて付着試験を行った。その結果、表3に示したようにL. reuteri CE5の盲腸への付着率は3.0%と中程度であったが、付着菌数はそ嚢と同程度であった。L. crispatus JCM 5810は付着率および付着菌数とも低く、L. reuteri CE5の10分の1程度であった。
L. reuteri CE5は図1に示したように、サルモネラ菌量の10倍量および100倍量の菌量を添加すると、S. Typhimurium JCM 1652のそ嚢切片への付着をそれぞれ、15%および82%阻害した。S. Typhimurium EF85-9に対しては、10倍量の菌量でも、80%付着を阻害した。このためそ嚢切片への付着性が高い乳酸菌株であるL. reuteri CE5はサルモネラの付着を抑制できることがin vitroの実験系で確認された。
実施例1で分離した乳酸菌の給与が鶏ひなの体重に与える影響を調査した。試験は3回実施した。
(1) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー抜きオス(レイヤー種のオス、デカルブホワイトおよびローラ)を使用した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を、飲水は水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。給与した菌数はMRS平板を用いて計数した。
1日齢時に、適当な菌数となるように希釈した乳酸菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。8日齢時に、鶏ひなの体重および飼料摂取量(2回目、3回目のみ)を測定した。
(1) 1回目
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が2.4×107CFU/羽、CE5株給与区が2.2×107CFU/羽であった。
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が1.4×105CFU/羽、CE5株給与区が1.2×105CFU /羽であった。
乳酸菌給与菌数は、JCM5810株給与区が1.1×105CFU/羽、CE5株給与区が0.9×105CFU /羽であった。
実施例2で確認した増体重作用をより詳細に確認するため、さらにより規模の大きい飼養試験を行った。
(1) 乳酸菌
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にブイヨン培地(グルコース1%、酵母エキス2%、ペプトン2%、フラクトオリゴ糖1%)で37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。1羽あたりの乳酸菌投与菌数は、JCM5810が2.6×106CFU/羽、CE5が5.5×106CFU/羽であり、各個体に両菌株を同時投与した。
ブロイラー専用種(チャンキー)初生雄雛を250羽導入し、体重の近似した個体を180羽選抜して供試した。
区分け時に胃ゾンデを用いてそ嚢内に滅菌水を1羽あたり0.5mLずつ単回強制経口投与する対照区と、同様に乳酸菌を投与する試験区の計2区を設定した。
供試鶏を体重の分布がほぼ均等となるように30羽ずつ割付けた6群に区分し、両区に3反復群ずつ割付けて4週間飼育した。
供試飼料の配合割合は表10に示したとおりである。
供試鶏は、電熱給温、強制換気式の無窓鶏舎内で群飼した。各群あたりの飼育面積は、給餌器および給水器を除いて約2m2とした。
敷料はオガクズを用い、試験終了時まで排泄物を堆積させた。照明は終日点灯した。
飼料および飲水は自由摂取させた。
ワクチネーションは、初生時にマレックおよび鶏痘生ワクチン接種済みの雛を導入し、4日齢および14日齢にNB生ワクチンを、21日齢に鶏痘生ワクチンを追加接種した。
(i) 体重および増体量
区分け時より1週間間隔で個体別体重を測定し、毎週の増体量および試験期間を通算した増体量を算出した。
(ii) 飼料摂取量および飼料要求率
毎週の飼料摂取量を群毎に測定し、増体量と同様に集計して、1羽あたりの飼料摂取量および飼料要求率を算出した。
(iii) 健康状態
健康状態を毎日一定時刻に観察して記録した。
試験期間中の増体量、飼料摂取量および飼料要求率について、一元配置法により分散分析し、両区間の差の有意性について検討した。なお、試験開始から各体重測定時点の増体量について群毎に棄却検定を行って異常値と判定された個体および試験中に淘汰、斃死した個体は、試験開始時に遡って除外して各成績を取りまとめた。
毎週の増体量、飼料摂取量および飼料要求率を表11-1に、試験期間を通算した増体量、飼料摂取量および飼料要求率を表11-2に示した。
乳酸菌の給与が鶏ひなのサルモネラ定着阻害に与える影響を調査した。試験は2回実施した。
(1) 試験方法
(i) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー (ローラ抜きオス)を使用した。供試ひな導入時に使用した輸送箱の敷料についてサルモネラ検査を行い、サルモネラ陰性を確認した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を与えた。飲水は滅菌水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。
1日齢時に、L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株の菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。給与した菌数はMRS平板を用いて計数し、L. crispatus JCM5810株の給与菌数は1.4×105CFU/mL/羽、L. reuteri CE5株の給与菌数は1.2×105CFU/mL/羽であった。
乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。
サルモネラはナリジクス酸耐性のS. Typhimurium EF85-9株を使用し、ひなへの感染は乳酸菌投与の24時間後に行なった。ドルセット卵培地で冷蔵保存したサルモネラEF85-9株をトリプトソーヤ平板寒天培地に画線し、37℃・20時間培養した。独立した白色スムースコロニーを釣菌し、サルモネラO多価抗原とのスライド凝集反応およびナリジクス酸50μg/mL添加MLCB平板培地上でのコロニー形状により供試サルモネラであることを確認した。その後、トリプトソーヤ液体培地に接種し、37℃・18時間培養し、培養後の菌液は0.1%ペプトン水で希釈した。このサルモネラ新鮮培養菌希釈液0.5mLをゾンデを用いて経口感染させた。感染サルモネラ菌数は1.1×103CFU/0.5mL/羽であった。
感染6日後に供試ひなを剖検し、盲腸内容物中のサルモネラ菌数および陽性率を測定した。サンプリングした盲腸内容物はハーナテトラチオネート増菌培地および0.1%ペプトン水で10倍階段希釈し、50μg/mLナリジクス酸添加MLCB平板に塗沫、37℃で24時間培養後に中心黒色の典型的なサルモネラコロニー数を計数し、サルモネラO多価抗原とのスライド凝集反応によりサルモネラであることを確認した。
ハーナテトラチオネート増菌培地は1次増菌検査(41.5℃で20時間培養)および2次増菌検査(さらに室温で5日間放置後、新しいハーナテトラチオネート増菌培地に接種・培養)にてサルモネラの検出を試みた。1次増菌でサルモネラ陽性の場合、菌数測定の検出限界値を菌数とし、1次増菌でサルモネラ陰性だが2次増菌で陽性の場合は菌数を10とした。2次増菌でもサルモネラ陰性のものを菌数0とした。
(i) 感染サルモネラ菌数
盲腸内サルモネラ菌数の結果は以下の表にまとめた。
(1) 試験方法
(i) 供試ひなおよび飼養管理
1日齢のレイヤー(デカルブホワイト抜きオス)を使用した。供試ひな導入時に使用した輸送箱の敷料についてサルモネラ検査を行い、サルモネラ陰性を確認した。供試ひなは体重の分布がほぼ均等となるように各試験区10羽ずつ区分けし、動物飼育装置(東洋理工製)内で試験区ごとにケージ飼育した。
飼料はγ線滅菌済みの試験用飼料(日本クレア SDL No.1)を与えた。飲水は水道水を与え、それぞれ自由摂取とした。
また1日齢鶏ひなの腸内細菌叢を確立するために、市販の鶏盲腸内容物培養飼料(CEテクト:(株)科学飼料研究所製)を標準的な使用量の4分の1量となるように経口給与した。
L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株を使用した。使用の前日にネジ口試験管に入れたMRSブロスで37℃・20時間培養し、培養終了後、適当な菌数となるように滅菌蒸留水で希釈した。1日齢時に、L. crispatus JCM5810株およびL. reuteri CE5株の菌液を、ゾンデを用いて1羽につき1mLずつ経口的に給与した。
給与した菌数はMRS平板を用いて計数し、L. crispatus JCM5810株の給与菌数は2.4×107CFU/mL/羽、L. reuteri CE5株の給与菌数は2.2×107CFU/mL/羽であった。
乳酸菌を給与しない陰性対照区には同様の方法で滅菌蒸留水を1mLずつ給与した。
試験1と同様に行なった。感染サルモネラ菌数は1.3×103CFU/0.5mL/羽であった。
試験1と同様に行なった。
(4) 試験結果
(i) 感染サルモネラ菌数
盲腸内サルモネラ菌数の結果は以下の表にまとめた。
Claims (11)
- ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)及びラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
- ラクトバチルス・ロイテリCE5株(受領番号FERM AP-21524)及びラクトバチルス・クリスパータスJCM5810株(受領番号FERM AP-21523)の少なくともいずれか一方の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
- 前記CE5株及び前記JCM5810株の生菌体を有効成分として含む請求項2記載の生菌剤。
- 鶏用である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の生菌剤。
- 増体重促進剤である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の生菌剤。
- 腸管感染症の防止剤である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の生菌剤。
- 前記感染症がサルモネラ感染症である請求項6記載の生菌剤。
- 鶏の腸内から分離された分離菌を鶏そ嚢切片と接触させて、該分離菌の中から、そ嚢切片への付着性を有する分離菌を選択し、次いで、選択された分離菌をサルモネラと同時にそ嚢切片に接触させて、該分離菌の中から、サルモネラのそ嚢切片への付着を阻害する作用を有する分離菌を選択することを含む、鶏のサルモネラ感染症の防止作用を有する細菌のスクリーニング方法。
- 前記細菌が乳酸菌である請求項8記載の方法。
- 請求項8又は9記載の方法でスクリーニングされた細菌。
- 請求項10記載の細菌の生菌体を有効成分として含む生菌剤。
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