JP3004890B2 - 病原体感染防御剤 - Google Patents
病原体感染防御剤Info
- Publication number
- JP3004890B2 JP3004890B2 JP7094430A JP9443095A JP3004890B2 JP 3004890 B2 JP3004890 B2 JP 3004890B2 JP 7094430 A JP7094430 A JP 7094430A JP 9443095 A JP9443095 A JP 9443095A JP 3004890 B2 JP3004890 B2 JP 3004890B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- asialo
- lactobacillus
- cells
- lactobacillus acidophilus
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラクトバシラス アシ
ドフィルス コンプレックス（Lactobacillusacidophilu
s complex）に属する微生物またはその菌体を有効成分
とする感染防御剤に関する。本発明はまた、前記ラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックスに属する微生
物の菌体から抽出して得ることができ、アシアロＧＭ１
に親和性を有し、病原体感染防御活性を有する蛋白質に
関する。本発明の感染防御剤及び蛋白質は、アシアロＧ
Ｍ１をレセプターとする病原体と拮抗的にアシアロＧＭ
１に結合することによって、病原体のレセプターへの結
合を阻害し、病原体の感染を防御することができる。
ドフィルス コンプレックス（Lactobacillusacidophilu
s complex）に属する微生物またはその菌体を有効成分
とする感染防御剤に関する。本発明はまた、前記ラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックスに属する微生
物の菌体から抽出して得ることができ、アシアロＧＭ１
に親和性を有し、病原体感染防御活性を有する蛋白質に
関する。本発明の感染防御剤及び蛋白質は、アシアロＧ
Ｍ１をレセプターとする病原体と拮抗的にアシアロＧＭ
１に結合することによって、病原体のレセプターへの結
合を阻害し、病原体の感染を防御することができる。
【０００２】
【従来の技術】ラクトバシラス属細菌は、ヒト消化管内
に生息することが知られ、免疫機能の亢進、感染防御、
腸内環境の改善、腸管機能の亢進等、様々な生理活性を
果たしていると考えられている。近年、ジョンソン（Jo
hnson）らによって、従来、ラクトバシラス アシドフィ
ルス（L.acidophilus）に分類されてきた菌株は、新た
に、ラクトバシラス アシドフィルス（L.acidophilu
s）、ラクトバシラス クリスパタス（L.crispatus）、
ラクトバシラス アミロボラス（L.amylovorus）、ラク
トバシラス ガセリ（L.gasseri）、ラクトバシラス ガ
リナルム（L.gallinarum）及びラクトバシラスジョンソ
ニイ（L.johnsonii）の６複合菌種として再分類される
に至った（Int.J.Systemic Bacteriol.,Vol.30,No.1,p
p.53-68）。従って、本発明においては、従来の分類に
基づくラクトバシラス アシドフィルスを、「ラクトバ
シラス アシドフィルス コンプレックス（L.acidophilu
s complex）」と呼び、新分類による菌種を全て包含す
るものとして使用する。即ち、本発明においては、「ラ
クトバシラス アシドフィルス コンプレックス（L.acid
ophilus complex）」を、上記の新規分類により名称を
付与された上記６菌種の共通の名称として使用する。
に生息することが知られ、免疫機能の亢進、感染防御、
腸内環境の改善、腸管機能の亢進等、様々な生理活性を
果たしていると考えられている。近年、ジョンソン（Jo
hnson）らによって、従来、ラクトバシラス アシドフィ
ルス（L.acidophilus）に分類されてきた菌株は、新た
に、ラクトバシラス アシドフィルス（L.acidophilu
s）、ラクトバシラス クリスパタス（L.crispatus）、
ラクトバシラス アミロボラス（L.amylovorus）、ラク
トバシラス ガセリ（L.gasseri）、ラクトバシラス ガ
リナルム（L.gallinarum）及びラクトバシラスジョンソ
ニイ（L.johnsonii）の６複合菌種として再分類される
に至った（Int.J.Systemic Bacteriol.,Vol.30,No.1,p
p.53-68）。従って、本発明においては、従来の分類に
基づくラクトバシラス アシドフィルスを、「ラクトバ
シラス アシドフィルス コンプレックス（L.acidophilu
s complex）」と呼び、新分類による菌種を全て包含す
るものとして使用する。即ち、本発明においては、「ラ
クトバシラス アシドフィルス コンプレックス（L.acid
ophilus complex）」を、上記の新規分類により名称を
付与された上記６菌種の共通の名称として使用する。
【０００３】旧分類で、ラクトバシラス アシドフィル
スとして一括分類されていた菌種の前記生理的作用は、
新分類の６複合菌種のいずれに認められるのか、未だに
判明しておらず、その検討も十分になされていない。さ
らにまた、ラクトバシラスアシドフィルス コンプレッ
クスに関して報告された上記のような生理活性の大部分
は、未だに現象論に終始しているものが多く、はっきり
とした作用機作が解明されていないものが多い。
スとして一括分類されていた菌種の前記生理的作用は、
新分類の６複合菌種のいずれに認められるのか、未だに
判明しておらず、その検討も十分になされていない。さ
らにまた、ラクトバシラスアシドフィルス コンプレッ
クスに関して報告された上記のような生理活性の大部分
は、未だに現象論に終始しているものが多く、はっきり
とした作用機作が解明されていないものが多い。
【０００４】ラクトバシラス アシドフィルス コンプレ
ックスに属する細菌の抗菌作用、感染防御作用は、in v
itroの系のみならず、in vivoにおいても尿路感染を中
心として数多く報告されている（Clements,M.L.ら、Ant
imicrobial Agents and Chemotherapy,20(1),104-108,
(1981); Reid,G. ら、Infection and Immunity,49(2)32
0-324,(1985)）。しかし、その感染防御効果の主な作用
因子としては、これらの菌の生産する有機酸（Burnett,
G.S.ら、Nature,197,815,(1963)）、バクテリオシン様
因子（Barefoot,S.F.ら、Applied and Environmental M
icrobiology,45,1808-1815,(1983)）、ハイドロジェン
パーオキサイド（Juven,B.J.ら、Journalof Applied ba
cteriology,65,357-360,(1988)）等が取上げられてき
た。また、ライド（Reid）ら（Raphael,C.Y.ら、Infect
ion and Immunity,47(1), 84-89,(1985)）が先鞭をつけ
て主張してきたように、ラクトバシラス アシドフィル
スの定着作用に関する機構は、主として非特異的な疎水
性相互作用に支配されるものであり、大腸菌などの雑菌
に対する付着阻止機能は、共通の受容体に対する競合で
はなく、むしろその立体障害性によって発揮されるもの
という見方が支配的であった。従って、特異的な共通受
容体の奪い合いによる病原体の付着を拮抗的に阻止する
作用を報告した例はない。
ックスに属する細菌の抗菌作用、感染防御作用は、in v
itroの系のみならず、in vivoにおいても尿路感染を中
心として数多く報告されている（Clements,M.L.ら、Ant
imicrobial Agents and Chemotherapy,20(1),104-108,
(1981); Reid,G. ら、Infection and Immunity,49(2)32
0-324,(1985)）。しかし、その感染防御効果の主な作用
因子としては、これらの菌の生産する有機酸（Burnett,
G.S.ら、Nature,197,815,(1963)）、バクテリオシン様
因子（Barefoot,S.F.ら、Applied and Environmental M
icrobiology,45,1808-1815,(1983)）、ハイドロジェン
パーオキサイド（Juven,B.J.ら、Journalof Applied ba
cteriology,65,357-360,(1988)）等が取上げられてき
た。また、ライド（Reid）ら（Raphael,C.Y.ら、Infect
ion and Immunity,47(1), 84-89,(1985)）が先鞭をつけ
て主張してきたように、ラクトバシラス アシドフィル
スの定着作用に関する機構は、主として非特異的な疎水
性相互作用に支配されるものであり、大腸菌などの雑菌
に対する付着阻止機能は、共通の受容体に対する競合で
はなく、むしろその立体障害性によって発揮されるもの
という見方が支配的であった。従って、特異的な共通受
容体の奪い合いによる病原体の付着を拮抗的に阻止する
作用を報告した例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックスに属する細菌
に共通する結合受容体の研究を行ったところ、この結合
受容体が、アシアロＧＭ１であることを確認した。この
アシアロＧＭ１は、病原性大腸菌、緑膿菌、シュードモ
ナス セパシア（Pseudomonas cepacia）、カンピロバク
ター（Campyrobacter）、ロタウイルス（Rota viru
s）、レオウイルス（Reo virus）、ポリオウイルス（Po
lio virus ）に属する微生物が細胞に付着し感染が成立
する際の受容体であることが知られている。本発明者ら
は、このアシアロＧＭ１とラクトバシラス アシドフィ
ルス コンプレックスの結合性と、病原体の感染の関係
について検討を行った。特に、アシアロＧＭ１を受容体
とする病原体（エンテロパソジェンを中心として）とラ
クトバシラス アシドフィルス コンプレックスの受容体
に対する拮抗を、アシアロＧＭ１標品を展開した薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）上で検討し、さらに、アシ
アロＧＭ１リッチな回盲弁由来腫瘍細株ＨＣＴ−８（AT
CC CCL224）上での拮抗現象について検討を行った。そ
の結果、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレック
スは、病原体感染防御効果を有しており、この感染防御
効果には、これまで知られていなかったラクトバシラス
アシドフィルス コンプレックスの特異的受容体が重要
な機能を果していることが判明した。即ち、アシアロＧ
Ｍ１に対して親和性を示すパソジェン（例：病原性大腸
菌、緑膿菌、キャンピロバクター、ロタウイルス、レオ
ウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、シュー
ドモナス スペーシア等）は、このアシアロＧＭ１に結
合して感染が成立するが、ラクトバシラス アシドフィ
ルス コンプレックスは、病原体がこの受容体へ結合す
ることを拮抗的に阻害する。特に消化器官での感染防御
には、腸管粘膜の細胞表面に存在するアシアロＧＭ１に
対する結合を阻害することで感染防御を行うことが明ら
かとなった。このようなアシアロＧＭ１に対する病原性
微生物の結合を拮抗的に阻害する作用は、ラクトバシラ
ス アシドフィルス コンプレックスに属する菌種全てに
存在していた。さらにまた、本発明者らの検討により、
この阻害作用は、ラクトバシラス アシドフィルス コン
プレックスの菌体から抽出される蛋白質にも存在するこ
とが明らかとなった。
バシラス アシドフィルス コンプレックスに属する細菌
に共通する結合受容体の研究を行ったところ、この結合
受容体が、アシアロＧＭ１であることを確認した。この
アシアロＧＭ１は、病原性大腸菌、緑膿菌、シュードモ
ナス セパシア（Pseudomonas cepacia）、カンピロバク
ター（Campyrobacter）、ロタウイルス（Rota viru
s）、レオウイルス（Reo virus）、ポリオウイルス（Po
lio virus ）に属する微生物が細胞に付着し感染が成立
する際の受容体であることが知られている。本発明者ら
は、このアシアロＧＭ１とラクトバシラス アシドフィ
ルス コンプレックスの結合性と、病原体の感染の関係
について検討を行った。特に、アシアロＧＭ１を受容体
とする病原体（エンテロパソジェンを中心として）とラ
クトバシラス アシドフィルス コンプレックスの受容体
に対する拮抗を、アシアロＧＭ１標品を展開した薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）上で検討し、さらに、アシ
アロＧＭ１リッチな回盲弁由来腫瘍細株ＨＣＴ−８（AT
CC CCL224）上での拮抗現象について検討を行った。そ
の結果、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレック
スは、病原体感染防御効果を有しており、この感染防御
効果には、これまで知られていなかったラクトバシラス
アシドフィルス コンプレックスの特異的受容体が重要
な機能を果していることが判明した。即ち、アシアロＧ
Ｍ１に対して親和性を示すパソジェン（例：病原性大腸
菌、緑膿菌、キャンピロバクター、ロタウイルス、レオ
ウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、シュー
ドモナス スペーシア等）は、このアシアロＧＭ１に結
合して感染が成立するが、ラクトバシラス アシドフィ
ルス コンプレックスは、病原体がこの受容体へ結合す
ることを拮抗的に阻害する。特に消化器官での感染防御
には、腸管粘膜の細胞表面に存在するアシアロＧＭ１に
対する結合を阻害することで感染防御を行うことが明ら
かとなった。このようなアシアロＧＭ１に対する病原性
微生物の結合を拮抗的に阻害する作用は、ラクトバシラ
ス アシドフィルス コンプレックスに属する菌種全てに
存在していた。さらにまた、本発明者らの検討により、
この阻害作用は、ラクトバシラス アシドフィルス コン
プレックスの菌体から抽出される蛋白質にも存在するこ
とが明らかとなった。
【０００６】本発明はこのような知見に基づいてなされ
たものであり、ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスに属する微生物またはその菌体を有効成分とす
る、アシアロＧＭ１に親和性を有する病原性微生物に対
する感染防御剤を提供することを目的とする。さらに本
発明は、このラクトバシラス アシドフィルス コンプレ
ックスに属する微生物の菌体から抽出され、病原体感染
防御効果を有する蛋白質を提供することを目的とする。
たものであり、ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスに属する微生物またはその菌体を有効成分とす
る、アシアロＧＭ１に親和性を有する病原性微生物に対
する感染防御剤を提供することを目的とする。さらに本
発明は、このラクトバシラス アシドフィルス コンプレ
ックスに属する微生物の菌体から抽出され、病原体感染
防御効果を有する蛋白質を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、ラク
トバシラス アシドフィルス コンプレックス（Lactobac
illus acidophilus complex）に属しアシアロＧＭ１に
親和性を有する微生物の生菌体、死菌体または細胞壁か
ら、アルカリ塩水溶液または界面活性剤を用いて抽出し
て得られる表面粗蛋白質画分を有効成分とする病原体感
染防御剤である。本発明はまた、ラクトバシラス アシ
ドフィルス コンプレックスに属しアシアロＧＭ１に親
和性を有する微生物の生菌体、死菌体または細胞壁か
ら、アルカリ塩水溶液または界面活性剤を用いて抽出し
て得ることができ、アシアロＧＭ１に親和性を有し、病
原体感染防御活性を有する表面粗蛋白質画分である。
トバシラス アシドフィルス コンプレックス（Lactobac
illus acidophilus complex）に属しアシアロＧＭ１に
親和性を有する微生物の生菌体、死菌体または細胞壁か
ら、アルカリ塩水溶液または界面活性剤を用いて抽出し
て得られる表面粗蛋白質画分を有効成分とする病原体感
染防御剤である。本発明はまた、ラクトバシラス アシ
ドフィルス コンプレックスに属しアシアロＧＭ１に親
和性を有する微生物の生菌体、死菌体または細胞壁か
ら、アルカリ塩水溶液または界面活性剤を用いて抽出し
て得ることができ、アシアロＧＭ１に親和性を有し、病
原体感染防御活性を有する表面粗蛋白質画分である。
【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明において使用されるラクトバシラス アシドフィル
ス コンプレックスに属する微生物は、生菌であっても
死菌であってもよい。また、菌体が化学的または物理的
な方法により破壊されたものであってもよい。ラクトバ
シラス アシドフィルス コンプレックスに属する微生物
としては、従来の分類（Bergey's Manual of Determina
tive Bacteriology 8th Ed.,pp.576-593）によりラクト
バシラス アシドフィルスに分類され、前記のジョンソ
ンらによる新分類による「ラクトバシラス アシドフィ
ルス（L.acidophilus）」、「ラクトバシラス クリスパ
タス（L.crispatus）」、「ラクトバシラス アミロボラ
ス（L.amylovorus）」、「ラクトバシラス ガセリ（L.g
asseri）」、「ラクトバシラス ガリナルム（L.gallina
rum）」及び「ラクトバシラス ジョンソニイ（L.johnso
nii）」の６複合菌種のいずれか１種または１種以上で
ある。これらの菌種に分類されるものであれば、いずれ
のものであってもよい。また、この分類に属する菌種の
変異株や育種により性質が変わったものであっても、本
発明の病原体感染防御剤として使用することができる。
発明において使用されるラクトバシラス アシドフィル
ス コンプレックスに属する微生物は、生菌であっても
死菌であってもよい。また、菌体が化学的または物理的
な方法により破壊されたものであってもよい。ラクトバ
シラス アシドフィルス コンプレックスに属する微生物
としては、従来の分類（Bergey's Manual of Determina
tive Bacteriology 8th Ed.,pp.576-593）によりラクト
バシラス アシドフィルスに分類され、前記のジョンソ
ンらによる新分類による「ラクトバシラス アシドフィ
ルス（L.acidophilus）」、「ラクトバシラス クリスパ
タス（L.crispatus）」、「ラクトバシラス アミロボラ
ス（L.amylovorus）」、「ラクトバシラス ガセリ（L.g
asseri）」、「ラクトバシラス ガリナルム（L.gallina
rum）」及び「ラクトバシラス ジョンソニイ（L.johnso
nii）」の６複合菌種のいずれか１種または１種以上で
ある。これらの菌種に分類されるものであれば、いずれ
のものであってもよい。また、この分類に属する菌種の
変異株や育種により性質が変わったものであっても、本
発明の病原体感染防御剤として使用することができる。
【０００９】本発明において使用することができるこれ
らの微生物の代表的な菌株として、下記の菌株を例示す
ることができる。これらの菌株は、併記した寄託番号に
より工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてお
り、入手可能である。 （菌株） −ラクトバシラス アシドフィルス（L.acidophilus）Ｓ
ＢＴ２０６２（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１０７３０） −ラクトバシラス クリスパタス（L.crispatus）ＳＢＴ
１２６４（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２６）、 −ラクトバシラス アミロボラス（L.amylovorus）ＳＢ
Ｔ１２６９（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２７）、 −ラクトバシラス ガセリ（L.gasseri）ＳＢＴ１２６５
（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２５）、 −ラクトバシラス ガリナルム（L.gallinarum）ＪＣＭ
２０１１（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２３）及び −ラクトバシラス ジョンソニイ（L.johnsonii）ＳＢＴ
２０５０（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２４）。
らの微生物の代表的な菌株として、下記の菌株を例示す
ることができる。これらの菌株は、併記した寄託番号に
より工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてお
り、入手可能である。 （菌株） −ラクトバシラス アシドフィルス（L.acidophilus）Ｓ
ＢＴ２０６２（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１０７３０） −ラクトバシラス クリスパタス（L.crispatus）ＳＢＴ
１２６４（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２６）、 −ラクトバシラス アミロボラス（L.amylovorus）ＳＢ
Ｔ１２６９（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２７）、 −ラクトバシラス ガセリ（L.gasseri）ＳＢＴ１２６５
（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２５）、 −ラクトバシラス ガリナルム（L.gallinarum）ＪＣＭ
２０１１（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２３）及び −ラクトバシラス ジョンソニイ（L.johnsonii）ＳＢＴ
２０５０（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２４）。
【００１０】菌体は、これらのラクトバシラス アシド
フィルス コンプレックスに属する微生物を、ヒトの乳
または牛、羊、山羊等の獣乳またはこれらの脱脂乳を基
本とした培地で培養するか、ブリッグス肝臓培地（Brig
gs liver broth）、ＭＲＳ培地等の公知の半合成培地に
て培養して回収することができる。また、回収した菌体
は、有効成分としてそのまま使用することもできるが、
必要に応じて、洗浄し、培地成分を除去したものを使用
してもよい。また、回収した菌体は、洗浄した後、紫外
線、エックス線、ガンマ線等の照射またはペニシリンや
ストレプトマイシン処理等によって死菌体としてもよ
い。さらに、菌体は、菌体を含有する培養物そのもので
あっても、凍結乾燥や噴霧乾燥して得られる乾燥物であ
ってもよい。
フィルス コンプレックスに属する微生物を、ヒトの乳
または牛、羊、山羊等の獣乳またはこれらの脱脂乳を基
本とした培地で培養するか、ブリッグス肝臓培地（Brig
gs liver broth）、ＭＲＳ培地等の公知の半合成培地に
て培養して回収することができる。また、回収した菌体
は、有効成分としてそのまま使用することもできるが、
必要に応じて、洗浄し、培地成分を除去したものを使用
してもよい。また、回収した菌体は、洗浄した後、紫外
線、エックス線、ガンマ線等の照射またはペニシリンや
ストレプトマイシン処理等によって死菌体としてもよ
い。さらに、菌体は、菌体を含有する培養物そのもので
あっても、凍結乾燥や噴霧乾燥して得られる乾燥物であ
ってもよい。
【００１１】本発明においては、この菌体のみならず、
菌体から抽出した蛋白質を感染防御剤の有効成分として
使用することもできる。蛋白質を使用することにより、
単位重量当たりの感染防御効果を、さらに増大させるこ
とができる。蛋白質は、通常、上記の生菌体、死菌体及
び細胞壁からアルカリ塩の水溶液または界面活性剤によ
って抽出することで得られる蛋白質画分であることがで
きる。抽出に用いるアルカリ塩としては、これらに限定
されるものではないが、例えば、塩化リチウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム等を例示することができる。ま
た、抽出に用いる界面活性剤としては、これらに限定さ
れるものではないが、N-ラウロイルサルコシン（lauroy
lsarcosine）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、ト
ライトンＸ−１００、トゥイーン２０、トゥイーン８０
等を例示することができる。これらの中でも、アルカリ
塩としては塩化リチウムが、界面活性剤としてはN-ラウ
ロイルサルコシンが特に好ましい。この蛋白質画分は、
さらに薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上に展開した
アシアロＧＭ１に対する親和性を指標として活性物質を
分離精製することができる。本発明はこの精製蛋白質を
も包含するものである。本発明の病原体感染防御活性を
有する蛋白質は、ラクトバシラス アシドフィルス コン
プレックスの菌体細胞壁上に存在する。このため菌体を
破壊後、細胞壁画分を回収し、得られた細胞壁画分を感
染防御剤として用いることもできる。
菌体から抽出した蛋白質を感染防御剤の有効成分として
使用することもできる。蛋白質を使用することにより、
単位重量当たりの感染防御効果を、さらに増大させるこ
とができる。蛋白質は、通常、上記の生菌体、死菌体及
び細胞壁からアルカリ塩の水溶液または界面活性剤によ
って抽出することで得られる蛋白質画分であることがで
きる。抽出に用いるアルカリ塩としては、これらに限定
されるものではないが、例えば、塩化リチウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム等を例示することができる。ま
た、抽出に用いる界面活性剤としては、これらに限定さ
れるものではないが、N-ラウロイルサルコシン（lauroy
lsarcosine）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、ト
ライトンＸ−１００、トゥイーン２０、トゥイーン８０
等を例示することができる。これらの中でも、アルカリ
塩としては塩化リチウムが、界面活性剤としてはN-ラウ
ロイルサルコシンが特に好ましい。この蛋白質画分は、
さらに薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上に展開した
アシアロＧＭ１に対する親和性を指標として活性物質を
分離精製することができる。本発明はこの精製蛋白質を
も包含するものである。本発明の病原体感染防御活性を
有する蛋白質は、ラクトバシラス アシドフィルス コン
プレックスの菌体細胞壁上に存在する。このため菌体を
破壊後、細胞壁画分を回収し、得られた細胞壁画分を感
染防御剤として用いることもできる。
【００１２】これらの微生物、その菌体またはその菌体
から抽出した蛋白質を有効成分とする本発明の病原体感
染防御剤は、経口投与することが望ましい。また、本発
明の病原体感染防御剤は、直接投与することもできる
が、医薬品の製造に通常用いられる賦形剤、安定剤等の
添加剤、例えば、乳糖、ステアリン酸ナトリウム等を用
いて、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の適宜
の製剤として投与することもできる。また、本発明の病
原体感染防御剤の投与量は、対象となる病原微生物の種
類、投与対象者の症状、年齢、性別、体重等を考慮し
て、個別に決定することが好ましいが、通常は、菌体乾
燥物として、０.０１ｇ〜５０ｇを１日１回または数回
に分けて投与するとよい。
から抽出した蛋白質を有効成分とする本発明の病原体感
染防御剤は、経口投与することが望ましい。また、本発
明の病原体感染防御剤は、直接投与することもできる
が、医薬品の製造に通常用いられる賦形剤、安定剤等の
添加剤、例えば、乳糖、ステアリン酸ナトリウム等を用
いて、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の適宜
の製剤として投与することもできる。また、本発明の病
原体感染防御剤の投与量は、対象となる病原微生物の種
類、投与対象者の症状、年齢、性別、体重等を考慮し
て、個別に決定することが好ましいが、通常は、菌体乾
燥物として、０.０１ｇ〜５０ｇを１日１回または数回
に分けて投与するとよい。
【００１３】また、これらの有効成分は、耐熱性に優
れ、殺菌処理によってもその効果が失活しないため、飲
食品の原料中に添加して用いることもできる。飲食品と
しては、特に限定されないが、例えば、バター、チー
ズ、ヨーグルト等の乳食品、牛乳やジュース等の飲料、
ケーキやクッキー等の菓子類を挙げることができる。ま
た、本発明の病原体感染防御剤の有効成分であるラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックスに属しアシア
ロＧＭ１に親和性を有する微生物を、ヨーグルト製造用
の乳酸菌として使用すると、病原体感染防御効果を有す
るヨーグルトを製造することができる。
れ、殺菌処理によってもその効果が失活しないため、飲
食品の原料中に添加して用いることもできる。飲食品と
しては、特に限定されないが、例えば、バター、チー
ズ、ヨーグルト等の乳食品、牛乳やジュース等の飲料、
ケーキやクッキー等の菓子類を挙げることができる。ま
た、本発明の病原体感染防御剤の有効成分であるラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックスに属しアシア
ロＧＭ１に親和性を有する微生物を、ヨーグルト製造用
の乳酸菌として使用すると、病原体感染防御効果を有す
るヨーグルトを製造することができる。
【００１４】尚、本発明の有効成分は、発酵乳の原料乳
酸菌として広く使用されてきた菌種であるため、安全性
の点で何等問題がないことが従来より知られている。従
って、ラットでの急性毒性試験を、体重２００〜２３０
ｇのWistar系雄性ラットを１群７匹として用い、本発明
の感染防御剤（生菌体の生理食塩水懸濁液）を２週間経
口投与したが、ＬＤ50値は、１g／kg以上であり、極め
て安全性が高いことが明らかである。
酸菌として広く使用されてきた菌種であるため、安全性
の点で何等問題がないことが従来より知られている。従
って、ラットでの急性毒性試験を、体重２００〜２３０
ｇのWistar系雄性ラットを１群７匹として用い、本発明
の感染防御剤（生菌体の生理食塩水懸濁液）を２週間経
口投与したが、ＬＤ50値は、１g／kg以上であり、極め
て安全性が高いことが明らかである。
【００１５】
【実施例】以下、実施例及び試験例を示し、本発明をさ
らに詳細に説明する。 試験例１ 本試験例では、ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスの内、特に発酵特性に優れたラクトバシラス
アシドフィルスＳＢＴ２０６２株、ラクトバシラス ガ
セリＳＢＴ１２６５株、ラクトバシラス アミロボラス
ＳＢＴ１２６９及びラクトバシラス クリスパタスＳＢ
Ｔ１２６４株が、病原性大腸菌（E.coli Pb176;CFA/II
(CS1+CS3);LT+ST+）のアシアロＧＭ１への結合を阻害す
る効果を示す。 尚、本試験例では、下記の活性測定方
法を用いて、本発明の有効成分の活性を確認した。
らに詳細に説明する。 試験例１ 本試験例では、ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスの内、特に発酵特性に優れたラクトバシラス
アシドフィルスＳＢＴ２０６２株、ラクトバシラス ガ
セリＳＢＴ１２６５株、ラクトバシラス アミロボラス
ＳＢＴ１２６９及びラクトバシラス クリスパタスＳＢ
Ｔ１２６４株が、病原性大腸菌（E.coli Pb176;CFA/II
(CS1+CS3);LT+ST+）のアシアロＧＭ１への結合を阻害す
る効果を示す。 尚、本試験例では、下記の活性測定方
法を用いて、本発明の有効成分の活性を確認した。
【００１６】レセプターへの付着阻害活性の測定法 （ａ）ＴＬＣオーバーレイアッセイ アシアロＧＭ１（５μg）、アシアロＧＭ２（５μg）、
ガングリオシド混合物（２０μg）、中性グリコスフィ
ンゴリピド混合物（２０μg）、グリコテトラオシルセ
ラミド（５μg）及びホスファチジルエタノールアミン
（５μg）を、クロロホルム：メタノール：水（60:40:
9）からなる組成の移動相を用いて；また、セラミドタ
イプＩＩ（ceramide typeIII:５μg）、セラミドタイプ
ＩＶ（ceramide typeIV:５μg）、グリコシルセラミド
（５μg）、スルファチド（５μg）、ガラクトシルセラ
ミド（５μg）及びラクトシルセラミド（５μg）を、ク
ロロホルム：メタノール：水（65:24:4）からなる組成
の移動相を用いて、シリカゲルプレートに展開した。こ
れらの脂質を風乾した後、一旦水に浸漬し、その後、１
％のゼラチン（ELISA-グレード）を含むトリス緩衝化生
理食塩水（10mMTris-150mMNaCl-0.04%アジ化ナトリウ
ム;pH8.0）にてブロッキング（37℃、50rpm、一晩）し
た。
ガングリオシド混合物（２０μg）、中性グリコスフィ
ンゴリピド混合物（２０μg）、グリコテトラオシルセ
ラミド（５μg）及びホスファチジルエタノールアミン
（５μg）を、クロロホルム：メタノール：水（60:40:
9）からなる組成の移動相を用いて；また、セラミドタ
イプＩＩ（ceramide typeIII:５μg）、セラミドタイプ
ＩＶ（ceramide typeIV:５μg）、グリコシルセラミド
（５μg）、スルファチド（５μg）、ガラクトシルセラ
ミド（５μg）及びラクトシルセラミド（５μg）を、ク
ロロホルム：メタノール：水（65:24:4）からなる組成
の移動相を用いて、シリカゲルプレートに展開した。こ
れらの脂質を風乾した後、一旦水に浸漬し、その後、１
％のゼラチン（ELISA-グレード）を含むトリス緩衝化生
理食塩水（10mMTris-150mMNaCl-0.04%アジ化ナトリウ
ム;pH8.0）にてブロッキング（37℃、50rpm、一晩）し
た。
【００１７】対象となる病原菌については、トリプチケ
ースソイブロース（TSB）またはＭ−９培地（Antibodie
s a laboratory manual,p422,Ed Harlow and Daivid La
neEds., Cold Spring Harbor Labolatory Publicatio
n）を用いて、35Ｓ−メチオニン（10ml/74MBq）により
代謝ラベル（37℃、150rpm,12-24時間）した。また、ラ
クトバシラス アシドフィルス コンプレクッスに属する
細菌については、ブリッグス肝臓培地（Briggs liver b
roth）を用いて、35S-メチオニン（10ml/148MBq）によ
り代謝ラベル（37℃、150rpm、48-72時間）した。その
後、代謝ラベルした菌を、１％牛血清アルブミン（BS
A）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS;pH7.0）により
遠心洗浄（3回、6,000rpm、5分）した。一方、シリカゲ
ルプレートを、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより３回洗浄し
（50rpm、10分）、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより懸濁した
ラベル病原菌またはラクトバシラス アシドフィルス コ
ンプレックスに属する細菌を加え、３７℃にて１時間オ
ーバーレイ（50rpm）を行った。オーバーレイは、旋回
式のシェーカーを用いて、１０mlの病原菌懸濁液とＴＬ
Ｃプレートを合わせて旋回させて行った。オーバーレイ
後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより６回洗浄し（50rpm、3
分）、風乾した後、オートラジオグラムをとった。必要
に応じ、デンシトメトリーにて定量化した後、付着強度
を調べることとした。一方、ラクトバシラス アシドフ
ィルス コンプレックスに属する細菌に関しては、代謝
ラベルを行うことなく、マウスによって作成した抗体を
プローブとして、パーオキシダーゼ標識二次抗体にて検
出する方法を併用した。
ースソイブロース（TSB）またはＭ−９培地（Antibodie
s a laboratory manual,p422,Ed Harlow and Daivid La
neEds., Cold Spring Harbor Labolatory Publicatio
n）を用いて、35Ｓ−メチオニン（10ml/74MBq）により
代謝ラベル（37℃、150rpm,12-24時間）した。また、ラ
クトバシラス アシドフィルス コンプレクッスに属する
細菌については、ブリッグス肝臓培地（Briggs liver b
roth）を用いて、35S-メチオニン（10ml/148MBq）によ
り代謝ラベル（37℃、150rpm、48-72時間）した。その
後、代謝ラベルした菌を、１％牛血清アルブミン（BS
A）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS;pH7.0）により
遠心洗浄（3回、6,000rpm、5分）した。一方、シリカゲ
ルプレートを、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより３回洗浄し
（50rpm、10分）、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより懸濁した
ラベル病原菌またはラクトバシラス アシドフィルス コ
ンプレックスに属する細菌を加え、３７℃にて１時間オ
ーバーレイ（50rpm）を行った。オーバーレイは、旋回
式のシェーカーを用いて、１０mlの病原菌懸濁液とＴＬ
Ｃプレートを合わせて旋回させて行った。オーバーレイ
後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより６回洗浄し（50rpm、3
分）、風乾した後、オートラジオグラムをとった。必要
に応じ、デンシトメトリーにて定量化した後、付着強度
を調べることとした。一方、ラクトバシラス アシドフ
ィルス コンプレックスに属する細菌に関しては、代謝
ラベルを行うことなく、マウスによって作成した抗体を
プローブとして、パーオキシダーゼ標識二次抗体にて検
出する方法を併用した。
【００１８】抗体の調製は、６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マ
ウスを用いて、死菌体１００μｇをＰＢＳ２０μｌ中に
懸濁させた後、フロイントインコンプリートアジュバン
ト（ＦＩＡ）８０μｌとのエマルジョンを作製した後、
背部皮下へ１週１回、４週連続して免疫を行った。最終
免疫時にＳＰ−２（１０6細胞）を腹腔内に投与して、
９日後の腹水を回収し抗体を得た。
ウスを用いて、死菌体１００μｇをＰＢＳ２０μｌ中に
懸濁させた後、フロイントインコンプリートアジュバン
ト（ＦＩＡ）８０μｌとのエマルジョンを作製した後、
背部皮下へ１週１回、４週連続して免疫を行った。最終
免疫時にＳＰ−２（１０6細胞）を腹腔内に投与して、
９日後の腹水を回収し抗体を得た。
【００１９】尚、抗ロタウイルス付着活性に関しては、
ヨードビーズを使用したNa-125Iラベルを行うウィロー
ビ（Willoughby）らの方法（J.Virology,64(10),4830-4
835(1990)）に準じて、オーバーレイアッセイを行い、
同様に評価した。
ヨードビーズを使用したNa-125Iラベルを行うウィロー
ビ（Willoughby）らの方法（J.Virology,64(10),4830-4
835(1990)）に準じて、オーバーレイアッセイを行い、
同様に評価した。
【００２０】（ｂ）ＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイ 本方法は、カールソン、ストロンバーグ（Karlsson,Str
onberg）の方法（Karlsson K.A.,Stronberg N, Methods
in Enzymology Vol.138,220-232,(1987)）に準じた方
法である。アシアロＧＭ１（５μｇ）をスポットし、こ
れを展開（クロロホルム：メタノール：水＝６０：４
０：９）したシリカゲルプレートを風乾した後、一旦水
に浸漬し、その後、１％のゼラチン（ELISA-グレード、
バイオラッド社製）を含むトリス緩衝化生理食塩水（10
mMTris-150mMNaCl-0.04%アジ化ナトリウム;pH8.0）によ
りブロッキング（37℃、50rpm 、一晩）した。対象とな
る病原菌についてはトリプチケースソイブロース（TS
B）またはＭ−９培地を用いて35Ｓ−メチオニン（放射
活性10ml/74MBq）により代謝ラベル（37℃、150rpm,12-
24時間）した。その後、病原菌を、１％牛血清アルブミ
ン（BSA）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS;pH7.0）
により遠心洗浄（３回、6,000rpm、5分）した。場合に
より、その後、被検定蛋白画分を含む１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓに浸漬し、３７℃において３０分間保持することによ
り前処理を行った。一方、シリカゲルプレートを、１％
ＢＳＡ−ＰＢＳにより３回洗浄し（50rpm、10分）、場
合によってはそのまま、または、必要な場合には、同様
に被検定蛋白画分を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより、３
７℃において３０分間保持することにより前処理を行
い、その後、これを吸引して除いた。次いで、被検定蛋
白画分を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより前処理をしたラ
ベル病原菌、または前処理を施さない病原菌を加え、３
７℃にて１時間オーバーレイ（50rpm）を行った。オー
バーレイは、旋回式のシェーカーを用いて１０mlの病原
菌懸濁液とＴＬＣプレートを合わせて旋回させて行っ
た。オーバーレイ後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより６回洗
浄し（50rpm、３分）、風乾した後、オートラジオグラ
ムをとった。必要に応じ、デンシトメトリーにて定量化
した後、被検定蛋白画分の阻害活性を主として、ＩＣ50
値にて判定した。ＩＣ50値は次の数１式の値を５０とす
る場合の被検物質の濃度である。
onberg）の方法（Karlsson K.A.,Stronberg N, Methods
in Enzymology Vol.138,220-232,(1987)）に準じた方
法である。アシアロＧＭ１（５μｇ）をスポットし、こ
れを展開（クロロホルム：メタノール：水＝６０：４
０：９）したシリカゲルプレートを風乾した後、一旦水
に浸漬し、その後、１％のゼラチン（ELISA-グレード、
バイオラッド社製）を含むトリス緩衝化生理食塩水（10
mMTris-150mMNaCl-0.04%アジ化ナトリウム;pH8.0）によ
りブロッキング（37℃、50rpm 、一晩）した。対象とな
る病原菌についてはトリプチケースソイブロース（TS
B）またはＭ−９培地を用いて35Ｓ−メチオニン（放射
活性10ml/74MBq）により代謝ラベル（37℃、150rpm,12-
24時間）した。その後、病原菌を、１％牛血清アルブミ
ン（BSA）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS;pH7.0）
により遠心洗浄（３回、6,000rpm、5分）した。場合に
より、その後、被検定蛋白画分を含む１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓに浸漬し、３７℃において３０分間保持することによ
り前処理を行った。一方、シリカゲルプレートを、１％
ＢＳＡ−ＰＢＳにより３回洗浄し（50rpm、10分）、場
合によってはそのまま、または、必要な場合には、同様
に被検定蛋白画分を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより、３
７℃において３０分間保持することにより前処理を行
い、その後、これを吸引して除いた。次いで、被検定蛋
白画分を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより前処理をしたラ
ベル病原菌、または前処理を施さない病原菌を加え、３
７℃にて１時間オーバーレイ（50rpm）を行った。オー
バーレイは、旋回式のシェーカーを用いて１０mlの病原
菌懸濁液とＴＬＣプレートを合わせて旋回させて行っ
た。オーバーレイ後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより６回洗
浄し（50rpm、３分）、風乾した後、オートラジオグラ
ムをとった。必要に応じ、デンシトメトリーにて定量化
した後、被検定蛋白画分の阻害活性を主として、ＩＣ50
値にて判定した。ＩＣ50値は次の数１式の値を５０とす
る場合の被検物質の濃度である。
【００２１】
【数１】付着阻害強度＝１００×（１−被検物質存在下
での付着強度／被検物質非存在下での付着強度）
での付着強度／被検物質非存在下での付着強度）
【００２２】尚、抗ロタウイルス付着活性に関しては、
ヨードビーズを使用したNa-125Iラベルを行う、ウィロ
ービ（Willoughby）らの方法（J.Virology,64(10),4830
-4835(1990)）に準じてオーバーレイアッセイを行い、
同様に評価することができた。
ヨードビーズを使用したNa-125Iラベルを行う、ウィロ
ービ（Willoughby）らの方法（J.Virology,64(10),4830
-4835(1990)）に準じてオーバーレイアッセイを行い、
同様に評価することができた。
【００２３】（Ｃ）細胞結合阻害アッセイ 本方法は、ロークス（Laux）D.C.らの方法（J.Microbio
logical Methods,Vol.2,27-39,(1984)）に準じた方法で
ある。アシアロＧＭ１が細胞表面に高密度に発現してい
ることが確認されている回盲部アデノカルシノーマ細胞
株ＨＣＴ−８（ATCC CCL224）を検定細胞として用い
た。このＨＣＴ−８細胞は、ＡＴＣＣの培養指針に従っ
て、１００U/mlペニシリンＧ、１００mg/mlストレプト
マイシン、１０％牛胎児血清（FCS）を含む２５mMＨＥ
ＰＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ１６４０（HEPES-RPMI-FCS）にて
継代培養した。アッセイには２４穴カルチャープレート
（コスター社製）を用いた。通常、１ウェル当たり１×
１０5の細胞（1ml）をシードし、加湿された５％炭酸ガ
ス雰囲気下で、３７℃において４８−７２時間培養し、
コンフリュエントの状態にした。次いで、コンフリュエ
ントの状態に達した細胞を、温めた１mlの２５mMＨＥＰ
ＥＳ緩衝化ＨＡＮＫ'Ｓ ＢＳＳ（HEPES-HANK'S)により
洗浄した後、０.５mlの５％ＢＳＡ−ＰＢＳを加えて１
時間ブロッキングした。１mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'
Ｓにより２回洗浄した後、さらに、目的蛋白画分を含む
０.５mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３０分間プレ
インキュベート（コントロールはHEPES-HANK'Sのみ）し
た。これを、アスピレートした後、35Ｓ−メチオニン
（10ml/74MBq）により代謝ラベルした病原菌（1X109cfu
/0.5mlHEPES-HANK'S) を加え（ある場合には病原菌自体
も、目的蛋白画分を含む０.５mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮ
Ｋ'Ｓにより３０分間プレインキュベートしておく）、
約２時間インキュベートして、付着を完了させた。１.
０mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより６回洗浄した
後、０.５mlの１％ＳＤＳを含む０.１ＮNaOHを用い３７
℃にて１時間インキュベートした。その後、全てを１０
mlのシンチレーションカクテル（Ready Protein+,ベッ
クマン社製）に加え、ベータ線の放射活性より付着菌数
を測定した。阻害活性はオーバーレイアッセイと同様の
計算方法でＩＣ50値を求めた。
logical Methods,Vol.2,27-39,(1984)）に準じた方法で
ある。アシアロＧＭ１が細胞表面に高密度に発現してい
ることが確認されている回盲部アデノカルシノーマ細胞
株ＨＣＴ−８（ATCC CCL224）を検定細胞として用い
た。このＨＣＴ−８細胞は、ＡＴＣＣの培養指針に従っ
て、１００U/mlペニシリンＧ、１００mg/mlストレプト
マイシン、１０％牛胎児血清（FCS）を含む２５mMＨＥ
ＰＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ１６４０（HEPES-RPMI-FCS）にて
継代培養した。アッセイには２４穴カルチャープレート
（コスター社製）を用いた。通常、１ウェル当たり１×
１０5の細胞（1ml）をシードし、加湿された５％炭酸ガ
ス雰囲気下で、３７℃において４８−７２時間培養し、
コンフリュエントの状態にした。次いで、コンフリュエ
ントの状態に達した細胞を、温めた１mlの２５mMＨＥＰ
ＥＳ緩衝化ＨＡＮＫ'Ｓ ＢＳＳ（HEPES-HANK'S)により
洗浄した後、０.５mlの５％ＢＳＡ−ＰＢＳを加えて１
時間ブロッキングした。１mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'
Ｓにより２回洗浄した後、さらに、目的蛋白画分を含む
０.５mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３０分間プレ
インキュベート（コントロールはHEPES-HANK'Sのみ）し
た。これを、アスピレートした後、35Ｓ−メチオニン
（10ml/74MBq）により代謝ラベルした病原菌（1X109cfu
/0.5mlHEPES-HANK'S) を加え（ある場合には病原菌自体
も、目的蛋白画分を含む０.５mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮ
Ｋ'Ｓにより３０分間プレインキュベートしておく）、
約２時間インキュベートして、付着を完了させた。１.
０mlのＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより６回洗浄した
後、０.５mlの１％ＳＤＳを含む０.１ＮNaOHを用い３７
℃にて１時間インキュベートした。その後、全てを１０
mlのシンチレーションカクテル（Ready Protein+,ベッ
クマン社製）に加え、ベータ線の放射活性より付着菌数
を測定した。阻害活性はオーバーレイアッセイと同様の
計算方法でＩＣ50値を求めた。
【００２４】尚、抗ロタウイルス付着活性については、
ＨＣＴ−８細胞を標的として用いた上で、ウィロービ
（Willoughby）らの方法（J.Virology,64(10),4830-483
5 (1990)）に従ってアッセイを行い、付着阻害活性を測
定した。
ＨＣＴ−８細胞を標的として用いた上で、ウィロービ
（Willoughby）らの方法（J.Virology,64(10),4830-483
5 (1990)）に従ってアッセイを行い、付着阻害活性を測
定した。
【００２５】（１）ラクトバシルス アシドフィルス コ
ンプレックスの糖脂質結合性 ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスの各種
糖脂質に対する結合性を、ＴＬＣオーバーレイアッセイ
で確認した。受容体がアシアロＧＭ１のみであることを
示すために、受容体として認識される糖脂質として、ア
シアロＧＭ１（５μｇ）、アシアロＧＭ２（５μｇ）、
ガングリオシド混合物（２０μｇ）、グロボシド混合物
（２０μｇ）、グロボトリアオシルセラミド（５μｇ）
及びホスファチジルコリン（５μｇ）を展開して、結合
性を確認した。展開した糖脂質をオルシノール発色によ
り検出したパターンを図１に示す。各レーンは、１がア
シアロＧＭ１を、２がアシアロＧＭ２を、３がガングリ
オシド混合物を、４がグロボシド混合物を、５がグロボ
テトラオシルセラミドを、６がホスファチジルコリンを
展開したものを示す。また、代表的な菌株であるラクト
バシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２株、ラクトバ
シラス ガセリＳＢＴ１２６５株、ラクトバシラス アミ
ロボラスＳＢＴ１２６９株及びラクトバシラス クリス
パタスＳＢＴ１２６４株の結合性を図２に示す。各レー
ンは、１がアシアロＧＭ１を、２がアシアロＧＭ２を、
３がガングリオシド混合物を、４がグロボシド混合物
を、５がグロボテトラオシルセラミドを、６がホスファ
チジルコリンを展開したものを示す。図２から明らかで
あるように、これらのラクトバシルス アシドフィルス
コンプレックスに属する微生物は、いずれもアシアロＧ
Ｍ１にのみ結合した。
ンプレックスの糖脂質結合性 ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスの各種
糖脂質に対する結合性を、ＴＬＣオーバーレイアッセイ
で確認した。受容体がアシアロＧＭ１のみであることを
示すために、受容体として認識される糖脂質として、ア
シアロＧＭ１（５μｇ）、アシアロＧＭ２（５μｇ）、
ガングリオシド混合物（２０μｇ）、グロボシド混合物
（２０μｇ）、グロボトリアオシルセラミド（５μｇ）
及びホスファチジルコリン（５μｇ）を展開して、結合
性を確認した。展開した糖脂質をオルシノール発色によ
り検出したパターンを図１に示す。各レーンは、１がア
シアロＧＭ１を、２がアシアロＧＭ２を、３がガングリ
オシド混合物を、４がグロボシド混合物を、５がグロボ
テトラオシルセラミドを、６がホスファチジルコリンを
展開したものを示す。また、代表的な菌株であるラクト
バシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２株、ラクトバ
シラス ガセリＳＢＴ１２６５株、ラクトバシラス アミ
ロボラスＳＢＴ１２６９株及びラクトバシラス クリス
パタスＳＢＴ１２６４株の結合性を図２に示す。各レー
ンは、１がアシアロＧＭ１を、２がアシアロＧＭ２を、
３がガングリオシド混合物を、４がグロボシド混合物
を、５がグロボテトラオシルセラミドを、６がホスファ
チジルコリンを展開したものを示す。図２から明らかで
あるように、これらのラクトバシルス アシドフィルス
コンプレックスに属する微生物は、いずれもアシアロＧ
Ｍ１にのみ結合した。
【００２６】（２）大腸菌の糖脂質結合性 通常の大腸菌（E.coli SBT 3254）及び病原性大腸菌
（E.coli SBT3275(Pb176:CFA/II(CS1+CS3))）の糖脂質
結合性を同様に確認した。結果を図３に示す。各レーン
は、１がアシアロＧＭ１を、２がアシアロＧＭ２を、３
がガングリオシド混合物を、４がグロボシド混合物を、
５がグロボテトラオシルセラミド（５μｇ）を、６がホ
スファチジルコリン（５μｇ）を展開したものを示す。
図３から明らかであるように、両株ともに、アシアロＧ
Ｍ１に選択的な結合性を示した。
（E.coli SBT3275(Pb176:CFA/II(CS1+CS3))）の糖脂質
結合性を同様に確認した。結果を図３に示す。各レーン
は、１がアシアロＧＭ１を、２がアシアロＧＭ２を、３
がガングリオシド混合物を、４がグロボシド混合物を、
５がグロボテトラオシルセラミド（５μｇ）を、６がホ
スファチジルコリン（５μｇ）を展開したものを示す。
図３から明らかであるように、両株ともに、アシアロＧ
Ｍ１に選択的な結合性を示した。
【００２７】（３）アシアロＧＭ１への大腸菌の結合阻
害 上記（１）と同様にして、アシアロＧＭ１をＴＬＣ上に
展開し、ブロッキング処理を行った。次いで、ペニシリ
ン及びストレプトマイシンにて殺菌処理を施したラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックス（L.acidophi
lus SBT 2062株、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１２６
５株、ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９株
及びラクトバシラス クリスパタスＳＢＴ１２６４）
を、２×１０9／mlPBS-１％BSA濃度でＴＬＣ上に加え、
５０rpmの速度で回転させながら、３７℃で１時間イン
キュベーションした。このＴＬＣプレートに35Ｓ−メチ
オニンで標識した病原性大腸菌（E.coli Pb176）を終濃
度２×１０9／mlとなるように加え、さらに１.５時間イ
ンキュベートした。その後、洗浄、風乾し、オートラジ
オグラムを取った。結果を図４に示す。各レーンは、１
がアシアロＧＭ１（１０μｇ）を、２がアシアロＧＭ１
（５μｇ）を、３がアシアロＧＭ１（２.５μｇ）を、
４がアシアロＧＭ１（１.２５μｇ）を示す。図４に示
されるように、試験を行ったラクトバシラス アシドフ
ィルス コンプレックスに属する微生物はいずれも、病
原性大腸菌（E.coli SBT3275(Pb176:CFA/II(CS1+CS
3))）がアシアロＧＭ１へ結合する現象を阻害した。同
様にして、上記菌株の生菌体を用いた試験においても、
各菌株は同様に、大腸菌のアシアロＧＭ１への結合を阻
害した。
害 上記（１）と同様にして、アシアロＧＭ１をＴＬＣ上に
展開し、ブロッキング処理を行った。次いで、ペニシリ
ン及びストレプトマイシンにて殺菌処理を施したラクト
バシラス アシドフィルス コンプレックス（L.acidophi
lus SBT 2062株、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１２６
５株、ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９株
及びラクトバシラス クリスパタスＳＢＴ１２６４）
を、２×１０9／mlPBS-１％BSA濃度でＴＬＣ上に加え、
５０rpmの速度で回転させながら、３７℃で１時間イン
キュベーションした。このＴＬＣプレートに35Ｓ−メチ
オニンで標識した病原性大腸菌（E.coli Pb176）を終濃
度２×１０9／mlとなるように加え、さらに１.５時間イ
ンキュベートした。その後、洗浄、風乾し、オートラジ
オグラムを取った。結果を図４に示す。各レーンは、１
がアシアロＧＭ１（１０μｇ）を、２がアシアロＧＭ１
（５μｇ）を、３がアシアロＧＭ１（２.５μｇ）を、
４がアシアロＧＭ１（１.２５μｇ）を示す。図４に示
されるように、試験を行ったラクトバシラス アシドフ
ィルス コンプレックスに属する微生物はいずれも、病
原性大腸菌（E.coli SBT3275(Pb176:CFA/II(CS1+CS
3))）がアシアロＧＭ１へ結合する現象を阻害した。同
様にして、上記菌株の生菌体を用いた試験においても、
各菌株は同様に、大腸菌のアシアロＧＭ１への結合を阻
害した。
【００２８】（４）ＨＣＴ−８細胞への大腸菌の結合阻
害 ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２による
拮抗阻害について、検討を行った。ＨＣＴ−８細胞の成
育したウエルに、５×１０8、１×１０9、２×１０9、
４×１０9／mlの濃度になるように、ラクトバシラス ア
シドフィルスＳＢＴ２０６２の生菌体を加え、３７℃で
０.５時間インキュベーションを行った。その後、ラク
トバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２生菌体懸濁
液を新しいものと交換した上で、これに35Ｓ-メチオニ
ン標識病原性大腸菌（E.coli Pb176)を最終濃度が２×
１０9／mlとなるように加え、さらに１時間インキュベ
ートした。細胞を６回洗浄した後、常法通り溶解し、放
射活性の測定を行い、放射活性を指標として大腸菌の結
合を阻害する効果を確認した。測定結果を図５に示す。
処理１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそのま
ま加えた場合の結合を、処理２は、５×１０8／mlのラ
クトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存さ
せた場合の結合を、処理３は、１×１０9／mlのラクト
バシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存させた
場合の結合を、処理４は、２×１０9／mlのラクトバシ
ラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存させた場合
の結合を、処理５は、４×１０9／mlのラクトバシラス
アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存させた場合の結合
を、処理６は、細胞なしの場合の結合を示す。データ
は、１２回の測定結果を箱髭図で示す。図５に示される
ように、ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６
２は、病原性大腸菌の付着を阻害することが明らかであ
る。
害 ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２による
拮抗阻害について、検討を行った。ＨＣＴ−８細胞の成
育したウエルに、５×１０8、１×１０9、２×１０9、
４×１０9／mlの濃度になるように、ラクトバシラス ア
シドフィルスＳＢＴ２０６２の生菌体を加え、３７℃で
０.５時間インキュベーションを行った。その後、ラク
トバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２生菌体懸濁
液を新しいものと交換した上で、これに35Ｓ-メチオニ
ン標識病原性大腸菌（E.coli Pb176)を最終濃度が２×
１０9／mlとなるように加え、さらに１時間インキュベ
ートした。細胞を６回洗浄した後、常法通り溶解し、放
射活性の測定を行い、放射活性を指標として大腸菌の結
合を阻害する効果を確認した。測定結果を図５に示す。
処理１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそのま
ま加えた場合の結合を、処理２は、５×１０8／mlのラ
クトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存さ
せた場合の結合を、処理３は、１×１０9／mlのラクト
バシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存させた
場合の結合を、処理４は、２×１０9／mlのラクトバシ
ラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存させた場合
の結合を、処理５は、４×１０9／mlのラクトバシラス
アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存させた場合の結合
を、処理６は、細胞なしの場合の結合を示す。データ
は、１２回の測定結果を箱髭図で示す。図５に示される
ように、ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６
２は、病原性大腸菌の付着を阻害することが明らかであ
る。
【００２９】同様に、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１
２６５、ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９
及びラクトバシラス クリスパタスＳＢＴ１２６４につ
いても測定を行い、同様な結果を得た。これを図６に示
す。処理１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそ
のまま加えた場合の結合を、処理２は、５×１０8／ml
のラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９と共存
させた場合の結合を、処理３は、５×１０8／mlのラク
トバシラス ガセリＳＢＴ１２６５と共存させた場合の
結合を、処理４は、５×１０8／mlのラクトバシラス ク
リスパタスＳＢＴ１２６４と共存させた場合の結合を、
処理５は、細胞なしの場合の結合を示す。また、データ
は、１２回の測定結果を箱髭図で示した。図６に示され
るように、いずれの菌も強い付着阻害活性を示た。さら
に、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスに
属するその他の細菌について試験を行ったが、いずれの
菌種も同様の大腸菌の付着阻害効果を有することを確認
した。
２６５、ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９
及びラクトバシラス クリスパタスＳＢＴ１２６４につ
いても測定を行い、同様な結果を得た。これを図６に示
す。処理１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそ
のまま加えた場合の結合を、処理２は、５×１０8／ml
のラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９と共存
させた場合の結合を、処理３は、５×１０8／mlのラク
トバシラス ガセリＳＢＴ１２６５と共存させた場合の
結合を、処理４は、５×１０8／mlのラクトバシラス ク
リスパタスＳＢＴ１２６４と共存させた場合の結合を、
処理５は、細胞なしの場合の結合を示す。また、データ
は、１２回の測定結果を箱髭図で示した。図６に示され
るように、いずれの菌も強い付着阻害活性を示た。さら
に、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスに
属するその他の細菌について試験を行ったが、いずれの
菌種も同様の大腸菌の付着阻害効果を有することを確認
した。
【００３０】（５）ＨＣＴ−８細胞への大腸菌の結合阻
害（ラクトバシラス アシドフィルスコンプレックス死
菌の効果 上記（４）の効果が、代謝産物（特に有機酸）を介さず
に生じていることを確認するために、ペニシリン及びス
トレプトマイシンにより殺菌処理を施したラクトバシラ
ス アシドフィルスＳＢＴ２０６２を用いて、上記
（４）と同様の試験を実施した。尚、殺菌処理は、１ml
当たり５０００IUのペニシリンＧまたは５０００μｇの
ストレプトマイシンを含むＰＢＳを調製し、これに菌体
を懸濁して１晩、３７℃にて保持し、これを殺菌水で洗
浄する方法を採用した。死菌体を用いる以外の操作は、
上記（４）と同様に操作を行った。結果を図７に示す。
処理１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそのま
ま加えたときの結合を、処理２は、５×１０8／mlのラ
クトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存さ
せた場合の結合を、処理３は、１×１０9／mlと共存さ
せた場合の結合を、処理４は、２×１０9／mlと共存さ
せた場合の結合を、処理５は、４×１０9／mlと結合さ
せた場合の結合を、処理６は、細胞なしの場合の結合を
示す。データは、１２回の測定結果を箱髭図で示す。図
７に示される結果から、ラクトバシラス アシドフィル
スＳＢＴ２０６２株の菌体が、病原性大腸菌のＨＣＴ−
８細胞への結合を阻害することが確認できた。
害（ラクトバシラス アシドフィルスコンプレックス死
菌の効果 上記（４）の効果が、代謝産物（特に有機酸）を介さず
に生じていることを確認するために、ペニシリン及びス
トレプトマイシンにより殺菌処理を施したラクトバシラ
ス アシドフィルスＳＢＴ２０６２を用いて、上記
（４）と同様の試験を実施した。尚、殺菌処理は、１ml
当たり５０００IUのペニシリンＧまたは５０００μｇの
ストレプトマイシンを含むＰＢＳを調製し、これに菌体
を懸濁して１晩、３７℃にて保持し、これを殺菌水で洗
浄する方法を採用した。死菌体を用いる以外の操作は、
上記（４）と同様に操作を行った。結果を図７に示す。
処理１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそのま
ま加えたときの結合を、処理２は、５×１０8／mlのラ
クトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２と共存さ
せた場合の結合を、処理３は、１×１０9／mlと共存さ
せた場合の結合を、処理４は、２×１０9／mlと共存さ
せた場合の結合を、処理５は、４×１０9／mlと結合さ
せた場合の結合を、処理６は、細胞なしの場合の結合を
示す。データは、１２回の測定結果を箱髭図で示す。図
７に示される結果から、ラクトバシラス アシドフィル
スＳＢＴ２０６２株の菌体が、病原性大腸菌のＨＣＴ−
８細胞への結合を阻害することが確認できた。
【００３１】同様に、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１
２６５、ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９
及びラクトバシラス クリスパタスＳＢＴ１２６４の死
菌体についても検討を行った。結果を図８に示す。処理
１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそのまま加
えた場合の結合を、処理２は、５×１０8／mlのラクト
バシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９と共存させた場
合の結合を、処理３は、５×１０8／mlのラクトバシラ
ス ガセリＳＢＴ１２６５と共存させた場合の結合を、
処理４は、５×１０8／mlのラクトバシラス クリスパタ
スＳＢＴ１２６４と共存させた場合の結合を、処理５
は、細胞なしの場合の結合を示す。また、データは、１
２回の測定結果を箱髭図で示した。図８に示されるよう
に、いずれの菌も強い大腸菌付着阻害活性を示した。さ
らに、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス
に属するその他の細菌について、検討を行ったが、いず
れの菌種にも同様な効果を確認した。
２６５、ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９
及びラクトバシラス クリスパタスＳＢＴ１２６４の死
菌体についても検討を行った。結果を図８に示す。処理
１は、２.５×１０9／mlのE.coli SBT3275をそのまま加
えた場合の結合を、処理２は、５×１０8／mlのラクト
バシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９と共存させた場
合の結合を、処理３は、５×１０8／mlのラクトバシラ
ス ガセリＳＢＴ１２６５と共存させた場合の結合を、
処理４は、５×１０8／mlのラクトバシラス クリスパタ
スＳＢＴ１２６４と共存させた場合の結合を、処理５
は、細胞なしの場合の結合を示す。また、データは、１
２回の測定結果を箱髭図で示した。図８に示されるよう
に、いずれの菌も強い大腸菌付着阻害活性を示した。さ
らに、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス
に属するその他の細菌について、検討を行ったが、いず
れの菌種にも同様な効果を確認した。
【００３２】（６）ＨＣＴ−８細胞への大腸菌の結合阻
害（ラクトバシラス アシドフィルスコンプレックス）
死菌の前処理による効果 上記の阻害作用は、ラクトバシラス アシドフィルス コ
ンプレックス細菌の死菌体の細胞への付着によることを
確認するための試験を行った。最初に、細胞をラクトバ
シラス アシドフィルス コンプレックス細菌の死菌体に
より処理した上で、一旦洗浄し、その後、病原性大腸菌
で処理を行った。その結果、死菌体の前処理によっての
みでも、病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着阻害効
果が生じることを確認した。結果を図９に示す。２.５
×１０9／mlのE.coli SBT3275の処理に先だって、処理
１は、前処理をしない場合の結合を、処理２は、５×１
０8／mlのラクトバシラス アシドフィラスＳＢＴ２０６
２と共存させた場合の結合を、処理３は、５×１０8／m
lのラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９と共存
させた場合の結合を、処理４は、５×１０8／mlのラク
トバシラス ガセリＳＢＴ１２６５と共存させた場合の
結合を、処理５は、５×１０8／mlのラクトバシラス ク
リスパタスＳＢＴ１２６４と共存させた場合の結合を、
処理６は細胞なしの場合の結合を示す。また、データ
は、１２回の測定結果を箱髭図で示した。
害（ラクトバシラス アシドフィルスコンプレックス）
死菌の前処理による効果 上記の阻害作用は、ラクトバシラス アシドフィルス コ
ンプレックス細菌の死菌体の細胞への付着によることを
確認するための試験を行った。最初に、細胞をラクトバ
シラス アシドフィルス コンプレックス細菌の死菌体に
より処理した上で、一旦洗浄し、その後、病原性大腸菌
で処理を行った。その結果、死菌体の前処理によっての
みでも、病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着阻害効
果が生じることを確認した。結果を図９に示す。２.５
×１０9／mlのE.coli SBT3275の処理に先だって、処理
１は、前処理をしない場合の結合を、処理２は、５×１
０8／mlのラクトバシラス アシドフィラスＳＢＴ２０６
２と共存させた場合の結合を、処理３は、５×１０8／m
lのラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６９と共存
させた場合の結合を、処理４は、５×１０8／mlのラク
トバシラス ガセリＳＢＴ１２６５と共存させた場合の
結合を、処理５は、５×１０8／mlのラクトバシラス ク
リスパタスＳＢＴ１２６４と共存させた場合の結合を、
処理６は細胞なしの場合の結合を示す。また、データ
は、１２回の測定結果を箱髭図で示した。
【００３３】（７）ラクトバシラス アシドフィルス コ
ンプレックス細胞壁成分の病原性大腸菌付着阻害効果） マタレリ（Mattarelli）P.らの方法（Mattarelli P. et
al., Res. Microbiology,Vol.144,581-593,(1993)）に
従って、細胞壁画分の調製を行った。ラクトバシラス
アシドフィルス コンプレックスに属する各微生物ラク
トバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２、ラクトバ
シラス ガセリＳＢＴ１２６５、ラクトバシラス アミロ
ボラスＳＢＴ１２６９及びラクトバシラス クリスパタ
スＳＢＴ１２６４を培養し、常法により菌体を回収し、
この菌体を洗浄後超音波処理に付し、菌体を破砕し、３
０００rpmで１０分間遠心分離することによって、未破
砕の菌体を除去し、上清を５０００rpmで５時間超遠心
して細胞壁画分を回収した。この細胞壁画分を凍結乾燥
処理した後、下記の試験(A)及び(B)に用いた。
ンプレックス細胞壁成分の病原性大腸菌付着阻害効果） マタレリ（Mattarelli）P.らの方法（Mattarelli P. et
al., Res. Microbiology,Vol.144,581-593,(1993)）に
従って、細胞壁画分の調製を行った。ラクトバシラス
アシドフィルス コンプレックスに属する各微生物ラク
トバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６２、ラクトバ
シラス ガセリＳＢＴ１２６５、ラクトバシラス アミロ
ボラスＳＢＴ１２６９及びラクトバシラス クリスパタ
スＳＢＴ１２６４を培養し、常法により菌体を回収し、
この菌体を洗浄後超音波処理に付し、菌体を破砕し、３
０００rpmで１０分間遠心分離することによって、未破
砕の菌体を除去し、上清を５０００rpmで５時間超遠心
して細胞壁画分を回収した。この細胞壁画分を凍結乾燥
処理した後、下記の試験(A)及び(B)に用いた。
【００３４】 (A) アシアロＧＭ１への大腸菌付着阻害効果 ５μｇのアシアロＧＭ１のＴＬＣを行い、このＴＬＣプ
レートを用いたＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイを行っ
た。標識化した大腸菌の付着量をオートラジオグラムの
黒変化によってデンシトメトリーで測定した。測定値
は、細胞壁画分を添加しない場合を１００とした相対値
を求め、３回の実験の平均値で表した。結果を下記表１
に示す。
レートを用いたＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイを行っ
た。標識化した大腸菌の付着量をオートラジオグラムの
黒変化によってデンシトメトリーで測定した。測定値
は、細胞壁画分を添加しない場合を１００とした相対値
を求め、３回の実験の平均値で表した。結果を下記表１
に示す。
【００３５】
【表１】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス細胞壁画分の 病原性大腸菌のアシアロＧＭ１への付着阻害率 ---------------------------------------------------------------- 添加細胞壁画分濃度（mg/ml） 0 2.5 5 10 ---------------------------------------------------------------- L.acidophilus SBT2062 100 83 65 38 L.gasseri SBT1265 100 93 71 48 L.amylovorus SBT1269 100 79 53 32 L.crispatus SBT1264 100 86 61 42 ----------------------------------------------------------------
【００３６】 (B) ＨＣＴ−８細胞への大腸菌付着阻害効果 ＨＣＴ−８細胞を培養したウエルに細胞壁成分を加え、
大腸菌の付着阻害を測定した。前記のＨＣＴ−８細胞へ
の付着阻害実験と同様に操作を行い、放射活性を測定し
た。測定結果は、無添加の場合を１００とした相対値を
求め、８回の実験の平均値で表した。結果を下記表２に
示す。
大腸菌の付着阻害を測定した。前記のＨＣＴ−８細胞へ
の付着阻害実験と同様に操作を行い、放射活性を測定し
た。測定結果は、無添加の場合を１００とした相対値を
求め、８回の実験の平均値で表した。結果を下記表２に
示す。
【００３７】
【表２】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス細胞壁画分の 病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着阻害率 ------------------------------------------------------------------- 添加細胞壁画分濃度（mg/ml） 0 2.5 5 10 ------------------------------------------------------------------- L.acidophilus SBT2062 100 78 61 28 L.gasseri SBT1265 100 72 59 41 L.amylovorus SBT1269 100 83 63 35 L.crispatus SBT1264 100 81 69 39 -------------------------------------------------------------------
【００３８】（８）ラクトバシラス アシドフィルス コ
ンプレックス表面粗蛋白質画分の病原性大腸菌付着阻害
効果） 培養後、回収、洗浄した菌体を、ペニシリン−ストレプ
トマイシン処理により菌体を殺菌処理した。このペニシ
リン−ストレプトマイシン処理菌体より、ロータル（Lo
rtal）S.らの方法（Lortal S.,et al.,Journal of Gene
ral Microbiology, Vol.138,611-618,(1992)）に従っ
て、菌体の湿重量の５倍量の５ＭLiClを加え、４℃で１
５分間振盪抽出した。蛋白質は白色沈殿として得られ、
蛋白質画分を透析し、次いで蛋白質濃度を５mg／mlに調
整した。この蛋白質画分を凍結乾燥処理した後、下記の
試験(A)及び(B)に用いた。
ンプレックス表面粗蛋白質画分の病原性大腸菌付着阻害
効果） 培養後、回収、洗浄した菌体を、ペニシリン−ストレプ
トマイシン処理により菌体を殺菌処理した。このペニシ
リン−ストレプトマイシン処理菌体より、ロータル（Lo
rtal）S.らの方法（Lortal S.,et al.,Journal of Gene
ral Microbiology, Vol.138,611-618,(1992)）に従っ
て、菌体の湿重量の５倍量の５ＭLiClを加え、４℃で１
５分間振盪抽出した。蛋白質は白色沈殿として得られ、
蛋白質画分を透析し、次いで蛋白質濃度を５mg／mlに調
整した。この蛋白質画分を凍結乾燥処理した後、下記の
試験(A)及び(B)に用いた。
【００３９】(A)ＴＬＣオーバーレイ阻害活性 ５μｇのアシアロＧＭ１をＴＬＣを行い、そのＴＬＣプ
レートを用いたＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイを行っ
た。標識化した大腸菌の付着量を、オートラジオグラム
の黒変化をデンシトメトリーで測定することにより求め
た。測定値は、細胞壁画分を添加しない場合を１００と
した相対値を求め、３回の実験の平均値で表した。結果
を表３に示す。
レートを用いたＴＬＣオーバーレイ阻害アッセイを行っ
た。標識化した大腸菌の付着量を、オートラジオグラム
の黒変化をデンシトメトリーで測定することにより求め
た。測定値は、細胞壁画分を添加しない場合を１００と
した相対値を求め、３回の実験の平均値で表した。結果
を表３に示す。
【００４０】
【表３】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスの表面蛋白質粗画分 の病原性大腸菌のアシアロＧＭ１への付着阻害効果 -------------------------------------------------------------- 添加表層蛋白画分濃度（mg/ml） 0 0.63 1.25 2.5 -------------------------------------------------------------- L.acidophilus SBT2062 100 86 67 44 L.gasseri SBT1265 100 91 73 59 L.amylovorus SBT1269 100 89 87 61 L.crispatus SBT1264 100 85 62 25 --------------------------------------------------------------
【００４１】(B)ＨＣＴ−８細胞への大腸菌付着阻害効
果 ＨＣＴ−８細胞を培養したウエルに抽出蛋白質を加え、
大腸菌の付着阻害を測定した。前記のＨＣＴ−８細胞へ
の付着阻害実験と同様に操作を行い、放射活性を測定し
た。測定結果は、無添加の場合を１００とした相対値を
求め、８回の実験の平均値で表した。結果を表４に示
す。
果 ＨＣＴ−８細胞を培養したウエルに抽出蛋白質を加え、
大腸菌の付着阻害を測定した。前記のＨＣＴ−８細胞へ
の付着阻害実験と同様に操作を行い、放射活性を測定し
た。測定結果は、無添加の場合を１００とした相対値を
求め、８回の実験の平均値で表した。結果を表４に示
す。
【００４２】
【表４】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス表面蛋白質画分の 病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着阻害率 --------------------------------------------------------------- 添加表層蛋白画分濃度（mg/ml） 0 0.63 1.25 2.5 --------------------------------------------------------------- L.acidophilus SBT2062 100 86 63 49 L.gasseri SBT1265 100 90 72 60 L.amylovorus SBT1269 100 92 81 58 L.crispatus SBT1264 100 88 78 55 ---------------------------------------------------------------
【００４３】以上の結果から、ラクトバシラス アシド
フィルス コンプレックスの病原性微生物付着阻止作用
は、菌体に存在し、特に、菌体の細胞壁表面の蛋白質が
必要であることが判明した。
フィルス コンプレックスの病原性微生物付着阻止作用
は、菌体に存在し、特に、菌体の細胞壁表面の蛋白質が
必要であることが判明した。
【００４４】試験例２ 本試験例では、ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスの大腸菌付着阻害効果について、抗体を用いて
解析した結果について示す。 （１）抗ＧＡ１抗体による細胞前処理と病原性大腸菌の
ＨＣＴ−８細胞への付着最初に、ＨＣＴ−８細胞に対す
る病原性大腸菌（E.coli Pb176:CFA/II(CS1+CS3)）の付
着受容体であるアシアロＧＭ１に対する抗体である抗ア
シアロＧＭ１抗体により、ＨＣＴ−８細胞を前処理し、
その結合に及ぼす影響を評価した。市販のウサギ抗アシ
アロＧＭ１抗血清（和光純薬（米）社製）を用い、その
アシアロＧＭ１に対する特異性を確認した。各種糖脂質
（５μg）をシリカゲルプレートを用いてＴＬＣを行い
（クロロホルム：メタノール：水＝６５：２４：４）、
５％ＢＳＡ−ＰＢＳにてブロッキングした後、ウサギ抗
アシアロＧＭ１抗血清及び通常ウサギ血清（コントロー
ル）により処理（37℃、1時間、1%BSA-0.05%Tween20-PB
Sにより1:100に希釈）した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより
５回洗浄（50ｒpm、37℃、5分）した後、アルカリフォ
スファターゼラベル羊抗ウサギＩｇＧにて同様に処理し
た。次いで、同様に洗浄した後、常法に従って発色させ
た。結果を図１０に示す。図１０において、レーン１
は、ガラクトシルセラミドの場合を、２はラクトシルセ
ラミドの場合を、３はグロボトリオシルセラミドの場合
を、４はグロボテトラオシルセラミドの場合を、５はア
シアロＧＭ２の場合を、６はアシアロＧＭ１の場合を、
７はホスファチジルコリンの場合を示す。図１０に示さ
れるように、抗アシアロＧＭ１抗血清は、アシアロＧＭ
１に特異的であることが確認できた。尚、図１０の左図
に示されるように、コントロールとして用いた同希釈率
（1:100）の通常ウサギ血清（シグマ化学社製：脱塩後
使用）は、いずれの糖脂質とも反応しなかった。
レックスの大腸菌付着阻害効果について、抗体を用いて
解析した結果について示す。 （１）抗ＧＡ１抗体による細胞前処理と病原性大腸菌の
ＨＣＴ−８細胞への付着最初に、ＨＣＴ−８細胞に対す
る病原性大腸菌（E.coli Pb176:CFA/II(CS1+CS3)）の付
着受容体であるアシアロＧＭ１に対する抗体である抗ア
シアロＧＭ１抗体により、ＨＣＴ−８細胞を前処理し、
その結合に及ぼす影響を評価した。市販のウサギ抗アシ
アロＧＭ１抗血清（和光純薬（米）社製）を用い、その
アシアロＧＭ１に対する特異性を確認した。各種糖脂質
（５μg）をシリカゲルプレートを用いてＴＬＣを行い
（クロロホルム：メタノール：水＝６５：２４：４）、
５％ＢＳＡ−ＰＢＳにてブロッキングした後、ウサギ抗
アシアロＧＭ１抗血清及び通常ウサギ血清（コントロー
ル）により処理（37℃、1時間、1%BSA-0.05%Tween20-PB
Sにより1:100に希釈）した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳにより
５回洗浄（50ｒpm、37℃、5分）した後、アルカリフォ
スファターゼラベル羊抗ウサギＩｇＧにて同様に処理し
た。次いで、同様に洗浄した後、常法に従って発色させ
た。結果を図１０に示す。図１０において、レーン１
は、ガラクトシルセラミドの場合を、２はラクトシルセ
ラミドの場合を、３はグロボトリオシルセラミドの場合
を、４はグロボテトラオシルセラミドの場合を、５はア
シアロＧＭ２の場合を、６はアシアロＧＭ１の場合を、
７はホスファチジルコリンの場合を示す。図１０に示さ
れるように、抗アシアロＧＭ１抗血清は、アシアロＧＭ
１に特異的であることが確認できた。尚、図１０の左図
に示されるように、コントロールとして用いた同希釈率
（1:100）の通常ウサギ血清（シグマ化学社製：脱塩後
使用）は、いずれの糖脂質とも反応しなかった。
【００４５】このウサギ抗アシアロＧＭ１抗血清（HEPE
S-HANK'Sで希釈）によりＨＣＴ−８細胞を１.５時間処
理した後、ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにて３回洗浄し、
次いで、プロトコールに従って、細胞付着実験を行っ
た。結果を図１１に示す。図１１において、１は無処理
の場合を、２は通常ウサギ血清処理（１：５０）の場合
を、３はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：５０）の場
合を、４はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：１００）
の場合を、５はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：２０
０）の場合を、６はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：
４００）の場合を、７は細胞が存在しない状態での結合
を示す。図１１に示されるように、抗血清濃度依存的な
結合阻害作用を確認することができた。
S-HANK'Sで希釈）によりＨＣＴ−８細胞を１.５時間処
理した後、ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにて３回洗浄し、
次いで、プロトコールに従って、細胞付着実験を行っ
た。結果を図１１に示す。図１１において、１は無処理
の場合を、２は通常ウサギ血清処理（１：５０）の場合
を、３はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：５０）の場
合を、４はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：１００）
の場合を、５はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：２０
０）の場合を、６はウサギ抗アシアロ抗血清処理（１：
４００）の場合を、７は細胞が存在しない状態での結合
を示す。図１１に示されるように、抗血清濃度依存的な
結合阻害作用を確認することができた。
【００４６】（２）アシアロＧＭ１含有ＨＥＰＥＳ−Ｈ
ＡＮＫ'Ｓによる細胞前処理が病原性大腸菌の細胞付着
に及ぼす影響 アシアロＧＭ１を含有するＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓに
より、病原性大腸菌（E.coli Pb176:CFA/II(CS1+CS3)）
を前処理（37℃,1時間）した。その後、ＨＥＰＥＳ−Ｈ
ＡＮＫ'Ｓにより３回洗浄し、細胞付着実験を行った。
結果を図１２に示す。データは１２回の測定結果を箱髭
図で示した。図１２に示されるように、アシアロＧＭ１
の前処理濃度依存的な結合阻害作用を確認することがで
きた。また、８０mg/mlの濃度のアシアロＧＭ１で前処
理した群では、ほぼ５０％の結合阻害が確認された。
ＡＮＫ'Ｓによる細胞前処理が病原性大腸菌の細胞付着
に及ぼす影響 アシアロＧＭ１を含有するＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓに
より、病原性大腸菌（E.coli Pb176:CFA/II(CS1+CS3)）
を前処理（37℃,1時間）した。その後、ＨＥＰＥＳ−Ｈ
ＡＮＫ'Ｓにより３回洗浄し、細胞付着実験を行った。
結果を図１２に示す。データは１２回の測定結果を箱髭
図で示した。図１２に示されるように、アシアロＧＭ１
の前処理濃度依存的な結合阻害作用を確認することがで
きた。また、８０mg/mlの濃度のアシアロＧＭ１で前処
理した群では、ほぼ５０％の結合阻害が確認された。
【００４７】（３）粗ＣＦＡ／ＩＩ（ＣＳ１＋ＣＳ３）
抗原による細胞前処理が病原性大腸菌の細胞付着に及ぼ
す影響 アシアロＧＭ１に親和性を示すことが明かにされている
病原性大腸菌のＣＦＡ／ＩＩ（ＣＳ１＋ＣＳ３）抗原
を、病原性大腸菌（E.coli Pb176（CFA/II:(CS1+CS
3)））より、ＰＢＳ−２ＭＵｒｅａにより、抽出（37
℃、0.5時間）した。菌体を除去した後、硫安沈殿（80
％飽和）及び透析した後、凍結乾燥粉末として保存した
ものを本試験に用いた。ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにて
溶解したＣＦＡ／ＩＩ（CS1+CS3）抗原により、病原性
大腸菌（E.coli Pb176:CFA/II(CS1+CS3)）を前処理（37
℃、1時間）した。その後、前処理された前記抗原を、
ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３回洗浄し、次いで、
細胞付着阻害効果を確認した。結果を図１３に示す。図
１３において、１は無処理の場合の結合を、２はＣＦＡ
／ＩＩの濃度が０.０１mg／mlの場合の結合を、３は０.
１mg／mlの場合の結合を、４は１.０mg／mlの場合の結
合を、５は細胞が存在しない状態での結合を示す。デー
タは１２回の測定結果を箱髭図で示した。図１３に示さ
れるように、処理濃度依存的な付着阻害作用が認められ
た。これにより、病原性大腸菌が、細胞上のアシアロＧ
Ｍ１を受容体として結合していることを確認することが
できた。
抗原による細胞前処理が病原性大腸菌の細胞付着に及ぼ
す影響 アシアロＧＭ１に親和性を示すことが明かにされている
病原性大腸菌のＣＦＡ／ＩＩ（ＣＳ１＋ＣＳ３）抗原
を、病原性大腸菌（E.coli Pb176（CFA/II:(CS1+CS
3)））より、ＰＢＳ−２ＭＵｒｅａにより、抽出（37
℃、0.5時間）した。菌体を除去した後、硫安沈殿（80
％飽和）及び透析した後、凍結乾燥粉末として保存した
ものを本試験に用いた。ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにて
溶解したＣＦＡ／ＩＩ（CS1+CS3）抗原により、病原性
大腸菌（E.coli Pb176:CFA/II(CS1+CS3)）を前処理（37
℃、1時間）した。その後、前処理された前記抗原を、
ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３回洗浄し、次いで、
細胞付着阻害効果を確認した。結果を図１３に示す。図
１３において、１は無処理の場合の結合を、２はＣＦＡ
／ＩＩの濃度が０.０１mg／mlの場合の結合を、３は０.
１mg／mlの場合の結合を、４は１.０mg／mlの場合の結
合を、５は細胞が存在しない状態での結合を示す。デー
タは１２回の測定結果を箱髭図で示した。図１３に示さ
れるように、処理濃度依存的な付着阻害作用が認められ
た。これにより、病原性大腸菌が、細胞上のアシアロＧ
Ｍ１を受容体として結合していることを確認することが
できた。
【００４８】（４）レクチンによる細胞前処理が病原性
大腸菌の細胞付着に及ぼす影響 ３種の市販レクチン（シグマ化学社製）で、ＨＣＴ−８
細胞を前処理し、その結合に及ぼす影響を評価するため
に、下記表５に示す３種のレクチンを用いて、細胞上に
存在する糖の重要性についての推定を行った。
大腸菌の細胞付着に及ぼす影響 ３種の市販レクチン（シグマ化学社製）で、ＨＣＴ−８
細胞を前処理し、その結合に及ぼす影響を評価するため
に、下記表５に示す３種のレクチンを用いて、細胞上に
存在する糖の重要性についての推定を行った。
【００４９】
【表５】 レクチンの糖特異性 ------------------------------------------------------- レクチン 結合特異性 ------------------------------------------------------- Momordica charantia lectin（ＭＣＬ） D-gal, D-galNAc Glycine max lectin（ＧＭＬ） D-galNAc Abrus prelatorius lectin（ＡＰＬ） D-gal -------------------------------------------------------
【００５０】即ち、各レクチンを蛋白換算濃度５０μg/
mlとして、ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓに溶解した。細胞
を各レクチンで前処理（37℃、1時間）した後、ＨＥＰ
ＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３回洗浄し、プロトコールに
従って細胞付着実験を行った。結果を図１４に示す。図
１４において、１は無処理、２は表５中のＡＰＬを用
い、３は同じくＧＭＬを用い、４は同じくＭＣＬを用い
各処理を施した後、２.５×１０9／mlのE.coliSBT3275
を加えて付着状態を示した。データは１２回の測定結果
を箱髭図で示した。図１４に示される結果より、ガラク
トース特異的なレクチンにより処理した場合に、大腸菌
の結合が顕著に阻害されることが判明した。この結果よ
り、細胞表面上に存在するアシアロＧＭ１分子のうち、
末端のＤ−ｇａｌ分子がレセプターとして重要な役割を
演じているものと推定される。
mlとして、ＨＥＰＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓに溶解した。細胞
を各レクチンで前処理（37℃、1時間）した後、ＨＥＰ
ＥＳ−ＨＡＮＫ'Ｓにより３回洗浄し、プロトコールに
従って細胞付着実験を行った。結果を図１４に示す。図
１４において、１は無処理、２は表５中のＡＰＬを用
い、３は同じくＧＭＬを用い、４は同じくＭＣＬを用い
各処理を施した後、２.５×１０9／mlのE.coliSBT3275
を加えて付着状態を示した。データは１２回の測定結果
を箱髭図で示した。図１４に示される結果より、ガラク
トース特異的なレクチンにより処理した場合に、大腸菌
の結合が顕著に阻害されることが判明した。この結果よ
り、細胞表面上に存在するアシアロＧＭ１分子のうち、
末端のＤ−ｇａｌ分子がレセプターとして重要な役割を
演じているものと推定される。
【００５１】以上の結果から、ラクトバシラス アシド
フィルス コンプレックスは、ＨＣＴ−８細胞上のアシ
アロＧＭ１分子を認識し、これを病原菌と奪い合うこと
によって、感染を抑制することが確認できた。特に、レ
クチンを用いた実験で示すように、アシアロＧＭ１末端
のガラクトース分子が、この効果発現に重要な役割を果
していることが明らかとなった。
フィルス コンプレックスは、ＨＣＴ−８細胞上のアシ
アロＧＭ１分子を認識し、これを病原菌と奪い合うこと
によって、感染を抑制することが確認できた。特に、レ
クチンを用いた実験で示すように、アシアロＧＭ１末端
のガラクトース分子が、この効果発現に重要な役割を果
していることが明らかとなった。
【００５２】実施例１ ラクトバシラス アシドフィルス（L.acidophilus）ＳＢ
Ｔ２０６２、ラクトバシラス クリスパタス（L.crispat
us）ＳＢＴ１２６４、ラクトバシラス アミロボラス
（L.amylovorus）ＳＢＴ１２６９、ラクトバシラス ガ
セリ（L.gasseri）ＳＢＴ１２６５、ラクトバシラス ガ
リナルム（L.gallinarum）及びラクトバシラス ジョン
ソニイ（L.johnsonii）を、それぞれＭＲＳ培地を用い
て前培養し、対数増殖期にある培養液を、０.３％の酵
母エキスを添加した１０％還元脱脂乳培地（１２１℃に
１０分間加熱したもの）に１％添加して、３７℃で２日
間培養し、培養物を凍結乾燥後粉末化し、病原体感染防
御剤を得た。
Ｔ２０６２、ラクトバシラス クリスパタス（L.crispat
us）ＳＢＴ１２６４、ラクトバシラス アミロボラス
（L.amylovorus）ＳＢＴ１２６９、ラクトバシラス ガ
セリ（L.gasseri）ＳＢＴ１２６５、ラクトバシラス ガ
リナルム（L.gallinarum）及びラクトバシラス ジョン
ソニイ（L.johnsonii）を、それぞれＭＲＳ培地を用い
て前培養し、対数増殖期にある培養液を、０.３％の酵
母エキスを添加した１０％還元脱脂乳培地（１２１℃に
１０分間加熱したもの）に１％添加して、３７℃で２日
間培養し、培養物を凍結乾燥後粉末化し、病原体感染防
御剤を得た。
【００５３】実施例２ （ヨーグルトの製造）ラクトバシラス アシドフィルス
（L.acidophilus）ＳＢＴ２０６２、ラクトバシラス ク
リスパタス（L.crispatus）ＳＢＴ１２６４、ラクトバ
シラス アミロボラス（L.amylovorus）ＳＢＴ１２６
９、ラクトバシラス ガセリ（L.gasseri）ＳＢＴ１２６
５、ラクトバシラス ガリナルム（L.gallinarum）及び
ラクトバシラス ジョンソニイ（L.johnsonii）を、それ
ぞれヨーグルトミックス（生乳に２％脱脂乳を添加し、
１００℃に１０分間加熱したもの）に５％接種し、３７
℃で２４時間培養した後、冷却し、各菌株を含有するヨ
ーグルトを調製した。このヨーグルトは、アシアロＧＭ
１をレセプターとする病原性大腸菌に対する感染防御効
果を有していた。
（L.acidophilus）ＳＢＴ２０６２、ラクトバシラス ク
リスパタス（L.crispatus）ＳＢＴ１２６４、ラクトバ
シラス アミロボラス（L.amylovorus）ＳＢＴ１２６
９、ラクトバシラス ガセリ（L.gasseri）ＳＢＴ１２６
５、ラクトバシラス ガリナルム（L.gallinarum）及び
ラクトバシラス ジョンソニイ（L.johnsonii）を、それ
ぞれヨーグルトミックス（生乳に２％脱脂乳を添加し、
１００℃に１０分間加熱したもの）に５％接種し、３７
℃で２４時間培養した後、冷却し、各菌株を含有するヨ
ーグルトを調製した。このヨーグルトは、アシアロＧＭ
１をレセプターとする病原性大腸菌に対する感染防御効
果を有していた。
【００５４】実施例３ （錠剤の製造）ラクトバシラス アシドフィルス（L.aci
dophilus）ＳＢＴ２０６２株をブリッグス肝臓培地（Br
iggs liver broth）で培養し、次いで、４℃にて７００
０rpmで１５分間遠心分離し、上清を分離して菌体を回
収した。菌体に１０倍量の殺菌水を加え、７０００rpm
で１５分間遠心して洗浄を行い、これを３回繰り返して
洗浄菌体を得た。これを凍結乾燥処理して菌体粉末を得
た。この菌体粉末１部に乳糖５部を混合し、これを１ｇ
ずつ打錠機を用いて常法により打錠して、本菌体を２０
０mg含有する錠剤を調製した。
dophilus）ＳＢＴ２０６２株をブリッグス肝臓培地（Br
iggs liver broth）で培養し、次いで、４℃にて７００
０rpmで１５分間遠心分離し、上清を分離して菌体を回
収した。菌体に１０倍量の殺菌水を加え、７０００rpm
で１５分間遠心して洗浄を行い、これを３回繰り返して
洗浄菌体を得た。これを凍結乾燥処理して菌体粉末を得
た。この菌体粉末１部に乳糖５部を混合し、これを１ｇ
ずつ打錠機を用いて常法により打錠して、本菌体を２０
０mg含有する錠剤を調製した。
【００５５】
【発明の効果】以上、詳しく説明したように、本発明に
より、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス
（Lactobacillus acidophilus complex）に属しアシア
ロＧＭ１に親和性を有する微生物またはその菌体を有効
成分とする病原体感染防御剤が提供される。本発明の病
原体感染防御剤は、アシアロＧＭ１をレセプターとする
病原体であって、病原性大腸菌、緑膿菌、シュードモナ
ス セパシア（Pseudmonas cepacia）、カンピロバクタ
ー（Campyrobacter）、ロタウイルス（Rota virus）、
レオウイルス（Reo virus）及びポリオウイルス（Polio
virus）に属する微生物に対して有効である。また、本
発明により、前記微生物の菌体から、アルカリ塩水溶液
または界面活性剤を用いて抽出して得ることができ、ア
シアロＧＭ１に親和性を有し、病原体感染防御活性を有
する蛋白質が提供される。本発明の蛋白質も前記微生物
に対して非常に有効である。
より、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックス
（Lactobacillus acidophilus complex）に属しアシア
ロＧＭ１に親和性を有する微生物またはその菌体を有効
成分とする病原体感染防御剤が提供される。本発明の病
原体感染防御剤は、アシアロＧＭ１をレセプターとする
病原体であって、病原性大腸菌、緑膿菌、シュードモナ
ス セパシア（Pseudmonas cepacia）、カンピロバクタ
ー（Campyrobacter）、ロタウイルス（Rota virus）、
レオウイルス（Reo virus）及びポリオウイルス（Polio
virus）に属する微生物に対して有効である。また、本
発明により、前記微生物の菌体から、アルカリ塩水溶液
または界面活性剤を用いて抽出して得ることができ、ア
シアロＧＭ１に親和性を有し、病原体感染防御活性を有
する蛋白質が提供される。本発明の蛋白質も前記微生物
に対して非常に有効である。
【図１】受容体として知られている糖脂質のＴＬＣ展開
図である。ＴＬＣのレーンは、１がアシアロＧＭ１（５
μｇ）を、２がアシアロＧＭ２（５μｇ）を、３がガン
グリオシド混合物（２０μｇ）を、４がグロボシド混合
物（２０μｇ）を、５がグロボテトラオシルセラミド
（５μｇ）を、６がホスファチジルコリン（５μｇ）を
展開したものである。
図である。ＴＬＣのレーンは、１がアシアロＧＭ１（５
μｇ）を、２がアシアロＧＭ２（５μｇ）を、３がガン
グリオシド混合物（２０μｇ）を、４がグロボシド混合
物（２０μｇ）を、５がグロボテトラオシルセラミド
（５μｇ）を、６がホスファチジルコリン（５μｇ）を
展開したものである。
【図２】糖脂質に対するラクトバシラス アシドフィル
ス コンプレックスの結合性を示すＴＬＣ展開図であ
る。ＴＬＣのレーンは、１がアシアロＧＭ１（５μｇ）
を、２がアシアロＧＭ２（５μｇ）を、３がガングリオ
シド混合物（２０μｇ）を、４がグロボシド混合物（２
０μｇ）を、５がグロボテトラオシルセラミド（５μ
ｇ）を、６がホスファチジルコリン（５μｇ）を展開し
たものである。
ス コンプレックスの結合性を示すＴＬＣ展開図であ
る。ＴＬＣのレーンは、１がアシアロＧＭ１（５μｇ）
を、２がアシアロＧＭ２（５μｇ）を、３がガングリオ
シド混合物（２０μｇ）を、４がグロボシド混合物（２
０μｇ）を、５がグロボテトラオシルセラミド（５μ
ｇ）を、６がホスファチジルコリン（５μｇ）を展開し
たものである。
【図３】糖脂質に対する病原性大腸菌と通常大腸菌の結
合性を示すＴＬＣ展開図である。ＴＬＣのレーンは、１
がアシアロＧＭ１（５μｇ）を、２がアシアロＧＭ２
（５μｇ）を、３がガングリオシド混合物（２０μｇ）
を、４がグロボシド混合物（２０μｇ）を、５がグロボ
テトラオシルセラミド（５μｇ）を、６がホスファチジ
ルコリン（５μｇ）を展開したものである。
合性を示すＴＬＣ展開図である。ＴＬＣのレーンは、１
がアシアロＧＭ１（５μｇ）を、２がアシアロＧＭ２
（５μｇ）を、３がガングリオシド混合物（２０μｇ）
を、４がグロボシド混合物（２０μｇ）を、５がグロボ
テトラオシルセラミド（５μｇ）を、６がホスファチジ
ルコリン（５μｇ）を展開したものである。
【図４】病原性大腸菌のアシアロＧＭ１に対する結合
を、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスが
阻害する現象を確認したＴＬＣ阻害アッセイによるオー
トラジオグラムの展開図である。各レーンは、１がアシ
アロＧＭ１（１０μｇ）を、２がアシアロＧＭ１（５μ
ｇ）を、３がアシアロＧＭ１（２.５μｇ）を、４がア
シアロＧＭ１（１.２５μｇ）を示す。
を、ラクトバシラス アシドフィルス コンプレックスが
阻害する現象を確認したＴＬＣ阻害アッセイによるオー
トラジオグラムの展開図である。各レーンは、１がアシ
アロＧＭ１（１０μｇ）を、２がアシアロＧＭ１（５μ
ｇ）を、３がアシアロＧＭ１（２.５μｇ）を、４がア
シアロＧＭ１（１.２５μｇ）を示す。
【図５】ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６
２の生菌体が示す病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対す
る付着を阻害する作用を、細胞結合阻害アッセイ法によ
り測定した結果を示すグラフである。＊は、９５％の範
囲から外れたデータの位置を示している。
２の生菌体が示す病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対す
る付着を阻害する作用を、細胞結合阻害アッセイ法によ
り測定した結果を示すグラフである。＊は、９５％の範
囲から外れたデータの位置を示している。
【図６】ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６
９、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１２６５、ラクトバ
シラス クリスパタスＳＢＴ１２６４の生菌体が示す病
原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対する付着を阻害する作
用を、細胞結合阻害アッセイ法により測定した結果を示
すグラフである。
９、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１２６５、ラクトバ
シラス クリスパタスＳＢＴ１２６４の生菌体が示す病
原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対する付着を阻害する作
用を、細胞結合阻害アッセイ法により測定した結果を示
すグラフである。
【図７】ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６
２の死菌体が示す病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対す
る付着を阻害する作用を、細胞結合阻害アッセイ法によ
り測定した結果を示すグラフである。
２の死菌体が示す病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対す
る付着を阻害する作用を、細胞結合阻害アッセイ法によ
り測定した結果を示すグラフである。
【図８】ラクトバシラス アミロボラスＳＢＴ１２６
９、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１２６５、ラクトバ
シラス クリスパタスＳＢＴ１２６４の死菌体が示す病
原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対する付着を阻害する作
用を、細胞結合阻害アッセイ法により測定した結果を示
すグラフである。＊は、９５％の範囲から外れたデータ
の位置を示している。
９、ラクトバシラス ガセリＳＢＴ１２６５、ラクトバ
シラス クリスパタスＳＢＴ１２６４の死菌体が示す病
原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対する付着を阻害する作
用を、細胞結合阻害アッセイ法により測定した結果を示
すグラフである。＊は、９５％の範囲から外れたデータ
の位置を示している。
【図９】ラクトバシラス アシドフィルスＳＢＴ２０６
２の死菌体により予めＨＣＴ−８細胞を前処理した後、
病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対する付着を阻害する
作用を細胞結合阻害アッセイ法により測定した結果を示
すグラフである。＊は、９５％の範囲から外れたデータ
の位置を示す。
２の死菌体により予めＨＣＴ−８細胞を前処理した後、
病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞に対する付着を阻害する
作用を細胞結合阻害アッセイ法により測定した結果を示
すグラフである。＊は、９５％の範囲から外れたデータ
の位置を示す。
【図１０】糖脂質に対する抗アシアロＧＭ１抗血清の結
合性を示すＴＬＣ展開図である。ＴＬＣのレーンは、１
がガラクトシルセラミド（５μｇ）を、２がラクトシル
セラミド（５μｇ）を、３がグロボトリオシルセラミド
（５μｇ）を、４がグロボテトラオシルセラミド（５μ
ｇ）を、５がアシアロＧＭ２（５μｇ）を、６がアシア
ロＧＭ１（５μｇ）を、７がホスファチジルコリン（５
μg）を展開したものである。黒化した部位が抗血清と
反応性を示す糖脂質の存在を示す。
合性を示すＴＬＣ展開図である。ＴＬＣのレーンは、１
がガラクトシルセラミド（５μｇ）を、２がラクトシル
セラミド（５μｇ）を、３がグロボトリオシルセラミド
（５μｇ）を、４がグロボテトラオシルセラミド（５μ
ｇ）を、５がアシアロＧＭ２（５μｇ）を、６がアシア
ロＧＭ１（５μｇ）を、７がホスファチジルコリン（５
μg）を展開したものである。黒化した部位が抗血清と
反応性を示す糖脂質の存在を示す。
【図１１】病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着に及
ぼす抗アシアロＧＭ１抗血清の効果を示すグラフであ
る。＊は９５％の範囲から外れたデータの位置を示す。
ぼす抗アシアロＧＭ１抗血清の効果を示すグラフであ
る。＊は９５％の範囲から外れたデータの位置を示す。
【図１２】アシアロＧＭ１による病原性大腸菌の前処理
の結果、ＨＣＴ−８細胞への付着が抑制されることを示
すグラフである。＊は９５％の範囲から外れたデータの
位置を示す。
の結果、ＨＣＴ−８細胞への付着が抑制されることを示
すグラフである。＊は９５％の範囲から外れたデータの
位置を示す。
【図１３】粗精製ＣＦＡ／ＩＩ（ＣＳ１＋ＣＳ３）抗原
によるＨＣＴ−８細胞の前処理の結果、病原性大腸菌の
ＨＣＴ−８細胞への付着が抑制されることを示すグラフ
である。＊は９５％の範囲から外れたデータの位置を示
す。
によるＨＣＴ−８細胞の前処理の結果、病原性大腸菌の
ＨＣＴ−８細胞への付着が抑制されることを示すグラフ
である。＊は９５％の範囲から外れたデータの位置を示
す。
【図１４】糖特異的レクチンによるＨＣＴ−８細胞の前
処理の結果、病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着が
抑制されることを示すグラフである。
処理の結果、病原性大腸菌のＨＣＴ−８細胞への付着が
抑制されることを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:23） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225 1:23） (56)参考文献 特開 平５−201828（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−194640（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−145026（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−292947（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−98782（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−91126（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−501624（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/74 C07K 14/335
Claims (5)
- 【請求項１】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックス（Lactobacillus acidophilus complex）に属
しアシアロＧＭ１に親和性を有する微生物の生菌体、死
菌体または細胞壁から、アルカリ塩水溶液または界面活
性剤を用いて抽出して得られる表面粗蛋白質画分を有効
成分とする病原体感染防御剤。 - 【請求項２】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスに属する微生物が、ラクトバシラス アシドフ
ィルス（L.acidophilus）、ラクトバシラスクリスパタ
ス（L.crispatus）、ラクトバシラス アミロボラス（L.
amylovorus）、ラクトバシラス ガセリ（L.gasseri）、
ラクトバシラス ガリナルム（L.gallinarum）及びラク
トバシラス ジョンソニイ（L.johnsonii）に分類される
乳酸菌である請求項１記載の病原体感染防御剤。 - 【請求項３】 病原体が、アシアロＧＭ１に親和性を有
する微生物である請求項１または２記載の病原体感染防
御剤。 - 【請求項４】 アシアロＧＭ１に親和性を有する病原体
が、病原性大腸菌、緑膿菌、シュードモナス セパシア
（Pseudomonas cepacia）、カンピロバクター（Campyro
bacter）、ロタウイルス（Rota virus）、レオウイルス
（Reo virus）、ポリオウイルス（Polio virus）に属す
る微生物である請求項３記載の病原体感染防御剤。 - 【請求項５】 ラクトバシラス アシドフィルス コンプ
レックスに属しアシアロＧＭ１に親和性を有する微生物
の生菌体、死菌体または細胞壁から、アルカリ塩水溶液
または界面活性剤を用いて抽出して得ることができ、ア
シアロＧＭ１に親和性を有し、病原体感染防御活性を有
する表面粗蛋白質画分。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7094430A JP3004890B2 (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | 病原体感染防御剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7094430A JP3004890B2 (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | 病原体感染防御剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08268899A JPH08268899A (ja) | 1996-10-15 |
| JP3004890B2 true JP3004890B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=14110029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7094430A Expired - Fee Related JP3004890B2 (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | 病原体感染防御剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3004890B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009242275A (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-22 | Kagaku Shiryo Kenkyusho:Kk | 生菌剤 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1034787A1 (en) * | 1999-03-11 | 2000-09-13 | Société des Produits Nestlé S.A. | Lactobacillus strains preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria |
| IT1306716B1 (it) * | 1999-06-21 | 2001-10-02 | Mendes S U R L | Associazione di batteri lattici e suo uso per la prevenzione e/o iltrattamento terapeutico di infezioni e di stati infiammatori. |
| JP4509250B2 (ja) * | 1999-06-24 | 2010-07-21 | 明治乳業株式会社 | Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ除菌性医薬品 |
| JP2005225841A (ja) * | 2004-02-16 | 2005-08-25 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 病原体感染防御剤 |
| JP5095912B2 (ja) * | 2004-09-06 | 2012-12-12 | 雪印メグミルク株式会社 | 免疫増強剤 |
| CN101678051B (zh) | 2006-09-04 | 2012-12-12 | 雪印惠乳业株式会社 | 促进血中脂连蛋白浓度增加及/或抑制其减少的制剂及内脏脂肪蓄积抑制剂 |
| JP2008214253A (ja) | 2007-03-02 | 2008-09-18 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 内臓脂肪減少剤 |
| JP5225652B2 (ja) | 2007-10-29 | 2013-07-03 | 雪印メグミルク株式会社 | アディポネクチン分泌促進及び／又は減少抑制剤 |
| PL2262514T3 (pl) | 2008-03-07 | 2020-06-15 | Savencia Sa | Środki do wspomagania wydzielania i/lub hamowania spadku adiponektyny |
| RU2500412C2 (ru) * | 2008-09-04 | 2013-12-10 | Ом Фарма | ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭКСТРАКТЫ ИЗ БАКТЕРИЙ Lactobacillus И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ |
| JP5075254B2 (ja) * | 2011-01-07 | 2012-11-21 | スノーデン株式会社 | 胃酸及びガストリンの産生を抑制する乳酸菌 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2811503B2 (ja) * | 1990-10-04 | 1998-10-15 | 株式会社ヤクルト本社 | 抗ｈｉｖ剤 |
| KR950014592B1 (ko) * | 1991-10-22 | 1995-12-11 | 주식회사태평양 | 화장료용 유산균제재 |
| JPH05292947A (ja) * | 1992-04-17 | 1993-11-09 | Sanei Touka Kk | ラクトバチルス・アシドフィルスｐｎ−ｒｉ−２−４、それを用いた乳酸菌製剤及びその製造方法 |
| ATE161181T1 (de) * | 1992-07-06 | 1998-01-15 | Nestle Sa | Lactobacillus acidophilus enthaltende antigastritis-mittel |
| JP2717497B2 (ja) * | 1993-12-28 | 1998-02-18 | 不二ラテックス株式会社 | 酸性多糖類被覆コンドーム |
-
1995
- 1995-03-28 JP JP7094430A patent/JP3004890B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009242275A (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-22 | Kagaku Shiryo Kenkyusho:Kk | 生菌剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08268899A (ja) | 1996-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4665060A (en) | Therapeutic treatment employing oligosaccharides | |
| KR100422050B1 (ko) | 항원성이 보강된 장내세균을 생산하는 방법과 이를 포함하는 방법 | |
| JP3004890B2 (ja) | 病原体感染防御剤 | |
| RU2412241C2 (ru) | Способ профилактики желудочно- кишечных заболеваний у животных или людей, способ лечения желудочно-кишечных заболеваний у животных или людей и лекарственное средство для лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных или людей | |
| US5266315A (en) | Composite for Clostridium difficile diarrhea and pseudomembranous colitis | |
| Trejo et al. | Co-culture with potentially probiotic microorganisms antagonises virulence factors of Clostridium difficile in vitro | |
| PT88166B (pt) | Processo para a obtencao de poliosideos capsulares de stafilococos | |
| EP1082964A1 (en) | Lactic acid bacterium-containing compositions, drugs and foods | |
| JPH09241173A (ja) | 乳酸菌を有効成分とする抗胃炎剤、抗潰瘍剤および醗酵食品 | |
| US5260280A (en) | Bacterial toxin neutralizer | |
| JPH0413628A (ja) | クロストリジウム・ディフィシル下痢症および偽膜性大腸炎の予防ならびに治療用医薬組成物 | |
| Rimler | Studies of the pathogenic avian haemophili | |
| Kapczynski et al. | Adherence of Lactobacillus to intestinal 407 cells in culture correlates with fibronectin binding | |
| Takahashi et al. | Studies of the effect of Clostridium butyricum on Helicobacter pylori in several test models including gnotobiotic mice | |
| US5330975A (en) | Bacterial toxin neutralizer | |
| Medrano et al. | Kefiran protects Caco-2 cells from cytopathic effects induced by Bacillus cereus infection | |
| Rupp et al. | Characterization of the hemagglutinin of Staphylococcus epidermidis | |
| JP2595133B2 (ja) | 免疫刺激剤およびその製造法 | |
| EP0454813B1 (en) | A casein fraction for therapeutic, prophylactic and/or diagnostic use in infections of the respiratory tract | |
| Laishevtsev | Mannheimiosis of cattle, sheep and goats | |
| WIBAWAN et al. | The role of hyaluronic acid capsular material of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in mediating adherence to HeLa cells and in resisting phagocytosis | |
| AU689494B2 (en) | Method for the prevention and treatment of bovine mastitis | |
| US5968901A (en) | Antibacterial composition | |
| JP2005502594A (ja) | 抗ふけ菌免疫抗体及びその用途 | |
| Op den Camp et al. | Cell surface hydrophobicity of Bifidobacterium bifidum subsp. pennsylvanicum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071119 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081119 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081119 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101119 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 12 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 12 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 12 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 12 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121119 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121119 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131119 Year of fee payment: 14 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |