JPH05292947A - ラクトバチルス・アシドフィルスｐｎ−ｒｉ−２−４、それを用いた乳酸菌製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 胃酸や胆汁に対する抵抗性や病原菌に対する
抗菌性が強い、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lact
obacillus acidophilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４〔微工研
菌寄第１２３８７号〕。 【効果】 ラクトバチルス・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ
−２−４を用いた乳酸菌製剤を人や動物に経口摂取させ
ることにより、腸内の有害菌を抑制し、また、ラクトバ
チルス・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４を含む有用
菌を増加させることができ、該ラクトバチルス・アシド
フィルスＰＮ−ＲＩ−２−４を用いた乳酸菌製剤は、生
菌剤に求められる諸条件に適合し、下痢などの病気の予
防またはその治療効果が期待でき、発育促進や健康維持
に役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】

【０００２】本発明は、ラクトバチルス・アシドフィル
スＰＮ−ＲＩ−２−４、それを用いた乳酸菌製剤及びそ
の製造方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】

【０００４】乳酸菌は、人や動物の腸管や腔内に常在菌
叢として分布し、健康維持に役立つことが従来より知ら
れていたが、最近、特に腸内菌叢の研究が飛躍的に進む
につれて、乳酸菌の役割が次第に明らかにされてきた。

【０００５】そのため、発酵乳，乳酸菌飲料などの乳酸
菌を含む食品や乳酸菌製剤の効果が注目されている。

【０００６】ところで、かかる腸内菌叢は、大別する
と、乳酸菌群、嫌気性群、好気性群の細菌からなる。

【０００７】また、これらの腸内菌叢には、乳酸菌等の
ように人や動物にとって有用な有用菌と、逆に害になる
有害菌とがあり、これらの有用菌と有害菌とが一定のバ
ランスで腸内に棲息している。

【０００８】ここで、有用菌とは、ビタミンや蛋白質の
合成、消化吸収の補助、外来菌の増殖抑制、免疫機能の
刺激等、宿主の健康維持に役立つ菌をいい、これに対し
て有害菌とは、腸内で宿主にとって有害な種々の物質を
生成し、急性や慢性の疾病、老化、発がんに関与してい
ると考えられている菌をいう。

【０００９】従って、腸内の有害菌の生育を抑制した
り、反対に有用菌を増すようにすれば、人間の病気や老
化、発がんを抑え、健康が維持できると考えられる。

【００１０】また、家畜についても、有用菌である乳酸
菌などの細菌またはその発酵産物の投与が、発育を促進
し、下痢などの病気を予防または治癒するために効果的
であることが従来より知られており、特に最近その応用
が盛んになってきた。

【００１１】これらの製剤はプロバイオティクス（Prob
iotics）と呼ばれ、世界的に使用されるようになってき
た。

【００１２】ところで、生まれた直後の幼動物は、本質
的には無菌であるが、出生後直ちに外界から細菌が侵入
し始める。

【００１３】そして、幼動物の腸内菌叢における有用菌
と有害菌とのバランスは、生後の日令にしたがって次第
に安定したものとなるが、外界や飼料などの変化によっ
て影響を受け易い。

【００１４】すなわち、幼動物では、有用菌は容易に減
少し易く、日和見的な大腸菌が速やかに増殖し易い。

【００１５】このように、日和見的な大腸菌が増殖する
と、腸内菌叢のバランスが乱れ、発病の原因となり易
い。

【００１６】このような場合には、幼動物に乳酸菌等の
生菌剤を予防的に投与しておくと、有用菌が優勢になり
腸内を酸性に保つことで大腸菌の増殖を抑制でき、腸内
菌叢の乱れによる発病予防に効果がある。

【００１７】このような生菌剤の投与は、一般的に幼動
物において顕著な効果が認められるが、健康な成動物に
おいてもかなりの効果が認められる。

【００１８】成動物の腸内菌叢は、常に一定なものでは
なく、微妙なバランスを保っているため、ストレスなど
外界の刺激によってそのバランスは容易に壊れる。

【００１９】すなわち、腸内菌叢のバランスは腸内のｐ
Ｈに強く依存している。

【００２０】従って、乳酸菌が優勢で乳酸を十分生成し
ていれば、腸内を酸性に保つことができ、大腸菌の増殖
は抑制されている。

【００２１】逆に、乳酸菌の活性が低下し乳酸などの有
機酸が減少すると、大腸菌は容易に増殖し、下痢などの
病気の原因となる。

【００２２】生菌剤に用いられる細菌は、腸内細菌に由
来するものと腸内常在菌でないものとがあるが、投与し
た動物の腸内に定着し増殖する性質を有する腸内細菌に
由来するものが理想である。

【００２３】しかしながら、腸内細菌には、動物種が異
なると種特異性のため腸内で定着できないものもある。

【００２４】すなわち、例えその腸内細菌が動物固有の
ものであっても、外から投与した場合は先住菌によって
排除される傾向が強く、腸内での定着増殖は必ずしも期
待できない。

【００２５】そのため、菌の投与を中止すると、既に投
与した菌が比較的短時間のうちに腸内から消失するのが
普通である。

【００２６】このような場合でも、生菌剤を一定量以上
継続投与すれば定着とは関係なしに下痢の予防治癒や発
育促進に有効であるとの報告があるが、それは投与した
細菌が自ら腸内で作用するか、もともと腸内にいた有用
細菌を維持増殖させたものと考えられる。

【００２７】一般に、生菌剤が有効に作用するために
は、必要量の生きた菌が胃を通じて腸に到達する必要が
ある。

【００２８】そのため、細菌に求められる条件は、製剤
中で安定であること、混合する飼料中または飲水中で安
定であることの他にも、特に、消化管の中でも強い酸性
を示す胃の中でこれに耐える耐酸性があること、更に、
小腸内では胆汁の殺菌力に抵抗性があること等が掲げら
れる。

【００２９】また、現在、生菌剤として強く望まれてい
るのは、生菌の活性が強く腸内での作用が高いことであ
る。

【００３０】さらに、生菌は、腸内で旺盛に増殖して定
着することが望ましく、少なくとも存住乳酸菌の増殖を
促す効果が高いことが必要である。

【００３１】

【発明が解決しようとする課題】

【００３２】しかし、現在多数の生菌剤が市販されてい
るが、これらの条件を十分満たすものは、残念ながら存
在しない。

【００３３】本発明の解決しようとする課題は、生菌剤
に求められる条件に適合した宿主動物に由来する乳酸菌
株を見い出し、十分な生存安定性があり諸条件に適合す
る乳酸菌製剤と、該製剤の製造法を提供することにあ
る。

【００３４】

【課題を解決するための手段】

【００３５】本発明者らは、上述の諸条件に適合した乳
酸菌を求め、各種動物、即ち、牛、豚、鶏などの腸内か
ら多数の乳酸菌株を分離し、培養して菌の特性を調べた
結果、豚の腸内から常法に従って純粋分離することで、
本発明の目的に合致する優秀な乳酸菌株を取得すること
に成功した。

【００３６】即ち、本発明は、新規なラクトバチルス・
アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＰＮ−
ＲＩ−２−４〔微工研菌寄第１２３８７号〕と、このラ
クトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidop
hilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４〔微工研菌寄第１２３８７
号〕を用いた乳酸菌製剤と、該ラクトバチルス・アシド
フィルス（Lactobacillus acidophilus)ＰＮ−ＲＩ−２
−４〔微工研菌寄第１２３８７号〕を、発酵性糖類を主
炭素源とした培地に接種して、通性嫌気性菌に適した培
養条件で培養して増殖させた後、菌体を分離し、乳酸菌
製剤とする、乳酸菌製剤の製造方法とである。

【００３７】この新規なラクトバチルス・アシドフィル
スＰＮ−ＲＩ−２−４は、次の菌学的性質を有する。

【００３８】(a) グラム陽性、無芽胞形成性、通性嫌気
性桿菌。

【００３９】(b) グルコースを発酵し、乳酸（ＤＬ）を
産生する。グルコースからガス産生はしない。１５℃で
発育および運動性は陰性である。グルコース、マンノー
ス、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マ
ルトース、セロビオース、ラクトース、トレハロース、
メリビオース、ラフィノース、デキストリン、エスクリ
ン、サリシンおよびアミグダリンより酸を産生し、逆
に、アラビノース、キシロース、ラムノース、リボー
ス、メレチトース、スターチ、ソルビトール、およびマ
ンニトールよりの酸の産生は認められない。ＢＬ寒天培
地、ＬＢＳ寒天培地、ＭＲＳ寒天培地、ブリッグス・リ
バー・ブロス（Briggs Liver Broth）での発育性は良好
である。

【００４０】(c) 本菌の表現型（上記に示した性状）で
は、本菌はラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobac
illus acidophilus）と同定される。しかし、ＤＮＡホ
モロジー（homology）の性状ではラクトバチルス・アシ
ドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ではなく、
ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acid
ophilus）に近いラクトバチルス・アシドフィルス グ
ループ（Lactobacillus acidophilus group）の菌であ
ることが示された。

【００４１】以上の菌学的性質から、本菌は、ラクトバ
チルス・アシドフィルス グループ（Lactobacillus ac
idophilus group）に属する新規な微生物であると判断
され、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillu
s acidophilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４と命名された。

【００４２】次に、上記のラクトバチルス・アシドフィ
ルスＰＮ−ＲＩ−２−４を用いた乳酸菌製剤の製造法に
ついて説明する。

【００４３】該乳酸菌製剤は、ラクトバチルス・アシド
フィルスＰＮ−ＲＩ−２−４を、グルコース、フラクト
ース、シュークロース等の発酵性糖類を主炭素源とし、
更に、微生物に利用可能な窒素化合物、例えば、ペプト
ン、麦芽エキス、コーンスティープリカー、酵母エキス
等の窒素源や、硫酸第１鉄、硫酸マンガン、酢酸ナトリ
ウム、燐酸１水素カリウム等の無機塩類や、（Tween 8
0）等を添加した培地に接種して、通性嫌気性菌に適し
た培養条件で培養して増殖せしめ、菌体を洗浄、分離し
た後、保護剤を加えて乾燥し、更に使用目的に応じて菌
濃度を調整するための増量剤を加え製剤とすることで製
造する。

【００４４】ラクトバチルス・アシドフィルスＰＮ−Ｒ
Ｉ−２−４の培養は、通常、液体培地を用いて、嫌気的
条件で培養するのが好ましいが、該菌は通性嫌気性であ
るため、完全な嫌気条件でなくてもよい。

【００４５】当該液体培地の主炭素源としては、グルコ
ース、フラクトース、シュークロースなどの糖質が使用
されるが、これら糖質の培地中の量的割合は１〜２０％
（Ｗ／Ｖ）で使用されることが好ましく、特に、４〜８
％（Ｗ／Ｖ）の範囲で添加、使用されることが好まし
い。

【００４６】培養温度は、微生物が生育しうる範囲、即
ち、２０℃〜４５℃で行なわれることが好ましいが、特
に、３０℃〜４０℃の範囲とすることが好ましい。

【００４７】培養の際のｐＨは、３〜８、好ましくは５
〜７の範囲に調節する。

【００４８】培養時間は、使用する培地の種類及び主炭
素源である糖質の濃度により異なるが、通常、１０〜２
４時間程度である。

【００４９】該培養時間については、本発明における培
養は微生物の菌数が最大となった時点で培養を終了させ
ることが望ましく、それ以上培養を続けると微生物が減
少し始めるとともに、製剤化した時、その微生物の生残
性（生き残る率）が低下する原因となる。

【００５０】なお、培養は、液体培地にラクトバチルス
・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４を直接接種する他
に、別に培養した種培養液を接種して行なうこともでき
る。

【００５１】このようにして得られた培養液中の微生物
は、常法に従って分離する。

【００５２】即ち、このような場合に当該分野において
通常使用される周知の手段、例えば膜濾過、遠心分離な
どの操作によって、微生物の分離を行なう。

【００５３】例えば、得られた微生物を含む培養液を有
機膜を用いて濾過し、微生物の濃度を１０倍に濃縮した
後、洗浄液を微生物濃縮液と同量加え、１／２量になる
まで有機膜を用いて濾過洗浄する。これを３回繰り返
す。

【００５４】ここで、洗浄液は、コーンスティープリカ
ー（濃度７°Bx）にグルコース２％（Ｗ／Ｖ）添加した
液を、濃度３°Bxに希釈後、苛性ソーダで中和し、生じ
た沈澱を除去することで調製する。

【００５５】そして、洗浄を終えた微生物濃縮液に保護
剤を加えた後、苛性ソーダ等によってｐＨを調整し、真
空凍結乾燥機等を使用して水分４％以下に乾燥し、乳酸
菌製剤を得る。

【００５６】ここで、使用目的に応じて、スキムミル
ク、ラクトース、澱粉等を単独または混合した増量剤を
加えることにより、微生物濃度を調整して乳酸菌製剤を
製造することもできる。

【００５７】該乳酸菌製剤は、粉状の他にも、顆粒状、
ペレット状、タブレット状にすることができる。

【００５８】なお、上記保護剤の成分と洗浄微生物濃縮
液に対する添加量の一例を、下記に示す。

【００５９】スキムミルク１０％（Ｗ／Ｖ）：グルタミ
ン酸ソーダ１％（Ｗ／Ｖ）：Ｌ−アスコルビン酸０．５
％（Ｗ／Ｖ）：Ｌ−システイン０．０５％（Ｗ／Ｖ）

【００６０】

【実施例１】

【００６１】コーンスティープリカー（濃度５°Bx）に
グルコース６％（Ｗ／Ｖ），０．２％（Ｗ／Ｖ）のツィ
ーン８０を加え、０．１μｍ除菌フィルター〔旭化成工
業株製ＰＳＶ３０３〕で濾過したものを、培地として使
用した。

【００６２】３００リットルタンク培養装置〔小松川化
工機株製〕に、上記培地２００リットルを０．１μｍ孔
径を有する有機膜〔旭化成工業株製ＰＳＶ３０３〕を着
装した除菌フィルターを用いて除菌しながら投入し、１
２Ｎ苛性ソーダでｐＨを５．５に調整した。

【００６３】次に、温度を３７℃に調整し、予め上記と
同様な培地で１６時間培養を行なったラクトバチルス・
アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４菌株の種菌（１０⁹
ケ／ml）２リットルを培地に接種し、更に、温度３７
℃、ｐＨ５．５に保ちながら１６時間攪拌培養した。

【００６４】この際、ｐＨの調整は、自動調節装置で１
２Ｎ苛性ソーダを添加することで行った。

【００６５】培養終了時の培養液中の菌数は、４×１０
⁹ ケ／mlであった。

【００６６】培養液は、０．１μｍ孔径を有する有機膜
〔旭化成工業株製ＰＳＶ３１３〕を装着した精密フィル
ターで濾過し、２０リットルまで濃縮した。

【００６７】次いで、該濃縮液に予め用意した洗浄液２
０リットルを加え、同様にして濾過し、２０リットルに
なるまで濃縮した。

【００６８】これを３回繰り返した。

【００６９】洗浄液は、濃度７°Bxのコーンスティープ
リカー２５リットルを、１２Ｎ苛性ソーダで中和し、沈
澱を沈降させた後、上澄液２０リットルをとり、これに
グルコース２％を添加し、６０リットルに希釈して調製
した。

【００７０】洗浄を終えた菌体濃縮液２０リットルに、
スキムミルク２kg，グルタミン酸ソーダ２００ｇ，Ｌ−
アスコルビン酸１００ｇ，Ｌ−システイン１０ｇを加え
て溶解した後、４Ｎ苛性ソーダでｐＨ７に調整した。

【００７１】該菌体液を−４０℃で凍結し、ＲＬＥ−３
０８型真空凍結乾燥機〔共和真空技術株製〕を用い、５
０℃で６０分間予備乾燥、７０℃で１５０分間一次乾
燥、更に３０℃で１４時間二次乾燥を行なった。乾燥物
の水分は３．８％であり、生菌数は１．５×１０¹¹ケ／
ｇであった。

【００７２】

【実施例２】

【００７３】コーンスティープリカー（濃度７°Bx）
に、グルコース２％（Ｗ／Ｖ），０．２％（Ｗ／Ｖ）の
ツィーン８０を加え、０．１μｍ除菌フィルター〔旭化
成工業株製ＰＳＶ３０３〕で除菌しながら、乳酸菌連続
培養装置〔関西化学機械製作株製〕の培地供給タンクに
送り込んだ。

【００７４】培地供給タンクに供給された培地は、リア
クター部へ１４リットル／Ｈで送液され、リアクター系
を循環させる。

【００７５】リアクター循環系に、予め培養したラクト
バチルス・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４菌株の種
菌５リットルを注入接種し、１２Ｎ苛性ソーダでｐＨ
５．５に調整し、温度を３７℃に保持して培養を開始し
た。

【００７６】リアクター系には、０．１μｍの孔径を有
する有機膜〔旭化成工業株製ＰＳＶ３１３〕が装着され
ており、連続的に発酵培地が濾過されると同時に新しい
培地が供給された。

【００７７】培養液の菌濃度をＯＤ６６０nmで測定し、
その１００倍希釈液が１．０に達したら菌体液を７５０
ml／ｈで抜きだした。

【００７８】その時の生菌数は、２．５×１０¹⁰ケ／ml
であった。

【００７９】抜きだした菌体液は、実施例１に準じて洗
浄、乾燥を行なった。

【００８０】乾燥物の水分は４．５％であり、生菌数は
１×１０¹¹ケ／ｇであった。

【００８１】

【実施例３】

【００８２】培養を実施例２に準じて行い、菌体の洗浄
を、高速遠心分離機を用いて行なった。

【００８３】すなわち、乳酸菌連続培養装置から連続的
に抜き出した菌体液を、６０００rpm，１０minで遠心分
離し、上澄液を除き、沈降菌体を実施例１に示した洗浄
液を用いて懸濁し、遠心分離前の量にまで戻し、再度遠
心分離した。

【００８４】このような洗浄をもう一度繰り返した後、
実施例１に準じて乾燥を行なった。

【００８５】乾燥物の水分は４．１％であり、生菌数は
１．５×１０¹¹ケ／ｇであった。

【００８６】

【試験例】

【００８７】次に、本発明に係るラクトバチルス・アシ
ドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４の胃酸に対する抵抗試験
（試験例１）、胆汁酸に対する抵抗試験（試験例２）、
病原菌に対する生育抑制試験（試験例３）について説明
する。

【００８８】なお、何れの試験例も、本発明株として
は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus
acidophilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４〔微工研菌寄第１２
３８７号〕を用い、対照株１〜対照株４としては、下記
に示す菌株をそれぞれ用い、合計５種の乳酸菌につい
て、各々の試験を行なった。

【００８９】・対照株１（ブタ由来株）：Lactobacillu
s amylovorus Ｆ−１００

【００９０】・対照株２（ブタ由来株）：Lactobacillu
s amylovorus Ｉ−８０

【００９１】・対照株３（市販品）：Lactobacillus ac
idophilus Ｍ−１３

【００９２】・対照株４（市販品）：Lactobacillus ac
idophilus

【００９３】

【試験例１】

【００９４】胃酸に対する抵抗試験は、ｐＨ１，ｐＨ
２，ｐＨ３の各塩酸溶液に、各供試菌株を各々別に添加
し、３７℃の恒温水槽中で、０時間（添加直後），０．
５時間，１時間，３時間及び５時間作用させることで行
った。

【００９５】そして、それぞれ、０時間（添加直後），
０．５時間，１時間，３時間及び５時間後に、各塩酸溶
液中の生残乳酸菌数を測定した。

【００９６】すなわち、試験例１は、次のようにして行
った。

【００９７】(a) 前培養培地：ＭＲＳ寒天培地（OXOI
D）

【００９８】(b) 菌数測定用培地：ＭＲＳ寒天培地（OX
OID）

【００９９】(c) 菌液の調製：各菌株を前培養培地で３
５℃，２日間嫌気培養した後、菌体を滅菌生理食塩水に
浮遊させて菌液とした。

【０１００】(d) 試験液：ｐＨ１，ｐＨ２，ｐＨ３の各
塩酸溶液を、それぞれオートクレーブで１２１℃，１５
分間殺菌処理後冷却して供試した。

【０１０１】(e) 作用：１ml当りの生菌数が１０⁵ 〜１
０⁶ となるように、１００mlに対して１mlの割合で試験
液に菌液を添加し、３７℃の恒温水槽中でそれぞれ０時
間（添加直後），０．５時間，１時間，３時間及び５時
間作用させた。

【０１０２】(f) 培養：各作用後に試験液中で生残する
供試菌株数を、測定用培地を使用した重層平板培養法
（３５℃，２日間好気培養）により測定した。

【０１０３】ｐＨ１，ｐＨ２，ｐＨ３の塩酸溶液１ml中
における各供試菌株の生菌数の経時変化を、表１に示
す。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】

【試験例２】

【０１０６】胆汁酸に対する抵抗試験は、ｐＨが５，６
及び７になるように胆汁末を添加した各平板培地（ＭＲ
Ｓ寒天培地）に、供試菌株（乳酸菌）を塗抹培養後、発
育が阻止される胆汁末の最低濃度を測定し、該最低濃度
を供試菌に対する胆汁末の最小発育阻止濃度とすること
で行った。

【０１０７】すなわち、試験例２は、次のようにして行
った。

【０１０８】(a) 増菌用培地：ＭＲＳブイヨン（OXOI
D）

【０１０９】(b) 感受性測定用培地：ＭＲＳ寒天培地
（OXOID）

【０１１０】(c) 胆汁末：胆汁末〔和光純薬工業株製〕

【０１１１】(d) 感受製測定用平板培地の作製：滅菌精
製水で胆汁末の２００００ppm 懸濁液を調製し、さら
に、２倍希釈を行い、１００００，５０００，２５０
０，１２５０，６２５，３１３，１５６，７８及び３９
ppm 懸濁液を調製した。次に、加熱溶解した感受性測定
用培地に、上記の各供試品希釈段階懸濁液を培地の１／
９量加え、さらにｐＨ５，ｐＨ６及びｐＨ７に調整し、
充分に混合後シャーレに分注，固化させて、感受性測定
用平板培地とした。以上のように、ｐＨ５，ｐＨ６及び
ｐＨ７の三種類の感受性測定用平板系列を作製した。

【０１１２】(e) 接種用菌液の調製：増菌用培地で継代
培養した試験菌株を、接種，培養後，菌数が１０⁶ ケ／
mlになるように同培地で希釈して供試した。

【０１１３】(f) 培養：感受性測定用平板培地（ｐＨ
５，ｐＨ６及びｐＨ７の各々の系列）に接種用菌液をニ
クロム線（内径約１mm）で２cm程度画線塗抹し、３５℃
で１８〜２０時間嫌気培養した。

【０１１４】(g) 判定：所定の時間培養後、発育が阻止
された最低濃度をもって供試菌株に対する胆汁末の最小
発育阻止濃度とした。

【０１１５】その結果を、表２に示す。

【０１１６】

【表２】

【０１１７】

【試験例３】

【０１１８】病原菌に対する生育抑制試験は、腸内の病
原菌（大腸菌、サルモネラ、緑膿菌）の各菌株と供試菌
株（乳酸菌）とを単独にまたは組み合わせて液体培地に
添加して振とう培養し、それぞれ０時間（理論添加菌
数）の他に、３時間，６時間，９時間及び２４時間後に
ついて、液体培地１ml中における各生菌数と、各々の液
体培地のｐＨとを測定することで行った。

【０１１９】すなわち、試験例３は、次のようにして行
った。

【０１２０】(a) 試験病原菌：Escherichia coli IFO 3
301 （大腸菌），Salmonella typhimurium 実験室保存
株（サルモネラ），Pseudomonas aeruginosa IID P-1
（緑膿菌）

【０１２１】(b) 前培養培地：試験病原菌→普通寒天斜
面培地，供試菌株( 乳酸菌）→ＭＲＳ培地

【０１２２】(c) 接種用菌液の調製：試験病原菌は、３
５℃で一夜培養した後の前培養培地を、生菌数が１ml当
り１０³ 〜１０⁵ となるように、ＭＲＳ培地に浮遊して
菌液とした。乳酸菌は、３５℃で一夜培養した後の前培
養培地を、生菌数が１ml当り１０³ 〜１０⁵ となるよう
に、同培地を用いて希釈した。

【０１２３】(d) 試験用培地：ＭＲＳ培地を、水酸化ナ
トリウム溶液を使用して、ｐＨ７．０に調整して供試し
た。

【０１２４】(e) 菌数測定用培地：大腸菌，サルモネラ
→ＤＨＬ寒天培地、緑膿菌→１／２セトリマイド培地、
乳酸菌→１ppm硫酸コリスチン添加 ＭＲＳ寒天培地

【０１２５】(f) 培養：試験用培地１ml当りの菌数が各
菌株とも１０〜１０³ となるように、試験用培地１００
mlに対して、１mlの割合で接種用菌液を添加して充分に
混合後、それぞれ０時間（理論添加菌数），３時間，６
時間，９時間及び２４時間，３７℃の恒温水槽中で振と
う培養を行なった。試験は、試験病原菌と供試菌株（乳
酸菌）とを同一の試験用培地に接種したもの及び試験病
原菌と供試菌株とを各々単独で試験用培地に接種したも
のについて実施した。

【０１２６】(g) 生菌数の測定：上記のように培養を行
なった試験用培地中の生菌数を、各々菌数測定用培地を
使用して測定した。なお、乳酸菌数測定のための培養は
重層平板培養法（３５℃，２日間培養）で行い、試験病
原菌（大腸菌，サルモネラ，緑膿菌）数測定のための培
養は混釈平板培養法（３５℃，２日間培養）で行った。

【０１２７】本発明株を用いた結果を表３に、対照株１
を用いた結果を表４に、対照株２を用いた結果を表５
に、対照株３を用いた結果を表６に、対照株４を用いた
結果を表７に、それぞれ示す。

【０１２８】

【表３】

【０１２９】

【表４】

【０１３０】

【表５】

【０１３１】

【表６】

【０１３２】

【表７】

【０１３３】

【試験結果の考察】

【０１３４】表１より、本発明に係るラクトバチルス・
アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４は、対照株のいずれ
の乳酸菌よりも胃酸に対する耐性が極めて強いことが確
認された。

【０１３５】また、表２より、本発明に係るラクトバチ
ルス・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４は、対照株の
乳酸菌と同等以上に、胆汁酸に対しても抵抗性が非常に
高いことが確認された。

【０１３６】さらに、表３〜表７より、本発明に係るラ
クトバチルス・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４は、
前記病原菌に対して、対照株のいずれの菌と比較しても
著しい生育抑制効果があり、病原菌に対する抵抗性が強
いことが確認された。

【０１３７】

【使用例】

【０１３８】本発明に係る菌株を、幼動物に飲水混合し
て給与する場合について説明する。

【０１３９】例えば仔豚の場合、母乳の他に水分を補給
するため、飲水が不断給与される。

【０１４０】しかし、一般に幼動物の腸内菌叢は外界や
飼料などの変化に極めて影響を受け易く、有用菌が容易
に減少して大腸菌などの有害菌が速やかに増殖し易いた
め、幼動物は下痢を起こして死亡する例が多い。

【０１４１】現在は、このような事態を防ぐため、ワク
チンや抗生物質を投与しているが、この場合、残留によ
る害や耐性菌が問題となり、そのためこれらに代わる予
防策が必要とされている。

【０１４２】そこで、誕生２週令の仔豚３０頭を３群に
分け、７週令までＡ群は無添加の飲水、Ｂ群は本発明に
係る乳酸菌製剤添加の飲水（５×１０⁸ ケ／頭・日）を
飲水器を使用し、Ｃ群は本発明に係る乳酸菌製剤添加の
飲水（５×１０⁸ ケ／頭・日）を強制投与したところ、
Ａ群に比較して、Ｂ群，Ｃ群は治療の回数が少なく、特
にＣ群は治療の回数が少なく又、体重増加が大きいな
ど、明かに有意な差が認められ、本発明に係る乳酸菌製
剤の投与効果があることが確認された。

【０１４３】

【発明の効果】

【０１４４】本発明に係るラクトバチルス・アシドフィ
ルスＰＮ−ＲＩ−２−４は、胃酸や胆汁に対して抵抗性
が強いので、生きた菌のまま胃を通じて腸にまで到達す
ることができ、十分な生存安定性がある。

【０１４５】また、本発明に係るラクトバチルス・アシ
ドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４は、病原菌に対する抗菌
性が強く、病原菌の生育を抑制することができる。

【０１４６】該ラクトバチルス・アシドフィルスＰＮ−
ＲＩ−２−４を用いた乳酸菌製剤を人や動物に経口摂取
させることにより、腸内の有害菌を抑制し、また、ラク
トバチルス・アシドフィルスＰＮ−ＲＩ−２−４を含む
有用菌を増加させることができる。

【０１４７】従って、ラクトバチルス・アシドフィルス
ＰＮ−ＲＩ−２−４を用いた乳酸菌製剤は、生菌剤に求
められる諸条件に適合し、下痢などの病気の予防または
その治療効果が期待でき、発育促進や健康維持に役立つ
ものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内藤 秀雄 愛知県名古屋市西区笠取町２−62 (72)発明者 今井 健一 愛知県春日井市藤山台３−１−８−320− 405

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトバチルス・アシドフィルス（Lact
   obacillus acidophilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４〔微工研
   菌寄第１２３８７号〕。
2. 【請求項２】 ラクトバチルス・アシドフィルス（Lact
   obacillus acidophilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４〔微工研
   菌寄第１２３８７号〕を用いた乳酸菌製剤。
3. 【請求項３】 ラクトバチルス・アシドフィルス（Lact
   obacillus acidophilus）ＰＮ−ＲＩ−２−４〔微工研
   菌寄第１２３８７号〕を、発酵性糖類を主炭素源とした
   培地に接種して、通性嫌気性菌に適した培養条件で培養
   して増殖させた後、菌体を分離し、乳酸菌製剤とする、
   乳酸菌製剤の製造方法。