KR100443254B1 - 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 락토바실러스플란타룸 - Google Patents

내산성, 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 락토바실러스플란타룸 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 이를 유효성분으로 하는 식품 및 사료첨가제에 관한 것으로써, 보다 구체적으로는 김치로부터 분리 동정된 pH 2.5에서 내산성 및 400 ㎍/㎖ 담즙산에서 내담즙성을 갖고, 에놀플록사신, 틸로신 또는 에리스로마이신에 대한 항생제에 내성을 갖는 신규 락토바실러스 플란타룸 및 상기 균주를 유효성분으로 하는 식품 및 사료첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수하고, 장내 병원성 세균 억제 능력 및 장내의 유익한 균총 증가에 우수한 효과를 나타냄으로써 식품 및 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

내산성, 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 {Lactobacillus plantarum having acid-, bile acid- and antibiotic-resistance}
본 발명은 신규 유산균 및 이를 유효성분으로 하는 식품 및 사료첨가제에 관한 것으로써, 보다 구체적으로는 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 락토바실러스 속 균주 및 상기 균주를 유효성분으로 하는 식품 및 사료첨가제에 관한 것이다.
유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하는 최종 대사산물로 젖산을 상당량 생산하는 세균을 일컫는다. 유산균은 인간이 오래 전부터 이용하고 있는 미생물의 일종으로 우리나라에서는 김치 등에, 서양에서는 유가공 발효에 많이 이용하고 있다.
최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 발효유 제조, 건강 및 기능성 식품, 정장제, 의약품 및 생균제품 등에 널리 이용되고 있는 매우 중요한 산업용 균주이며 여기에 속하는 세균들로는 스트렙토코커스 속(Streptococcussp.), 페디오코커스 속(Pediococcussp.), 루코노스톡 속(Leuconostocsp.), 락토바실러스속(Lactobacillussp.), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacillussp.) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 있다. 또한 우리나라 고유의 채소류 발효식품인 김치에는 락토바실러스 속, 페디오코커스 속, 루코노스톡 속 및 바이셀라 속 등과 같은 유산균류가 주종을 이루고 있다.
상기 유산균들은 그람 양성균으로써 혐기성이거나 편혐기성인 성질을 지니고 있으며, 동물의 장내 소화관벽에 밀집, 정착하여 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하며, 젖산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
어린 동물은 장내 균총이 완전히 형성되지 않아 정상적인 장내 균총형성에 유익한 균주인 유산균이 요구되며, 스트레스나 유해물질의 흡수, 여행 및 음주 등에 의해 장내균총이 파괴되어 대장균과 같은 유해 균주에 의한 설사와 같은 질병의 발생을 억제하는 데에도 유산균이 요구된다. 또한 유산균은 인체의 장내 미생물 중 우세 균총의 하나로서, 감염에 대한 저항성, 항암효과, 혈액 내 콜레스테롤 함량의 저하 및 정장 효과와 같이 유익하게 작용한다고 보고된 바 있다(Hentges D. Hosono A.et al.,Agr. Biol. Chem.,1990, 54, 7, 1639∼1643).
또한, 유산균은 동물의 성장촉진 및 사료 이용률 개선, 병에 대한 저항력 증가, 유해세균의 증식억제, 폐사율 감소, 부패 독성 물질의 생성억제 및 각종 비타민 생성에 이용되고 있다.
유산균은 생균 자체를 이용하기 때문에 경구 섭취 시 인체 내의 가혹한 환경, 즉 pH가 3 이하로 내려가는 산성 환경과 위장과 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙산에 의해 생육이 저해되어 대장에 도달하는 생균수가 감소할 뿐만 아니라 장내 정착률이 저하된다는 문제점이 지적되고 있다. 또한, 유산균의 생균수에 따른 효능을 보고하면서 시판되고 있는 유산균 발효 우유를 섭취하였을 때 대장에 도달하여 정착하는 유산균의 생균수가 숙주에 유익한 작용을 할 정도의 충분한 양이 되지 못함을 보고하였다(Royet al.,J. Dairy Sci., 1990, 73, 1478∼1484). 또한 비피더스 발효음료의 제조에 있어서 내산성이 우수한 균주를 선발하는 것이 시급한 실정이다(Berradaet al.,J. Dairy Sci., 1991, 14, 409~413).
상기에서 보는 바와 같이, 유산균이 인체나 동물에서 유용한 효과를 나타내려면 외부로부터 유입되는 유산균이 아무런 장애 없이 장내에 도달하여 장의 점막에 부착된 후 그 기능을 나타내어야 한다. 이를 위해서는 직접 장에 부착될 수 있는 균주여야 하고, 경구투여서 위산에 의한 파괴가 적어야 하며, 담즙산에 대한 내성이 강해야 하며, 병원균의 살균능력이 강해야 한다.
대한민국 특허등록 제142615호에서는 한국인의 유아의 분변으로부터 내산성 및 콜레스테롤 분해능이 우수한 새로운 유산균을 분리하였다고 보고하였으나, 가축이나 인체 내에서 분리된 유산균의 효능에 대해서는 보고되지 않았다.
이에 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위해 한국 고유의 채소 발효식품인 김치로부터 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 락토바실러스 플란타룸을 분리, 동정하고, 분리된 유산균이 장내 유해균을 억제하고 사료 요구율을 개선시켜 가축의 성장을 촉진함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 유산균 및 상기 유산균을 유효성분으로 하는 식품 및 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pH 2.5에서 내산성 및 400 ㎍/㎖ 담즙산에서 내담즙성을 갖고 에놀플록사신, 틸로신 또는 에리스로마이신에 대한 항생제에 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸을 유효성분으로 하는 식품 및 사료첨가제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 pH 2.5에서 내산성 및 400 ㎍/㎖ 담즙산에서 내담즙성을 갖고 에놀플록사신, 틸로신 또는 에리스로마이신에 대한 항생제에 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum)을 제공한다.
본 발명에서는 국내에서 시판되고 있는 김치제품과 가정에서 제조된 다양한 종류의 김치를 사용하여 내산성, 내담즙성이 우수한 유산균을 분리, 선별하였다.선별한 유산균은 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성을 기초로 하여 분류하고 16S rRNA의 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다.
본 발명에서 분리, 선별한 유산균의 형태학적 및 생리학적 특징은표 1에서 보는 바와 같이, 타원형 모양이고, 그람 양성형이며, 포자를 형성하지 않으며, 운동성이 없고, 호기성 또는 혐기성 조건에서 모두 성장한다. 또한, 산화 및 발효를 하고 카탈라제나 옥시다제 활성이 없고, 글루코스 배지에서 성장하고, 15℃에서 성장하나 45℃에서는 성장하지 않고, 에스쿨린을 분해하나, 알지닌 또는 젤라틴을 분해하지 않고, 질산을 환원하지 않는다. 인돌이나 덱스트란을 형성하지 않고, 10% 알콜에서 성장하며, DL-락틱에시드를 생산하고, 염기서열에서 G 및 C 분자는 43%를 차지한다. 또한, 본 발명의 유산균의 당 이용성은표 2에서 보는 바와 같이 아라비노스, 셀로바이오스, 에스쿨린, 프룩토스, 글루코스, 갈락토스, 락토스, 말토스, 만니톨, 만노스, 멜레지토스, 라피노스, 리보스, 람노스, 살리신, 솔비톨, 수크로스, 트레할로스 및 자일로스를 당으로 이용하고, 셀룰로스 및 글루코네이트를 당으로 이용하지 않는다.
락토바실러스 플란타룸의 형태학적, 생리학적 특성
특 성 결 과 특 성 결 과
형태/그람형 타원형/그람양성 산화/발효 산화/발효
포자 - 에스쿨린 분해 +
운동성 - 질산 환원 -
공기중 성장 ＋ 알지닌 분해 -
혐기성 ＋ 젤라틴 분해 -
카탈라제 － 인돌 -
옥시다제 － 덱스트란 형성 -
글루코스(산) ＋ Mol% G+C 43
150C에서 성장 W 10% 알콜에서 성장 +
450C에서 성장 － DL-락틱에시드 +
락토바실러스 플란타룸의 당 이용성
당 결 과 당 결 과
아라비노스(arabinose) + 만노스(Mannose) +
셀룰로스(Cellulose) - 멜레지토스(Melezitose) +
셀로바이오스(Cellobiose) + 라피노스(Raffinose) +
에스쿨린(Esculin) + 리보스(Ribose) +
프룩토스(Fructose) + 람노스(Rhamnose) +
글루코네이트(Gluconate) - 살리신(Salicin) +
글루코스(Glucose) + 솔비톨(Sorbitol) +
갈락토스(Galactose) + 수크로스(Sucrose) +
락토스(Lactose) + 트레할로스(Trehalose) +
말토스(Maltose) + 자일로스(Xylose) +
만니톨(Mannitol) +
상기 균주의 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 상기 균주는서열번호 1의 염기서열을 가지는 "락토바실러스 플란타룸"으로 동정하였다. 본 발명에서는 상기 균주를 "락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) J-124"라고 명명하고, 이를 2002년 4월 15일자로 한국생명공학연구원(KRIBB)내 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10224BP).
본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 pH 1.5에서는 생존하지 못하였고, pH2.5에서는 처리 후 60분까지는 생존력이 90% 이상을 유지하며, 90분에도 50% 이상의 생존력을 나타냈다. 또한 pH 3.5에서는 처리 후 90분까지는 생존력이 95% 이상을 유지하며, 120분에도 70% 이상의 생존력을 나타냈다(표 6참조). 따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 pH 2.5의 강산에서도 생존력이 뛰어나 경구 섭취 후 인체내의 가혹한 환경, 즉 강산성의 환경에서도 생존이 가능하여, 생체 내에서 유익한 기능을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 담즙산 농도 100 ㎍/㎖에서 105배 희석까지 생존할 수 있고, 담즙산 농도 400 ㎍/㎖에서 104배 희석까지 생존할 수 있으며, 담즙산 농도 500 ㎍/㎖에서 103배 희석까지 생존할 수 있었다(표 7참조). 따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 담즙산 500 ㎍/㎖까지도 내성이 뛰어나 경구 섭취 후 소화기관 내에서 분비되는 담즙산에 의해 파괴되지 않아 생체 내에서 유익한 기능을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 에놀플록사신(Enorfloxacin), 틸로신(Tylosin) 또는 에리스로마이신(Erythromycin) 등의 항생제를 첨가한 배지에서 성장하는 것으로 나타났다(표 8참조). 따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 에놀플록사신, 틸로신 및 에리스로마이신 등의 항생제에 대한 내성을 갖고 있다. 이는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸을 항생제와 함께 혼합한 경우, 상기 항생제에 대해서 내성을 갖고 있기 때문에 균주가 죽지 않고 생존을 지속할 수 있기 때문에, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 사료 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸을 함유하는 식품을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 내산성 및 내담즙성이 우수해, 상기 균주를 경구 섭취하면 생체 내의 가혹한 환경, 즉 pH가 3 이하로 내려가는 산성 환경과 위장 및 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙산에 의해서도 생육이 우수해 장으로 도달할 수 있는 확률이 증가하고, 장내 정착률이 높아져 장내에서 기능을 할 수 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 항생제 내성이 우수하기 때문에 항생제의 존재하에서도 생육이 가능해 생체 내에서 유익한 기능을 할 수 있다.
따라서 내산성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 락토바실러스 플란타룸을 첨가하여 식품을 제조할 수 있고, 상기 식품은 유산 발효유, 생균제, 인체용 정장제, 요쿠르트, 생균활성제, 식품첨가제, 과채발효유 및 발효육 등이 될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 식품 g 당 107CFU 이상의 생균을 첨가하여 정제, 환제, 산제, 과립제 또는 캡슐제형으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸을 함유하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 항생제 내성이 우수하여 항생제를 첨가하여도 생존이 가능하고, 생체내에서도 우수한 내산성 및 내담즙성으로 장까지 도달하는 동안에 생존이 유지되기 때문에 장내 정착률이 높아져 장내에서 유익한 기능을 할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸을 첨가한 사료를 자돈에 투여하여 장내 균총의 변화를 측정한 결과, 락토바실러스 플란타룸을 첨가하여 투여한 군의 경우 인체에 유익한 균으로 알려진 효모는 대조군에 비해 상당히 증가하였고, 인체에 유해한 균으로 알려진 클로스트리듐 속(Clostridiumsp.)(Bizani D., J.Appl. Microbiol., 2002, 93(3):512-9)은 대조군에 비해 상당히 감소하였다(표 4참조). 따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 동물의 장내에서 효모를 상당히 증가시키고, 클로스트리듐 속을 상당히 감소시켜 장내에 유익한 균의 성장을 촉진하고 장내 유해한 균의 성장을 억제함으로써 동물의 건강을 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸을 사료에 첨가하여 자돈에 투여한 뒤 자돈의 무게 및 사료 섭취량을 측정하여 동물의 성장 및 사료 요구율을 측정한 결과, 락토바실러스 플란타룸을 사료에 첨가한 군의 무게는 대조군에 비해 월등히 증가하였고, 사료 요구율은 대조군에 비해 낮았다(표 5참조). 따라서, 락토바실러스 플란타룸을 첨가한 사료를 투입하면 사료만 투입한 대조군에 비해 사료 요구율이 낮아 적은 양의 사료 섭취로도 자돈의 무게를 증가시킬 수 있어 동물의 성장을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸을 함유하는 사료첨가제는 돼지, 가금류, 또는 어류 등의 동물 성장 촉진용 사료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸을 함유하는 사료첨가제는 사료 1 g당 락토바실러스 플란타룸을 105개 내지 1010개 이상을 첨가하는 것이 바람직하며, 107개 내지 109개로 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유산균 분리 및 동정
본 발명자들은 국내에서 시판되고 있는 김치제품과 가정에서 제조된 다양한 종류의 김치를 사용하여 유산균을 분리하였다.
김치 시료로부터 김치 발효액만을 분리하여 김치액 1 ㎖을 멸균한 생리식염수에 101내지 107배로 단계적으로 희석한 후, 각 희석액 0.1 ㎖을 엠알에스(MRS, 배지 조성은표 3참조) 한천배지에 도말하고 30℃에서 24시간동안 배양하여 유산균만을 분리, 선별하였다.
엠알에스 배지 조성
성분 농도(g/ℓ)
프로테오스 펩톤 10
우육추출물 10
효모추출물 5
포도당 20
트윈 80 1
구연산암모니움 2
초산나트륨 5
황산마그네슘 0.1
황산망간 0.05
인산나트륨 2
증류수 1 ℓ
본 발명자들은 상기에서 선별한 유산균을 동정하기 위하여 상용화된 API 킷트(바이오레이욱스사, 프랑스)를 이용하여 유산균의 생화학적 특성을 조사하였다(표 1,표 2참조).
그 결과, 상기에서 선별한 유산균의 형태학적 및 생리학적 특징은표 1에서 보는 바와 같이 그람 양성형이고, 포자를 형성하지 않으며, 운동성이 없고, 호기성또는 혐기성 조건에서 모두 성장을 하며, 카탈라제나 옥시다제를 생산하지 않으며, 글루코스 배지에서 성장하고, 15 ℃에서 성장하나 45 ℃에서는 성장하지 않고, 에스쿨린을 분해하나, 알지닌 또는 젤라틴을 분해하지 않고, 질산을 환원하지 않으며, 인돌, VP 또는 덱스트란을 형성하지 않고, 10% 알콜에서 성장하고, DL-락틱에시드를 생산하고, 염기서열에서 G 및 C 분자는 43%를 차지한다.
또한, 본 발명의 유산균의 당이용성은표 2에서 보는 바와 같이 아라비노스, 셀로바이오스, 에스쿨린, 프룩토스, 글루코스, 갈락토스, 락토스, 말토스, 만니톨,만노스, 멜레지토스, 라피노스, 리보스, 람노스, 살리신, 솔비톨, 수크로스, 트레할로스 및 자일로스를 당으로 이용하고, 셀룰로스 및 글루코네이트를 당으로 이용하지 않는다.
또한, 본 발명자들의 상기 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 염기서열을 자동 염기서열 분석기로 분석한 결과, 상기 균주는서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 플란타룸으로 동정되었다. 본 발명자들은 상기 균주를 '락토바실러스 플란타룸 J-124'로 명명하고, 이를 2002년 4월 15일자로 한국생명공학연구원(KRIBB) 내 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10224 BP).
<실시예 2> 락토바실러스 플란타룸 J-124를 자돈에 투여시 효과
본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 J-124가 자돈에 대한 사료요구율 및 체중 증가에 미치는 효과에 대하여 조사하였다.
락토바실러스 플란타룸 J-124를 엠알에스 액체배지에서 30℃로 18시간 동안 정치 배양한 후 원심 분리하여 미생물을 회수하고, 세포수가 1010CFU/㎖이 되도록 10% 탈지분유 안정제에 현탁하고 동결 건조하여 유산균 분말을 제조하였다. 유산균 분말을 말분과 혼합, 분산시키고 자돈에 투여하는 경우에는 사료에 이를 혼합하여 사용하였다. 경기도 안성에 위치한 종축장에서 각 군당 12 마리씩 구분하여 3주령된 자돈을 대상으로 본 발명의 유산균을 43일 간 투여하였다. 이 때 대조군은가축사료 투여군, 실험군은 가축사료에 락토바실러스 플란타룸 J-124 유산균 분말을 혼합하여 투여한 군으로 상기 군의 사료요구율, 체중 증가율 및 유해균 억제능을 측정하였다(표 4, 표 5).
그 결과 대조군에 비해 락토바실러스 플란타룸 J-124를 자돈에 투여하였을 때 장내 균총은 효모의 성장이 대조군에 비해 상당히 증가한 반면 클로스트리듐의 성장은 대조군에 비해 상당히 감소하였다(표 4). 또한, 대조군에 비해 자돈의 사료 섭취량이 29 ㎏ 증가하고, 자돈의 무게가 25 ㎏ 증가하였다. 사료의 섭취량을 자돈의 무게 증가로 나누어서 계산한 자돈의 사료 요구율은 대조군에 비해 0.4 감소한 것으로 나타났다(표 5). 따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 J-124는 자돈의 장내 균총을 효과적으로 증식시키고, 사료 요구율을 감소시킴으로써 사료첨가제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
락토바실러스 플란타룸 J-124의 자돈 투여 시 장내 균총의 변화 측정
대조군 락토바실러스 J-124 투여군
실험 전 실험 후 실험 전 실험 후
효모(Yeast) 4.9 ±1.19* 4.4 ±0 3.4 ±0.14 7.2 ±0
락토바실러스 속(Lactobacillussp.) 8.0 ±1.03 8.6 ±0.50 7.6 ±0.96 8.4 ±0.31
클로스트리듐 속(Clostridiumsp.) 6.7 ±1.13 7.7 ±0.67 7.7 ±1.13 7.6 ±0
유박테리움(Eubacterium) 8.3 ±0.62 6.1 ±0 8.4 ±0.91 7.1 ±0
전체 갯수 9.4 ±0.16 8.9 ±0.36 9.3 ±0.38 8.9 ±0.27
*log10(균수/돼지 분변 1g) 로서 평균 ±표준편차로 표기함
자돈에 투여시 락토바실러스 플란타룸 J-124의 효능 측정
항목 대조군 락토바실러스 플란타룸 J-124
자돈의 연령 (days) 21 21
실험기간(days) 43 43
초기 자돈의 수 12 12
최종 자돈의 수 12 12
초기 자돈의 평균 무게(kg) 82.8 84.5
최종 자돈의 무게(kg) 288.3 314.7
자돈 무게의 평균 변화량(kg) 205.5 230.2
자돈의 증체지수(%) 100.00 112.02
평균 사료 섭취량(kg) 310 339
사료요구율(자돈무게/사료섭취량) 1.51 1.47
<실시예 3> 락토바실러스 플란타룸 J-124의 내산성 측정
본 발명자들은 위산과 같은 소화효소에 대해 락토바실러스 플란타룸 J-124가 생존하는 능력을 알아보았다.
구체적으로, 락토바실러스 플란타룸 J-124를 엠알에스 액체 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 정치 배양하여 유산균의 농도가 109내지 1010CFU/㎖이 되도록 하였다. 배양된 유산균은 6,000 rpm으로 10분 간 원심 분리하여 유산균을 수집하고, 이를 멸균수로 두 번 세척하여 1/10로 농축하여 세포수가 약 1010CFU/㎖이 되도록 하여 사용하였다. 멸균된 pH 2의 완충용액에 농축된 락토바실러스 플란타룸 J-124을 첨가한 후 30℃ 항온수조에 담아 2시간 동안 방치한 후 멸균수에 일정비율로 희석하여 엠알에스 평판배지에 도말하여 나타난 집락수(colony forming unit, CFU)를 비교하여 유산균의 생존력을 표시하였으며 유산균의 생존력은 하기의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
생존력(%) = A/B ×100
A : 시간 경과 후 생균수, B : 반응 초기의 생균수
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 J-124는 pH 1.5에서는 생존하지 못하였고, pH 2.5에서는 30분, 60분, 90분 및 120분이 지남에 따라 생존력이 각각 92.98%, 92.98%, 56.14% 및 31.58%의 생존력을 나타내어, 처리 후 60분까지는 생존력이 90% 이상이며, 90분에도 50% 이상의 생존력을 나타내었다. 또한 pH 3.5에서는 30분, 60분, 90분 및 120분이 지남에 따라 생존력이 각각 101.03%, 96.49%, 96.49% 및 71.93%의 생존력을 나타내어, 처리 후 90분까지는 생존력이 95% 이상이며, 120분에도 70% 이상의 생존력을 나타내었다(표 6).
따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 J-124는 pH 2.5 내지 pH 3.5의 강산에서도 생존력이 뛰어나 내산성이 뛰어난 균주임을 알 수 있다.
락토바실러스 플란타룸 J-124의 내산성 측정
pH 처리시간(분)에 따른 생존능
0 30 60 90 120
1.5 100* 0 0 0 0
2.5 100 92.98 92.98 56.14 31.58
3.5 100 101.03 96.49 96.49 71.93
* 생존능은 상기 수학식 1에 의거하여 표기하였음.
<실시예 4> 락토바실러스 플란타룸 J-124의 내담즙성 측정
본 발명자들은 생체내에서 소화되면서 분비되는 담즙산에 대한 락토바실러스 플란타룸 J-124의 생존능을 측정하였다.
멸균된 담즙산이 300 ㎍/㎖이 첨가된 용액에 락토바실러스 플란타룸 J-124를 첨가하여 30℃ 항온수조에 담아 2시간 동안 방치한 후 멸균수에 일정비율로 희석하여 엠알에스 평판배지에 도말하여 나타난 집락 수(colony forming unit, CFU)를 비교하여 유산균의 생존력을 표시하였다.
그 결과, 대조군으로 담즙산이 첨가되지 않은 배지에서는 10배씩 희석함에 따라 락토바실러스 플란타룸 J-124의 집락수가 감소하여 107배 희석하면 평균 3.5개의 집락수를 보이고, 100 ㎍/㎖ 담즙산 농도에서는 10배씩 희석함에 따라 집락수가 감소하여 105배 희석하면 평균 1개의 집락수를 보였다. 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ 담즙산 농도에서는 10배씩 희석함에 따라 집락수가 감소하여 104배 희석하면 각각 평균 1.5개, 1개 및 0.5개의 집락수를 보이며, 500 ㎍/㎖ 담즙산 농도에서는 10배씩 희석함에 따라 집락수가 감소하여 103배 희석하면 평균 2.5개의 집락수를 보였다(표 7).
상기의 결과를 통해 락토바실러스 플란타룸 J-124는 담즙산 농도 100 ㎍/㎖에서 105배 희석까지 생존할 수 있고, 담즙산 농도 200 내지 400 ㎍/㎖에서 104배 희석까지 생존할 수 있으며, 담즙산 농도 500 ㎍/㎖에서 103배 희석까지 생존할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 락토바실러스 플란타룸 J-124는 담즙산 농도 0 내지 500 ㎍/㎖에서 생존 가능하며, 100 내지 400 ㎍/㎖에서 더욱 높게 생존 가능하며, 200 내지 400 ㎍/㎖에서 가장 높게 생존 가능하여 내담즙성이 뛰어남을 알 수 있다.
락토바실러스 플란타룸 J-124의 내담즙성 측정
담즙산 농도(㎍/㎖) 희석 인자
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
0 > > > > > 7481 43
100 > > 6061 106 20 0 -
200 > 3844 71 12 - - -
300 > 1216 35 20 0 - -
400 > 1119 21 10 0 - -
500 > > 41 0 0 0 -
> : 집락수가 많아 셀 수 없음을 나타내고,
- : 집락수가 없음을 나타낸다.
<실시예 5> 락토바실러스 플란타룸 J-124의 항생제 내성 측정
본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 J-124가 항생제에 내성을 가지는지 측정하였다. 항생제 내성의 실험은 마이크로필터(0.2 ㎛)로 제균된 각각의 항생제 용액(30 ㎍)을 종이판에 처리하고 건조시킨 후, 1％ 농도의 시험균이 함유된 0.7％ 소프트 아가 10 ㎖이 뒤덮인 엠알에스 아가 플레이트에 얹은 뒤 30℃에서 48시간 배양하여 판 주위에 나타나는 투명환의 크기를 측정하였다.
그 결과, 에놀플록사신 주위에는 11 mm의 투명환, 틸로신 주위에는 12 mm의 투명환 및 에리스로마이신 주위에는 13 mm의 투명환이 형성되었다(표 8).
따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 J-124는 항생제 에놀플록사신, 틸로신 및 에리스로마이신에 대해 내성을 갖는 것을 알 수 있다.
락토바실러스 플란타룸 J-124의 항생제 내성
항생제(30㎍/판) 투명환의 크기(㎜)
징크 바시트라신(Zinc bacitracin) -
옥시테트라사이클린(Oxytetracycline) -
콜리스틴(Colistin) -
코로테트라사이클린(Chorotetracyclin) -
에놀플록사신(Enorfloxacin) 11
틸로신(Tylosin) 12
젠타마이신(Gentamicin) -
에리스로마이신(Erytromycin) 13
옥시테트라사이클린(Oxytetracycline) -
세파렉신(Cephalexin) -
- : 투명환이 형성되지 않음을 의미한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 함유하는 식품 및 사료첨가제에 관한 것으로써, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸은 내산성이나 내담즙성 및 항생제 내성이 우수하고, 장내 병원성 세균 억제 능력 및 장내의 유익한 균총 증가에 우수한 효과를 나타내고, 가축의 사료 요구율을 저하시켜 식품 및 사료첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Lactobacillus plantarum having acid-, bile acid- and antibiotic-resistance <130> 2p-07-06 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 705 <212> DNA <213> Lactobacillus Plantarum J-124 <400> 1 cgaacgctgc cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacga actctggtat tgattggtgc 60 ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg 120 cccagaagcg ggggataaca cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca acttggaccg 180 catggtccga gcttgaaaga tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt 240 agctagatgg tggggtaacg gctcaccatg gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta 300 atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 360 cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc 420 tcgtaaaact ctgttgttaa agaagaacat atctgagagt aactgttcag gtattgacgg 480 tatttaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540 aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt 600 gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga 660 ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatg 705

Claims (5)

  1. pH 2.5에서 내산성 및 400 ㎍/㎖ 담즙산에서 내담즙성을 갖고 에놀플록사신, 틸로신 또는 에리스로마이신에 대한 항생제에 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum).
  2. 제 1항에 있어서, 락토바실러스 플란타룸 J-124(수탁번호 : KCTC 10224BP)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸.
  3. 제 1항의 락토바실러스 플란타룸을 함유하는 식품.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 식품은 유산 발효유, 생균제, 인체용 정장제, 요쿠르트, 생균활성제, 식품첨가제, 과채발효유 또는 발효육인 것을 특징으로 하는 식품.
  5. 제 1항의 락토바실러스 플란타룸을 함유하는 성장 촉진용 사료첨가제.
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