KR100490284B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군을 유발하는 바이러스의 생육을억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스훼칼리스 프로바이오-64 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군을 유발하는 바이러스의 생육을 억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64)에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 내산성, 내 담즙산성을 지니면서 동시에 병원성 미생물과 바이러스의 생육을 억제하는 효과가 우수한 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64가 제공된다.

또한, 본 발명의 Probio-64를 함유하는 약학적 또는 식품학적 조성물, 상기 미생물을 이용한 장내 유해 미생물의 생육 억제하는 방법 및 가축용 생균활성제가 제공된다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군을 유발하는 바이러스의 생육을 억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 프로바이오-64{NEW ACID TOLERANT PROBIOTIC ENTEROCOCCUS FAECALIS PROBIO-64 THAT CAN SUPPRESS THE GROWTH OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS}

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군을 유발하는 바이러스의 생육을 억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 프로바이오-64 에 관한 것이다.

돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)의 원인체인 PRRSV 바이러스는 피막이 있는 RNA 바이러스로 낮은 온도에서도 안정하다.

이 바이러스는 돼지호흡기 복합증후군(PRDC) 또는 이유후 전신성 소모성증후군(PMWS)을 유도하는 요인으로서 매우 중요하게 인식되고 있다.

발생현황으로는 북미, 유럽, 아시아 전역의 여러 나라에서 발생하고 있으며 우리나라도 1993년에 최초로 감염이 확인되었으며, 현재는 80 % 이상의 농장에서 항체 양성율이 나타난다. 국내에서는 양돈장의 위생상태, 사양관리상태에 따라 다양하게 나타난다.

전파경로를 살펴보면 감염된 돼지로부터 직접 접촉에 의한 감염, 야생동물, 사료와 물의 오염, 공기 감염, 태반 감염, 정액을 통한 감염을 들 수 있다.

임상증상으로는 번식장애로서 임신돈에 감염되어 바이러스가 태반을 통해 태아에 감염되어 유산 또는 사산이 일어나는데 특히 임신 말기에 유산이나 조산이 특징이다. 정상적인 교배에도 불구하고 재발이 증가하여 수태율이 떨어진다. 태어잔 자돈은 허약자돈, 사산, 대형 미이라가 많이 나타난다.

호흡기 관련 증상으로는 PRRSV 단독 감염으로 인한 피해보다는 2차적으로 세균성 호흡기 질병과 복합감염시 피해가 매우 크다. 위생상태나 백신 프로그램이 비슷한 농장에서 피해정도가 다양하게 나타날 수 있다.

뿐만 아니라, 대장균에 의한 2차 감염으로 그 폐해가 더욱더 증가하고 있는 실정이다.

돼지 생식기 호흡기 증후군은 바이러스성 질병이므로 항생제를 투여하더라도 바이러스에 대한 치료 효과를 볼 수 없으며 단지 2차 감염을 일으키는 미생물에 대한 치료 효과만 기대할 수 있다.

그러나, 항생제의 남용을 기피하는 세계적인 추세와 육류 내의 잔류 항생제가 인체로 이전되는 문제가 발생하게 되어 항생제 대체물질에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있다.

또한, 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)은 바이러스의 감염 예방을 위해 백신이 사용되고 있으나 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 제기되고 있다.

PRRSV에 의해서 돼지 생식기 호흡기 증후군과 함께 유도될 수 있는 이유 후 전신소모성증후군(Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)은 1990년대 캐나다의 조기 이유 실시 양돈장에서 처음 발생하였으며, 돼지써코바이러스 2형이 주요 병인체로 주목을 받고 있다.

현재까지 이에 대한 백신이 개발되지 않아 한번 발생하면 치료하기 힘든 것으로 알려지고 있으며, 더욱이 돼지가 이 질병에 걸리면 면역체계가 망가져 호흡기 질병이나 폐렴 등 2차 질병이 유발된다.

인체 및 동물체의 장내에는 다양한 미생물들이 존재하면서 장내의 미생물 균총을 이루고 있다.

이러한 미생물 중에는 숙주 동물에 유용한 것으로 알려져 온 유산균 등의 유익한 미생물들이 있는가 하면 반대로 숙주에 직접적 또는 잠재적인 유해성을 가지는 대장균, 살모넬라, 포도상구균 등의 미생물들이 있다.

인체 및 동물체의 경우 스트레스의 증가, 유해세균의 감염, 외부 환경의 변화에 의해서 장내 미생물 균총이 파괴될 경우 유해 미생물들의 급격한 성장을 초래하여, 숙주동물의 건강상태를 악화시키게 된다.

이러한 변화는 설사에서부터 심지어는 폐사의 위험으로까지 진행될 수 있으며, 이때 치료의 목적으로 항생제를 투여하게 되고, 사용된 항생제는 체외로 완전히 배설이 되지 않고 숙주 내에 잔류하며, 지속적인 투여 시 유해미생물들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료를 할 수 없게 된다.

또한, 현재는 가축의 경우 육류, 우유, 난 등의 항생제 잔존량에 대한 규제가 갈수록 엄격해지고 있으므로 계속적인 항생제의 사용 및 남용은 재고해야 할 문제로 이미 대두되어왔다.

이에 대한 대안으로 현재 생균활성제인 프로바이오틱스에 대한 관심이 증대되고 있다.

생균활성제인 프로바이오틱스는 인체나 동물의 장내에 서식하는 유익한 미생물을 분리하여 제제화한 것으로 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 유산균들이 주요 균주로 이용되고 있다.

이러한 유산균들은 전통적으로 식품의 발효와 가공과정에 다양하게 이용되었으며, 그들의 안전성은 오래 전부터 인지되어 미국의 FDA는 GRAS(Generally recognized as safe) 목록에 이들 중의 일부를 포함시키고 있다.

따라서, 유산균을 이용한 생균활성제 프로바이오틱스는 항생제 남용으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 일으키지 않고, 장내 유해 세균의 이상발효를 억제하여 안정된 장내 균총을 유지하며 유해 미생물의 감염으로 인한 질병을 감소시킬 수 있다.

또한, 생균활성제의 지속적인 투여는 사료효율을 높여주고 건강 유지를 통해 증체량의 증대를 꾀할 수 있다.

생균활성제로서의 효과적인 사용을 위해서는 유해한 미생물에 대한 억제 활성뿐만 아니라 내 산성, 내 담즙산성을 지니는 것이 매우 중요하다.

동물체에 생균활성제를 투여할 후 경우 장에 도착할 때까지는 강산인 위액을 만나게 되고 그 다음 담즙산을 만나게 된다.

이들 위액과 담즙산은 일반적으로 세균을 죽이거나 활성을 떨어뜨리기 때문에 투여된 생균활성제가 무사히 장에 도달하여 그 기능을 발휘하기 위해서는 위액과 담즙산에 견딜 수 있는 성질을 가지고 있어야 한다.

한국등록특허공보 특10-0445292(다기능 프로바이오틱능력을 가지는 신규 엔테로코카스 페시움 유비티-엠01)에는, 각종 병원균의 증식을 억제하거나 살균작용을 가지며, 사료의 효율을 개선시키며, 폐사율을 줄이고, 계란의 증산, 체중증가, 질병의 예방과 치료에 이용될 수 있는 다기능의 프로바이오틱 능력을 가지는 신규 엔테로코커스 페시움 유비티 엠-11에 관한 것이 공개되어 있으나, 각종 병원균의 증식을 억제하는 작용보다는 사료의 효율을 높이는데 중점을 두고 있다.

또, 본 발명의 출원인이 선출원한 한국공개특허공보 특2003-0002568(가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성 미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 및 이를 함유한 생균활성제)에는, 동물체의 체내 및 장내의 유해한 성질을 나타내는 여러 종의 병원성 미생물 및 살모넬라 갈리나룸의 생육을 효과적으로 억제하는 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 ( KCTC 10391BP)에 관한 것이 공개되어 있으나, 가금티푸스를 유발하는 살모넬라 갈리나룸을 억제하는 것에 중점을 두고 있어 본 발명의 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스를 억제하는 것과는 차이가 있다.

본 발명은, 인간 및 동물에는 해가 없고, 내 산성 및 내 담즙성이 뛰어난 신규 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64 ; KCTC 10723BP)를 제공하는 데 목적이 있다.

또, 본 발명은 기존 항생제의 대체용으로 가축에게 투여하거나 , 의약품, 사료첨가제, 동물약품 등으로 사용하여 장내의 유해한 병원성 미생물의 생육을 탁월하게 억제할 뿐만 아니라, 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 생균활성제 함유 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스 및 유해 병원성 미생물의 생육을 억제하는 신규한 내산성 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64 (Enterococcus faecalis Probio-64)에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 내산성, 내 담즙산성을 지니면서 동시에 병원성 미생물과 바이러스의 생육을 효과적으로 억제하는 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64 ; KCTC 10723BP)와, 상기 미생물을 함유하는 생균활성제 및 약학적 또는 식품학적 조성물, 상기 미생물을 이용한 장내 유해 미생물의 생육 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 종래의 유산균제제 보다 유해 미생물들을 더욱 효과적으로 억제할 수 있는 내산성, 내 담즙산성을 지니며, 추가적으로 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스의 증식을 억제하고 면역 활성이 우수한 신규 유산균제제의 탐색을 시도하였다.

그 결과, 본 발명 신규 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64는 가축에서 유래한 장내세균으로, 해로운 병원성 미생물들의 생육을 억제할 수 있고, 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있어 결과적으로 가축의 생식기 및 호흡기 질병을 예방 및 치료 할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 미생물은 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-64는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 균주로서 99.5%의 16S rDNA 상동성으로 엔테로코커스 훼칼리스(Enterococcus faecalis)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.

본 균주의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열목록에 기재하였다(서열번호 1).

또한, 상기 균주를 엔테로코커스 훼칼리스속에 속하는 균주 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64)로 명명하고, 특허출원을 위한 국제미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2004년 11월 15일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10723BP).

본 발명의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64 균주의 형태 및 생리·생화학적 특성을 조사한 결과는 다음과 같다.

Probio-64는 그람양성 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 구균이다.

가스와 인돌을 생성하지 않으며, 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않으며, 0.5 % 담즙산에 내성을 나타낸다.

또, 상기 균주의 성장 조건으로는 30 ∼ 37 ℃가 바람직하였다.

본 발명의 미생물은 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 영하 80 ℃에 보관하거나 멸균된 10 % 탈지유에 현탁하여 동결 건조하는 것이 바람직하다.

본 발명 신규 프로바이오틱 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64는 장 세포에 흡착할 수 있을 뿐만 아니라, 다음과 같은 프로바이오틱 특성을 보유한다.

- 호기적, 혐기적 조건 및 다양한 pH에서의 생장 능력

; 이러한 성질은 위장관내에서 변화되는 다양한 생리적 및 병리적 조건에 잘 적응할 수 있는 능력을 부여한다.

- 위산 및 담즙산 내성

- 동결건조에서의 생균활성 보유 능력

- 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) 원인체 바이러스 증식 억제 능력

또한, 본 발명 신규 미생물은 공지의 다른 예방 또는 치료방법과 같이 항생제 내성이나 생물 독성 등의 부작용이 없는 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, '프로바이오틱(probiotic)’은 ‘사람을 포함한 동물의 위장관내에서 숙주의 장내 미생물 균형을 개선하여 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물’의 의미로 이해된다.

프로바이오틱 미생물은 프로바이오틱 활성을 갖는 살아 있는 미생물로 단일 또는 복합 균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.

구체적으로, 장내 유해 미생물 생육억제 활성을 가지면서, 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스의 증식을 효과적으로 억제하고, 내 산성, 내 담즙산성을 보유한 미생물을 탐색하는 과정은 다음과 같았다.

즉, 혐기백(상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)에 가축의 대장 내용물을 채취하여 호모게나이저로 균질화시키고 5 g을 취하여 pH2로 조정한 혐기 희석액 45 ㎖에 넣어 1 : 10 의 비율로 희석한 다음, 진탕기를 이용하여 120 분간 진탕하였다.

진탕액 1 ㎖를 옥스갈(디프코사 제품, 상품명) 0.5 %를 첨가한 BL 고체배지 (일본 영연화학사 제품)에 도말하고, 37 ℃에서 48 시간 혐기장치를 이용하여 배양하였다.

배양이 끝난 후 형성된 집락(colony) 500 개를 선발하여 배지(GAM semi-agar)에 옮겨 배양한 뒤, 영하 80 ℃에서 보존하였다.

본 발명의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64를 이용한 장내 유해 미생물의 생육 억제방법의 한 바람직한 실시예는 다음과 같다.

본 발명의 엔테로코커스 훼칼리스 (Enterococcus faecalis) Probio-64가 유해 미생물을 억제하기 위한 최적온도 조건으로는 30 ~ 37 ℃가 바람직하다.

분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등의 문헌(Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990)을 변형하여 실린더 플레이트(cylinder plate) 법으로 실시하였다.

배양 후 나타난 억제환의 직경을 측정하여 분리균주의 병원성 미생물에 대한 생장 억제 능을 비교하였다.

항생제 평가 시 사용되는 미생물 10종은 한국생명공학연구소에서 분양받아 사용하였으며, 그 종류는 다음과 같다 : 대장균 ( E. coli KCTC 2441), 클렙지엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae KCTC 2208), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus KCTC 1621), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis KCTC 1917), 시겔라 플렉너리(Shigella flexneri KCTC 2008), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 엔테로박터 틀로아세(Enterobacter cloacea KCTC 2361), 살모넬라 타이필무리움(Salmonella typhimurium), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii KCTC 2006), 메틸로시누스 트리초스포리움(Methylosinus trichosporium KCTC 2591).

상기의 유해 미생물들을 NB(nutrient broth) 액체배지에서 배양한(37 ℃, 18 시간) 후 배양액 0.1 ㎖를 취하여 NA(nutrient agar) 고체배지에 도말하고 건조시킨 다음 지름 8 ㎜의 실린더를 배지 위에 올려놓았다.

분리한 미생물들은 MRS 액체배지에서 혐기적으로 배양한(37 ℃, 18시간) 후, 분리한 미생물이 생산하는 항균물질을 추출하기 위하여 분리 균주 배양액에 같은 양의 차가운 아세톤을 넣고, 24 시간을 방치한 다음 원심분리하고, 상등액을 감압 농축하여 항균력 측정에 사용하였다.

위의 NA(nutrient agar) 배지에 올려놓은 지름 8 ㎜의 실린더에 농축액 50㎕를 접종하고 배양(37 ℃, 24 시간)하였다.

일정 시간의 배양이 끝난 다음 형성된 생육 억제 환(clear zone)을 측정하여 대조구와 비교하고, 유해한 병원성미생물의 생육억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-64로 명명하였다.

본 발명의 균주 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64)가 유해한 병원성 미생물의 생장을 억제하는 억제환의 지름(단위는 mm)은 다음과 같았다.

대장균(E. coli KCTC 2441)에 대해 19 ㎜,클렙지엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumoniae KCTC 2208)에 대해 16 ㎜, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 1621)에 대해 18 ㎜, 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis KCTC 1917)에 대해 18 ㎜, 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에 대해 19 ㎜, 엔터로박터 클로세아(Enterobacter cloacea KCTC 2361)에 대해 18 ㎜, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)에 대해 20 ㎜, 시트로박터 푸룬디(Citrobacter freundii KCTC 2006)에 대해 16 ㎜, 시겔라 플렛네리(Shigella flexneri KCTC 2008)에 대해 14 ㎜, 메틸로시누스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium KCTC 2591)에 대해 17 ㎜로 나타났다.

본 발명의 한 유익한 측면에 있어서, 본 발명은 신규의 프로바이오틱 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64)를 함유하는 식품, 의약품, 동물약품, 사료첨가제를 제공한다.

본 발명 미생물은 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로, 또는 첨가되어 사용되거나 가축이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명 미생물은 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 부여함) 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 증강시키거나 보완함)에 첨가되어 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적, 수의학적 또는 영양학적 조성물은 분리된 프로바이오틱 세균으로 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64) 또는 이와 함께 2 종 이상의 다른 유익한 균주와 적당한 담체를 함께 포함할 수 있다.

예컨대, 본 발명 조성물에 본 발명 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취 시 유해 바이러스나 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이 바람직하다.

그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로마이세스(Saccharomyces,) 캔디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토루롭시스(Torulopsis)를 포함하는 효모(yeasts), 아스퍼질러스(Aspergillus), 라이조푸스(Rhizopus), 무코(Mucor), 페니실리움(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 류코노스톡(Leuconostoc), 박테로이드(Bacteroides), 스타필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 푸소박테리움(Fusobacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스 (Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 그리고 마이크로코커스(Micrococcus) 속 세균들이 있다.

적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cereviseae), 바실러스균(B. coagulans, B. licheniformis, B. subtilis), 비피더스균(B. bifidum, B. infantis, B. longum), 엔테로코커스균( E. faecalis, E. faecalis), 락토바실러스균(L. acidophilus, L. alimentarius , L. casei, L. curvatus, L. delbruckii, L. johnsonii, L. farciminus , L. gasseri, L. helveticus, L. rhamnosus, L. reuteri, L. sake, L. lactis), 마이크로코커스 바리안스(Micrococcus varians), 페디오코커스 아시딜란티(Pediococcus acidilactici), 및 스타필로코커스 지로수스(Staphylococcus xylosus) 등을 들 수 있다.

엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(KCTC 10723BP) 또는 이들 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명 조성물에 추가로 포함할 수 있다.

본 발명 조성물에 함유될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당 업계에 충분히 공지되어 있다.

본 발명 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64 균주는 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.

통상적인 항생제 대신에, 본 발명 신규 미생물 및 조성물은 생균활성제로 동물에 투여되거나 식품, 의약품, 동물약품 또는 사료첨가제와 함께 동물에 투여될 수 있다.

이러한 생균활성제는 기존 항생제의 대체용으로 장내 유해한 미생물을 억제하며 안정된 장내 균총의 유지를 통해 동물체의 건강상태를 양호하게 하고 가축의 증체량과, 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 등의 목적으로 사용할 수 있다.

본 발명 조성물은 또한 장내 미생물 균총을 유지하기 위해 항생제 투여 후에도 투여될 수 있다.

특히, 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) 원인체 바이러스의 생육 억제 능을 갖는 본 발명 신규 미생물은 특히, 다른 치료법이 비효과적이거나 부작용이 있는 돼지 생식기 호흡기 증후군, 장내 유해미생물 감염에 의해 유발된 대부분의 질병 증상 완화나 치료에 매우 유용하다.

그리하여, 본 발명은 신규 미생물 또는 이를 유효량 함유한 조성물을 사용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) , 장내 유해미생물 감염에 의해 유발된 대부분의 질병 증상 완화나 치료하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예와 실험 예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 내 산성, 내 담즙산성 특성을 갖는 세균의 분리

가축의 대장 내용물을 채취하여 혐기백 (상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)을 이용하여 혐기적으로 운반하였다.

채취한 위 내용물을 호모게나이저로 균질화시키고, 5 g을 pH 2로 조정한 혐기 희석액(0.78 % K₂HPO₄, 염혼합액 37.5 ㎖, L-cystein 0.5 g, 25 % L-ascorbic acid 2 ㎖, 8 % Na₂CO₃ 50 ㎖, 0.1 % resazurin 1 ㎖를 증류수 860 ㎖에 녹이고, agar 0.5 g을 첨가) 45 ㎖에 1 : 10 의 비율로 희석하고, 진탕기를 이용하여 120 분간 진탕하였다.

진탕액 1 ㎖를 옥스갈(Difco) 0.5 %를 첨가한 BL 고체배지[Lab-lemco powder 2.4 g, Proteose peptone No.3 10 g, Trypticase 5 g, Phytone peptone 3 g, yeast extract 5 g, liver extract 150 ml, glucose 10 g, soluble starch 0.5 g, sol.A 10 ㎖, sol.B 5 ㎖, 10 % FS antifoam F-20 5 ㎖, Tween 80 1 g, L-cystein 0.5 g, horse serum 50 ㎖를 증류수 1000 ㎖에 녹이고, agar 15 g을 첨가; sol.A 의 조성, 10 % KH₂PO₄과 10 % K₂HPO₄을 혼합한 것이며 ; sol.B의 조성, 황산마그네슘 10 g, 황산철 0.5 g, 소금 0.5 g, 황산망간 0.337 g을 증류수 250 ㎖에 녹임) 에 도말하고, 37 ℃에서 48 시간 배양하였다.

일정시간이 지난 후 나타나는 콜로니를 500 개 선발하여 GAM semi-agar 배지 [peptone 10 g, Soya peptone 3 g, Proteose peptone No.3 10 g, Peptonized whale serum 13.5 g, yeast extract 5 g, Beef extract 2.2 g, liver extract 1.2 g, KH₂PO₄ 2.5 g, NaCl 3 g, L-cystein 0.3 g, Na thioglycolate 0.3 g, glucose 2 g를 증류수 1000 ㎖에 녹이고, agar 1.5 g을 첨가] 에 옮겨 37 ℃에서 배양한 뒤, 영하 80 ℃에서 보존하였다.

<실시예 2> 분리한 미생물 Probio-64 균주의 동정

실시예 1에서 분리된 Probio-64 균주를 MRS 배지(Difco)에서 37 ℃ 조건으로 배양하였다.

Probio-64 균주를 동정하기 위하여, Probio-64의 형태 및 생리학적 특성은 윤 등 (Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 904, 1997)의 방법을 사용하여 결정하였다.

16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석은 윤 등(Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다.

Probio-64의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열목록에 나타내었다(서열번호 1).

16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-64는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 균주로서 99.5 %의 16S rDNA 상동성으로 엔테로코커스 훼칼리스(Enterococcus faecalis)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.

따라서, 이상의 결과에 기초하여 Probio-64는 엔테로코커스 훼칼리스 (Enterococcus faecalis)의 균주로 동정하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2004 년 11 월 15 일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10723BP).

본 발명의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64 균주는 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 운동성이 없으며, 세포의 형태는 구균이다.

가스와 인돌을 생성하지 않으며, 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않으며, 0.5 % 담즙산에 내성을 나타내는 것으로 나타났다.

<실험예 1> 분리된 미생물의 유해 미생물 생장 억제 실험

실시예 2에서 동정한 Probio-64를 준비하였다.

항생제 평가 시 사용되는 미생물 10종은 한국생명공학연구소에서 분양받아 사용하였으며, 그 종류는 다음과 같다 : 대장균( E. coli KCTC 2441), 클렙지엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae KCTC 2208), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus KCTC 1621), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis KCTC 1917), 시겔라 플렉너리(Shigella flexneri KCTC 2008), 살모넬라 갈리나(Salmonella gallinarum), 엔테로박터 틀로아세(Enterobacter cloacea KCTC 2361), 살모넬라 타이필무리움(Salmonella typhimurium), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii KCTC 2006), 메틸로시누스 트리초스포리움(Methylosinus trichosporium KCTC 2591).

위의 유해 미생물들을 NB(nutrient broth) 액체배지에서 배양한(37 ℃, 18 시간) 후 배양액 0.1 ㎖를 취하여 NA(nutrient agar) 고체배지에 도말하고 건조시킨 다음 지름 8 ㎜의 실린더를 배지 위에 올려놓았다.

분리한 미생물들은 MRS 액체배지에서 혐기적으로 배양한(37 ℃, 18 시간) 후, 분리한 미생물이 생산하는 항균물질을 추출하기 위하여 분리 균주 배양액에 같은 양의 차가운 아세톤을 넣고, 24 시간을 방치한 다음 원심분리하고, 상등액을 감압 농축하여 항균력 측정에 사용하였다.

위의 NA(nutrient agar) 배지에 올려놓은 지름 8 ㎜의 실린더에 농축액 50 ㎕를 접종하고 배양(37 ℃, 24 시간)하였다.

일정 시간의 배양이 끝난 다음 형성된 생육 억제 환(clear zone)을 측정하여 대조구와 비교하였으며, 유해한 병원성 미생물에 대한 억제 활성을 표 1에 나타내었다.

<표 1> Probio-64의 여러 유해 병원성 미생물에 대한 억제 활성

병원체 (Pathogenes)	Antagonism(mm)
시겔라 플렉네리균(Shigella flexneriKCTC 2008)	14
메틸로시누스 트리코스로리움균(Methylosinus trichosporium KCTC 2591)	17
크렙지엘라 뉴모니아균 (Klebsiella pneumonia KCTC 2208)	16
스타필로코커스 아레우스균 (Staphylococcus aureus KCTC 1621)	18
대장균 (E.coli KCTC 2441)	19
스타필로코커스 에피더미디스균(Staphylococcus epidermidis KCTC 1917)	18
시트로박터 푸룬디균 (Citrobacter freundii KCTC 2006)	16
엔테로박터 크로세균 (Enterobacter cloacea KCTC 2361)	18
살모넬라 타이피무리움균(Salmonella typhimurium)	20
살모넬라 갈리나룸균 (Salmonella gallinarum)	19

상기의 표 1에서 알 수 있는 바와 같이 Probio-64는 사용된 유해미생물 10 종에 대해서 생육 억제 활성을 갖는 매우 유용한 미생물인 것으로 확인되었다.

<실험예 2> 분리된 미생물의 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 원인체 바이러스 생장 억제 실험

1. 실험재료

실시예 2에서 동정한 Probio-64를 준비하였다.

돼지생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ; PRRSV) BI2055(바이러스함유량, 105 TCID50/ml)를 준비하였다.

공시세포로는 MARC-145 cell을 준비하였다.

세포배양액은 MEM(Minimum Essential Medium)배지, 엘글루타민 보충액(supplemented with L-glutamine), HEPES 완충용액, 비필수 아미노산(Nonessential aminoacids), 항생제(Antibiotics), NaHCO₃를 준비하였다.

인산완충 생리식염수(PBS pH7.2), 우태혈청(FBS), 트립신(Trypsin), 96-well microplates를 준비하였다.

2. 실험방법

MARC-145cells(105 MARC-145 cells/ml)을 96-well microplate에 구멍 당 0.2 ㎖씩 넣어 24 시간동안 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 단층세포가 형성되도록 하였다.

준비한 본 발명의 균주 Probio-64를 원액과 FBS가 들어 있지 않은 MEM으로 1 : 2가 되도록 희석한 것을 준비하였다.

PRRSV가 105 TCID50/ml이 되도록 하여 준비한 Probio-64 균주희석액과 섞은 후 4 ℃에서 30 분간 반응시켰다.

MARC-145 cells를 PBS로 3회 세척하였다.

반응액의 각각을 4 구멍에 40 ㎕씩 넣었다.

FBS가 5 % 포함된 증식배지 160 ㎕를 넣어 잘 혼합하였다.

37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 3 일간 배양하였다.

현미경으로 CPE 유무를 관찰하였다.

3. 결과 및 판정

최종적으로 같은 실험을 3 회 반복하였다.

모든 구멍에서 PRRSV에 의한 CPE가 보이지 않을 경우 유효억제 농도로 판정하였다. 즉, PRRSV를 104 TCID50/0.1ml 증식억제할 수 있을 때 유효한 것으로 하였다.

엔테로코커스 훼칼리스(Enterococcus faecalis) Probio-64의 PRRSv에 대한 억제활성은 다음 표 2와 같았다.

<표 2> Probio-64의 PRRSv에 대한 세포변성효과(CPE)

배양 시간	접종 후 3일 배양		접종 후 4 일 배양		접종 후 5일 배양
Probio-64	1 : 10	1 : 1	1 : 10	1 : 1	1 : 10	1 : 1
CPE	-	-	-	-	-	-

실험결과, 본 발명의 Probio-64에 의해 바이러스가 저해를 받아 MARC-145 cell의 변성효과가 없는 것으로 나타났고(도1A), Probio-64의 무처리군에서는 PRRSV에 의해 세포변성효과가 양성으로 나타나 세포가 파괴되었다(도1B).

따라서, 엔테로코커스 훼칼리스(Enterococcus faecalis) Probio-64는 PRRSv에 대한 항바이러스 활성(antiviral activity)이 있는 것으로 판정하였다.

본 발명에 의해, 내 산성 및 내 담즙성이 뛰어나며, 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 원인체 바이러스의 생육 억제 능력을 갖는 신규 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64 ; KCTC 10723BP)가 제공된다.

또한, 본 발명에 의해, 기존 항생제의 대체용으로 인체 및 각종 가축에게 에게 투여하거나 약학적 또는 식품학적 조성물, 장내 유해 미생물의 생육 억제하는 방법 및 가축용 생균활성제가 제공된다.

도 1은 본 발명 Probio-64가 PRRSV에 의한 세포변성을 억제하는 것을 나타내는 배양결과사진.

A : 실험군(MARC-145 cell - negative)

B : 무처리군(PRRSV CPE on MARC-145 cell)

<110> ProBionic Corp. <120> ACID TOLERANT PROBIOTIC ENTEROCOCCUS FAECALIS PROBIO-64 THAT CAN SUPPRESSES THE GROWTH OF PATHOGENIC MICROORGANISMS AND PRRSV <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1516 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcttctttcc tcccgagtgc 60 ttgcactcaa ttggaaagag gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctaccca 120 tcagaggggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgc ataacagttt atgccgcatg 180 gcataagagt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat ggacccgcgg tgcattagct 240 agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg 300 gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt 420 aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggac gttagtaact gaacgtcccc tgacggtatc 480 taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540 gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 600 gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggag 660 agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaggaacac cagtggcgaa 720 ggcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840 ttcagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac tctagagata gagctttccc 1020 ttcggggaca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc catcatttag ttgggcactc 1140 tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac aacgagtcgc tagaccgcga 1260 ggtcatgcaa atctcttaaa gcttctctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca 1320 tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380 ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc 1440 tttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500 ccgtatcgga aggtgc 1516

Claims (7)

1. 돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스의 생육을 억제하는 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64(Enterococcus faecalis Probio-64 ; KCTC 10723BP).
2. 프로바이오틱 활성을 갖는 조성물에 있어서,

   제1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64를 포함하고,

   증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 중 선택된 1 종 이상의 담체를 포함하여 프로바이오틱 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,

   프로바이오틱 생균활성 조성물.
3. 프로바이오틱 활성을 갖는 조성물에 있어서,

   제1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64를 포함하고,

   증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 중 선택된 1종 이상의 담체를 포함하며, Probio-053(KCTC 10391BP) 또는 이와 1종 이상의 프로바이오틱 미생물을 포함하여 구성되며, 프로바이오틱 활성을 갖는 것이 특징인,

   프로바이오틱 생균활성 조성물.
4. 제2항 또는 제3항의 프로바이오틱 생균활성 조성물에 있어서,

   구강 섭취 시 질병의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것이 특징인,

   프로바이오틱 생균활성 조성물.
5. 제1항에 있어서,

   엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64는, 식품 또는 사료첨가제에 유효성분으로 이용되는 것을 특징으로 하는,

   엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64.
6. 제1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64를 이용하여,

   인간을 제외한 동물의 장내 유해 병원성미생물의 생육을 억제하거나, 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.
7. 제1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-64를 이용하여,

   돼지 생식기 호흡기 증후군 원인체 바이러스를 억제하거나 상기 바이러스에 의한 생식기, 호흡기 질병을 예방 또는 치료하는 방법.