CN115786175B - 一株粘膜乳杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一株粘膜乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)，其特征在于，保藏编号为：GDMCC NO：62541；保藏日期：2022年06月13日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株可以提高猪对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抵抗效果，该菌株在I型干扰素IFN‑α，IFN‑β等因子的调节方面以及在III型干扰素IFN‑λ1，IFN‑λ3基因的调节方面具有较好的功能，特定浓度的菌株针对抗病毒蛋白基因MX1、MX2、OAS1和ZAP的调节具有差异化和特异性。同时，本发明还提供了该菌的用途。

Description

一株粘膜乳杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一株粘膜乳杆菌及其用途。

背景技术

肠道疾病是现代养猪业中普遍存在的问题，而腹泻类疾病在仔猪阶段比较易发，包括细菌性腹泻、病毒性腹泻，营养性腹泻、以及寄生虫引起的腹泻，其中病毒性腹泻发生率高、传播快、传播范围广、死亡率高，治疗效果不明显，主要以预防为主。猪肠道冠状病毒是危害养猪业最严重的病原体之一，包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪三角冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)，其中PEDV尤为重要，特别是2010年至今，流行性腹泻是一种急性高度传染性疾病，主要表现出腹泻、呕吐、脱水等临床症状，在部分规模化猪场死亡率高达100％，是引起新生仔猪肠炎和死亡的重要原因，给养殖业造成重大的经济损失。

对于疾病来说，一般预防效果会好于治疗效果，特别是病毒性疾病，PEDV具有严格的组织嗜性和宿主特异性。然而，由于病毒的遗传变异，有效的疫苗保护受到影响；抗病毒药物通常有严重的毒副作用，使用量和效果有限。因此，需要不断寻求可控制病毒性疾病的有效方法，益生菌因其无毒、无抗药性、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全的优点受到广泛关注。

乳酸类益生菌已被广泛用于预防及治疗人和动物胃肠道紊乱性疾病。包括例如乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属，片球菌属等。乳酸细菌已被用作保存食物的发酵剂，这利用了其低pH和在发酵活动中产生的发酵产物的作用来抑制腐败细菌的生长。乳酸菌能够耐受机体胃肠道酸碱环境，多为厌氧或兼性厌氧菌，能够在肠道上皮细胞定植。乳酸菌还可以抑制沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌的入侵。Giang等(2010)在断奶仔猪日粮中添加屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌复合微生态制剂，与未添加空白对照组比较仔猪腹泻发生率下降。乳酸杆菌口服疫苗的作用效果也得到一些研究结果的证实，近年来越来越多的报道显示乳杆菌属具有抵抗人和动物不同种病毒的作用，目前乳酸菌属已经广泛应用于人和动物疾病的预防和治疗方面。粘膜是许多细菌和病毒入侵感染机体的最主要途径，因此，粘膜免疫在预防这类感染中具有重要作用。通过粘膜途径的口服疫苗能够有效诱导机体潜在的体液免疫和粘膜免疫，是应对这类疾病的有效策略。

益生菌能够促进肠道黏膜免疫，可以作为预防和治疗肠道疾病的制剂，但是关于益生菌直接抗病毒活性的研究还处于起步阶段，特别是野生型菌株的抗病毒活性鲜有报道。

粘膜乳杆菌作为益生菌的用途已经被广为报道，如下相关资料：

D1：CN201811598892.4公开了一株具有抗流感能力的粘膜乳杆菌及其应用。

D2：CN202011623705.0公开了一株缓解内毒素感染的粘膜乳杆菌及应用。

D3：CN202110927936.9公开了一种合作猪源粘膜乳杆菌及其应用。该菌株命名为粘膜乳杆菌LM410，保藏号为CGMCC No.22828。该菌株分离自健康合作猪粪便，具有良好的产酸、耐酸和耐胆盐能力以及拮抗病原菌能力。该发明提供的粘膜乳杆菌LM410能够抑制C型产气荚膜梭菌生长并对C型产气荚膜梭菌致猪肠上皮细胞损伤具有明显保护作用。

D4：CN201180075632.9公开了一种粘膜乳杆菌菌株，其能够降低肠屏障通透性。该菌株尤其用于减轻肠屏障功能障碍。

D5：CN201510516430.3明确公开一种基于肠道菌群分布差异设计针对ABO血型人群的益生菌复合物及其方法与应用。本发明利用高通量的罗氏454平台，排除宿主饮食习惯、病史、年龄等个体差异的影响，针对大人群的肠道菌群16S rDNA基因经行测序分析，分析ABO血型肠道微生物多样性的差异，发现了ABO血型之间影响个体健康的差异性肠道菌群，并在了解差异益生菌在人体所发挥的作用，结合ABO血型对不同疾病的易感性的基础上，个性化地设计针对ABO血型的益生菌复合物，以实现预防或治疗疾病、提高人体免疫力、改善宿主肠道菌群构成、促进营养物质的消化吸收、抑制有害菌及有害物质等功能等作用。

其在说明书记载：粘膜乳杆菌(Lactobacillu mucosa)是存在于人体肠道的乳酸菌，而菌大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。而Lactobacillu mucosa能够通过降低肠屏障通透性对减轻肠屏障功能障碍起到良好的效果，对肠道疾病尤其包括IBS、IBD等肠道疾病起治疗作用。因为正常的肠上皮层细胞之间存在紧密连接，作为屏障来限制物质从肠腔到肠粘膜的转移，而通过一些肠道病原体或通过促炎症细胞因子等致病因素能破坏紧密连接，从而影响上皮细胞通透性，有助于包括IBD和IBS等各种肠道疾病(CLAYBURGH等人，LabInvest，84，282-91，2004))。而根据实施例3，发现A、O型血人群Lactobacillu mucosa含量很低，与B型血存在显著性差异。大量研究证实O型血的人群对消化性溃疡具有易感性，A型血的人群更易得CD。因此，针对A、O型血人群，个性化地补充富含Lactobacillu mucosa的一种或多种益生菌复合物能预防或治疗A、O型血人群患由肠屏障功能障碍所引起的肠道疾病。

D5所使用的粘膜乳杆菌(Lactobacillu mucosa)购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，DSM NO.：13345。

可见DSM NO.：13345是有益于肠道健康、能治疗肠道疾病，防止肠道被病原体等致病因子所感染。

本案解决的技术问题是：如何进一步发现新的菌株以提高猪对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抵抗效果，同时我们还期望新的菌株在I型干扰素IFN-α，IFN-β等因子的调节方面以及在III型干扰素IFN-λ1，IFN-λ3基因的调节方面具有较好的功能，更加期望能够在抗病毒蛋白MX1、MX2、OAS1和ZAP的差异化调节方面有进展。

发明内容

本发明的目的在于提供一株粘膜乳杆菌，该菌株可以提高猪对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抵抗效果，该菌株在I型干扰素IFN-α，IFN-β等因子的调节方面以及在III型干扰素IFN-λ1，IFN-λ3基因的调节方面具有较好的功能，特定浓度的菌株针对抗病毒蛋白基因MX1、MX2、ZAP和OAS1的调节具有差异化和特异性。

同时，本发明还提供了该菌的用途。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株粘膜乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)，保藏编号为：GDMCC No.62541；保藏日期：2022年06月13日，保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

上述的粘膜乳杆菌作为益生菌中有效成分的用途。

上述的粘膜乳杆菌作为预防和治疗肠道疾病的药品中的活性成分的用途。

上述的粘膜乳杆菌作为治疗由猪流行性腹泻病毒引起的流行性腹泻的疾病治疗药物的活性成分的用途。

同时，本发明还公开了一种益生菌制剂，所述益生菌制剂中含如上所述的粘膜乳杆菌。

本发明还公开了一种药物，含有如上所述的粘膜乳杆菌。

本发明还公开了一种食品，所述食品中含有如上所述的粘膜乳杆菌。

优选地，所述食品为乳制品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的粘膜乳杆菌为肠道菌株，可以很好的在肠道定殖，可以提高猪对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抵抗效果，该菌株在I型干扰素IFN-α，IFN-β等因子的调节方面以及在III型干扰素IFN-λ1，IFN-λ3基因的调节方面具有较好的功能，特定浓度的菌株针对抗病毒蛋白基因MX1、MX2、ZAP和OAS1的调节具有差异化和特异性。

附图说明

图1为：乳酸杆菌革兰氏染色图；

图2为：乳酸菌分离16S rDNA鉴定图谱；

图3为：16S rDNA测序Blast结果比对截图；

图4为：CCK8检测IPEC-J2细胞活性结果图；

图5为：粘膜乳杆菌G01预防组PEDV N蛋白mRNA相对表达含量的图表；

图6为：粘膜乳杆菌G01预防组PEDV N蛋白Western Blot检测的图谱；

图7为：粘膜乳杆菌G01预防组上清液TCID₅₀检测的图表；

图8为：粘膜乳杆菌G01治疗组PEDV N蛋白mRNA相对表达含量的图表；

图9为：粘膜乳杆菌G01治疗组PEDV N蛋白Western Blot检测的图谱；

图10为：粘膜乳杆菌G01治疗组上清液TCID₅₀检测的图表；

图11为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中IFN-αmRNA的表达的图表；

图12为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中IFN-βmRNA的表达的图表；

图13为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中IFN-λ1mRNA的表达的图表；

图14为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中IFN-λ3mRNA的表达的图表；

图15为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中MX1 mRNA的表达的图表；

图16为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中MX2 mRNA的表达的图表；

图17为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中ISG15 mRNA的表达的图表；

图18为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中ZAP mRNA的表达的图表；

图19为：粘膜乳杆菌G01与PEDV在IPEC-J2细胞中OAS1 mRNA的表达的图表；

图20为：粘膜乳杆菌G01与粘膜乳杆菌DSM13345抑制PEDV N蛋白mRNA的表达的图表。

不做特殊说明的情况下：菌株在前、PEDV在后，如lab.muc+PEDV代表预防组；

PEDV在前、菌株在后，如PEDV+lab.muc代表治疗组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

筛选上述粘膜乳杆菌菌株G01的步骤包括：采集粪样；菌株的分离纯化；将菌株进行传代培养，将稳定性最优的菌株命名为粘膜乳杆菌菌株G01。

1.粪样采集

采集广州市动物卫生研究所断奶巴马香猪新鲜粪样，放入冷藏盒中，带回分离筛选备用。菌株的分离纯化称取粪样5g加入45mL灭菌生理盐水中，充分混匀，取1mL混悬液加入9mL的无菌生理盐水中，十倍稀释至10⁵、10⁶、10⁷，取0.1mL涂布于MRS固体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，无水乙酸钠5g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.19g，吐温801mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为6.5)，每个稀释度三个重复，37℃厌氧培养48h，挑取单个菌落划线厌氧纯化培养。48h后，将纯化后的菌落进行过氧化氢试验和革兰氏染色镜检，其中过氧化氢试验阴性、革兰氏染色阳性(参考图1)的菌株，可以初步判定为乳酸菌，此时将对应的单个菌落接入灭菌的MRS液体培养基，37℃，培养24h，取菌液加入离心管，按照1：1的比例加入30％的甘油，混匀，-70℃冷冻保存备用。

根据16S rRNA基因序列分析，分离株可能属于Limosilactobacillus reuterisubsp.DSM20016种，Weissella thailandensis FS61-1种，Limosilactobacillusvaginalis ATCC 49540种，Limosilactobacillus mucosaeG01种，Lactobacillusjohnsonis CIP 103620种，Ligilactobacillus salivarius JCM 1231种。

乳酸菌分离16S rDNA鉴定参考图2，16S rDNA测序Blast结果比对参考图3，粘膜乳杆菌G01序列参考SEQ ID No.1。

SEQ ID No.1序列如下：

tgccaccttatgcggctagctccccgaagggttaccccaccgactttgggtgttgcaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgcaggcgagttgcagcctgcagtccgaactgagaacggttttaagagattagcttgccctcgcgagttcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaactgaatgctggcaactagtaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtcattgcgttcccgaaggaaacgccctatctctagggttggcgcaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcattccaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctgacagtttccgatgcacttctttggttaagccaaaggctttcacatcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttagataccgtcactgcgtgaacagttgctctcacgcacgttcttctctaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggtgttgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtatggaccgtgtctcagttccattgtggccgatcagtctctcaactcggctacgcatcacagccttggtaggccgttaccctaccaacaagctaatgcgccgcaggtccatcccaaagtgatagccgaaaccatcttttaaatttgaatcatgcgattcaaattgttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccgctttggggcaggttacctacgtgttactcacccgtccgccactcgctggtaaaccaacgtcaagtccgtgcaagcacgttcaatcagttgggccaacgcgttcgacttgcatgtatagcaccccgcccc

实施例2

粘膜乳杆菌G01在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用：

(1)细胞培养：

IPEC-J2细胞(猪小肠上皮细胞、IPEC-J2)用10％FBS的1640培养基培养48小时左右传代；

细胞传代：传代时用0.25％的胰酶消化，约4分钟左右即可消化。具体步骤如下：

贴壁细胞用移液管吸去培养器皿中的旧培养液，用PBS溶液洗去残留的旧培养基；

向瓶内加入1ml消化液(0.25％胰酶)轻轻摇动培养瓶，使消化液铺满所有细胞表面；在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终止消化(吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终止消化)；用移液管吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液；计数，分装到新培养瓶中，并补加一定量的含血清的新鲜培养液；盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO₂气体的进入，将培养瓶放回CO₂培养箱。

(2)PEDV病毒增殖：

将消化好的IPEC-J2细胞接T25细胞培养瓶，放37℃、5％CO₂恒温培养箱培养至长出单层细胞；

将-80℃保存的PEDV病毒液(PEDV-GD/HZ/2016/0.1ml接种到长有单层Vero细胞的培养瓶中，37℃、5％CO₂恒温培养箱孵育1h；用移液器小心吸出病毒孵育液，加入含有双抗的不含血清的DMEM细胞维持液，37℃、5％CO₂恒温培养箱培养48-72h；每天观察细胞状态，80％以上细胞出现病变时收获病毒细胞增殖液；病毒细胞增殖液反复冻融3次，4000rpm离心10min，收集上清病毒液，使用0.22μm滤膜过滤，-80℃保存备用。

病毒增殖产物RT-PCR检测：收集的病毒液扩增PEDV的N基因片段，对病毒增殖产物进行验证。

基因扩增反应体系(10μL1)如下：

体系体积

Q221-01 2×One Step SYBR Green Mix 5μL

One Step SYBR Green Enzyme Mix 0.5μL

Gene Specific Primer Forward(10μM)0.2μL

Gene Specific Primer Reverse(10μM)0.2μL

ddH₂O 2.1μL

反转录模板2μL

反应程序：50℃3分钟，95℃，30秒；95℃，10秒、60℃，30秒、40个循环；95℃，15秒，60℃，60秒，95℃，15秒。

(3)益生菌(粘膜乳杆菌G01的保藏号编为GDMCC62541)菌液的预处理：

将平板复壮的粘膜乳杆菌G01接种于50mlMRS液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心10mins，PBS溶液换液，清洗重悬，离心，反复3次，离心后的菌体沉淀PBS重悬后使用全波长分光光度计，调整菌液浓度为1OD，5000r离心使用1640培养基重悬，调整菌悬液浓度为4℃保存备用。无菌PBS重悬，调整菌悬液浓度为10⁸CFU/m1，4℃保存备用。

(4)益生菌的细胞毒性检测：

96孔板中接种细胞悬液，培养至长出单层细胞；取粘膜乳杆菌G01的菌悬液，菌悬液10倍梯度稀释，选取10⁵CFU/ml、10⁶CFU/ml、10⁷CFU/ml 3个梯度，不同处理各做6个重复，每孔加入100ul不同处理液，37℃，5％CO₂培养箱中孵育120分钟；孵育后用PBS洗涤三次后加入细胞维持液继续培养，同时设立空白细胞对照和病毒对照；24h后，用CCK8法测定细胞活性，参考图4。细胞毒性＝(对照组OD₄₅₀－处理组OD₄₅₀)/对照组OD₄₅₀×100％。

通过CCK8法间接测定益生菌G01对IPEC-J2细胞的毒性作用，结果表明：10⁵CFU/ml、10⁶CFU/ml、10⁷CFU/ml 3个梯度的菌悬液对VERO细胞均没有毒性作用，在孵育2h后弃掉孵育液，促进细胞的生长，基于此在后续试验中分别选择10⁵CFU/ml和10⁶CFU/ml益生菌病毒抑制作用。

实施例3

(5)益生菌对PEDV病毒的抑制率

试验分为8组

IPEC-J2细胞作为阴性对照；

IFN+PEDV-GD/HZ/2016作用IPEC-J2细胞作为阳性对照；

1MOI、0.1MOI粘膜乳杆菌接入IPEC-J2细胞作为菌液对照；

预防组为：

1MOI粘膜乳杆菌+PEDV-GD/HZ/2016(0.1MOI)；

0.1MOI粘膜乳杆菌+PEDV-GD/HZ/2016(0.1MOI)；

治疗组为：

PEDV-GD/HZ/2016(0.1MOI)+1MOI粘膜乳杆菌；

PEDV-GD/HZ/2016(0.1MOI)+0.1MOI粘膜乳杆菌。

作用后按分组分别加入对应的粘膜乳杆菌和PEDV-GD/HZ/2016随后进行换液，24h后收取细胞上清用于检测TCID₅₀。细胞使用150μl IP细胞裂解液和3μlPMSF进行裂解。4℃8000r离心10分钟，收集细胞裂解上清液，进行RNA提取和WB验证。

为了分析IPEC-J2细胞在乳酸菌刺激作用下的抗病毒作用，检测预防和治疗过程中PEDV N蛋白的表达情况。采用Nanodrop 2000测定上清液中的蛋白含量，在SDS-PAGE凝胶上加入相同含量的样品，将经电泳分离的蛋白质转到PVDF薄膜上。用脱脂牛奶对PVDF薄膜进行1h的密封，然后添加使用一抗稀释剂1:1000的小鼠N单抗血清和PBST稀释的1:5000的HRP标记的羊抗鼠二抗进行孵育。使用PBST缓冲液清洗后，再用利用ECL显色溶液对其进行化学显色，然后利用蛋白质印记分析器对其进行拍照。

为了检测乳酸菌刺激IPEC-J2细胞的抗病毒作用，预防和治疗过程中上清液样品测定病毒滴度。将Vero细胞置于96孔细胞板，PEDV感染为阳性对照组。0.22um的滤器滤过乳酸菌上清，使用DMEM对上清液进行梯度稀释，每孔加入100μl放置37℃，72h。先用PBS洗3遍。加4％多聚甲醛30分钟，用PBS清洗3遍，使用0.1％TritonX-100进行破膜，用5％的牛血清白蛋白封闭60分钟，并于4℃的湿盒容器中与PEDV S单抗过夜孵育。用PBS清洗后的细胞中加入HRP山羊抗小鼠IgG CY3荧光抗体37℃孵育1h，清洗后用倒置荧光显微镜对样本进行检测。

为了检测I型和III型干扰素及相关因子表达情况，qRT-PCR检测IPEC-J2细胞中IFN-α，IFN-β，IFN-λ1，IFN-λ3，MX1，MX2，ZAP，ISG15，OAS1基因。

IPEC-J2细胞被乳酸菌感染后，用IFN对IPEC-J2细胞进行预处理组作为阳性对照，并在感染粘膜乳杆菌G01菌株1h后模拟PEDV感染。

应用qRT-PCR检测IFN依赖性基因及抗病毒相关因子的表达水平，使用β-actin作内参对照。IPEC-J2细胞PEDV组经无菌PBS处理后数据为1的相对变化检测各组的相对表达含量。

为了更好地评估乳酸菌在IPEC-J2细胞上的抗病毒作用，首先对分离得到的乳酸菌进行毒性检测，按照Mosman的方法，稍作修改。首先用含有10％的胎牛血清的RIMI 1640培养基对IPEC-J2进行培养，按5×10⁴/100μl的IPEC-J2细胞在96孔板上均匀分布，置于恒温培养箱中37℃培养12h，当细胞长成单层时，仅包含IPEC-J2细胞的空孔为阴性对照，乳酸菌进行离心处理，6000xg，10min，无菌PBS对该菌株清洗3次，加入10、1、0.1MOI乳酸菌，孵育24h后，每个孔中加入10μl CCK8试剂，37℃培养1h，然后测定450nm处的吸光度。细胞活性(％)＝1-(对照组OD₄₅₀-试验组OD₄₅₀/对照组OD₄₅₀)*100％。

当粘膜乳杆菌G01株为0.1MOI时对IPEC-J2细胞的毒性最低，(如图4)细胞活性最强，可以达124.458％。

图4中，横坐标中，各标识的意义为：为了检测分离得到的乳酸菌对IPEC-J2的细胞毒性作用，使用不同浓度的乳杆菌进行试验，分别是10MOI罗伊氏乳杆菌、1MOI罗伊氏乳杆菌、0.1MOI罗伊氏乳杆菌、10MOI威瑟菌、1MOI威瑟菌、0.1MOI威瑟菌、10MOI阴道乳杆菌、1MOI阴道乳杆菌、0.1MOI阴道乳杆菌、10MOI粘膜乳杆菌、1MOI粘膜乳杆菌、0.1MOI粘膜乳杆菌、10MOI约翰乳杆菌、1MOI约翰乳杆菌、0.1MOI约翰乳杆菌、10MOI唾液乳杆菌、1MOI唾液乳杆菌、0.1MOI唾液乳杆菌和对照组。

猪肠上皮IPEC-J2细胞经1MOI、0.1MOI乳酸菌感作2h，PBS清洗后，再经0.1MOIPEDV-GD/HZ/2016毒株感作2h。

如前所述，PEDV-GD/HZ/2016在IPEC-J2细胞中复制，通过对PEDV N基因的mRNA检测，N蛋白的表达，及细胞上清液TCID₅₀检测(参考图5-10)，结果表明，粘膜乳杆菌G01与IPEC-J2细胞感作则可明显降低PEDV-GD/HZ/2016在IPEC-J2细胞中增殖。

图5-10中横坐标各标识的意义为：

PEDV代表：GD/HZ/2016病毒；

PEDV+IFN代表：PEDV GD/HZ/2016毒株和IFN-α干扰素；

Lab.muc+PEDV 1MOI代表：1MOI粘膜乳杆菌G01菌株和0.1MOI PEDV毒株；

Lab.muc+PEDV 0.1MOI代表：0.1MOI粘膜乳杆菌G01菌株和0.1MOI PEDV毒株；

MOCK代表：PBS处理的IPEC-J2细胞对照；

Lab.muc 1MOI代表：1MOI粘膜乳杆菌G01菌株处理IPEC-J2细胞；

PEDV+Lab.muc 1MOI代表：0.1MOIPEDV毒株和1MOI黏膜乳杆菌G01菌株；

PEDV+Lab.muc 0.1MOI代表：0.1MOIPEDV毒株和0.1MOI黏膜乳杆菌G01菌株；

Lab.DSM+PEDV代表：1MOI Lab.DSM 13345菌株和0.1MOIPEDV毒株

PEDV+Lab.DSM代表：0.1MOIPEDV毒株和1MOI Lab.DSM13345菌株

猪肠上皮IPEC-J2细胞经0.1MOI PEDV-GD/HZ/2016感作2h，经PBS清洗，再经0.1、1MOI乳酸菌感作2h。检测黏膜乳杆菌与IPEC-J2细胞感作可降低PEDV-GD/HZ/2016在IPEC-J2细胞中的复制。结果表明，粘膜乳杆菌G01菌株对PEDV具有体外治疗作用。

结果如图11-14：1MOI和0.1MOI的粘膜乳杆菌G01与PEDV感作IPEC-J2细胞和PBS处理的细胞作对照，1MOI黏膜乳杆菌与PEDV作用IPEC-J2细胞中IFNα、IFNβ、IFNλ1和IFNλ3均有明显提高。

如图11-12：0.1MOI黏膜乳杆菌G01在预防过程中并未刺激I型IFNα和IFNβ的产生。

如图13-14，粘膜乳杆菌在体外预防和治疗过程中都可以刺激IFN-III型干扰素IFNλ1和IFNλ3明显增强。

如图15所示，粘膜乳杆菌G01在治疗过程中可以显著调节MX1基因，不同浓度的粘膜乳杆菌可以差异调节MX1的表达。

如图16所示，粘膜乳杆菌G01可以显著上调MX2的表达。

如图17所示，粘膜乳杆菌G01并没有引起ISG15的表达。

如图18-19所示，粘膜乳杆菌G01可以上调ZAP和OAS1的表达。

结论：

通过以上实验结果可以得到如下结果：

1.粘膜乳杆菌G01与IPEC-J2细胞感作则可明显降低PEDV-GD/HZ/2016在IPEC-J2细胞中增殖、对PEDV具有体外预防作用；

2.粘膜乳杆菌G01在治疗过程中可以更好刺激肠上皮IPEC-J2细胞产生III型IFN-λ1和IFN-λ3干扰素；

3.1MOI和0.1MOI粘膜乳杆菌G01可以差异调节OAS1基因，0.1MOI粘膜乳杆菌G01可以差异调节MX1基因。

实施例4

为了更好地评估粘膜乳杆菌种属之间的抗PEDV作用，购买粘膜乳杆菌DSM13345(购自明舟生物)作为对照菌种。

首先用含有10％的胎牛血清的RIMI 1640培养基对IPEC-J2进行培养，按5×10⁴/100μl的IPEC-J2细胞在96孔板上均匀分布，置于恒温培养箱中37℃培养12h，当细胞长成单层时，进行试验。

为了验证乳杆菌可以调节肠上皮细胞产生抗病毒作用，试验设置为7组。PEDV感染IPEC-J2细胞作为试验对照组，IFN与PEDV作用作为阳性对照组，试验PBS处理的IPEC-J2作为对照进行试验。预防组：调整菌液浓度，使用1MOI的粘膜乳杆菌DSM13345和粘膜乳杆菌G01与IPEC-J2细胞相互作用2h，随后使用无菌的PBS清洗3次，加入0.1MOI PEDV感作黏膜乳杆菌处理过的IPEC-J2细胞2h，随后使用PBS清洗3次，37℃培养24h后检测PEDV N的表达含量。治疗组与之相似，当IPEC-J2细胞长满单层后，加入0.1MOI的PEDV，感作2h，PBS清洗3次，随后使用1MOI的粘膜乳杆菌DSM13345和乳杆菌G01进行作用，培养2h后，使用PBS进行清洗，37℃培养24h后检测PEDV N的表达含量。

试验结果：如图20所示，图20中lab.DSM代表DSM13345，lab.G01代表粘膜乳杆菌G01；lab.DSM+PEDV代表预防组，PEDV+Lab.DSM代表治疗组。

图20证明了粘膜乳杆菌G01可以明显降低PEDV N蛋白的mRNA相对表达含量。

结论：同种粘膜乳杆菌之间均可以拮抗PEDV，其中本实验分离得到粘膜乳杆菌G01可以显著的抑制PEDV的复制。

Claims (6)

1.一株粘膜乳杆菌（Limosilactobacillus mucosae），其特征在于，保藏编号为：GDMCC NO：62541；保藏日期：2022年 06月13 日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.权利要求1所述的粘膜乳杆菌在制备用于治疗由猪流行性腹泻病毒引起的流行性腹泻药物中的用途。

3.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂中含如权利要求1所述的粘膜乳杆菌。

4.一种药物，其特征在于，含有如权利要求1所述的粘膜乳杆菌。

5.一种食品，其特征在于，所述食品中含有如权利要求1所述的粘膜乳杆菌。

6.根据权利要求5所述的食品，其特征在于，所述食品为乳制品。