CN112940985A - 一种增强人体免疫力的鼠李糖乳杆菌制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增强人体免疫力的鼠李糖乳杆菌制剂及其制备方法，本发明所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)为鼠李糖乳杆菌MiaoTech‑11菌株，保藏编号为CGMCC 20862。本发明鼠李糖乳杆菌制剂中活菌数量大且活性高，同时含有益生菌所产生的具有增强人体免疫力效果的代谢产物，在人体胃肠道中具有优异的增强人体免疫力的效果。
Description
技术领域
本发明属于益生菌生产技术领域，具体涉及一种增强人体免疫力的鼠李糖乳杆菌制剂及其制备方法。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)、处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。当人体免疫功能失调，或者免疫系统不健全时，就容易引起人体疾病，特别是引起感冒、扁桃体炎、哮喘、支气管炎、肺炎、腹泻等疾病的反复发作。
医学研究表明：肠道是人体微生物聚集最密集的部位，也是人体最大的免疫器官。人体60％的机体免疫细胞位于肠道粘膜，肠道菌群能促进肠道淋巴组织的成熟和免疫稳态的建立，在免疫调节中起重要作用，也就是说：维持微生态平衡和肠道菌群健康是增加免疫能力的重要因素。益生菌是能在胃肠道正常生长繁殖的有益微生物，补充益生菌有助于恢复肠道微生态平衡，修复肠道菌膜屏障，调节全身免疫功能等，是增强抵抗力、抗击病毒的有效措施。
革兰氏阴性菌细胞壁含有肽聚糖(PG)、脂多糖(LPS)和多糖(PS)；阳性菌虽然没有LPS，但是含有脂磷壁酸(LTA)。这些大分子成分是细菌对宿主发挥生理功能的主要物质基础，包括细菌对宿主细胞的黏附定植、免疫诱导、防御肿瘤发生等。在肠道细菌增殖和死亡过程中，这些大分子成分不断向外释放，不断刺激肠道粘膜产生免疫因子，从而对机体免疫功能产生影响。许多实验证据均表明：益生菌的细胞壁成分、代谢产物、菌体细胞等均可能刺激人和动物的肠道黏膜免疫系统。
鼠李糖乳杆菌多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌不能利用乳糖，可发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道。
目前，益生菌生产行业在生产各种益生菌菌粉(包括鼠李糖乳杆菌菌粉)的过程中，几乎全部采用液态发酵，在液态发酵完成后经离心分离或其它的固液分离方法去除水分而得到湿菌体，然后添加干燥保护剂或载体混匀、冷冻干燥、粉碎、包装等。这种生产方法去除了益生菌在液态发酵过程中所产生的对于调节人体免疫有助益的代谢产物，在产品中无法体现鼠李糖乳杆菌代谢产物的作用，因此，这种方法所生产的益生菌产品仅仅利用了益生菌本身的效果而未能利用其代谢产物的效果；此外，干燥时菌体应激死亡率高，并且由于在湿菌体中添加适量的干燥保护剂或载体，使得液态发酵的产品在干燥后实际所得到的菌体数量也有所减少。
因此，现有的益生菌生产工艺存在菌种含量低、发酵效果差、干燥时菌体死亡率高因而成品中菌种活力低等缺陷。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌。
本发明的第二目的在于提供上述鼠李糖乳杆菌的应用，尤其是在制备治疗增强人体免疫力药物中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种包含上述鼠李糖乳杆菌的制剂。
本发明的第四目的在于提供上述鼠李糖乳杆菌的制剂的制备方法,所述方法制备得到的鼠李糖乳杆菌的制剂中活菌数量大，活力高，同时含有益生菌所产生的代谢产物，在人体胃肠道中具有更好地增加增强人体免疫力的效果。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株，所述的鼠李糖乳杆菌菌株为鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌株，于2020年10月12日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 20862。
本发明还提供前述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株的应用，尤其是在制备增强人体免疫力的药物中的应用。
本发明还提供一种增强人体免疫力的制剂，所述制剂包含前述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。
根据本发明所述的增强人体免疫力的制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌株活化后，于液体培养基中进行逐级扩大培养，得到液体培养产物；
上述所说的扩大培养方法可按照常规的益生菌液态培养方法进行，作为一种可实施的方案，将鼠李糖乳杆菌经斜面培养或平板培养活化后接种至三角瓶液体培养基中，37℃、厌氧条件下培养24h，得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐液体培养基中进行培养，37℃、厌氧条件下培养24h，得到液体培养产物；优选的，所述斜面培养或平板培养的培养基包含如下浓度的原料组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L；所述三角瓶液体培养基和发酵罐液体培养基均包含如下浓度的原料组分：葡萄糖粉20g/L、蛋白胨粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L。
(2)将所述液体培养产物进行固液分离并除去液体部分，得到鼠李糖乳杆菌湿菌体；
所述固液分离的具体方式可按照常规的益生菌液态培养方法进行，例如可采用管式离心机或碟式离心机在无菌条件下进行，当采用上述两种离心机进行固液分离时，离心的转速可控制在8000-12000r/min，离心的时间控制在15-25min，优选采用10000r/min的离心转速离心20min。
(3)将所述鼠李糖乳杆菌湿菌体接种至固体发酵培养基中进行培养，优选培养温度为37℃，经低温干燥、粉碎、造粒、包衣，即得所述增强人体免疫力的制剂。
之所以将鼠李糖乳杆菌湿菌体接种至固体发酵培养基中进行培养，目的在于，(1)使菌体数量和活力均得到大幅提高，高活力的益生菌更容易在肠道中定植；(2)获得包括细菌多糖等具有调节免疫作用的鼠李糖乳杆菌代谢产物。与传统方法制成的鼠李糖乳杆菌制剂相比，含有本发明代谢产物的鼠李糖乳杆菌制剂在人体胃肠道中具有更好的增加免疫力的效果。
作为一种优选的可实施的方案，还包括调节所述接种后的固体发酵培养基的含水率至45-55％。所述含水率范围远低于液态培养物得到的湿菌体，因此，干燥固态培养物对菌体所造成的损伤和死亡率要远低于干燥液态培养物，从而使最终制备得到的产品的活菌数能达到1011cfu/g以上。具体的，可利用湿菌体、无菌水或步骤(2)分离得到的液体部分等含水物料调节接种后的固体培养基达到所述含水率范围。
作为一种优选的可实施的方案，以湿菌体100重量份计，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、食品级碳酸钙2重量份。进一步地，本发明人通过大量试验发现，固体发酵培养基中加入适量的乳清粉对于获得更多数量、更高活性的鼠李糖乳杆菌具有一定的助益，因此，更优选的，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、乳清粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、食品级碳酸钙2重量份。
本发明上述所说的固体发酵培养基各原料均优选采用食品级或医药级的粉末原料，且使用前经过粉末高温瞬间灭菌设备(150℃杀菌10s)或高温干热空气灭菌箱等杀菌设备(130℃高温烘箱烘1h)进行高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下再使用。所述低温干燥指的是-40℃以下冷冻干燥或30℃～40℃条件下真空干燥，优选为-40℃以下冷冻干燥。所述粉碎、造粒、包衣的工序均可参考常规的颗粒剂制剂工艺进行。
本发明的有益效果：
1.本发明分离得到的鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌株，具有如下特性：
(1)在pH5.0、5.5较低pH环境下仍然具有一定的生长能力，最适pH为6.0。在pH6.0培养得到的菌体，置于pH2.0的人工胃液中3h仍然具有较高的存活率；
(2)在34-40℃的培养温度环境下具有良好的生长能力，其最佳生长温度为37℃；
(3)具有增强人体免疫力的效果。
2.本发明包括液态培养、固液分离、固态培养相结合的工艺制备方法，充分利用了液态培养速度快，固液分离后的湿菌种菌体数量高，以及固态培养可使鼠李糖乳杆菌的菌种活力和数量有较大的恢复和增长，并且在固态培养过程中还能产生细菌多糖等具有增强免疫的代谢产物。此外，固态培养添加的固态培养基及其培养产物还具有干燥保护剂的作用，且固态培养产生的菌体在干燥时应激小，菌体干燥时死亡率低，最终获得的产品菌种活力高、并含有适量的细菌多糖等具有增强人体免疫力效果的代谢产物，在实际的使用过程中具有更好的增强人体免疫力能力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1菌株的分离、菌种特性与鉴定
1.1样品采集
从本公司销售的益生菌制剂中分离纯化获得鼠李糖乳杆菌样品。
1.2菌株的分离
在本公司销售的益生菌制剂样品中进行分离纯化。取益生菌制剂4g，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合鼠李糖乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合鼠李糖乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.3菌株的鉴定
(1)菌落形态与生理生化实验分析
本发明菌株的菌落为白色、圆形、表面光滑、边缘整齐、细胞呈杆状。不运动、不液化明胶、H2O2酶活性试验阴性、硫化氢试验阴性；革兰氏染色阳性。
本发明菌株的最适生长pH6.0，在pH5.0以上能生长；最适生长温度为30-35℃，15℃以上能生长。
本发明菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、纤维二糖；发酵葡萄糖时产酸、不产气。
(2)16S rRNA部分序列分析
将筛选菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1％琼脂糖进行凝胶电泳检测。使用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’GGTTACCTTGTTCGACTT-3’)进行PCR扩增，纯化后测序，得到的PCR产物序列，并进行菌种鉴定。
综合菌落形态分析、生理生化实验分析和16S rRNA部分序列分析的结果，将本发明菌株鉴定为鼠李糖乳杆菌，并命名为“鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11”。
1.4菌株的特性
1.4.1耐酸性
将经过活化的鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌种接种于MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液，取1mL鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11种子液接种于19mL pH分别为5.0、5.5和6.0的MRS液体培养基中，在37℃下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值(即在600nm波长处的吸光度值，通常可以用来比较培养液中的菌体细胞密度或菌体生长情况),以pH6.0的OD600值作对照(即以pH6.0培养的菌数为100％计)，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：
菌体生长情况(％)＝(其它pH培养的OD)/pH6.0培养的OD×100％。
结果见表1：
表1鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11在不同pH培养基中的生长情况
| pH | 空白对照(不培养) | 5.0 | 5.5 | 6.0 |
| 菌体生长情况(％) | 0.1 | 52.6 | 86.3 | 100 |
结果如表1所示，在初始pH5.0和5.5的培养基中培养得到的菌液，与pH6.0的培养基培养的菌液OD值相比，有一定程度的降低，但与不进行培养的空白对照组比较，仍然具有较高的生长速率。因此，鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11在pH5.0、5.5较低pH环境下仍然具有一定的生长能力。
将上述在pH6.0条件培养的鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌种，经过离心分离、磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次后用PBS重悬。取1mL重悬液分别与9mL pH2.0、2.5、3.0人工胃液混合，在37℃处理3h，然后分别测定处理前后的益生菌总数。
以未经人工胃液处理的菌数作对照，按照下列公式计算人工胃液处理前后的存活率：
存活率(％)＝(处理前的菌数-处理后的菌数)/处理前的菌数×100％。
结果见表2：
表2鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11在不同pH人工胃液处理后的存活率
| pH | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
| 存活率(％) | 66.8 | 83.5 | 86.7 |
结果如表2所示，在pH6.0培养得到的菌体，经过不同pH的人工胃液处理后，存活率为66％以上，仍然具有较高的存活率，因此，能够在正常的食用条件下以活菌形式进入肠道。
鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11在pH6.0环境下培养生长良好，最适pH为6.0。在pH6.0培养得到的菌体，置于pH2.0的人工胃液中3h仍然具有较高的存活率。
1.4.2耐温性
将经过活化的鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌种接种于MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液，取1mL鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11种子液接种于19mL pH分别为6.0的MRS液体培养基中，分别在31℃、34℃、37℃、40℃的温度下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值。
以37℃的OD600值作对照(即以37℃培养的菌数为100％计)，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：
菌体生长情况(％)＝(其它温度培养的菌数)/37℃培养的菌数×100％。
结果见表3：
表3鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11在不同温度下的生长情况
| 温度(℃) | 对照(不培养) | 31 | 34 | 37 | 40 |
| 菌体生长情况(％) | 0 | 76.1 | 89.2 | 100 | 86.5 |
结果如表3所示，在37℃的温度下培养得到的菌体数量最高，其它的温度条件下，与37℃的温度相比，培养产生的菌数较少，但与对照相比，仍然具有较高的生长速率。因此，鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11的最适温度为37℃，其在34～40℃温度环境下生长良好，具有在良好的耐温性。
1.4.3增加人体免疫力的功能效果
见实施例6。
综上所述，本发明的鼠李糖乳杆菌具有如下的特性：
(1)在pH5.0、5.5较低pH环境下仍然具有一定的生长能力，其最适生长pH为6.0；在pH6.0培养得到的菌体，置于pH2.0的人工胃液中3h仍然具有较高的存活率；
(2)在34-40℃的温度环境下生长良好，最佳生长温度为37℃；
(3)具有增加人体免疫力功能的效果。
实施例2制备鼠李糖乳杆菌制剂(液态法对照例)
2.1培养基
(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
2.2制剂的制备方法
本实施例的鼠李糖乳杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
使用上述改良MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。
(2)液态培养：
将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h，得到液体培养产物；
(3)固液分离：
将上述液体培养产物用管式离心机或碟式离心机进行固液分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；
(4)干燥：
将湿菌体置于冷冻干燥机中在-40℃冷冻干燥20h，即得到液态法制备的鼠李糖乳杆菌原粉。
产品中活菌数的测定方法为：用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后，采用MRS琼脂培养基平板倾注法，37℃培养48h后计菌落总数。
经测定：本实例所制备的鼠李糖乳杆菌原粉产品，其总菌数为3.32×1011CFU/g。
(5)造粒、包衣和包装：
向步骤(4)所得鼠李糖乳杆菌原粉中加入适量的辅料(如：海藻糖、脱脂奶粉等)，经造粒，得到液态法制备的鼠李糖乳杆菌制剂。
经测定：本实施例制备所得的鼠李糖乳杆菌制剂产品，其总菌数为2.85×1011CFU/g。
实施例3制备鼠李糖乳杆菌制剂(固态法1)
3.1培养基
(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(3)固体培养的培养基(用于固态培养)：
按照下列配方的比例准备固态培养的原料：
湿菌体100g、葡萄糖粉20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、番茄粉10g、K2HP042g、食品级碳酸钙2g。
除了湿菌体外，其余各种原料分别杀菌(分别用高温瞬时杀菌设备在150℃杀菌10s)，冷却后无菌混合均匀，作为固态培养基的原料备用。
3.2制剂的制备方法
本实施例的鼠李糖乳杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
使用上述改良MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。
(2)液态培养：
将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h，得到液体培养产物；
(3)固液分离：
将液体培养产物用管式离心机或碟式离心机进行固液分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；立即将湿菌体转入固态培养基培养；
(4)固态培养：
在无菌室将湿菌体与无菌的固态培养基混合，调节所得混合物的含水率为50％。然后置于厌氧固态发酵罐中，在37℃下密封厌氧固态培养72h。
(5)干燥：
将步骤(4)固态培养产物在-40℃下冷冻干燥20h，得到固态法(1)制备的鼠李糖乳杆菌原粉。经测定：本发明制备所得的鼠李糖乳杆菌原粉产品，其总菌数为4.16×1011CFU/g。
(6)造粒、包衣和包装：
将步骤(5)所得鼠李糖乳杆菌原粉造粒，包衣，得到固态法(1)制备的鼠李糖乳杆菌制剂。
经测定：本实例所制备的鼠李糖乳杆菌制剂产品，其总菌数为3.28×1011CFU/g。
实施例4制备鼠李糖乳杆菌制剂(固态法2)
实施例4的工艺操作与实施例3基本相同，仅更改部分操作参数，用于说明在不同的操作条件下生产的固态培养益生菌产品的效果。
4.1培养基
与实施例3的不同仅在于，实施例4的固体培养基增加乳清粉10g或10重量份。
4.2制剂的制备方法
与实施例3的不同仅在于，调节所得混合物的含水率为52％。在37℃下密封厌氧固态培养96h。
其他步骤同实施例3，分别制成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的鼠李糖乳杆菌原粉产品总菌数为4.65×1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为3.91×1011CFU/g。
实施例5制备鼠李糖乳杆菌制剂(固态法3)
实施例5的工艺操作与实施例3基本相同，仅更改部分操作参数，用于说明在不同的操作条件下生产的固态培养益生菌产品的效果。
5.1培养基
实施例5培养基同实施例3。
5.2制剂的制备方法
与实施例3的不同仅在于，调节所得混合物的含水率为55％。在37℃下密封厌氧固态培养120h。
其他步骤同实施例3，分别制成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的鼠李糖乳杆菌原粉产品总菌数为4.23×1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为3.63×1011CFU/g。
本发明的制备方法中，若发酵罐培养基较大，可将三角瓶液体菌种再接种于1-3级菌种罐中扩大培养，从而获得用于发酵罐的液体菌种，小规模培养则直接只用三角瓶培养的菌种进行接种。
实施例6效果对比试验(鼠李糖乳杆菌对NK细胞活性的影响)
益生菌增加免疫力的效果可以通过测定其对NK细胞活性的影响和对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应来进行表征。
6.1相同重量浓度下菌剂对NK细胞活性的影响
6.1.1实验材料：
试验动物：选用SPF级昆明种雌性小鼠，6-8周龄(体重18-22g)，共105只，随机分为7组，每组15只。
其它材料：小鼠淋巴瘤细胞(YAC-1)、Hank's液、RPMI1640完全培养液、LDH基质液等。
6.1.2试验方法：
1)剂量与分组：
实验时分别取样品0.1g，用纯净水配制成10ml的样液，分别供动物灌胃使用。动物在实验室条件下适应3天后，随机分组，每日按表4的样品和剂量进行灌胃，连续灌胃30天，每次灌胃10ml，对照组灌服无菌纯净水10ml。
2)灌喂方法：
实验时分别取样品0.1g，用纯净水配制成10ml的样液，分别供动物灌胃使用。动物在实验室条件下适应3天后，随机分组，每日按表1的样品和剂量进行灌胃，连续灌胃30天，对照组灌服无菌纯净水10ml。
3)效应细胞(小鼠脾细胞)的制备：
鼠李糖乳杆菌制剂喂养实验结束后，将各剂量组小鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm，10min离心，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
4)靶细胞(YAC-1细胞)的传代
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
5)NK细胞活性测定(LDH法)
取浓度为4×105个/ml的靶细胞(YAC-1)和效应细胞(小鼠脾细胞)各100μl(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μl；上述各项均设3个复孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养4小时，然后将96孔培养板以1500r/min离心5分钟，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3分钟，每孔加入1mol/L HCl 30μl，在酶联仪492nm处测定光密度值。
按下式计算NK细胞活性：
NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
受试样品组的NK细胞活性显著高于阴性对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。
6.1.3实验结果：
鼠李糖乳杆菌制剂对小鼠NK细胞活性的影响实验结果见表4：
表4不同工艺生产的鼠李糖乳杆菌产品对小鼠NK细胞活性的影响
注：NK细胞活性转换值＝sin-1(A1/2)
由表4的结果可以看出：
与阴性对照相比，由实施例2和实施例3生产的鼠李糖乳杆菌原粉对小鼠NK细胞活性具有特别显著的效果。
与阴性对照相比，由实施例2、实施例3、实施例4和实施例5等生产的鼠李糖乳杆菌制剂对小鼠NK细胞活性具有特别显著的效果。并且由固态发酵法实施例3-5制备的鼠李糖乳杆菌制剂对小鼠NK细胞活性具有特别显著的效果比实施例2制备的制剂效果更好。
6.2相同菌数时制剂产品对小鼠NK细胞活性的影响
试验方法同6.1。
分别称取益生菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1×1010CFU/ml，每次灌服10ml，故每次服用的鼠李糖乳杆菌总数为10×1010CFU，即1×1011CFU。
按照6.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例制剂样品对小鼠NK细胞活性的影响，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表5：
表5相同菌数时制剂产品对小鼠NK细胞活性的影响
注：NK细胞活性转换值＝sin-1(A1/2)
如表5所示，实施例2为液态法制备的制剂产品对小鼠NK细胞活性的影响，而实施例3、4、5则分别为3种固态法制备的制剂产品对小鼠NK细胞活性的影响。
益生菌对小鼠NK细胞活性的影响，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的效果，但表5的结果表明：与液态法所制备的鼠李糖乳杆菌制剂相比，本发明的实施例3、4、5采用固态法制备的鼠李糖乳杆菌制剂对小鼠NK细胞活性具有更大的影响，说明其增强免疫力的效果更明显。液态法制剂在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其增强免疫力的效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有鼠李糖乳杆菌菌体外，还含有固态培养过程中所产生的细菌多糖等代谢产物，鼠李糖乳杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体对小鼠NK细胞活性的影响。
实施例7效果对比试验(鼠李糖乳杆菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响)
7.1相同重量浓度下益生菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
7.1.1实验材料：
试验动物：选用SPF级昆明种雌性小鼠，6-8周龄(体重18-22g)，共105只，随机分为7组，每组15只。
其它材料：Hank's液、RPMI1640完全培养液等。
7.1.2试验方法：
(1)剂量与分组：
每组小鼠分别用阴性对照组(纯水)、实施例2原粉、实施例3原粉、实施例2制剂、实施例3制剂、实施例4制剂、实施例5制剂等进行灌胃，详见表6。每日2次，所有小鼠连续服用30天。
(2)灌喂方法：
实验时分别取样品0.1g，用纯净水配制成10ml的样液，分别供动物灌胃使用。动物在实验室条件下适应3天后，随机分组，每日按表6的样品和剂量进行灌胃，连续灌胃30天，每次灌胃10ml，对照组灌服无菌纯净水10ml。
(3)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)：
淋巴细胞增殖反应：
鼠李糖乳杆菌制剂喂养实验结束后，将各剂量组小鼠无菌取脾，置无菌Hank’s液中磨碎，经1000r/min离心洗涤后，将细胞悬于1ml的完全培养液中，活细胞计数并调整浓度3×106个/ml，将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，1孔75μl ConA液(相当于7.5μl/ml)，另一孔作对照。置于5％CO2，37℃培养72h。培养结束前4小时，每孔吸去上清液0.7ml，每孔加入0.7ml无血清RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μl/ml/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶溶解，分别加入96孔培养板中，作3个孔的平行样，以570nm波长测定光密度值，按下式计算光密度差值，从而计算出淋巴细胞的增殖转化能力。
淋巴细胞的增殖能力＝光密度差值＝OD(ConA孔)-OD(对照孔)
7.1.3实验结果：
鼠李糖乳杆菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响见表6：
表6不同工艺生产的鼠李糖乳杆菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
由表6的结果可以看出：
与阴性对照相比，由实施例2和实施例3生产的鼠李糖乳杆菌原粉对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应均具有显著的效果；与液态法(即实施例2)制备的鼠李糖乳杆菌原粉相比，固态法1(即实施例3)制备的鼠李糖乳杆菌原粉具有更强的增加免疫力的效果。
与阴性对照相比，由实施例2、实施例3、实施例4和实施例5等生产的鼠李糖乳杆菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应均具有特别显著的效果；与液态培养法(实施例2)相比，由固态培养法(实施例3-5)制备的鼠李糖乳杆菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应具有更好的效果。
7.2相同菌数时制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的效果对比
试验方法同7.1。
分别称取益生菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1×1010CFU/ml，每次灌服10ml，故每次服用的干酪乳杆菌总数为10×1010CFU，即1×1011CFU。
按照7.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表7：
表7相同菌数时制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
如表7所示，实施例2为液态法制备的制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，而实施例3、4、5则分别为3种固态法制备的制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应。
益生菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的效果，但表5的结果表明：与液态法所制备的鼠李糖乳杆菌制剂相比，本发明的实施例3、4、5采用固态法制备的鼠李糖乳杆菌制剂具有更大的对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，说明其增强免疫力的效果更明显。液态法制剂在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其抑菌效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有鼠李糖乳杆菌菌体外，还含有固态培养过程中所产生的细菌多糖等代谢产物，鼠李糖乳杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应。
综合表4、表5、表6和表7的效果对比结果，所有进行实验的鼠李糖乳杆菌制剂都有增强免疫力的效果，且由固态培养法制备的鼠李糖菌剂效果具有比液态培养法更好的增强免疫力的效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株，其特征在于，所述的鼠李糖乳杆菌菌株为鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌株，保藏编号为CGMCC20862。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株在制备增强人体免疫力的药物中的应用。
4.一种增强人体免疫力的制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。
5.权利要求4所述增强人体免疫力的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11菌株活化后，于液体培养基中进行逐级扩大培养，得到液体培养产物；
(2)将所述液体培养产物进行固液分离并除去液体部分，得到鼠李糖乳杆菌湿菌体；
(3)将所述鼠李糖乳杆菌湿菌体接种至固体发酵培养基中进行培养，经低温干燥、粉碎、造粒、包衣，即得所述增强人体免疫力的制剂。
6.根据权利要求5所述增强人体免疫力的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将鼠李糖乳杆菌经斜面培养或平板培养活化后接种至三角瓶液体培养基中，37℃、厌氧条件下培养24h，得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐液体培养基中进行培养，37℃、厌氧条件下培养24h，得到液体培养产物；
所述斜面培养或平板培养的培养基包含如下浓度的原料组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L；
所述三角瓶液体培养基和发酵罐液体培养基均包含如下浓度的原料组分：葡萄糖粉20g/L、蛋白胨粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L。
7.根据权利要求5所述增强人体免疫力的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以湿菌体100重量份计，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、食品级碳酸钙2重量份。
8.根据权利要求5所述增强人体免疫力的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以湿菌体100重量份计，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、乳清粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP042重量份、食品级碳酸钙2重量份。
9.根据权利要求5所述增强人体免疫力的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，还包括调节所述接种后的固体发酵培养基的含水率至45-55％。
10.根据权利要求5所述增强人体免疫力的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)中，所述培养的温度均为37℃。
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