CN110141584B - 一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用 - Google Patents

一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用 Download PDF

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Abstract

一种开菲尔乳杆菌M11在抑菌及作为治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用。本发明解决了现有乳酸菌表面疏水性低以及乳酸菌抑菌能力差的问题。本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，抑菌效果好。本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11及其菌制剂均具有优异的表面疏水性和凝聚性，对肠道有很好的粘附能力，使得其在Ⅱ型糖尿病的应用中有很好的血糖调节能力，本发明对Ⅱ型糖尿病病症有明显的缓解作用。

Description

一种开菲尔乳杆菌M11在抑菌及作为治疗Ⅱ型糖尿病药剂的 活性成分的应用
技术领域
本发明涉及一种开菲尔乳杆菌的应用。
背景技术
乳酸杆菌是动物肠道内的共生菌，能够帮助消化，有助人体肠道的健康，含有活性乳酸杆菌的食品常被视为健康食品，通常乳酸杆菌添加在酸奶等发酵食品中，用以人体人类肠道中菌群平衡调节。在体内肠上皮细胞可以分泌某种物质(可能是一种蛋白质或脂质磷壁酸)，有利于乳酸杆菌等益生菌在肠黏膜上定植，从而形成菌膜屏障，排斥致病菌在肠壁上的粘附。同时，乳酸杆菌会产生乳酸、乙酸及细菌素，抑制多种致病菌的侵入。因此应用乳酸杆菌代替抗生素防止人类或者动物的肠道疾病已成为当前食品和饲料工业中重要的研究领域。2019年，YANG研究发现鼠李糖乳杆菌GG还可增加仔猪肠道的通透性，并通过调控抗菌肽、细胞因子和趋化因子的分泌以改善肠道的免疫屏障功能。
乳酸杆菌的粘附特性是评价乳酸杆菌益生功能的重要指标之一，粘附定植是乳酸杆菌在肠道中发挥生理功能的前提和基础。有学者研究表明微生物细胞表面疏水性和自动聚集能力对菌株的粘附性起着主要的作用，疏水性和自聚能力较高的乳酸杆菌在肠道中也呈现较高的粘附性，即菌体表面疏水性和自聚能力与其对肠道上皮细胞的粘附力成正比。
目前，乳杆菌潜在的防治Ⅱ型糖尿病的功能已得到动物体内及临床实验的证实和广泛认可。当机体摄入适量的乳杆菌时，能有效调节能量代谢，降低脂肪和胆固醇堆积，有效补充Ⅱ型糖尿病引起的肠道菌群缺失，建立新的肠道平衡稳态，恢复健康肠道菌群结构，降低肠道渗透性，提高肠道屏障作用，抑制炎症反应，减轻葡萄糖不耐受并提高葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。现有普通乳酸菌的表面疏水性低，粘附性差，血糖调节能力较差，其在防治Ⅱ型糖尿病应用效果较差，另外，乳酸杆菌还需要对致病菌产生抑制作用，才能发挥其调整血糖的作用。现在有的普通乳酸菌抑菌能力较差，限制了乳酸菌在Ⅱ型糖尿病的应用。
发明内容
本发明为了解决现有乳酸菌表面疏水性低以及乳酸菌抑菌能力较差的问题。而提供了一种开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在抑菌及作为治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用。
本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在抑菌上的应用。
本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11作为治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用，其中所述的开菲尔乳杆菌经过冻干处理制成菌制剂，然后再作为治疗Ⅱ型糖尿病活性吃成分进行应用。
开菲尔乳杆菌经过冻干处理制成菌制剂的方法为：开菲尔乳杆菌Lactobacilluskefiri M11在MRS培养基中培养至对数生长期后离心，去上清留菌体，然后向菌体中加入脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠混合，经过冻干处理即得到开菲尔乳杆菌菌制剂；其中，菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100:6～7:1～2：1～2。
上述开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在改善Ⅱ型糖尿病患者肠道微生物菌群中的应用。
本发明所述的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M11保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2019年1月24日，保藏号为CCTCC NO：M2019080。
本发明的Lactobacillus kefiri M11来源于西藏灵菇，其菌体形态为革兰氏阳性菌、中长杆菌，菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑。
本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，抑菌效果好。本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11及其菌制剂均具有优异的表面疏水性和凝聚性，对肠道有很好的粘附能力，使得其在Ⅱ型糖尿病的应用中有很好的血糖调节能力，同时降低了血清和肾脏中的丙二醛水平，减轻糖尿病所引起的氧化损伤，同时对致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)的有很好的抑制作用，本发明对Ⅱ型糖尿病的病症有明显的缓解作用，另外，本发明开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiriM11对Ⅱ型糖尿病患者肠道微生物菌群具有明显的改善。
附图说明
图1是Lactobacillus kefirii M11的菌落特征；
图2是Lactobacillus kefirii M11的菌体特征；
图3是Lactobacillus kefirii M11的总DNA PCR扩增图；
图4是开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefirii M11系统发育分析图；
图5是保加利亚菌Lactobacillus bulgaricus ATCC11842的抑菌结果图；
图6是开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefirii M11抑菌结果图；
图7为Lactobacillus kefirii M11和Lactobacillus kefirii M11菌制剂-20℃条件下储存时间对活菌数的影响；
图8是Lactobacillus kefirii M11在人工胃液中耐受性结果图；
图9是Lactobacillus kefirii M11在人工肠液中耐受性结果；
图10是乳杆菌及菌制剂Ⅱ型糖尿病小鼠实验；
图11是开菲尔乳杆菌菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠血清氧化损伤结果；
图12是开菲尔乳杆菌菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠肾脏氧化损伤结果；
图13是开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefirii M11小鼠肠道菌群的影响。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在抑菌上的应用。
具体实施方式二：本实施方式开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11作为治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：开菲尔乳杆菌经过冻干处理制成菌制剂，然后再作为治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的进行应用，菌制剂的制作方法为：开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在MRS培养基中培养至对数生长期后离心，去上清留菌体，然后向菌体中加入脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠混合，经过冻干处理即得到开菲尔乳杆菌菌制剂；其中，菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100:6～7:1～2：1～2。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：冻干处理方法是菌体与脱脂乳、蔗糖和海藻酸钠的混合物在-20℃条件下冷冻1～5h，然后在冷阱温度小于-40℃、真空度大于200mtorr的条件下真空冷冻干燥，即完成了冻干处理。其他与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三不同的是：离心条件是离心转速为5000r/min、离心时间为10min。其他与具体实施方式三相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三不同的是：菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100:6.67：:1.67：1.67。其他与具体实施方式三相同。
具体实施方式七：本实施方式开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在改善Ⅱ型糖尿病患者肠道微生物菌群中的应用。
本实施方式在用于开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11经过冻干处理制成菌制剂后在用于改善Ⅱ型糖尿病患者肠道微生物菌群。开菲尔乳杆菌经过冻干处理制成菌制剂，具体的方法为：开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在MRS培养基中培养至对数生长期后离心，去上清留菌体，然后向菌体中加入脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠混合，经过冻干处理即得到开菲尔乳杆菌菌制剂；其中，菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100:6～7:1～2：1～2。
实施例1开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11分离、纯化及鉴定：
一、西藏灵菇菌粒培养
1、西藏灵菇菌粒活化：按5％接种量将西藏灵菇菌粒接种到灭菌完达山纯牛奶中，21℃恒温培养24h，将培养后的西藏灵菇发酵液通过灭菌过滤网过滤，保留西藏灵菇菌粒，重复一周；其中西藏灵菇菌粒于2017年采集自黑龙江大学微生物重点实验室。
2、西藏灵菇菌粒传代：将活化后的西藏灵菇菌粒按照5％的比例扩大培养到灭菌牛乳中，21℃恒温培养48h，将培养后的西藏灵菇发酵液通过灭菌过滤网过滤，保留西藏灵菇菌粒；每隔48h传代一次，共传代4次；
二、乳杆菌分离、纯化
2g无菌生理盐水洗净的步骤一中传代后的西藏灵菇菌粒与1mL无菌生理盐水混合放入研钵中，研磨至颗粒直径为1-3mm；将制得的西藏灵菇菌粒分多次转移到10ml的离心管中定容至10ml，涡旋震荡均匀；对菌悬液分别按104、105、106梯度进行稀释。在MRS固体培养基上37℃培养选择具有乳酸菌菌落形态(通常每个样品5至10个菌落)进行革兰氏染色，选择革兰氏阳性细菌并且在电子显微镜下观察为杆状的典型乳杆菌菌体形态，在MRS固体培养基上纯化，分离获得一株乳杆菌，编号为M11。对M11菌株纯化三代。
三、对步骤二中纯化后的乳杆菌M11菌株进行鉴定
1、细菌DNA的提取
按照上海生工生物有限公司的Ezup柱式细菌DNA抽提试剂盒操作说明提取乳杆菌M11菌株的总DNA。
2、乳杆菌M11总DNA的PCR扩增
PCR扩增引物：5'-TACCTTGTTAGCACTT-3'
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
PCR反应体系(50μL)：10×PCR buffer 10μL，引物对(10μmol/L)各5μL，dNTP MIX(100mmol/L)4μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)2.5μL，dd H2O 26.5μL，模板DNA 2μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，进行循环35个，72℃延伸10min，4℃下保存。
3、琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，称取1g琼脂糖，用1×TAE缓冲溶液配制1.0％琼脂糖电泳凝胶，未凝固时加入溴化乙锭使其终浓度达到1μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液使液面没过胶面。将5μL PCR产物分别和1μL 6×loading buffer混合，点样，其中一孔加入DNA marker。电泳30min，紫外凝胶成像仪观察电泳结果。
4、乳杆菌M11的16S rDNA测序
选择琼脂糖凝胶电泳成像后长度为1000bp左右的PCR产物送往上海生工进行测序。使用针对GenBank DNA数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)的BLAST搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.blast)鉴定从西藏灵菇菌粒中分离的乳杆菌。用软件MEGA 5.1构建进化树，进行系统发育分析，结果如图4所示。
本实施方式M11菌株的菌落特征如图1所示；M11菌株的菌体特征如图2所示，从图1和图2所示，本实施方式的M11菌株菌体形态为革兰氏阳性菌、中长杆菌，菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑。
本实施方式M11菌株的总DNA PCR扩增结果如图3所示，其中，M为maker，1为M11菌株；由图3可知，从西藏灵菇中分离出的本实施方式M11菌株的基因序列长度在1000bp左右，提取的基因片段完整，无降解，可以测序。
根据分子生物学分析以及菌落、菌体特征确定本实施方式M11菌株为开菲尔乳杆菌，命名为Lactobacillus kefirii M11。
实施例2本发明Lactobacillus kefiri M11菌在抑菌中的应用
待测菌株：本发明的Lactobacillus kefiri M11菌、保加利亚菌(Lactobacillus bulgaricus ATCC11842)；
具体的试验方法：
一、取待测菌体的发酵液，在3500r/min条件想离心12min去沉淀留上清；
二、双层检测平板的制备
在无菌平皿(d＝90mm)中倒入20mL加热融化的素琼脂(2％)，待其充分冷却凝固后，按一定次序摆放整齐n个已灭菌的牛津杯(d-7mm)。将分装于三角瓶中的30mL融化的指示菌半固体培养基冷却至50℃左右，加入105cfu/mL指示菌(B，subtilis)新鲜菌悬液1mL，迅速混合均匀，倒入平板。冷却后，用无菌镊子取出牛津杯，即为抑菌试验用双层检测平板。
三、待测样品的制备
第一组：用0.25mol/L NaOH溶液将制备好的步骤一得到的上清液的pH调至中性；第二组为步骤一中未调pH的上清液；第三组为空白对照，即用乳酸将未接菌的MRS培养基的pH调至上清液的pH值一致；第四组：用0.25mol/L NaOH溶液将步骤一中的上清液的pH调至中性，然后在加入胰蛋白酶(1.5mg/L)混合；
四、抑菌活性物质的检测
1、检测平板的培养基分别为大肠杆菌培养基和金黄色葡萄菌培养基，大肠杆菌培养基(LB(Luria-Bertani)培养基)成分如表1所示，大肠杆菌培养基在121℃条件想灭菌20min；金黄色葡萄菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)如表2所示，所使用的是牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)，在121℃条件想灭菌20min。
2、分别取100μl步骤三中第一组、第二组、第三组的样品，以无菌操作加入检测平板的牛津杯孔内，37℃培养15h；第四组样品在37℃保温处理1h后，沸水浴3min使胰蛋白酶失活，然后加入检测平板牛津杯孔作抑菌试验；
3、观察是否产生抑菌圈并用游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。
表1大肠杆菌培养基(LB(Luria-Bertani)培养基)
蛋白胨 10g
酵母膏 5g
Nacl 10g
蒸馏水 1000mL
pH 7.0
表2牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
Nacl 5g
琼脂 15-20g
水 1000mL
pH 7.0-7.2
抑菌效果如图1、图2所示，图1为保加利亚(Lactobacillus bulgaricusATCC11842)菌的抑菌结果图，图2为本发明的Lactobacillus kefiri M11菌的抑菌结果图，图中，金是金黄色葡萄球菌培养基、E是大肠杆菌培养基；保是保加利亚菌(Lactobacillus bulgaricus ATCC11842)，M11是Lactobacillus kefiri M11菌；孔1:第一组待测样品，孔2:第二组待测样品，孔3::第三组待测样品，孔4::第三组待测样品。
从图5和图6可以看出，本发明的Lactobacillus kefiri M11菌与保加利亚乳杆菌的相比较，本申请的Lactobacillus kefiri M11菌对大肠杆菌和金光色葡萄球菌有较强抑制作用，调整pH后，其抑菌效果减弱，但用乳酸将未接菌的培养基调整到发酵液pH时，保加利亚乳杆菌的抑菌作用没有M11菌株作用明显，这说明M11中存在对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用的物质，但该物质不是乳酸，该物质的抑菌效果受到pH的影响；而经过胰蛋白酶处理后，该菌株的抑菌效果减弱，说明该物质可能是蛋白类或肽类成分。
实施例3表面疏水性的测定、自凝能力的测定以及与致病菌的共聚能力的测定
一、表面疏水性的测定
待测样品为：本发明的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefirii)M11菌株(裸菌)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefirii)M11菌制剂、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus ATCC11842)菌株(裸菌)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricusATCC11842)菌粉。其中本发明的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefirii)M11菌制剂实验前置于-20℃的环境中保存12个月。
具体的的测定方法如下：
1、待测样品在MRS培养液中于37℃生长18h，在转速为5000r/min的条件下离心5min，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗涤两次；
2、步骤一中洗涤后的沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中并调整至细胞密度(2×108CFU/mL)；
3、向步骤二中加入3.0mL涡旋混合细胞悬液和1.0mL二甲苯的混合液，在30℃温育10min得到短暂涡旋混合物；
4、步骤三的短暂涡旋混合物在30℃下孵育1h以达到相分离，除去上层水相后测量剩余部分其在600nm处的吸光度。
表面疏水性(％)为原始悬浮液与混合后水相吸光度降低的百分比。
待测样品的表面疏水性结果如表3所示。
表3表面疏水性检测结果
Figure BDA0002066298440000071
由表1可知，本发明的Lactobacillus kefirii M11及其菌制剂的表面疏水性均高于Lactobacillus bulgaricus。
二、自凝能力测定
待测菌株为：本发明的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefirii)M11菌株(裸菌)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus ATCC11842)菌株。
具体测定方法如下：
待测菌株在MRS培养液中培养24h，在转速为5000r/min条件下离心10min收集菌体，使用PBS(pH6.8)洗涤2次后于PBS中重悬，将菌浓度调整为108CFU/mL，4mL等量的细胞菌悬液装入5mL的离心管中，混匀后静置于室温下。自聚测定的时间为1、2、3、4、5h，每次取0.5mL的上部菌悬液，加入到1.5mL的PBS中，混匀，测定600nm下的吸光值，以PBS作为空白对照。
凝集率(A％)计算公式为:A(％)＝(A0－At)/A0×100
式中:A0为初始时间时600nm下的吸光度；
At为不同时间的吸光光度值
自凝能力测定结果如表4所示。
三、乳酸杆菌与致病菌(大肠杆菌)的共聚能力测定
待测菌株为：本发明的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefirii)M11菌株(裸菌)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus ATCC11842)菌株。
具体测定方法如下：
乳酸杆菌在MRS培养基中培养24h，在转速为5000r/min条件下离心10min收集菌体，使用PBS(pH6.8)洗涤2次后于PBS中重悬，将菌数调整为108cfu/mL。同时，致病菌采用同样的方法，重悬于PBS中，并且调整菌数为108cfu/mL。分别吸取2mL待测菌菌悬液和致病菌菌悬液于试管中，漩涡震荡10s混匀，分别在1、2、3、4、5h测定其在波长为600nm下的吸光值。对致病菌的凝集率通过下列公式计算:
A(％)＝(A0－Amix)/A0×100
式中:Amix－为致病菌与待测菌混合液在各个时间点的吸光值；
A0－为初始时间时混合液的吸光值。
乳酸杆菌与致病菌(大肠杆菌)的共聚能力如表4所示。
表4自凝能力及与与致病菌的共聚能力测定结果
Figure BDA0002066298440000081
Figure BDA0002066298440000091
由表2可知，本发明的Lactobacillus kefiri M11的自聚能力和大肠杆菌共聚能力均好于Lactobacillus bulgaricus。
本发明的Lactobacillus kefiri M11菌及其菌制剂具有优异的表面疏水性，同时本发明Lactobacillus kefiri M11菌还具有很好的聚能力和大肠杆菌共聚能力，Lactobacillus kefiri M11菌及其菌制剂在肠道中具有很好的粘附性。
实施例4开菲尔乳杆菌菌制剂的制备
开菲尔乳杆菌菌制剂的制备方法为：上述开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M11在MRS培养基中培养至对数生长期，离心去上清留菌体，向菌体中加入脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠混合，经过冻干处理即得到Lactobacillus kefiri M11菌制剂；其中，菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100:6.67:1.67：1.67。
本实施方式的开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)M11的培养温度为37℃。
本实施方式的离心条件是离心转速为5000r/min、离心时间10min。
本实施方式冻干处理方法为：菌体与脱脂乳、蔗糖和海藻酸钠的混合物在-20℃条件下冷冻1～5h，然后在冷阱温度小于-40℃、真空度大于200mtorr的条件下真空冷冻干燥，即完成了冻干处理。其中，混合物冷冻后厚度小于等于20mm。
本实施方式的Lactobacillus kefiri M11菌制剂以及Lactobacillus kefiriM11(裸菌)在-20℃条件下储存时间对活菌数的影响如图7所示，图中
Figure BDA0002066298440000092
为Lactobacilluskefiri M11菌制剂，
Figure BDA0002066298440000093
为Lactobacillus kefiri M11裸菌，从图7可以看出，在0、1、2、3、4、5、8、12周之后测定菌制剂活菌数分别为3.92×109CFU/mL、1.41×109CFU/mL、9.89×109CFU/mL、5.12×108CFU/mL、2.27×108CFU/mL、1.881×108CFU/mL、1.87×108CFU/mL、4.85×107CFU/mL，储存12周以后活菌数仍能达到107CFU/mL。而Lactobacillus kefiri M11裸菌在-20℃保存一周，活菌数为0CFU/mL。
实施例5开菲尔乳杆菌及其菌制剂胃肠液耐受性
一、人工胃肠液配置：参照《中国药典》配制人工胃肠液；
1、人工胃液配置：取稀盐酸16.4mL，加入800mL的水和10g的胃蛋白酶，混合后调pH值至1.3，再加水定容至1L；
2、人工肠液配制：取磷酸氢二钾6.8g，加入500mL水使其溶解，用0.1mol/L NaOH调pH值至6.8得到磷酸氢二钾溶液；再称取10g胰蛋白酶加适量水溶解得到胰蛋白酶溶液，将磷酸氢二钾溶液和胰蛋白酶溶液混合后，加水定容至1L；
二、Lactobacillus kefiri M11菌制剂在胃肠液中耐受性的检测：称取Lactobacillus kefiri菌制剂按照体积比为1:10的比例分别加入10mL的人工胃液和人工肠液液中，充分混匀，每隔1h测定活菌数，观察6h。
三、Lactobacillus kefiri M11裸菌菌泥在胃肠液中耐受性的检测：Lactobacillus kefiri M11菌泥在5000r/min离心10min，去上清，然后用灭菌的PBS缓冲溶液洗涤沉淀3次，按照体积比为1:10的比例分别加入到人工胃液和人工肠液液中，充分混匀，每隔1h测定活菌数，观察6h。
检测结果如图8～9所示，其中，从图8和图9可以看出Lactobacillus kefiri M11菌及其菌制剂都具有良好的胃肠液耐受性，1g Lactobacillus kefiri M11菌制剂在10mL人工胃液及肠液中保留6h活菌数仍能达到106CFU/g以上，L.kefiri M11活菌数在人工胃液仍能达到1.44×106CFU/g、在人工肠液中达到2.77×106CFU/g；Lactobacillus kefiri M11裸菌菌泥进行胃肠液耐受性实验，胃肠液耐受性实验结果显示6h以后，Lactobacilluskefiri M11活菌数在人工胃液达到5.02×105CFU/g、在人工肠液中达到5.01×105CFU/g。
Lactobacillus kefiri M11菌制剂在人工胃肠液中活菌数明显高于Lactobacillus kefiri M11菌裸菌菌泥的活菌数，Lactobacillus kefiri M11菌制剂增强胃肠液耐受性。
实施例6Ⅱ型糖尿病小鼠实验
一、开菲尔乳杆菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影响
参照《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中的方法，试验采用昆明21日龄雄性小鼠进行。小鼠于动物培养室内适应性饲养1周后开始建模，随机选取12只作为正常阴性对照组(正常组)。模型组小鼠于建模前禁食24h(自由饮水)，130mg/kg剂量腹腔注射ALX。注射10天后禁食4h断尾取血，用血糖仪测定空腹血糖浓度，血糖浓度在10-25mmol/L之间的小鼠为Ⅱ型糖尿病建模成功小鼠。
选取36只Ⅱ型糖尿病建模成功小鼠平均分成3组(T2B2组、M11组和BJLY组)，每组12只，T2B2组为空白对照组，Ⅱ型糖尿病小鼠灌胃自来水，灌胃剂量为10mL/kg·d，连续灌胃5周；M11组Ⅱ型糖尿病小鼠灌胃Lactobacillus kefiri M11菌制剂，0.1gLactobacillus kefiri M11用1mL灭菌的磷酸盐缓冲液溶解，灌胃剂量为10mL/kg·d，连续灌胃5周；BJLY组Ⅱ型糖尿病小鼠灌胃保加利亚菌粉，0.1g保加利亚(Lactobacillus bulgaricus ATCC11842)菌粉用1mL灭菌的磷酸盐缓冲液溶解，灌胃剂量为10mL/kg·d，连续灌胃5周。血糖值试验结果如图10所示，由图10可知，看出T2B2组小鼠血糖明显正常组，而M11组小鼠血糖明显低于T2B2组，本发明的Lactobacillus kefiri M11菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖值有降低的作用。本发明的Lactobacillus kefiri M11菌制剂的降低血糖作用明显好于保加利亚乳杆菌。
二、开菲尔乳杆菌菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠氧化损伤的影响
丙二醛(Maloondialdehyde，MDA)是一个判定氧化损伤的常用指标，经常被用来判定氧化损伤程度。步骤一中实验小鼠在实验结束后处死，四组试验小鼠(正常组、T2B2组、M11组和BJLY组小鼠)分别取血清和肾脏组织进行检测；具体方法参见上海鑫乐生物科技有限公司提供的小鼠血浆脂多糖试剂盒说明书，并严格按照说明书操作，取血清或肾脏组织0.10g并加入0.90mL提取液充分匀浆，3000r/min离心20min，测定血清或肾脏中丙二醛含量。
测定各组小鼠血清中的丙二醛含量结果如图11所示，从图11可以看出T2B2组小鼠血清丙二醛含量明显高于正常组，而M11组小鼠血清丙二醛含量低，Lactobacillus kefiriM11菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠血清丙二醛含量有降低作用。
测定各组小鼠血清中的丙二醛含量结果如图12所示，从图12可以看出T2B2组小鼠血清丙二醛含量明显高于正常组，而M11组小鼠血清丙二醛含量低，Lactobacillus kefiriM11菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠血清丙二醛含量有降低作用。
本发明的Lactobacillus kefiri M11菌制剂对于Ⅱ型糖尿病病症缓解作用最明显。
三、开菲尔乳杆菌菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群的影响
1、样品前处理
称取200mg步骤一中各个实验组小鼠(正常组、T2B2组为空白对照组、M11组Ⅱ型糖尿病小鼠灌胃Lactobacillus kefiri M11菌制剂、BJLY组Ⅱ型糖尿病小鼠灌胃保加利亚菌粉)的新鲜粪便，分别放入灭菌的2mL离心管中，再加入1mL70％乙醇，震荡混匀，10000r/min室温离心3min，弃置上层液体。加入PBS溶液，震荡混匀，10000r/min室温离心3min，弃置上层液体，倒置2mL管于吸水纸上1min，直至没有液体流出。将样品管放入55℃烘箱10min，使残留酒精完全挥发，保证后续实验操作。
2、肠道菌群差异分析
上述处理结束的粪便，在上海生工生物工程公司对肠道菌群16S rDNA的V3-V4区进行分类测序工作，对各组小鼠肠道菌群的多样性和丰度进行不同生物分类学水平的分析，利用SPSS 17.0软件进行相关性分析。
Lactobacillus kefiri M11菌制剂对小鼠肠道菌群多样性的影响如表3所示。各组样品的序列数都超过35000，覆盖率达到99％，这表明小鼠99％肠道菌群均已被测序到。与正常组相比，T2B2组小鼠肠道菌群多样性减少了12.11％，与T2B2组相比，M11、B组小鼠肠道菌群多样性增加了9.44％、2.91％。由表5可知，Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群(正常组)多样性降低；M11组、BJLY组均有使Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群向正常水平恢复的能力，M11组肠道菌群alpha指数相近并且更接近正常组，结果表明Lactobacillus kefiri M11菌制剂对Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群多样性调节作用最佳。
表5肠道菌群alpha指数
Figure BDA0002066298440000121
LEfSe(LDA Effect Size)分析，可以用于两个或多个分组之间的比较，从而找到组间有显著性差异的物种。经过LEfSe(LDA Effect Size)分析T2B2与正常组相比肠道菌群发生了变化，其中，梭菌纲(Clostridia)普雷沃菌属(Prevotellaceae)、Alistipes等有害菌增加。正常组在拟杆菌门(Bacteroides)起作用；T2B2组在厚壁菌门中梭菌纲(Clostridia)起到重要作用；M11组在乳杆菌属(Lactobacillus)起到重要作用；BJLY组在变形菌门(Proteobacteria)起到重要作用。结果表明Lactobacillus kefiri M11菌制剂能使Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群中有益菌增加。
各处理组属水平的变化：高通量测序发现正常小鼠肠道菌群由Barnesiella、Bacteroides、Alloprevotella、Helicobacter、Alistipes、Clostridium XlVa、Parabacteroides、Escherichia/Shigella、Coprobacter、Lactobacillus、Holdemanella、Odoribacter组成。其中Barnesiella、Bacteroides、Alloprevotella为肠道菌群中的优势菌属。
各处理组属水平差异：正常组、T2B2组、M11组、BJLY组小鼠肠道菌群中Barnesiella的相对丰度分别为14692、10883.75、11328.5、15906.5，与正常组相比，T2B2组Barnesiella降低46.15％，与T2B2组相比，M11、BJLY组分别增加4.09％、46.15％；小鼠肠道菌群中Bacteroides的相对丰度分别为20781.25、3687.5、2975、1203.75、3062.5、13631，与正常组相比，T2B2组Bacteroides降低463.56％，与T2B2组相比，BJLY组增加269.65％，M11分别降低19.32％；各组小鼠肠道菌群中的Lactobacillus相对丰度分别为595.5、260.25、1287.75、819.5、269.5、674.5，与正常组相比，T2B2组Lactobacillus相对丰度降低128.82％，与T2B2组相比，M11、BJLY组Lactobacillus相对丰度分别增加214.89％、159.17％。小鼠肠道菌群中Alloprevotella的相对丰度分别为4746、6913.75、5345、4203.75、4764.25、11267.75，与正常组相比，T2B2组Alloprevotella增加31.35％，与T2B2组相比，BJLY组增加62.98％，M11降低39.20％。分析正常组、T2B2、M11组、BJLY组小鼠肠道菌群的影响，分析结果如图13所示，从图13可以看出，Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群中Barnesiella和bacteroides丰度降低，Lactobacillus kefiri M11使得Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群中Barnesiella和bacteroides丰度向正常水平恢复；T2B2组相对丰度降低，Lactobacillus kefiri M11菌制剂使得Ⅱ型糖尿病小鼠Lactobacillus增加最多。M11组Lactobacillus相对丰度与表面疏水性、自凝能力的测定结果以及胃肠液耐受性的结果一致，本发明的Lactobacillus kefiri M11粘附性好，由此可以证明LactobacilluskefiriM11菌制剂可以粘附在肠道上。正常组肠道菌群中Alloprevotella丰度升高，Lactobacillus kefiri M11菌制剂使得Ⅱ型糖尿病小鼠肠道菌群中Alloprevotella丰度向正常水平恢复；由此可知，Lactobacillus kefiri M11菌制剂能使得Ⅱ型糖尿病小鼠肠道中有益菌增加，有害菌减少。

Claims (7)

1.一种开菲尔乳杆菌M11在抑菌制药上的应用，所制备药物可用于抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，其中开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11保藏于中国典型培养物保藏中心 CCTCC ，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2019年1月24日，保藏号为CCTCC NO：M2019080。
2.一种开菲尔乳杆菌M11在制备治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分中的应用，其中开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11保藏于中国典型培养物保藏中心 CCTCC ，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2019年1月24日，保藏号为CCTCC NO：M 2019080。
3.根据权利要求2所述的开菲尔乳杆菌M11在制备治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的中应用，其特征在于开菲尔乳杆菌经过冻干处理制成菌制剂，具体的方法为：开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11在MRS培养基中培养至对数生长期后离心，去上清留菌体，然后向菌体中加入脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠混合，经过冻干处理即得到开菲尔乳杆菌菌制剂；其中，菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100: 6~7: 1~2：1~2。
4.根据权利要求3所述的开菲尔乳杆菌M11在制备治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分中的应用，其特征在于冻干处理方法为：菌体与脱脂乳、蔗糖和海藻酸钠的混合物在-20℃条件下冷冻1~5h，然后在冷阱温度小于-40℃、真空度大于200mtorr的条件下真空冷冻干燥，即完成了冻干处理。
5.根据权利要求3所述的开菲尔乳杆菌M11在制备治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分中的应用，其特征在于离心条件是离心转速为5000 r/min、离心时间为10min。
6.根据权利要求3所述的开菲尔乳杆菌M11在制备治疗Ⅱ型糖尿病药剂的活性成分中的应用，其特征在于菌体与脱脂乳、蔗糖、海藻酸钠重量比为100: 6.67:1.67：1.67。
7.开菲尔乳杆菌M11制备改善Ⅱ型糖尿病患者肠道微生物菌群药物中的应用，其中开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri M11保藏于中国典型培养物保藏中心 CCTCC ，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2019年1月24日，保藏号为CCTCC NO：M 2019080。
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