CN116790574B - 一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 - Google Patents
一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116790574B CN116790574B CN202310822743.6A CN202310822743A CN116790574B CN 116790574 B CN116790574 B CN 116790574B CN 202310822743 A CN202310822743 A CN 202310822743A CN 116790574 B CN116790574 B CN 116790574B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus kefir
- lactobacillus
- kefir
- immobilized
- microbial inoculum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 title claims abstract description 123
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 title claims abstract description 13
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 82
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 82
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 82
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 82
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 82
- 229920002752 Konjac Polymers 0.000 claims abstract description 74
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 63
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 63
- 239000000252 konjac Substances 0.000 claims abstract description 49
- 235000010485 konjac Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 235000001206 Amorphophallus rivieri Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[(2r,3s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5s,6r)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](OC3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229920002581 Glucomannan Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 229940046240 glucomannan Drugs 0.000 claims abstract description 24
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 22
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 235000015141 kefir Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 241001312219 Amorphophallus konjac Species 0.000 claims abstract 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 75
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 29
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 16
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 16
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 16
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 13
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 11
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 82
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 42
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 41
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 description 26
- 235000019823 konjac gum Nutrition 0.000 description 23
- 244000247812 Amorphophallus rivieri Species 0.000 description 22
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 15
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 14
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 14
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 13
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 12
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 8
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 2
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015816 nutrient absorption Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法，属于微生物制剂技术领域；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂包括以下制备用原料：海藻酸钠、魔芋胶、氯化钙溶液、壳聚糖溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠、魔芋胶、氯化钙、壳聚糖的质量浓度分别为2％～2.38％、1.47％～1.62％、1％和1.5％～1.74％；所述海藻酸钠和魔芋胶的总体积和开菲尔乳杆菌菌悬液的体积比为3：1。本发明通过合理选择固定化原料以及合理设置原料比例，得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂具有良好的耐酸性和肠溶性。
Description
技术领域
本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法。
背景技术
乳酸菌(lactic acidbacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。乳酸菌不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料(在理论上具有重要的学术价值)，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域具有极高的应用价值。
乳酸菌具有调节人体肠道菌群，促进营养物质吸收，降胆固醇和增强免疫力等生理功能。研究表明，产品中的活菌数需达到106cfu/mL才能发挥益生作用，然而大多数乳酸菌对胃酸、胆盐的耐受能力较差，即使产品中有足够多的活乳酸菌也难以在肠道发挥作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法，本发明的开菲尔乳杆菌固定化菌剂具有良好的耐酸性和肠溶性。
本发明提供了一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂，包括以下制备用原料：海藻酸钠、魔芋胶、氯化钙溶液、壳聚糖溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2％～2.38％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.47％～1.62％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中氯化钙的质量浓度为1％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.5％～1.74％；
所述海藻酸钠和魔芋胶的总体积和开菲尔乳杆菌菌悬液的体积比为3：1。
优选的，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2.04％～2.23％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.5％～1.58％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.52％～1.66％。
优选的，所述开菲尔乳杆菌包括开菲尔乳杆菌MRS101；所述开菲尔乳杆菌MRS101的保藏编号为CGMCC No.17506。
本发明还提供了上述方案所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将海藻酸钠、魔芋胶和水第一混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液第二混合后，在所述第二混合得到的混合液中加入氯化钙溶液，进行固定化，得到凝胶珠；
将所述凝胶珠和壳聚糖溶液第三混合，得到开菲尔乳杆菌固定化菌剂。
优选的，在所述固定化后，还包括对固定化的产物固液分离，收集固体组分，对所述固体组分进行洗涤。
本发明还提供了一种开菲尔乳杆菌冻干粉，包括以下制备用原料：开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂为上述方案所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂；
所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、山梨醇和丙三醇。
优选的，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂的体积比为1：2；所述冻干保护剂以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：脱脂奶粉16％、山梨醇8％～10％和丙三醇9％～15％。
优选的，所述冻干保护剂中丙三醇的质量浓度为12％。
本发明还提供了上述方案所述开菲尔乳杆菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
将所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂混合，进行冷冻干燥，得到开菲尔乳杆菌冻干粉。
本发明还提供了一种肠道菌剂，包括上述方案所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者所述的开菲尔乳杆菌冻干粉或者所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌冻干粉。
本发明提供了一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂，包括以下制备用原料：海藻酸钠、魔芋胶、氯化钙溶液、壳聚糖溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2％～2.38％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.47％～1.62％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中氯化钙的质量浓度为1％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.5％～1.74％；所述海藻酸钠和魔芋胶的总体积和开菲尔乳杆菌菌悬液的体积比为3：1。本发明通过合理选择固定化原料以及合理设置原料比例，得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂具有良好的耐酸性和肠溶性。本发明的开菲尔乳杆菌固定化菌剂在模拟胃液中处理120min后存活率仍在70％以上，游离乳酸菌在120min后无存活；固定化乳酸菌在模拟肠液中处理90min后释放率达80％以上，连续胃肠道模拟4h后存活率达70％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1海藻酸钠浓度对包埋率的影响；
图2魔芋胶浓度对包埋率的影响；
图3菌胶比对包埋率的影响；
图4CaCl2浓度对包埋率的影响；
图5壳聚糖浓度对包埋率的影响；
图6不同壁材对包埋率的影响；
图7为不同包埋材料凝胶珠扫描电镜结果，其中(a)ALG包埋；(b)ALG+KGM包埋；(c)ALG+CS包埋；(d)ALG+KGM+CS包埋；
图8海藻酸钠与魔芋胶交互作用对包埋率的影响；
图9海藻酸钠与壳聚糖交互作用对包埋率的影响；
图10魔芋胶与壳聚糖交互作用对包埋率的影响；
图11模拟胃液耐受；
图12模拟胃液中凝胶珠120min后形态；
图13模拟肠液溶出性结果；
图14模拟肠液中凝胶珠30min后形态变化；
图15为冷冻干燥前后凝胶珠对比图；其中(a)为冷冻干燥前凝胶珠形态；(b)为冷冻干燥后凝胶珠形态；
图16固定化乳酸菌储藏稳定性；
图17菌落涂布生长情况。
具体实施方式
本发明提供了一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂，包括以下制备用原料：海藻酸钠、魔芋胶、氯化钙溶液、壳聚糖溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2％～2.38％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.47％～1.62％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中氯化钙的质量浓度为1％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.5％～1.74％；
所述海藻酸钠和魔芋胶的总体积和开菲尔乳杆菌菌悬液的体积比为3：1。
在本发明中，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度优选为2.04％～2.23％，这一浓度得到的凝胶珠有较大的力学强度，利于实现有效包埋菌体。
在本发明中，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度优选为1.5％～1.58％，这一浓度会使海藻酸钠凝胶孔隙变小，从而可以有效提高对乳酸菌的包埋率。
在本发明中，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度优选为1.5％～1.74％。在本发明中，壳聚糖分子链中的伯氨基能与海藻酸钠中带负电的羧基结合，在凝胶珠表面复合一层强度较好的半透膜，增强了凝胶珠的机械强度与稳定性，还能减小表面的释放孔径，从而提高其包埋率。
在本发明中，所述氯化钙能够使凝胶珠粒径减小，机械强度增大。
在本发明中，所述开菲尔乳杆菌菌悬液中有效活菌数浓度优选为1*108～1*109cfu/mL。
在本发明的一个实施例中，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2.23％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.58％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中氯化钙的质量浓度为1％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.66％。上述比例下，开菲尔乳杆菌能够获得最佳的包埋效果，实际包埋率为66.94％，与预测值(66.51％)相对误差仅为0.43％。
在本发明中，所述开菲尔乳杆菌优选的包括开菲尔乳杆菌MRS101；所述开菲尔乳杆菌MRS101为高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)，于2019年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.17506。固定后开菲尔乳杆菌MRS101在4℃条件下储藏32d后存活率在60％以上，而常温条件下储藏16d后无存活；游离菌在4℃条件下储藏32d后存活率为24.33％，说明开菲尔乳杆菌固定化菌剂在低温条件下储藏稳定性良好。
本发明的开菲尔乳杆菌固定化菌剂在模拟胃液中处理120min后存活率仍在70％以上，游离乳酸菌在120min后无存活；固定化乳酸菌在模拟肠液中处理90min后释放率达80％以上，连续胃肠道模拟4h后存活率达70％。说明开菲尔乳杆菌包埋后能显著提高耐酸性，且有良好的肠溶性。
本发明还提供了上述方案所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将海藻酸钠、魔芋胶和水第一混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液第二混合后，在所述第二混合得到的混合液中加入氯化钙溶液，进行固定化，得到凝胶珠；
将所述凝胶珠和壳聚糖溶液第三混合，得到开菲尔乳杆菌固定化菌剂。
本发明首先将海藻酸钠、魔芋胶和水第一混合，得到混合溶液。
在本发明中，所述水优选为无菌水；所述海藻酸钠、魔芋胶和水的质量比优选为2～2.38：1.47～1.62：96～96.53；所述第一混合优选的包括搅拌混合；所述搅拌混合的转速优选为400rpm；所述搅拌混合的时间优选为60min。
得到混合溶液后，本发明将所述混合溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液第二混合后，在所述第二混合得到的混合液中加入氯化钙溶液，进行固定化，得到凝胶珠。
在本发明中，所述混合溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液的体积比优选为3：1；所述第二混合的方式优选的包括搅拌混合；所述搅拌混合的转速优选为400rpm；所述搅拌混合的时间优选为30min；所述氯化钙溶液的溶剂优选为水；所述氯化钙溶液中氯化钙的浓度优选为1.0％～1.5％；所以固定化的时间优选为30min。
在所述固定化后，本发明优选的还包括对固定化的产物固液分离，收集固体组分，对所述固体组分进行洗涤。在本发明中，所述固液分离的作用是去除氯化钙溶液；所述洗涤采用的试剂优选为无菌水；所述洗涤的方式优选为冲洗；所述洗涤的作用是洗掉凝胶珠表面的乳酸菌。
得到凝胶珠后，本发明将所述凝胶珠和壳聚糖溶液第三混合，得到开菲尔乳杆菌固定化菌剂。
在本发明中，所述凝胶珠和壳聚糖溶液的质量比优选为1：20；所述第三混合优选的包括搅拌混合；所述搅拌混合的转速优选为400rpm；所述搅拌混合的时间优选为30min。这一步骤的作用是在凝胶珠上覆壳聚糖膜。
在本发明中，所述壳聚糖溶液优选的采用以下方法制备得到：将壳聚糖粉末、水和冰醋酸混合，得到壳聚糖溶液；所述壳聚糖粉末、水和冰醋酸的比例为1.5g～1.74g：98.26mL～98.5mL：200μL；所述水优选为无菌水；所述冰醋酸的作用是加快壳聚糖的溶解速度。
在将所述凝胶珠和壳聚糖溶液第三混合后，本发明优选的还包括采用无菌水对所述第三混合后的产物进行洗涤。
本发明还提供了一种开菲尔乳杆菌冻干粉，包括以下制备用原料：开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂为上述方案所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂；
所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、山梨醇和丙三醇。
在本发明中，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂的体积比优选为1：2。
在本发明中，所述冻干保护剂以水为溶剂，优选的包括以下质量浓度的组分：脱脂奶粉16％、山梨醇8％～10％和丙三醇9％～15％。
在本发明中，所述冻干保护剂中丙三醇的质量浓度优选为12％。
在本发明的一个实施例中，所述冻干保护剂以水为溶剂，优选的由以下质量浓度的组分组成：脱脂奶粉16％、山梨醇10％和丙三醇15％，这一比例时开菲尔乳杆菌菌株存活率最高，为77.07％。
本发明还提供了上述方案所述开菲尔乳杆菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
将所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂混合，进行冷冻干燥，得到开菲尔乳杆菌冻干粉。
在所述混合后和冷冻干燥前，本发明优选的还包括将混合后的混合物于于-80℃冷冻2h；所述冷冻干燥的条件优选的包括：-55℃、<1MPa；所述冷冻干燥的时间优选为18～24h。
本发明还提供了一种肠道菌剂，包括上述方案所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者所述的开菲尔乳杆菌冻干粉或者所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌冻干粉。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与仪器
1.1试剂
本所使用的主要试剂如表1所示。
表1主要试剂
1.2菌种
开菲尔乳杆菌MRS1216.1(同开菲尔乳杆菌MRS101)。
1.3溶液配置
(1)0.9％生理盐水：称量1.80g氯化钠，加超纯水搅拌溶解，定容至200mL，121℃高压灭菌15min，冷却至常温备用。
(2)解囊剂：称量1.43g磷酸氢二钠和0.96g柠檬酸，加超纯水搅拌溶解，定容至100mL，121℃高压灭菌15min，冷却至常温备用。
2方法
2.1菌株活化
从-80℃冰箱取出保藏的MRS1216.1，摇瓶培养：将筛选的四株乳酸菌MRS1216.1、MRS1216.2、MRA1216.3、MRS1216.5进行活化，洁净台中各取1mL甘油菌接种于20mLMRS液体培养基，置恒温摇床37℃、180rpm培养24h进行菌株复苏，将复苏好的菌液以3％接种量接种至MRS液体培养基中，37℃、180rpm培养24h。
2.2乳酸菌菌悬液配制与计数
以体积浓度为3％的接种量将活化好的菌株接种到MRS液体培养基中，37℃、180rpm培养16h，培养好的菌液以8000rpm、4℃条件离心10min，弃上清，用生理盐水将菌泥洗涤两遍后重悬，将OD600调到1左右配制成菌悬液，取100μL菌悬液与900μL生理盐水混合，吹打均匀，进行梯度稀释，选择合适的三个稀释度10-5、10-6、10-7，取100μL稀释液加入到MRS平板中，涂布均匀，每个梯度三个平行样，正置30min后倒置于37℃恒温培养箱中培养72h，计数。
2.3固定化流程
称取海藻酸钠与魔芋胶粉末，缓慢加入无菌水(无菌水的用量依据海藻酸钠和魔芋胶的浓度计算得到)，400rpm搅拌60min形成海藻酸钠与魔芋胶混合溶液；称取壳聚糖粉末，加入无菌水与200μL冰醋酸(按壳聚糖质量优化浓度来计算壳聚糖粉末与水的比例)，400rpm搅拌60min；将菌悬液与混合溶液按1:3体积比混合，400rpm搅拌30min，随后滴加入氯化钙溶液中，固化30min，弃氯化钙溶液，凝胶珠用无菌水冲洗两遍，洗掉表面的乳酸菌，将固化好的凝胶珠加入壳聚糖溶液中，400rpm搅拌30min，在凝胶珠上覆壳聚糖膜，用无菌水洗净称重备用。
2.4包埋率的测定
计算1mL菌液可制成的凝胶珠克数，称取含1mL菌液的凝胶珠加入9mL解囊剂，置恒温摇床中37℃、200rpm摇晃60min，待全部溶解后，8000rpm、4℃离心10min，弃上清，加入1mL生理盐水重悬菌泥，稀释涂布，进行活菌计数，计算乳酸菌的包埋率(Encapsulationyield，EY)，计算公式如下:
EY＝m1/m0×100％
式中：EY，包埋率，％；m0，起始添加活菌数，cfu/mL；m1，包埋活菌数，cfu/mL。
2.5海藻酸钠浓度对包埋率影响
在1％魔芋胶，1％壳聚糖，1％CaCl2，菌胶体积比为1:3的条件下固定乳酸菌，以乳酸菌包埋率为测试指标，测定海藻酸钠浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)对包埋率的影响。
2.6魔芋胶浓度对包埋率影响
在1.5％海藻酸钠，1％壳聚糖，1％CaCl2，菌胶体积比为1:3的条件下固定乳酸菌，以乳酸菌包埋率为测试指标，测定魔芋胶浓度(0％、0.5％、1％、1.5％、2％)对包埋率的影响。
2.7菌胶比对包埋率影响
菌胶比指的是菌悬液体积与海藻酸钠、魔芋胶混合凝胶体积之比，在1.5％海藻酸钠，1％魔芋胶，1％壳聚糖，1％CaCl2的条件下固定乳酸菌，以乳酸菌包埋率为测试指标，测定菌胶比(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)对包埋率的影响。
2.8CaCl2浓度对包埋率影响
在1.5％海藻酸钠，1％魔芋胶，1％壳聚糖，菌胶体积比为1:3的条件下固定乳酸菌，以乳酸菌包埋率为测试指标，测定CaCl2浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)对包埋率的影响。
2.9壳聚糖浓度对包埋率影响
在1.5％海藻酸钠，1％魔芋胶，1％CaCl2，菌胶体积比为1:3的条件下固定乳酸菌，以乳酸菌包埋率为测试指标，测定壳聚糖浓度(0％、0.5％、1％、1.5％、2％)对包埋率的影响。
2.10包埋材料对包埋率影响
设置四组对照，分别以2％海藻酸钠为包埋材料，2％海藻酸钠与1.5％魔芋胶为包埋材料，2％海藻酸钠与1.5％壳聚糖为包埋材料，2％海藻酸钠、1.5％魔芋胶与1.5％壳聚糖为包埋材料，在1％CaCl2与菌胶体积比为1:3的条件下固定乳酸菌，以乳酸菌包埋率为测试指标，测定不同包埋材料对包埋率的影响。
2.11扫描电镜分析
将四组不同包埋材料制备好的凝胶珠置于-80℃超低温冰箱冷冻2h，冷冻干燥机预冷，在-55℃、<1MPa条件下干燥，用扫描电镜观察凝胶珠表面孔隙结构。
2.12响应面优化包埋工艺
在上述的基础上，对MRS1216.1包埋率有显著影响的因素是海藻酸钠浓度、魔芋胶浓度与壳聚糖浓度；根据Box-Behnken设计原理，以包埋率为响应值，对这三个因素进行优化，采取三因素三水平设计来优化固定化工艺，因素水平编码值见表2。
表2Box-Behnken因素及水平编码表
3结果与讨论
3.1海藻酸钠对包埋率影响结果
海藻酸钠浓度对包埋率的影响效果如图1所示。由图可知，当海藻酸钠浓度为2％时，乳酸菌包埋率最大；在0.5％至2％阶段随着海藻酸浓度上升，乳酸菌的包埋率增加；在2％之后，随着浓度的进一步增大，包埋率降低。
分析其原因，海藻酸钠浓度较低时，形成的凝胶珠机械强度较低，无法有效包埋菌体，随着浓度增大，溶液黏度与机械强度都增大，凝胶珠孔隙结构变小，能更好的包埋乳酸菌，使包埋率上升。海藻酸钠浓度高的凝胶珠有较大的力学强度；当海藻酸钠浓度过高时，凝胶内部网格过密，不利于乳酸菌吸收营养、释放代谢物，凝胶珠内部环境恶化导致乳酸菌死亡，且凝胶黏度过大不利于菌体分散。
3.2魔芋胶对包埋率影响结果
魔芋胶浓度对包埋率的影响效果如图2所示。由图可知，当魔芋胶浓度在0～1.5％范围内，包埋率随浓度增加而增大；在1.5％之后，随着浓度的进一步增大，包埋率降低。
分析其原因，可能是魔芋胶的添加，会使海藻酸钠凝胶孔隙变小，从而可以有效提高对乳酸菌的包埋率，但由于魔芋胶本身黏度较大，随着浓度的不断增大，会使凝胶内部网格过密，不利于乳酸菌生存，同时也会使要包埋的菌体分散困难，从而导致包埋率降低。
3.3菌胶比对包埋率影响结果
菌胶体积比对包埋率的影响效果如图3所示。由图可知，包埋率随着菌胶比的增大而增大；但随着菌胶比的增大，凝胶珠的粒径也随之增大，当菌胶比超过1:3时，由于黏度过大，会使凝胶珠不易挤压成型，出现蝌蚪状拖尾现象，且粒径过大不利于内部传质，一段时间后内部代谢物质累积，会使内部环境恶化，不利于乳酸菌生存；当体积比较小时，虽然粒径较小，但凝胶珠强度较差容易破碎，内部孔隙也较大，不利于对乳酸菌的包埋。因此，选择1:3的菌胶体积比进行后续研究。
3.4CaCl2对包埋率影响结果
CaCl2浓度对包埋率的影响效果如图4所示，凝胶珠在CaCl2溶液固化过程中，因为凝胶珠内部与外表面的Ca2+浓度差，会使Ca2+逐渐渗透进入凝胶珠内部，并将其中的水分不断挤出，使粒径减小，机械强度增大。由图4可知，CaCl2浓度升高对于对于乳酸菌包埋率影响不显著，当浓度大于1.5％时，可能是由于加入的盐浓度过高，使部分微生物活性丧失，从而导致包埋率下降；此外，CaCl2浓度变化对凝胶珠粒径影响变化也不大。因此，考虑经济使用原则，选取1％的CaCl2浓度作为固定化溶液进行后续研究。
3.5壳聚糖对包埋率影响结果
壳聚糖浓度对包埋率的影响效果如图5所示，壳聚糖的浓度主要影响覆膜的速度和厚度。从图中可看出，壳聚糖浓度在0-1.5％范围内时，乳酸菌的包埋率随浓度增大而增大，在1.5％之后，随着浓度的进一步增大，包埋率降低。分析其原因，壳聚糖分子链中的伯氨基能与海藻酸钠中带负电的羧基结合，在凝胶珠表面复合一层强度较好的半透膜，增强了凝胶珠的机械强度与稳定性，还能减小表面的释放孔径，从而提高其包埋率；膜厚度随着壳聚糖浓度增大而增厚，当浓度过高时，表面的壳聚糖膜容易开裂，从而导致包埋率下降。
3.6包埋材料对包埋率影响结果
包埋材料对包埋率的影响效果如图6所示，海藻酸钠(ALG)单独包埋时包埋率最低；海藻酸钠、魔芋胶(KGM)为包埋材料时，与海藻酸钠、壳聚糖为(CS)包埋材料的包埋率差距不明显；海藻酸钠、魔芋胶和壳聚糖三者共同作用时包埋率最高。
分析其原因，魔芋胶微粒具有吸附性，将其作为壁材，可以更好固定乳酸菌；壳聚糖可与海藻酸钠相互作用，形成的凝胶珠外层为壳聚糖，中层为壳聚糖-海藻酸盐聚电解质，最内层为芯料，壳聚糖可以很好的填充凝胶珠表面的孔隙，进一步提高乳酸菌的包埋率；因此，用海藻酸钠、魔芋胶与壳聚糖三者作为混合包埋材料更佳。
3.7不同包埋材料扫描电镜照片
不同包埋材料凝胶珠扫描电镜结果如图7所示，未加壳聚糖作为包埋材料的(a)和(b)与加壳聚糖作为包埋材料的(c)跟(d)进行对比，(a)与(b)在放大400倍后其表面呈蜂窝状，且孔隙过大，会造成乳酸菌的脱落，从而导致包埋率降低；而(c)跟(d)在放大2000倍后仍可看到紧密的孔隙结构，说明壳聚糖可以与海藻酸钠结合，在表面形成致密的膜，填补了海藻酸钠形成的空隙，为乳酸菌提供了一定附着条件，又能减少乳酸菌脱落，从而提高包埋率，但(c)的孔隙分布不规律，(d)的孔隙呈密致的网状结构。
3.8 Box-Behnken设计及结果
根据单因素结果，可知海藻酸钠、魔芋胶、壳聚糖对乳酸菌包埋率的影响较大，因此选取海藻酸钠、魔芋胶、壳聚糖浓度为变量，以包埋率为测试指标，利用响应面分析软件Design-Expert 8.0.6进行三因素三水平响应面优化，结果见表3。
表3 Box-Behnken设计及结果
3.9回归模型方差分析
通过软件得到包埋率的多元二次回归响应面模型，对回归方程进行方差分析，结果见表4。
如表4所示，该模型的P<0.0001，说明回归模型的差异为极显著水平，具有可信性；而失拟项P＝0.4513>0.05，回归模型差异不显著，说明回归方程与实际拟合中非正常误差所占比例小。回归系数R2＝0.9763,说明该模型与实际拟合较好，实际中约97.63％的结果可以通过拟合模型进行描述。校正系数RAdj 2＝0.9458，说明该模型可解释94.58％包埋率的变化。预测系数Rpred 2＝0.8095与RAdj 2之差小于0.2，证明模型有充分准确性和通用性。因此用该模型来分析和预测包埋率是可靠的。模型的回归方程如下：
Y＝65.72+2.38A-0.49B+1.66C-0.58AB+7.03AC+4.75BC-4.91A2-2.44B2-8.73C2
式中，Y是包埋率，单位为％；A是海藻酸钠，单位为％；B是魔芋胶，单位为％；C是壳聚糖，单位为％。
回归方程中各显著项表明，一次项A(P<0.01)影响极显著，且其F值最大，B(P>0.05)影响不显著，C(0.01<P<0.05)影响显著。因此，对包埋率影响最大的是海藻酸钠浓度，其次是壳聚糖浓度，最后是魔芋胶浓度，即A>C>B。AB(P>0.05)影响不显著，AC(P<0.01)影响显著，BC(P<0.01)影响显著。
通过响应面分析得到最佳复配方案为：海藻酸钠浓度为2.23％，魔芋胶浓度为1.58％，壳聚糖浓度为1.66％，预测包埋率为66.51％。
表4回归模型方差分析结果
注：P<0.01表示影响极显著(**)；0.01<P<0.05表示影响显著(*)
3.10响应曲面分析交互作用
为进一步分析两两因素之间的交互作用，用Design-Expert 8.0.6软件对海藻酸钠与魔芋胶、海藻酸钠与壳聚糖、魔芋胶与壳聚糖之间的交互作用进行拟合分析，结果见图8、图9、图10。
由图8可知，当海藻酸钠浓度在1.5％-1.95％、魔芋胶浓度在1.0％-1.5％时，包埋率随海藻酸钠与魔芋胶浓度的增大而增加。在海藻酸钠为1.95％、魔芋胶为1.5％时包埋率达到最大值；之后包埋率随海藻酸钠与魔芋胶浓度的增大而减小。同时，从等高线面图也可以看出等高线似椭圆又近似圆，说明海藻酸钠与魔芋胶之间存在交互作用，但交互作用不显著。
由图9可知，当海藻酸钠浓度在1.5％-1.95％、壳聚糖浓度在1.0％-1.5％时，包埋率随海藻酸钠与壳聚糖浓度的增大而增加。在海藻酸钠为1.95％、壳聚糖为1.5％时包埋率达到最大值；之后包埋率随海藻酸钠与壳聚糖浓度的增大而减小。同时，从等高线面图也可以看出等高线为椭圆，说明海藻酸钠与壳聚糖之间存在强交互作用。
由图10可知，当魔芋胶浓度在1.0％-1.5％、壳聚糖浓度在1.0％-1.5％时，包埋率随魔芋胶与壳聚糖浓度的增大而增加。在魔芋胶为1.5％、壳聚糖为1.5％时包埋率达到最大值；之后包埋率随魔芋胶与壳聚糖浓度的增大而减小。同时，从等高线面图也可以看出等高线为椭圆，说明魔芋胶与壳聚糖之间存在强交互作用。
3.11响应面模型验证
通过响应面分析得到最佳包埋工艺，对该方案进行验证，将包埋材料的浓度调整到：海藻酸钠2.23％，魔芋胶1.58％，壳聚糖1.66％，CaCl21％，菌胶比为1:3。结果如表5，取平均值得到的包埋率为66.94％，与预测值(66.51％)相对误差仅为0.43％，说明模型重现性较好，可以较为准确反映实际情况。
表5最佳包埋条件验证结果
3.5本实施例小结
本实施例以开菲尔乳杆菌MRS1216.1为菌株，海藻酸钠、魔芋胶、壳聚糖为包埋材料，以包埋率为指标，对影响包埋率的5个因素进行单因素分析，得到最佳单因素条件为：海藻酸钠浓度2％、魔芋胶浓度1.5％、CaCl2浓度1％、菌胶比1:3、壳聚糖浓度1.5％。随后利用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计，得到最佳包埋工艺条件为：2.23％海藻酸钠，1.58％魔芋胶，1％CaCl2，菌胶比1:3，1.66％壳聚糖，实际包埋率为66.94％，与预测值(66.51％)相对误差仅为0.43％。
实施例2开菲尔乳杆菌凝胶珠体外模拟稳定性研究
乳酸菌想要进入肠道发挥益生作用，需有足够数量的活菌进入小肠，所以乳酸菌在固定过程中需要较高的菌体存活率，还应具有较高的耐酸性与良好的储藏稳定性，并能在肠道中顺利释放。本实施例主要研究了开菲尔乳杆菌凝胶珠的耐酸性、肠溶性、保护剂优化以及储藏稳定性。
1材料与仪器
1.1试剂
本所使用的主要试剂如表6所示。
表6主要试剂
/>
1.2溶液配置
参照Minekus的方法配置模拟胃肠液(参见【Minekus M,Alminger M,Alvito P,etal.A standardised static in vitro digestion method suitable for food–aninternational consensus[J].Food&Function,2014,5(6):1113-1124.】)。
(1)模拟胃液：1L无菌水中加入2.80g氯化钠、2.10g碳酸氢钠、0.52g氯化钾、0.12g磷酸二氢钾、0.05g碳酸铵、0.02g六水合氯化镁和0.01g二水合氯化钙，并用1.00mmol/L盐酸或1.00mmol/L氢氧化钠调pH至2.0，含0.32％胃蛋白酶，经0.22μm滤膜过滤除菌，现配现用。
(2)模拟肠液：1L无菌水中加入7.15g碳酸氢钠、6.80g磷酸二氢钾、2.24g氯化钠、0.51g氯化钾、0.07g六水合氯化镁和0.04g二水合氯化钙，并用1.00mmol/L盐酸或1.00mmol/L氢氧化钠调pH至7.6，含1％胰酶、0.15％胆盐，经0.22μm滤膜过滤除菌，现配现用。
2方法
2.1菌株活化
同实施例1中2.1。
2.2菌悬液配制与计数
同实施例1中2.2。
2.3凝胶珠的制备
按照实施例1得出的固定乳酸菌最佳包埋工艺，按实施例1中2.3方法固定乳酸菌。
2.4存活率测定
存活率的计算公式如下：
存活率(％)＝M1/M0×100％
式中：M1表示处理后的乳酸菌活菌数，单位为cfu/mL；M0表示处理前的乳酸菌活菌数，单位为cfu/mL。
2.5体外模拟胃液耐受
计算1mL菌液可制成的凝胶珠克数，称取含1mL菌液的凝胶珠加入10mL模拟胃液中，并以1mL未包埋的菌液进行对照。
组：在37℃恒温摇床中180rpm培养120min，每隔30min，弃模拟胃液，用生理盐水冲洗凝胶珠两遍后加入9mL解囊剂，置恒温摇床中37℃、200rpm摇晃60min，待全部溶解后，8000rpm、4℃离心10min，弃上清，加入1mL生理盐水重悬菌泥，稀释涂布，计算存活率(参见【Monteagudo M,Rodríguez A,Rúa J,et al.In vitro evaluation of physiologicalprobiotic properties of different lactic acid bacteria strains ofdairy andhuman origin[J].Journal ofFunctional Foods,2012,4(2):531-541.】)。
对照组：在37℃恒温摇床中180rpm培养120min，每隔30min，8000rpm、4℃离心弃上清，用生理盐水冲洗菌泥两遍后加入1mL生理盐水重悬菌泥，稀释涂布，计算存活率。
2.6体外模拟肠液中溶出性
计算1mL菌液可制成的凝胶珠克数，称取含1mL菌液的凝胶珠加入10mL模拟肠液中，在37℃恒温摇床中180rpm培养120min，每隔30min取1mL溶液进行梯度稀释(参见【Guimaraes，R,VendraminiA,Santos A,et al.Development ofprobiotic beads similarto fish eggs[J].Journal ofFunctional Foods,2013,5(2):968-973.】)，计算乳酸菌释放率，释放率计算公式为：
释放率(％)＝S1/S0×100％
式中：S1表示模拟肠液中释放出的乳酸菌活菌数，单位为cfu/mL；S0表示固定的乳酸菌活菌数，单位为cfu/mL。
2.7体外模拟连续胃肠液中存活
称取含1mL菌液的凝胶珠加入10mL模拟胃液，37℃恒温摇床中180rpm培养120min后用生理盐水冲洗两遍，加入10mL模拟肠液，继续放入恒温摇床中培养120min，取1mL溶液进行梯度稀释，计算乳酸菌存活率[86]。
2.8冷冻干燥保护剂筛选
选取室有的脱脂奶粉、蔗糖、丙三醇、乳糖、山梨醇、抗坏血酸、硫酸镁7中常用的乳酸菌保护剂，将保护剂溶液与固定化小球以2:1的比例置于50mL离心管中混合，于-80℃超低温冰箱中冷冻2h，冷冻干燥机预冷，在-55℃、<1MPa条件下进行干燥，干燥24h左右，将干燥好后的小球复水1h，随后以步骤2.4测定乳酸菌存活率。
2.9最陡爬坡试验设计
根据2.8保护剂筛选出来的结果，将筛选出来的对开菲尔乳杆菌MRS1216.1有保护作用的保护剂进行最陡爬坡方向和步长设计，分别按表7的比例配置成复合保护剂，以上述方案的方法测定乳酸菌存活率，以存活率为指标确定保护剂的最适变化范围。
表7最陡爬坡试验设计
2.10保护剂正交优化
根据最陡爬坡试验结果，以冷冻干燥后乳酸菌存活率为考察指标，采用三因素三水平正交设计法进一步优化保护剂配方，因素水平编码值见表8。
对正交最优保护剂配方进行验证。
表8因素及水平编码表
2.11储藏稳定性研究
冻干含10mL菌液的凝胶珠，将冻干样品分为两份，一份储存在4℃冰箱中，一份常温储存，分别在0d、8d、16d、24d、32d取出，复水1h，游离菌放4℃冰箱作为对照组，以2.4的方法测定乳酸菌存活率，考察MRS1216.1固定化后的储藏稳定性。
3结果与讨论
3.1模拟胃液耐受结果
胃液的pH值会因为摄入食物不同在1.0～3.5之间波动，食物通常会在胃部停留2-3h，因此，本选择用pH 2.0的模拟胃液处理凝胶珠120min。凝胶珠耐酸性结果如图11所示，处理2h后凝胶珠形态如图12所示。
由图11可知，在模拟胃液过程中，随着时间延长，未包埋的乳酸菌存活率迅速下降，当处理时间达到30min时，存活率已不足20％；当处理时间达到120min时，乳酸菌无存活。可知MRS1216.1耐酸性能较差，因此，需要对MRS1216.1进行固定化处理提高其耐酸性，使其到达肠道发挥益生作用。
图12中包埋后的乳酸菌经模拟胃液处理120min后存活率还在70％以上，图12也可以看出，模拟胃液处理120min后，固定化小球形态良好，说明凝胶珠对模拟胃酸有良好的耐受性，可为内部包埋的乳酸菌提供保护。
3.2模拟肠液溶出性结果
将凝胶珠置于pH为7.6的模拟肠液中，测定凝胶珠的肠溶性。由图13与图14可知，在模拟肠液过程中，随着时间的延长，凝胶珠逐渐溶解，在30min时释放率达到60％以上，且凝胶珠全部溶胀破裂，在90min时释放率达到80％以上，几乎没有固体物质残留，释放率基本稳定，表面凝胶珠已经完全崩解，有良好的肠溶性。
主要原因可能是该壁材是由钙离子形成的可逆性凝胶，而人体肠道内含有碳酸根离子与磷酸根离子等更易与钙离子结合的阴离子，从而导致凝胶破裂，释放出包埋在内的乳酸菌。
3.3连续胃肠液模拟结果
将包埋后的乳酸菌经过胃肠道连续模拟4h，即模拟胃液中处理2h，模拟肠液中处理2h后，结果如表9，可知乳酸菌的存活率仍有70.68％。证明，经包埋后可以大大提高乳酸菌的耐酸性，使其达到肠道发挥益生作用。
表9连续胃肠液模拟结果
3.4不同保护剂对乳酸菌冻干存活率的影响
保护剂的作用主要是改变生物样品冻干时的化学、物理环境，在菌体表面形成一层保护膜或增强蛋白质的稳定性，减轻冻干过程或复水过程对细菌的应力损伤，从而提高细菌的存活率。
表10保护剂种类对冻干存活率的影响
不同的保护剂对开菲尔乳杆菌MRS1216.1冻干过程中的存活率影响不同，结果如表4.5。单一的保护剂并不一定能满足冻干过程的要求，表10中的7种保护剂中，脱脂奶粉、丙三醇、山梨醇三种保护剂对MRS1216.1有较好的保护作用。脱脂奶粉中的乳清蛋白能在细菌表面形成蛋白膜，且其它成分也能提高菌体的存活率；山梨醇中具有多个羟基官能团，在冻干过程中会与菌体细胞膜中的磷酸基团或表面的蛋白质极性基团形成氢键，降低菌体与外界环境的接触概率。此外，还能通过水合作用来降低游离水含量，减少低温下晶核形成，从而保护细胞膜与蛋白质的结构与功能；丙三醇能在冻干时改变胞内过冷状态，通过使细菌内外压力接近来降低细菌脱水缩皱速度。因此选取这三种保护剂混合进行后续优化。
3.5最陡爬坡试验结果
根据保护剂筛选结果进行最陡爬坡试验，试验结果由表11可知，随着脱脂奶粉、山梨醇、丙三醇浓度的增加，MRS1216.1的存活率呈现出先升高后降低的趋势。当脱脂奶粉浓度为16％、山梨醇浓度为8％、丙三醇浓度为12％时菌株存活率最高，为75.00％。
分析其原因，随着保护剂浓度的增加，细胞膜的稳定性也不断增加，冻干时受到的损伤减少，因此存活率不断提高；但升高到一定浓度后，高浓度的保护剂会加速细胞内蛋白质的聚合，形成较强的玻璃化结构，反而会导致细菌存活率的下降。
表11最陡爬坡试验设计结果
3.6正交结果及分析
根据最陡爬坡试验确定各保护剂的正交水平数，设计三因素三水平正交表，并对结果进行极差和方差分析，结果如表12。
表12正交极差分析
由表12可知，不同保护剂的添加量对MRS1216.1冻干存活率有着不同影响，各保护剂因素对存活率影响大小顺序为：A>B>C，保护剂添加量的最佳组合为A0B1C1，即脱脂奶粉16％，山梨醇10％，丙三醇15％。根据方差分析表13可知，一次项A(0.1<P<0.05)影响显著，且其F值最大，B(P>0.05)影响不显著，C(P>0.05)影响不显著，
表13正交方差分析
注：P<0.01表示影响极显著(**)；0.01<P<0.05表示影响显著(*)
通过正交分析得到最佳保护剂组合方案，对该方案进行验证，将保护剂分数调整到：脱脂奶粉16％，山梨醇10％，丙三醇15％。结果如表14所示，取平均值得到的存活率为77.07％。
表14最佳保护剂组合下存活率
3.7储藏稳定性研究
将凝胶珠进行冷冻干燥后，分为常温与4℃两组进行储藏，测定其储藏稳定性。图15为冷冻干燥前后凝胶珠对比图，图16为储藏32d乳酸菌存活率曲线图。
由图16可知，固定后乳酸菌在常温条件下储藏16d后无存活，在4℃条件下储藏32d后存活率还在60％以上，游离菌在4℃条件下储藏32d后存活率为24.33％，可见固定化乳酸菌在低温条件下储藏稳定性良好。冷冻干燥后菌体处在失水状态，在遇到合适的环境时会复苏，包埋后的乳酸菌与外界环境隔离，显著增加了耐酸性，当到达肠道后释放出来，其体内的tRNA与饥饿蛋白会促使其复苏，从而在肠道发挥益生作用。
3.8开菲尔乳杆菌验证
3.6过程中，发现平板中的乳酸菌菌落表面光滑，呈乳白色，外圈有透明光圈，但菌落大小不一致，如图17所示。挑取大小不同的八个菌落，液体MRS培养基中过夜培养，观察发现八瓶培养液中均产生开菲尔菌粒，因此，储藏过程中凝胶珠并未污染。
4.5本实施例小结
本实施例对最佳包埋工艺条件下固定的乳酸菌进行体外性能研究，固定化乳酸菌在模拟胃液中处理120min后存活率仍在70％以上，游离乳酸菌在120min后无存活；固定化乳酸菌在模拟肠液中处理90min后释放率达80％以上，连续胃肠道模拟4h后存活率达70％。说明乳酸菌包埋后能显著提高耐酸性，且有良好的肠溶性。
从7中保护剂中筛选出对MRS1216.1有明显保护作用的脱脂奶粉、山梨醇、丙三醇3种保护剂，通过爬坡试验与正交确定脱脂奶粉浓度为16％、山梨醇浓度为10％、丙三醇浓度为15％时菌株存活率最高，为77.07％。固定后MRS1216.1在4℃条件下储藏32d后存活率在60％以上，而常温条件下储藏16d后无存活；游离菌在4℃条件下储藏32d后存活率为24.33％，说明固定化乳酸菌在低温条件下储藏稳定性良好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂，其特征在于，由以下制备用原料组成：海藻酸钠、魔芋胶、水、氯化钙溶液、壳聚糖溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2％～2.38％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.47％～1.62％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中氯化钙的质量浓度为1％；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.5％～1.74％；
所述海藻酸钠和魔芋胶的总体积和开菲尔乳杆菌菌悬液的体积比为3：1。
2.根据权利要求1所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂，其特征在于，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中海藻酸钠的质量浓度为2.04％～2.23％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中魔芋胶的质量浓度为1.5％～1.58％；所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂中壳聚糖的质量浓度为1.52％～1.66％。
3.根据权利要求1所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂，其特征在于，所述开菲尔乳杆菌包括开菲尔乳杆菌MRS101；所述开菲尔乳杆菌MRS101的保藏编号为CGMCC No.17506。
4.权利要求1～3任意一项所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂的制备方法，其特在于，包括以下步骤：
将海藻酸钠、魔芋胶和水第一混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液和开菲尔乳杆菌菌悬液第二混合后，在所述第二混合得到的混合液中加入氯化钙溶液，进行固定化，得到凝胶珠；
将所述凝胶珠和壳聚糖溶液第三混合，得到开菲尔乳杆菌固定化菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述固定化后，还包括对固定化的产物固液分离，收集固体组分，对所述固体组分进行洗涤。
6.一种开菲尔乳杆菌冻干粉，其特征在于，包括以下制备用原料：开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂；
所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂为权利要求1～3任意一项所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者权利要求4或5所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂；
所述冻干保护剂包括脱脂奶粉、山梨醇和丙三醇。
7.根据权利要求6所述的开菲尔乳杆菌冻干粉，其特征在于，所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂的体积比为1：2；
所述冻干保护剂以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：脱脂奶粉16％、山梨醇8％～10％和丙三醇9％～15％。
8.根据权利要求7所述的开菲尔乳杆菌冻干粉，其特征在于，所述冻干保护剂中丙三醇的质量浓度为12％。
9.权利要求6～8任意一项所述开菲尔乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述开菲尔乳杆菌固定化菌剂和冻干保护剂混合，进行冷冻干燥，得到开菲尔乳杆菌冻干粉。
10.一种肠道菌剂，其特征在于，包括权利要求权利要求1～3任意一项所述的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者权利要求4或5所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌固定化菌剂或者权利要求6～8任意一项所述的开菲尔乳杆菌冻干粉或者权利要求9所述的制备方法制备得到的开菲尔乳杆菌冻干粉。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310822743.6A CN116790574B (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310822743.6A CN116790574B (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116790574A CN116790574A (zh) | 2023-09-22 |
| CN116790574B true CN116790574B (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=88048009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310822743.6A Active CN116790574B (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116790574B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106858606A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-06-20 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 具有抗氧化功能的益生菌粉及其制备方法 |
| CN107899021A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-04-13 | 扬州大学 | 一种表面修饰s‑层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用 |
| CN108330080A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-07-27 | 北京好实沃生物技术有限公司 | 一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用 |
| CN110141583A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-20 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌m3在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用 |
| CN110141584A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-20 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用 |
| CN110144311A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-20 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂 |
| CN110184214A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-30 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂 |
| CN110218718A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-09-10 | 南京趣酶生物科技有限公司 | 固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用 |
-
2023
- 2023-07-06 CN CN202310822743.6A patent/CN116790574B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106858606A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-06-20 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 具有抗氧化功能的益生菌粉及其制备方法 |
| CN107899021A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-04-13 | 扬州大学 | 一种表面修饰s‑层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用 |
| CN108330080A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-07-27 | 北京好实沃生物技术有限公司 | 一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用 |
| CN110141583A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-20 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌m3在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用 |
| CN110141584A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-20 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用 |
| CN110144311A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-20 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂 |
| CN110184214A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-30 | 黑龙江大学 | 一种开菲尔乳杆菌及其菌制剂 |
| CN110218718A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-09-10 | 南京趣酶生物科技有限公司 | 固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 开菲尔粒中菌种微囊化条件的优化和发酵特性研究;王亮等;中国食品学报;第17卷(第5期);73-81 * |
| 魔芋生物碱的微胶囊化工艺及生防效果试验;庞杰等;农业工程学报;第19卷(第4期);188-192 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116790574A (zh) | 2023-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106993813B (zh) | 一种益生菌微胶囊的制备方法 | |
| CN109619593B (zh) | 一种益生菌双层微胶囊及其制备方法 | |
| CN103932186B (zh) | 一种长双歧杆菌微胶囊及其制备方法 | |
| Grosso et al. | Stability of free and immobilized Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of immobilized B. lactis in yoghurt | |
| Ainsley Reid et al. | Microentrapment of probiotic bacteria in a Ca2+-induced whey protein gel and effects on their viability in a dynamic gastro-intestinal model | |
| CN111534435B (zh) | 一种可提高双歧杆菌耐酸性的冻干保护剂及其应用 | |
| CN112273658A (zh) | 一种基于内源乳化的双歧杆菌微胶囊的制备方法 | |
| CN113826904A (zh) | 一种高活性合生元微胶囊及其制备方法 | |
| Varankovich et al. | Survival of probiotics in pea protein-alginate microcapsules with or without chitosan coating during storage and in a simulated gastrointestinal environment | |
| CN109303166A (zh) | 耐热性乳酸菌微胶囊的制备方法 | |
| CN108048349B (zh) | 副干酪乳杆菌n1115包埋菌粉的制备方法及其应用 | |
| CN113208115A (zh) | 一种益生菌微胶囊及其制备方法 | |
| Abd-Elhamid | Production of functional kariesh cheese by microencapsulation of Bifidobacterium adolescentis ATCC 15704 | |
| Yu et al. | Effect of skim milk-alginate beads on survival rate of bifidobacteria | |
| CN110755403A (zh) | 一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法 | |
| CN114916675A (zh) | 一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠、制备方法和应用 | |
| Almeida et al. | Effect of emulsification/internal gelation-based microencapsulation on the viability of Akkermansia muciniphila upon prolonged storage and simulated gastrointestinal passage | |
| CN116790574B (zh) | 一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 | |
| CN112956697B (zh) | 鼠李糖乳杆菌微胶囊的制备方法 | |
| CN108949854B (zh) | 固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺 | |
| CN108902982B (zh) | 一种益生菌微胶囊冻干粉及其制备方法 | |
| CN111264870A (zh) | 一种高环境抗性的益生菌微胶囊及其制备方法 | |
| CN116570029A (zh) | 一种核桃低聚肽益生菌微胶囊及其制备方法 | |
| CN107034159B (zh) | 一种致病菌拮抗剂及其应用 | |
| CN116172203A (zh) | 一种干酪乳杆菌及其制剂的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |