CN107899021A - 一种表面修饰s‑层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表面修饰S‑层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用，所述壳聚糖微球采用乳化交联法进行制备，并通过乳酸菌S‑层蛋白修饰。（1）本发明采用乳酸菌S‑层蛋白对壳聚糖微球的表面进行修饰，延长其在体内作用时间，增加其稳定性；（2）本发明所述壳聚糖微球能够控制药物释放速度，降低药物毒副作用，改善药物的稳定性和改变给药途径等优点。

Description

一种表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用
技术领域
本发明涉及壳聚糖微球的制备领域，特别涉及一种S-层蛋白修饰壳聚糖微球的制备方法和应用，具体为乳酸菌的S-层蛋白修饰的壳聚糖微球及其在功能性食品和药品领域的应用。
背景技术
壳聚糖是一种带正电荷的天然多糖，无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用、无溶血效应，具有良好的生物相容性、生物降解性、生物黏附性和促进药物吸收的作用。将壳聚糖制成载药微球，能够控制药物释放速度，降低药物的毒副作用，提高疏水性药物对细胞膜的通透性，改善药物的稳定性和改变给药途径，延长药物疗效以及靶向给药等。近年来，已有多种药物实现了壳聚糖微球作为缓释控释载体，并实现了在胃、结肠、肝、肾等部位给药，在生物医学领域表现出良好的应用前景。
乳酸杆菌S-层蛋白作为已知最小的S-层蛋白，可作为S-层蛋白结构和功能的研究模型，其显著的结晶特性、基因的可修饰性以及S-层晶格空间结构特性，在生物技术、纳米科技和生物医药等方面有着巨大的应用前景。乳酸杆菌作为益生菌，利用S-层蛋白的启动子或基因序列进行外源蛋白的表达、抗原表位的展示等应用，为生物安全基因工程疫苗的研究开辟了一条新途径。此外，乳酸菌的S-层蛋白的生物拮抗作用备受人们的关注，但其机制还不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球、制备及应用。通过S-层蛋白在壳聚糖表面修饰，不仅能够使得壳聚糖微球在体内作用更长时间，控制药物释放，同时利用S-层蛋白的益生功能，提高壳聚糖微球的功能特性。
本发明制备S-层蛋白壳聚糖微球的方法简单、可行、质量可控，且制备出来的S-层蛋白修饰壳聚糖微球的粒径小，具有广大的市场应用价值。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种S-层蛋白修饰壳聚糖微球，所述壳聚糖微球是以壳聚糖为载体，戊二醛为 交联剂，以Span-80为乳化剂，环己烷为油相，通过乳化交联法制备的，并通过 乳酸菌S-层蛋白进行修饰，其中，S-层蛋白与壳聚糖微球的质量比为1:1.2～1.9。
具体制备方法包括以下步骤：
（1）乳酸菌S-层蛋白提取：收集乳酸菌在MRS培养基中生长至对数期的菌体，洗涤后与LiCl/GuHCl溶液先后混合孵育，离心收集上清后得S-层蛋白提取物；
（2）乳酸菌S-层蛋白纯化：采用SP Sepharose(HP)柱对步骤（1）中S-层蛋白粗提物进行分离纯化；
（3）乳酸菌S-层蛋白鉴定：采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定步骤（2）中纯化后的S-层蛋白的序列；
（4）壳聚糖微球制备：将壳聚糖物质加入适量体积及浓度醋酸溶液中，配置成壳聚糖溶液，按5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量比称取相应质量的5-氟尿嘧啶投放到上述醋酸溶液中，搅拌使其溶解后，慢慢加入到含有Span-80与环己烷的锥形瓶中，充分搅拌后，维持一段时间，按比例加入戊二醛继续反应，分离产物，洗涤，冷冻干燥后，得到壳聚糖微球；
（5）乳酸菌S-层蛋白修饰壳聚糖微球：将步骤（2）中纯化的S-层蛋白和步骤（4）中制备的壳聚糖微球分别溶于磷酸盐缓冲液，两者混合后在一定条件下孵育，离心弃去上清，得S-层蛋白修饰壳聚糖微球；
（6）S-层蛋白修饰壳聚糖微球性状观测：采用光学显微镜观察形状、大小和初步的分布，之后用激光粒度分析仪和扫描电镜进行粒度分析；
（7）S-层蛋白修饰壳聚糖微球的体外释放检测：制备包埋5-氟尿嘧啶的S-层蛋白修饰壳聚糖微球，分别称取适量的5-氟尿嘧啶粉末，壳聚糖微球和S-层蛋白修饰壳聚糖微球，置于含有5 mL的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的透析袋中，紧密封口，然后分别置于200 mL的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中，以100 r/min的速率恒温震荡，定时取5 mL的释放介质在265 nm测定其紫外吸光度，同时补充等量释放液，根据标准曲线计算浓度，并绘制累计释药率-时间曲线。
优选的，步骤（1）中所述乳酸菌为携带S-层蛋白的乳酸菌，包括嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、卷曲乳杆菌的一种或多种。
优选的，步骤（1）中LiCl/GuHCl溶液的浓度分别为5 mol/mL和4 mol/mL，每克湿菌体与10 mL的LiCl溶液37℃孵育30 min，离心取上清后，与5 mL的GuHCl溶液37℃孵育60min。
优选的，醋酸浓度0.2 mol/L，水油相比为1:2，交联剂用量2 mL，药物载体质量比为1:4，Span-80的用量1 mL。
优选的，步骤（5）中蛋白浓度为340 μg/mL，25℃，50 r/min恒温孵育4 h。
所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球在功能性食品中的应用。
所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球在药品中的应用。
本发明的原理在于：分离纯化后的S-层蛋白具有自组装特性，等电点偏碱性，在磷酸盐缓冲液中带负电荷，壳聚糖是带有正电荷的天然多糖，S-层蛋白能够在壳聚糖微球表面吸附组装，形成高度规则的晶格结构，根据此原理，本发明提供了一种S-层蛋白修饰壳聚糖微球的方法。
有益效果：
（1）本发明采用乳酸菌S-层蛋白对壳聚糖微球的表面进行修饰，延长其在体内作用时间，增加其稳定性；
（2）本发明所述壳聚糖微球能够控制药物释放速度，降低药物毒副作用，改善药物的稳定性和改变给药途径等优点。
附图说明
图1是嗜酸乳杆菌S-层蛋白的离子交换层析图谱。
图2是纯化后的嗜酸乳杆菌S-层蛋白的SDS-PAGE。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
实施例1
一种表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球，所述壳聚糖微球以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，以Span-80为乳化剂，环己烷为油相，通过乳化交联法制备的。其中，S-层蛋白与壳聚糖微球的质量比为1:1.32。
（1）乳酸菌S-层蛋白提取：
乳酸菌采用嗜酸乳杆菌CICC 6075（中国工业微生物菌种保藏管理中心），用MRS培养基中生长至对数期，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤后，每克湿菌体中加入10 mL的5mol/L的LiCl溶液，在37℃孵育0.5 h，离心后弃上清；再加入5 mL的4 mol/L的CuHCl溶液，37℃作用1 h后，离心收集上清，透析，冷冻干燥得嗜酸乳杆菌S-层蛋白粗提物。
（2）嗜酸乳杆菌S-层蛋白纯化：
将步骤（1）中S-层蛋白粗提物采用SP Sepharose(HP)柱进行分离纯化。8 mol/L 尿素-Tris-HCl溶液（pH 7.0，Buffer A）作为起始缓冲液平衡柱子，嗜酸乳杆菌S-层蛋白粗提物于8 mol/L 尿素-Tris-HCl溶液（pH 7.0，Buffer A）中溶解，蛋白总的上样量应低于30 mg。采用含Buffer B（含1 mol/L氯化钠）作为洗脱液进行线性洗脱，洗脱流速0.5 mL/min，紫外波长280 nm处检测吸光度值，收集洗脱峰，见图1，有2个吸收峰，分别收集用SDS-PAGE分析，发现峰2为S-层蛋白吸收峰，收集峰2洗脱液，透析48 h，离心获得沉淀，冻干后获得纯度较高的嗜酸乳杆菌S-层蛋白。
（3）嗜酸乳杆菌S-层蛋白鉴定：
采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳）鉴定步骤（2）纯化后的S-层蛋白分子量：SDS-PAGE采用12%分离胶和5%浓缩胶，取步骤（2）纯化后的S-层蛋白溶解后与上样缓冲液等体积混合，沸水浴8 min，每孔上样10 μL，浓缩胶90V恒压30 min，分离胶120V恒压1.5 h，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，电泳图见图2，可见嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子量约为46 kDa。
采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定步骤（2）中纯化后的S-层蛋白的序列；将SDS-PAGE凝胶上经纯化后的条带割下，采用5800超高分辨飞行时间生物质谱仪进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定，质谱数据用MASCOT软件在NCBI数据库进行搜索和匹配，确定所测蛋白来源于嗜酸乳杆菌S-层蛋白，该蛋白质分子量约为45.982 kDa，与电泳结果一致，蛋白理论等电点为9.55；
（4）壳聚糖微球制备：
以5-氟尿嘧啶为包封物，以壳聚糖微球的载药量和包封率为指标，通过正交试验确定壳聚糖微球制备的最优方案。考察因素为醋酸浓度，水油相比，交联剂用量，药物/载体比。
微球的载药量和包封率测定：准确称取适量微球，置于锥形瓶中，加入50 mL 0.5mol/L的盐酸溶液溶解24 h，过滤，以0.5 mol/L盐酸溶液做参照，在265nm处测其紫外吸光度，计算药物含量：药物含量=（微球中的药物质量÷称取的微球质量）×100%，药物包封率=（药物含量÷药物理论含量）×100%。
确定壳聚糖微球制备的最优工艺为：将20 mg壳聚糖物质加入0.2 mol/L醋酸溶液中，水油相比为1:2，配置成壳聚糖溶液，按5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量比为1:6称取相应质量的5-氟尿嘧啶投放到上述醋酸溶液中，搅拌使其溶解后，慢慢加入到含有Span-80与环己烷的锥形瓶中，充分搅拌后，维持一段时间,加入2 mL戊二醛继续反应，分离产物，洗涤，冷冻干燥后，得到壳聚糖微球。此时壳聚糖微球的载药量为8.85%，包封率为44.30%。
（5）嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰壳聚糖微球：
将步骤（2）中纯化的S-层蛋白和步骤（4）中制备的壳聚糖微球分别溶于磷酸盐缓冲液，蛋白浓度为340 μg/mL的嗜酸乳杆菌S-层蛋白溶液2 mL，加入1 mL的壳聚糖微球溶液（对应干重约为0.514 mg）两者混合后，25℃，50 r/min恒温孵育4 h，离心弃去上清，得S-层蛋白修饰壳聚糖微球。
（6）S-层蛋白修饰壳聚糖微球性状观测：
采用光学显微镜观察单一微球的色泽、颗粒大小的均一性、微球的分散状态、微球的圆整度及微球的黏连程度，之后用激光粒度分析仪和扫描电镜进行粒度分析。
（7）S-层蛋白修饰壳聚糖微球的体外释放检测：
制备包埋5-氟尿嘧啶的S-层蛋白修饰壳聚糖微球，分别称取适量的5-氟尿嘧啶粉末，壳聚糖微球和S-层蛋白修饰壳聚糖微球，置于含有5 mL的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的透析袋中，紧密封口，然后分别置于200 mL的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中，以100 r/min的速率恒温震荡，定时取5 mL的释放介质在265 nm测定其紫外吸光度，同时补充等量释放液，根据标准曲线计算浓度，并绘制累计释药率-时间曲线。
经过S-层蛋白修饰后，在相同条件下，S-层蛋白修饰壳聚糖微球的释放要更慢一点，原因可能是由于S-层蛋白在微球表面形成一道“屏障”，药物和介质分子不易进出，使得药物的释放速率变慢。在一定程度上增加了药物在体内的作用时间，提高其生物利用率。

Claims (9)

1.一种表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球，其特征在于，所述壳聚糖微球是以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，以Span-80为乳化剂，环己烷为油相，通过乳化交联法制备的，并通过乳酸菌S-层蛋白修饰。
2.权利要求1所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）乳酸菌S-层蛋白提取：收集乳酸菌在MRS培养基中生长至对数期的菌体，洗涤后与LiCl/GuHCl溶液先后混合孵育，离心收集上清后得S-层蛋白提取物；
（2）乳酸菌S-层蛋白纯化：对步骤（1）中S-层蛋白粗提物进行分离纯化；
（3）乳酸菌S-层蛋白鉴定：鉴定步骤（2）中纯化后的S-层蛋白；
（4）壳聚糖微球制备：以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，以Span-80为乳化剂，环己烷为油相，通过乳化交联法制备5-氟尿嘧啶壳聚糖微球；
（5）乳酸菌S-层蛋白修饰壳聚糖微球：将步骤（2）中纯化的S-层蛋白和步骤（4）中制备的壳聚糖微球分别溶于磷酸盐缓冲液，两者混合后在一定条件下孵育，离心弃去上清，得S-层蛋白修饰壳聚糖微球。
3.根据权利要求2所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌为携带S-层蛋白的乳酸菌，包括嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、卷曲乳杆菌的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中LiCl/GuHCl溶液的浓度分别为5 mol/mL和4 mol/mL，每1 g湿菌体与10 mL的LiCl溶液37℃孵育30 min，离心取上清后，与一半体积的GuHCl溶液37℃孵育60 min。
5.根据权利要求2所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，步骤（4）具体是将壳聚糖物质加入醋酸溶液中，配置成壳聚糖溶液，按5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量比称取相应质量的5-氟尿嘧啶投放到上述醋酸溶液中，搅拌使其溶解后，慢慢加入到含有Span-80与环己烷的锥形瓶中，充分搅拌后，维持一段时间，按比例加入戊二醛继续反应，分离产物，洗涤，冷冻干燥后，得到5-氟尿嘧啶壳聚糖微球。
6.根据权利要求4所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，醋酸浓度0.2 mol/L，水油相比为1:2，交联剂戊二醛用量2 mL，5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量比为1:4，Span-80的用量1 mL。
7.根据权利要求2所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，步骤（5）中蛋白浓度为340 μg/mL，25℃，50 r/min恒温孵育4 h。
8.权利要求1所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球在功能性食品中的应用。
9.权利要求1所述的表面修饰S-层蛋白的壳聚糖微球在药品中的应用。
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