CN108610274B - 一组环γ-聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及海洋生物医药技术领域，具体是一组环γ‑聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用。本发明从水母刺丝囊提取液分离得到的海洋天然环肽——环γ‑聚谷氨酸系列小分子，其分子量低，结构更稳定。本发明建立了获得天然环γ‑聚谷氨酸系列小分子的方法，表明其具有增加蛋白质亲水性和稳定性的特点，可以作为稳定蛋白制剂的生物高分子载体材料应用于医药领域。

Description

一组环γ-聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及海洋生物医药技术领域，具体地说，是一组环γ-聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用。
背景技术
近几十年来，从生物体内分离或化学合成了大量肽类化合物，其以高生物活性、低毒副作用的特点引起了药物学家的高度关注。一般情况下，直链肽的分子柔曲性造成构象易变，使其与受体结合的强度及选择性受到影响；机体内的一些酶类物质(如氨肽酶、羧肽酶)也易于将直链肽切割、降解。相比之下，环肽较线性多肽更为稳定，在激素、抗生素、离子载体系统、抗真菌素以及抗肿瘤活性等方面展现出更丰富的生物活性，具有多重生理功能和重大的药物开发应用前景。环肽在自然界广泛存在，动物、植物、细菌、真菌及海洋生物中都含有结构各异的环肽，但已知的绝大部分环肽类化合物来自于海洋生物(参见文献：Clark R,Craik D.Engineering cyclic peptide toxins.Meth Enzymol 2012,503:57-74；Chen J,Ma R,Sun S,et al.Synthesis and biological evaluation ofcyclopeptide gg-8-6and its analogues as anti-hepatocellular carcinomaagents.Bioorg Med Chem 2018,26:609-622；Abriouel H,Lucas R,Omar N,etal.Potential applications of the cyclic peptide enterocin as-48in thepreservation of vegetable foods and beverages.Probiotics Antimicrob 2010,2:77-89；Bertram A,Pattenden G.Marine metabolites:Metal binding and metalcomplexes of azole-based cyclic peptides of marine origin.Nat Prod Rep 2007,24:18-30；Fang W,Dahiya R,Qin H,et al.Natural proline-rich cyclopolypeptidesfrom marine organisms:Chemistry,synthetic methodologies and biologicalstatus.Mar Drugs 2016,14:194.)。近年来，随着生物技术、生物学与化学领域的交叉融合发展，不断有新的环肽分子被分离、鉴定。(参见文献：Zorzi A,Deyle K,Heinis C.Cyclicpeptide therapeutics:past,present and future.Curr Opin Chem Biol 2017；38:24-29.)
水母属刺胞动物门，是一类分布广泛、生物总量庞大的海洋无脊椎动物。相比陆地生态系统，海洋独特的生态环境赋予海洋生物更多、更高效的生物活性物质，如水母体内含有促生长、免疫调节、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种活性物质和功能蛋白(参见文献：阮增良,柳国艳,温小娟,等.水母毒素及水母来源新功能蛋白研究进展.中国海洋药物2013:86-92.；
Figure BDA0001618686960000021
B,Antunes A:Jellyfish bioactive compounds:Methods for wet-labwork.Mar Drugs 2016,14:75)。近年来水母来源生物活性物质及其开发应用的研究逐渐成为海洋生物技术领域的热点。目前针对水母研究较多的是其刺丝囊内毒素提取和分离鉴定。刺胞动物触手组织中均含有一类特化的细胞——刺细胞，刺丝囊是分布于刺细胞的主要功能细胞器，其表面是胶质外壳，毒素储存于中空小囊内，用作捕食和防御的武器。研究表明，水母毒素是一类结构新颖、毒性极强的多肽/蛋白类混合物，其毒素组分疏水性强、稳定性差(对热、pH值不耐受)，目前仅少数几种毒素分子被成功分离并鉴定。
但是关于一组水母刺丝囊中环γ-聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用，目前还未见报道。
发明内容
本发明在分离纯化越前水母(Nemopilema nomurai)刺丝囊毒素的过程中发现，从刺丝囊中提取得到的粗毒具有高水溶性，而将粗毒水溶液置于截留分子量为10kDa的透析袋中，在纯水中透析24h后发现透析袋内有沉淀产生，即毒素的水溶性明显降低。若将粗毒样品直接进行离子交换、凝胶过滤分离，则发现第一个蛋白洗脱峰均为紫外吸收明显的大峰，而之后的洗脱峰紫外吸收很低。表明刺丝囊毒素易聚合形成絮凝物，大部分蛋白在初期即同时被洗脱，因而分离效果不佳。我们推测，水母刺丝囊中存在一类水溶性好、吸附力强、有助于提升毒素活性蛋白亲水性的小分子物质，在水母毒素的结构稳定、活性维持方面起着至关重要的作用。
通过凝胶过滤层析、反向高效液相色谱配合质谱分析，本发明从越前水母刺丝囊提取液中分离得到了一组全新的环状多肽——环γ-聚谷氨酸。据文献报道，链状的γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一种经由杆菌类微生物发酵生成的生物高分子载体材料，或由D-或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺键结合而成，具有强水溶性、生物可分解性、安全无毒等特性，在食品、生物医药等领域应用广泛。γ-聚谷氨酸及其衍生物作为药物载体，可以改善药物的水溶性、降低毒性、控制药物释放以及提高药物靶向性。李文娟等人成功制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物，药物有效结合率达30％，明显降低了游离顺铂的毒性，仍对乳腺癌细胞Bcap-37和肝癌细胞BEL7404具有显著的杀伤作用(参见文献：李文娟,冯震,薛晓敏,等.γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及其生物活性.中国医药生物技术2010:98-104)。Li等将γ-聚谷氨酸与低水溶性的抗肿瘤药物紫杉醇(paclitaxel，TXL)利用共价结合制备得到高水溶性的聚谷氨酸紫杉醇(γ-PGA-TXL)，与TXL相比，该复合物有更独特的靶向功能，显著提高了TXL的生物利用度(参见文献：Li C,Price JE,Milas L,et al.Antitumor activity of poly(L-glutamic acid)-paclitaxelon syngeneic and xenografted tumors.Clin Cancer Res 1999；5:891-897.)。
本发明从水母刺丝囊提取液中分离得到的海洋天然环肽——环γ-聚谷氨酸系列小分子，其分子量低，结构更稳定。因此，本发明建立了获得天然环γ-聚谷氨酸系列小分子的方法，表明其具有增加蛋白质亲水性和稳定性的特点，可以作为稳定蛋白制剂的生物高分子载体材料应用于医药领域。
本发明的第一个目的在于提供一组来源于水母的全新天然环肽：环γ-聚谷氨酸系列小分子；本发明的第二个目的在于提供该系列环肽的制备方法；本发明的第三个目的在于提供该系列环肽的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一组环γ-聚谷氨酸，命名为Nn-cyclo-γ-PGA，其氨基酸序列(N→C)分别如下所示：
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:1)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:2)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:3)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:4)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ IDNO:5)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:6)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:7)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:8)。
优选的，所述的谷氨酸为外消旋体、L型或D型谷氨酸。
优选的，所述的环γ-聚谷氨酸是从越前水母刺丝囊提取液中分离得到的一组环状多肽，分别由4～11个谷氨酸残基组成，分子量依次为516Da、645Da、774Da、903Da、1032Da、1161Da、1290Da、1419Da。
本发明的第二方面，提供一组如上所述的环γ-聚谷氨酸的制备方法，是将新鲜越前水母触手剪下，采用密度梯度离心法制备越前水母刺丝囊，利用组织研磨器破碎得到刺丝囊提取液，再经凝胶过滤层析和高效液相色谱法分离纯化后得到。
本发明的越前水母来源环γ-聚谷氨酸Nn-cyclo-γ-PGA系列小分子的制备方法，具体步骤如下：
A)水母刺丝囊提取液制备
取冻存的越前水母触手组织解冻，加入等体积0.5M氯化镁溶液，4℃下自溶4天，用80目筛网过滤去除组织碎片，滤液2000×g离心5min，弃上清，沉淀加入10ml氯化镁溶液复溶；将不同浓度的Percoll悬液(90％，70％，50％，30％)各2ml铺管，吸取复溶后触手样品2ml上样，280×g梯度离心20min；离心后收集底层沉淀，镜下观察为大型未发射的刺丝囊(参见图1)；将洗净的刺丝囊转移至破碎管，利用组织研磨器Mini-Beadbeater在4600rpm转速下破碎10min，每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min，破碎完毕后10000×g离心10min，收集上清即为刺丝囊提取液；
上述操作都在0-4℃(如冰水混合物)条件下进行；
B)水母刺丝囊提取液初步分离
水母刺丝囊提取液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液过HiTrap Desalting5ml柱初步分离，用纯水洗脱，流速为5ml/min，280nm波长的紫外检测器同步检测；电喷雾质谱法(Electrospray mass spectrometry,ESI-MS)检测得知，其中流出体积4-6ml内的组分(参见图2A洗脱峰SE2)含有大量分子量在1000Da以下的组分(参见图2B)；
C)水母刺丝囊提取液SE2组分反向高效液相层析与质谱分析
将SE2组分冻干，溶于0.1％的TFA水中，利用HPLC反相C18柱进一步纯化，以含0.1％TFA的水和含0.1％TFA的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集洗脱时间12-20min之间的一系列洗脱峰(参见图3A)，即得到一系列Nn-cyclo-γ-PGA组分，即所述的环γ-聚谷氨酸系列小分子。
本发明对上述得到的Nn-cyclo-γ-PGA氨基酸组成进行分析：
将收集的每一个洗脱峰进行ESI-MS分析(参见图3B)，结果发现各洗脱峰所对应的组分为一组相对分子质量相差129的系列小分子，其相对分子质量依次为：516Da、645Da、774Da、903Da、1032Da、1161Da、1290Da、1419Da。该系列小分子的分子量均为129的倍数(4×，5×，6×，7×，8×，9×，10×，11×)，提示这些分子是以129为结构单元的聚合物，且该系列聚合物没有起始单元，为均一的聚合。
本发明继续对该组分子进行氨基酸组成分析，选择图3A中15min时的洗脱峰所对应样品进行酸水解(6N HCl，110℃)，然后用PITC衍生法进行氨基酸衍生，使用谷氨酸(Glu)作为标准对照(参见图4)，结果显示衍生后的样品HPLC谱图与标准对照谱图完全一致。再将图4A中15min时的洗脱峰收集并进行质谱分析，测定其分子量为283(M+H)，证明其成分就是PITC-Glu。以上实验表明，该组分子均由Glu一种氨基酸组成。
本发明的越前水母来源Nn-cyclo-γ-PGA的鉴定，还包括以下步骤：
Nn-cyclo-γ-PGA序列及分子结构测定
Glu的相对分子质量为147，谷氨酸残基相对分子质量为129，要形成分子量为129倍数的分子结构，有两种可能性：①N端是分子内封闭(焦谷氨酸)的肽链；②环谷氨酸。考虑到谷氨酸的特殊性，其可以γ-羧基形成肽键，因此其可能的分子结构类型有4种，即环α、环γ、焦谷α、焦谷γ。
为了进一步确定其分子结构类型，本发明以6个谷氨酸残基组成的6元肽为代表，化学合成了其所有可能的四种结构类型，分别为：①环α：Cyclo-alpha-E6；②环γ：Cyclo-gamma-E6；③焦谷α：Pyro-alpha-E6；④焦谷γ：Pyro-gamma-E6。将这四种化学合成的6元肽与水母刺丝囊中天然6元肽通过HPLC进行比较(参见图5)，可以发现，只有合成的Cyclo-gamma-E6与天然多肽的谱图完全一致，再结合之前的质谱分析结果，综合起来可以确定，该系列小分子是一组环γ-聚谷氨酸，分别由4～11个谷氨酸残基组成。
本发明也可通过人工方法合成如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示的环肽。
本发明的第三方面，提供一组如上所述的环γ-聚谷氨酸在制备生物高分子载体材料中的应用。
优选的，所述的生物高分子载体材料为稳定蛋白制剂的生物高分子载体材料。
检测加入Nn-cyclo-γ-PGA前后越前水母刺丝囊提取液的浊度及蛋白浓度变化，从而证明本发明的Nn-cyclo-γ-PGA系列小分子有显著增加蛋白质亲水性和稳定性的作用，可作为生物高分子载体材料应用于医药领域。
按照本说明书中提及的方法制备越前水母刺丝囊提取液，将制备得到的提取液冻干后，称取40mg冻干粉溶于1ml纯水中，将溶液置入透析袋(MW:10kDa)于纯水中透析24h以除去Nn-cyclo-γ-PGA等小分子组分，再将透析袋内样品冻干，冻干粉溶于1ml纯水中，紫外分光光度计分别测定透析前后样品水溶液在320nm波长处的吸光度(A320nm)，表示其各自的浊度。从图6A可以看出，提取液澄清透明，而透析去除Nn-cyclo-γ-PGA后的样品水溶液变得浑浊，浊度显著上升。
接下来按等比增加剂量，依次累计加入5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg Nn-cyclo-γ-PGA(4-11元环肽等比混合物)，混匀后依次测定溶液的吸光度(A320nm)和蛋白浓度。结果发现，提取液蛋白浓度为4.5mg/ml，透析后有大量蛋白质析出，样品水溶液的蛋白浓度显著下降为0.42mg/ml，表明透析后溶液中的蛋白稳定性降低。向透析后的浑浊溶液中加入Nn-cyclo-γ-PGA，随着加入Nn-cyclo-γ-PGA质量的累计增加，溶液逐渐变得清澈(图6A)；从图6B可以发现，透析后样品水溶液的浊度随着加入Nn-cyclo-γ-PGA量的增加呈剂量依赖性下降，而溶液蛋白浓度则依次升高。
以上实验结果表明，本发明中的Nn-cyclo-γ-PGA系列小分子可以增加蛋白质亲水性和稳定性，人工方法合成的如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示的环肽也具有同样活性，本发明的环肽有望作为稳定蛋白制剂的生物高分子载体材料应用于医药领域。
附图说明
图1为密度梯度离心法分离越前水母刺丝囊，未发射刺丝囊富集于D层。
图2为本发明越前水母来源Nn-cyclo-γ-PGA的初步分离。(A)刺丝囊提取液过HiTrap Desalting柱层析图；(B)SE2组分ESI-MS谱图
图3为刺丝囊提取液SE2组分反向高效液相层析与质谱分析。(A)SE2组分经高效液相色谱柱所得的谱图，条件：C18反相柱；流动相：0.1％TFA in H2O，0.1％TFA in ACN，1％/min线性梯度；(B)洗脱时间12-20min之间各洗脱峰进行ESI-MS分析所得其中一个谱图
图4为本发明越前水母来源Nn-cyclo-γ-PGA样品经PITC衍生后的HPLC谱图。(A)PITC-Glu；(B)样品经PITC衍生图；(C)样品与PITC-Glu的混合图。
图5为化学合成的四种6元谷氨酸肽与水母刺丝囊中天然6元肽的HPLC谱图。
图6刺丝囊提取液透析后加入Nn-cyclo-γ-PGA，溶液浊度和蛋白浓度的变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明采用的越前水母(Neopilema nomurai)样品采集自山东省青岛市崂山海域，并经集美大学水产学院洪惠馨教授鉴定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：水母刺丝囊提取液制备
取1000g冻存的水母触手组织置于烧杯中解冻，加入等体积预冷0.5M氯化镁溶液，4℃下自溶4天，用80目筛网过滤去除组织碎片，滤液2000×g离心5min，弃上清，沉淀加入10ml氯化镁溶液复溶。将不同浓度的Percoll悬液(90％，70％，50％，30％)各2ml铺管，吸取复溶后触手样品2ml上样，280×g梯度离心20min。离心后收集底层沉淀，镜下观察为大型未发射的刺丝囊(参见图1)；将洗净的刺丝囊转移至含有破碎用玻璃珠(直径0.5mm)的破碎管中，然后利用组织研磨器Mini-Beadbeater在4600rpm转速下破碎10min，每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min，破碎完毕后10000×g离心10min，收集上清即为水母刺丝囊提取液。
上述操作都在0-4℃(如冰水混合物)条件下进行。
实施例2：水母刺丝囊提取液初步分离
(1)HiTrap Desalting柱层析
将刺丝囊提取液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液过HiTrap Desalting 5ml柱初步分离，用纯水洗脱，流速为5ml/min，280nm波长的紫外检测器同步检测。ESI-MS分析得知，其中流出体积4-6ml内的组分(参见图2A洗脱峰SE2)含有大量分子量在1000Da以下的组分(图2B)。
(2)水母刺丝囊提取液SE2组分反向高效液相层析
将SE2组分冻干，溶于0.1％的TFA水，利用HPLC反相C18柱进一步纯化，以含0.1％TFA的水和含0.1％TFA的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集洗脱时间12-20min之间的一系列洗脱峰(参见图3A)，即得到一系列Nn-cyclo-γ-PGA组分，即所述的环γ-聚谷氨酸系列小分子。
实施例3：越前水母刺丝囊中Nn-cyclo-γ-PGA的组成分析及序列测定
(1)Nn-cyclo-γ-PGA氨基酸组成分析
将收集的每一个洗脱峰进行ESI-MS分析(参见图3B)。结果发现各洗脱峰所对应的组分为一组相对分子质量相差129的系列小分子，其相对分子质量依次为：516Da、645Da、774Da、903Da、1032Da、1161Da、1290Da、1419Da。该系列小分子的分子量均为129的倍数(4×，5×，6×，7×，8×，9×，10×，11×)，提示这些分子是以129为结构单元的聚合物，且该系列聚合物没有起始单元，为均一的聚合。
继续对该组分子进行氨基酸组成分析，选择图3A中15min时的洗脱峰所对应样品进行酸水解(6N HCl，110℃)，然后用苯异硫腈(PITC)衍生法进行氨基酸衍生。取200μl酸水解后样品于1.5ml离心管中，加入100μl 1.2％PITC乙腈溶液和100μl 14％TFA乙腈溶液，震荡使其混合均匀，室温放置1h，加入500μl正己烷萃取两次，取下层液200μl于HPLC瓶中，加入400μl水稀释后用HPLC分析，使用谷氨酸(Glu)作为标准对照(参见图4)，结果显示衍生后的样品HPLC谱图与标准对照谱图完全一致。再将图4A中15min时的洗脱峰收集并进行质谱分析，测定其分子量为283(M+H)，证明其成分就是PITC-Glu。以上实验表明，该组分子均由Glu一种氨基酸组成。
(2)Nn-cyclo-γ-PGA序列及分子结构测定
Glu的相对分子质量为147，谷氨酸残基相对分子质量为129，要形成分子量为129倍数的分子结构，有两种可能性：①N端是分子内封闭(焦谷氨酸)的肽链；②环谷氨酸。考虑到谷氨酸的特殊性，其可以γ-羧基形成肽键，因此可能的分子结构类型有4种，即环α、环γ、焦谷α、焦谷γ。
为了进一步确定其分子结构类型，我们以6个谷氨酸残基组成的6元肽为代表，化学合成了其所有可能的四种结构类型，分别为：①环α：Cyclo-alpha-E6；②环γ：Cyclo-gamma-E6；③焦谷α：Pyro-alpha-E6；④焦谷γ：Pyro-gamma-E6。将这四种化学合成的6元肽与水母刺丝囊中天然6元肽通过HPLC进行比较(参见图5)，可以发现，只有合成的Cyclo-gamma-E6与天然多肽的谱图完全一致，再结合之前的质谱分析结果，综合起来可以确定，该系列小分子是一组环γ-聚谷氨酸，分别由4～11个谷氨酸残基组成，其氨基酸序列(N→C)依次为：
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:1)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:2)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:3)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:4)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ IDNO:5)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ ID NO:6)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQ IDNO:7)
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)](SEQID NO:8)。
实施例4：Nn-cyclo-γ-PGA增加蛋白质亲水性和稳定性的作用
按照本说明书中提及的方法制备越前水母刺丝囊提取液，将制备得到的提取液冻干后，称取40mg冻干粉溶于1ml纯水中，将溶液置入透析袋(MW:10kDa)于纯水中透析24h以除去Nn-cyclo-γ-PGA等小分子组分，再将透析袋内样品冻干，冻干粉溶于1ml纯水中，紫外分光光度计分别测定透析前后样品水溶液在320nm波长处的吸光度(A320nm)，表示其各自的浊度。从图6A可以看出，粗毒水溶液澄清透明，而透析去除Nn-cyclo-γ-PGA等组分后的样品水溶液变得浑浊，浊度显著上升。
接下来按等比增加剂量，依次累计加入5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg Nn-cyclo-γ-PGA(4-11元环肽等比混合物)，混匀后依次测定溶液的吸光度(A320nm)和蛋白浓度。结果发现，提取液蛋白浓度为4.5mg/ml，透析后有大量蛋白质析出，样品水溶液的蛋白浓度显著下降为0.42mg/ml，表明透析后溶液中的蛋白稳定性降低。向透析后的浑浊溶液中加入Nn-cyclo-γ-PGA，随着加入Nn-cyclo-γ-PGA质量的累计增加，溶液逐渐变得清澈(图6A)；从图6B可以发现，透析后样品水溶液的浊度随着加入Nn-cyclo-γ-PGA量的增加呈剂量依赖性下降，而溶液蛋白浓度则依次升高。结果表明，本发明中的Nn-cyclo-γ-PGA系列小分子可以显著增加蛋白质亲水性和稳定性。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一组环γ-聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用
<130> /
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 1
Glu Glu Glu Glu
1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 2
Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 3
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 4
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 5
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 6
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 7
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 越前水母(Nemopilema nomurai)
<400> 8
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5 10

Claims (1)

1.一组环γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述的环γ-聚谷氨酸，其氨基酸序列N→C分别如下所示：
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
cyclo[(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)-(γ-E)]；
所述的制备方法包括以下步骤：
A)越前水母刺丝囊提取液制备
水母触手组织加入等体积0.5M氯化镁溶液，4℃下自溶4天，用80目筛网过滤去除组织碎片，滤液2000×g离心5min，弃上清，沉淀加入10ml氯化镁溶液复溶；将浓度分别为90％，70％，50％，30％的Percoll悬液各2ml铺管，吸取复溶后触手样品2ml上样，280×g密度梯度离心20min；离心后收集底层沉淀，镜下观察为大型未发射的刺丝囊；将洗净的刺丝囊转移至破碎管，利用组织研磨器在4600rpm转速下破碎10min，每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min，破碎完毕后10000×g离心10min，收集上清即为水母刺丝囊提取液；
上述操作都在0-4℃条件下进行；
B)水母刺丝囊提取液初步分离
水母刺丝囊提取液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液过HiTrap Desalting柱初步分离，用纯水洗脱，流速5ml/min，280nm波长的紫外检测器同步检测；电喷雾质谱法检测得知，其中流出体积4-6ml内的组分含有大量所述环γ-聚谷氨酸系列小分子；
C)C18柱反向高效液相层析
将上述流出体积4-6ml组分冻干，溶于0.1％的TFA水中，利用HPLC反相C18柱进一步纯化，以含0.1％TFA的水和含0.1％TFA的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集洗脱时间12-20min之间的一系列洗脱峰，即得到一系列所述的环γ-聚谷氨酸系列小分子。
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