CN108101960B - 一种具有ace抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法，属于生物医药及保健食品领域。本发明的多肽分子为天冬酰胺‑苏氨酸‑甲硫氨酸‑甲硫氨酸‑苏氨酸‑组氨酸‑脯氨酸。该多肽的两种制备方法为（1）红曲菌丝来源酶解提取法：通过将红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用PBS缓冲液进行复溶，采用葡聚糖凝胶柱层析，收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰并分别测定其ACE抑制活性，对具有最高的抑制活性的组分采用RP‑HPLC进行进一步分离，收集所得组分中具有最高ACE抑制活性组分，得到多肽；（2）人工固相合成多肽法：以2‑氯三苯甲基树脂为载体，芴甲氧羰酰基（Fmoc‑）为氨基保护基，HBTU、DIEA为缩合剂进行接肽反应，固相合成该抑制七肽。本发明操作简单，所得产品分子量小，结构新颖，兼具降血压活性和抗肿瘤活性的优点。

Description

一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药及保健食品领域，具体涉及一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤活性的多肽分子及其制备方法。

背景技术

据报道，恶性肿瘤和脑血管疾病已经分别占据我国居民死亡原因的前两位，是威胁人类生命健康的重大公共卫生问题。

恶性肿瘤作为人类的生命健康的第一杀手，它是由于一些完全不受机体调控的细胞恶性增生。所以，抑制肿瘤细胞生物学活性是当前抗癌药物研究的主要方向。近年来，具有抗肿瘤活性的天然多肽和人工合成多肽备受关注。抗肿瘤肽能破坏肿瘤细胞膜结构、抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成。与抗体和小分子药物相比，多肽药物有着免疫原性低、毒性低、活性高等特点，且分子量小易于吸收。因此抗癌活性肽的研究对于肿瘤的临床治疗有重要意义。

《中国高血压防治指南(2017年修订版)》指出，我国71％的脑卒中和54％的心梗死亡与高血压有关。高血压是一种临床常见的以体循环动脉血压增高为主的综合征，已经成为心脑血管病发病的第一危险因素。在调节血压方面，血管紧张素转化酶(AngiotensinConverting Enzyme，ACE)有着重要的影响。它能够催化血管紧张素Ⅰ(Angiotensin，AngⅠ)转化为血管紧张素Ⅱ(Angiotensin，AngⅡ)，起到升压的作用；同时，ACE能够降解舒缓激肽(Bradykinin，BK)，使之失去降压的作用。因此，研制具有ACE抑制活性药物对治疗高血压有积极意义。然而，当前市场上抑制ACE活性降血压药物主要是卡托普利、依那普利等化学合成类药物，对人体具有一定的副作用，如咳嗽、皮肤瘙痒、味觉紊乱等。所以，从动植物和微生物等食源性物质中获取天然的安全性高的ACE抑制活性多肽成为人们研究的热点。

目前世界上多肽类药物的研制已广泛涉足疫苗、抗肿瘤药物、心脑血管药物等方面。若能制备出一种既有抑制肿瘤细胞生物学活性、又有ACE抑制活性的新型多肽，将具有极大的潜力价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子，并提供该多肽分子的红曲菌丝来源酶解提取和人工合成的两种制备方法。本发明的多肽分子来源于天然食品(红曲)中，克服了化学药品的副作用，可以应用于保健食品和生物医药中，发挥降血压的作用和抗肿瘤的作用。

发明人经过大量实验和不懈努力，最终获得了一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子，该多肽分子为七肽氨基酸，其序列为天冬酰胺-苏氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-苏氨酸-组氨酸-脯氨酸(Asn-Thr-Met-Met-Thr-His-Pro)；或在上述限定的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与所述多肽分子具有相同生物学功能的由其衍生的多肽分子。

优选地，如上所述的一种具有ACE抑制活性的多肽分子在抗肿瘤方面的应用。

优选地，如上所述的一种具有ACE抑制活性的多肽分子在制备治疗或预防高血压的药品中的应用。

本发明另一目的是提供了一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤活性的多肽分子的制备方法，通过下述技术方案予以实现：将真空冷冻干燥得到的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用PBS缓冲液进行复溶；对复溶后的ACE抑制肽溶液进行离心，使用微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用GE公司superdex 30pg葡聚糖凝胶柱层析，收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰，对具有最高的ACE抑制活性的组分采用RP-HPLC进行进一步分离；收集所得组分中具有最高的抑制ACE活性组分，采用液相色谱-质谱联用分析测定组分基酸序列，所得肽即为本发明的七肽。

所述的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉为本课题组前期专利(一种红曲霉液态发酵制备ACE抑制肽的方法)所制备的多肽粉末；所述PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5；所述的离心条件为3000r/min条件下离心5min，收集上清液；所述的微孔滤膜为0.22微米的水系微孔滤膜；所述的柱层析条件为使用GE公司superdex 30pg葡聚糖凝胶柱，进样量10mL，柱温25℃，流动相为超纯水，流速1mL/min，蛋白检测波长为280nm；且步骤(1)所述的RP-HPLC分离条件为使用Shim-pack PRC-ODS色谱柱，进样量10mL，柱温25℃，流动相为超纯水，流速5mL/min，蛋白检测波长为220nm。

优选地，如上所述的ACE抑制活性测定的方法为：样品溶于超纯水，离心(7000rpm，15min)，取上清液10μL和40μL 0.78～6.5mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.3的0.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/L NaCl)于37℃保温6min，加入20μL ACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37℃下反应30min后，加入80μL 1mol/L的HCl溶液终止反应，至室温取10μL反应产物进样HPLC检测。

本发明所述的多肽分子的人工合成制备方法：通过下述技术方案予以实现：按照固相合成法在2-氯三苯甲基树脂上依次连接以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸，缩合剂为HBTU、DIEA；单个氨基酸的接肽时间为2h，脱保护剂为20％哌啶DMF，脱保护时间20min，获得七肽化合物粗品，再经过反相C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得七肽产品。

优选地，如上所述以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸为Fmoc-L-Asn(trt)-OH，Fmoc-L-Met-OH，Fmoc-L-Thr(Tbu)-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Pro-OH。

优选地，如上所述反相C18柱分离纯化步骤：取粗品肽200mg放入器皿中，用2-5mL50％的乙腈水溶液溶解，用0.45um滤膜过滤溶解液。将溶解好的样品过滤液做进样准备，制备HPLC平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％，梯度时间40min，收集从检测器出来的样品，并将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。

相对现有技术，本发明具有以下的有益效果:

1、本发明采用柱层析和半制备级高效液相色谱的方法分离纯化红曲霉液态发酵的菌丝体ACE抑制肽，得到组分中红曲霉菌丝体ACE抑制肽中的ACE抑制活性最高的多肽组分。同时，本发明还对该组分进行氨基酸序列测序，并且使用人工合成法按照该序列制取该肽。并且，本发明对人工合成法制备所得多肽进行抗肿瘤活性检测，证明其具有一定的抗肿瘤活性。本发明所得产品结构新颖，分子量小，兼具降血压活性高和抗肿瘤活性的优点。本发明的多肽分子来源于天然食品(红曲)中，克服了化学药品的副作用，可以应用于保健食品和生物医药中。

2、本发明采用MTT法观察测定本发明的合成多肽对人舌鳞状细胞癌SCC9和人胶质瘤细胞LN229等不同的组织来源的肿瘤细胞的生物活性的影响。实验结果证明本发明的多肽分子具有抑制肿瘤细胞生物活性的抗肿瘤功能，且在多肽浓度为1～5μM时对肿瘤细胞活性抑制率最高。

附图说明

图1为实施例4中SCC9细胞存活率图。

图2为实施例5中LN229细胞存活率图。

图3为本发明多肽的质谱分析检测图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明所涉及的术语定义，除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。氨基酸是构建生物机体的众多生物活性分子之一，还是构建人体细胞、修复人体组织的基础材料。

术语“多肽”意指α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物，多肽由氨基酸构成，但与蛋白质又有所不同，属于它们之间的中间物质。含有的氨基酸少于10个的被称为寡肽，10个到50个的称为多肽，氨基酸为50多个以上的多肽称为蛋白质。

术语“缺失”在本发明中意指多肽分子除了所示的氨基酸序列之外，还包括多肽分子氨基酸序列中丢失一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列的多肽分子。

术语“插入”在本发明中意指多肽分子除了所示的氨基酸序列之外，还包括多肽分子氨基酸序列中插入一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列的多肽分子。

术语“置换”在本发明中意指多肽分子除了所示的氨基酸序列之外，还包括多肽分子氨基酸序列中的一个或几个氨基酸被其他种类的氨基酸置换后的不影响其功能的新的氨基酸序列的多肽分子。

术语“对ACE抑制能力的IC₅₀值”在本发明中意指对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率达到50％时所对应的多肽分子的浓度。

实施例1

真空冷冻干燥得到的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5的PBS缓冲液进行复溶；对复溶后的ACE抑制肽溶液3000r/min条件下离心5min，收集上清液，使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用使用GE公司superdex30pg葡聚糖凝胶柱层析分离，进样量10mL，柱温25℃，流动相为超纯水，流速1mL/min，蛋白检测波长为280nm；收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰，编号为组分A-E。将具有最高的ACE抑制活性的组分E在3000r/min条件下离心5min，收集上清液，使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用RP-HPLC进行进一步分离，分离条件为使用Shim-pack PRC-ODS色谱柱，进样量10mL，柱温25℃，流动相为超纯水，流速5mL/min，蛋白检测波长为220nm；收集组分E经RP-HPLC分离所得的活性组分峰，将各组分收集液冷冻干燥后，分离并收集冻干液中的具有最高的ACE抑制活性的组分E3，即为该多肽产品，对其进行质谱分析测定序列，结果见图3。

将样品溶于超纯水，在7000rpm条件下离心15min，取上清液10μL和40μL 3.1mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.3的0.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/L NaCl)于37℃保温6min，加入20μL ACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37℃下反应30min后，加入80μL 1mol/L的HCl溶液终止反应，至室温取10μL反应产物进样检测。测得其ACE抑制活性。

结果证实；该肽为七肽产品，氨基酸组成是Asn-Thr-Met-Met-Thr-His-Pro，分子量为814.493Da，半抑制浓度是0.21mg/mL。

实施例2

制备方法同实施例1。

将样品溶于超纯水，在7000rpm条件下离心15min，取上清液10μL和40μL0.78mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.3的0.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/L NaCl)于37℃保温6min，加入20μL ACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37℃下反应30min后，加入80μL 1mol/L的HCl溶液终止反应，至室温取10μL反应产物进样检测。测得其ACE抑制活性。

结果证实；该肽为七肽产品，氨基酸组成是Asn-Thr-Met-Met-Thr-His-Pro，分子量为814.493Da，半抑制浓度是0.18mg/mL。

实施例3

以2-Chlorotrityl Chloride Resin为起始原料，按照固相合成的方法依次连接以芴甲氧羰酰基(Fmoc-)为保护基团Fmoc-L-Asn(trt)-OH，Fmoc-L-Met-OH，Fmoc-L-Thr(Tbu)-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，反应在常温下进行，得到七肽树脂，期间依次采用DIEA、HBTU为缩合剂，20％哌啶DMF为脱保护剂进行接肽反应，单个氨基酸接肽反应时间2h，脱保护时间20min，获得七肽化合物粗品，再经过反相C18柱纯化多肽，冷冻干燥，制得该ACE抑制七肽产品。将收集得到的产品，取样进行纯度和MS的鉴定。

将样品溶于超纯水，在7000rpm条件下离心15min，取上清液10μL和40μL 6.5mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.3的0.05mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3mol/L NaCl)于37℃保温6min，加入20μL ACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37℃下反应30min后，加入80μL 1mol/L的HCl溶液终止反应，至室温取10μL反应产物进样检测。测得其ACE抑制活性。

结果证实：该肽的的氨基酸组成是Asn-Thr-Met-Met-Thr-His-Pro，分子量为830.99Da，半抑制浓度是0.8mg/mL。由测定结果可知，本发明所提供的多肽合成分子对血管紧张素转化酶具有较高的抑制活性。

实施例4

制备方法同实施例3。

取多肽溶于双蒸水中，配制20mmol/L的多肽溶液，继续稀释至2mmol/L、200μmol/L。待60mm的细胞培养皿里接种的SCC9细胞密度长到约80％-90％，胰酶消化2min后加入培养基终止消化。用血球计数板计数，调整密度为5×10⁴个/mL。将SCC9细胞接种于96孔板中，每个孔100μL(约5000个细胞)置于培养箱培养过夜。向96孔板中分别加入多肽至终浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L，空白对照不加多肽，每个浓度三个复孔。置于培养箱培养48h后，每孔加入15-20μL的0.5％MTT溶液，继续培养4h后，甲臜结晶充分形成，弃去上清。向每孔加入150μL二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在OD490nm处测量各孔的吸光值，根据公式：存活率(％)＝实验组平均值/阴性对照平均值×100％，计算细胞存活率与抑制率，测定产品对SCC9细胞的抗肿瘤活性。

结果证实：该肽的的氨基酸组成是Asn-Thr-Met-Met-Thr-His-Pro，分子量为830.99Da，多肽对肿瘤细胞抑制活性结果如图1所示，在多肽浓度为5μM时，肿瘤细胞SCC9存活率为82％。由测定结果可知，本发明所提供的多肽合成分子具有一定的抗肿瘤活性。

实施例5

制备方法同实施例3。

取多肽溶于双蒸水中，配制20mmol/L的多肽溶液，继续稀释至2mmol/L、200μmol/L。待60mm的细胞培养皿里接种的LN229细胞密度长到约80％-90％，胰酶消化2min后加入培养基终止消化。用血球计数板计数，调整密度为5×10⁴个/mL。将LN229细胞接种于96孔板中，每个孔100μL(约5000个细胞)置于培养箱培养过夜。向96孔板中分别加入多肽至终浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L，空白对照不加多肽，每个浓度三个复孔。置于培养箱培养48h后，每孔加入15-20μL的0.5％MTT溶液，继续培养4h后，甲臜结晶充分形成，弃去上清。向每孔加入150μL二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在OD490nm处测量各孔的吸光值，根据公式：存活率(％)＝实验组平均值/阴性对照平均值×100％，计算细胞存活率与抑制率，测定产品对LN229细胞的抗肿瘤活性。

结果证实：该肽的的氨基酸组成是Asn-Thr-Met-Met-Thr-His-Pro，分子量为830.99Da，多肽对肿瘤细胞抑制活性结果如图2所示，在多肽浓度为1μM时，肿瘤细胞LN229存活率为79.9％。由测定结果可知，本发明所提供的多肽合成分子具有一定的抗肿瘤活性。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Asn Thr Met Met Thr His Pro

1 5

Claims (4)

1.一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子，其特征在于：该多肽分子为七肽氨基酸，其序列为天冬酰胺-苏氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-苏氨酸-组氨酸-脯氨酸。

2.权利要求1所述的一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子在制备抗肿瘤药品中的应用。

3.权利要求1所述的一种具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子在制备治疗或预防高血压的药品中的应用。

4.如权利要求1所述的具有ACE抑制活性和抗肿瘤的多肽分子的制备方法，其特征在于：通过下述技术方案予以实现：

方法A、真空冷冻干燥得到的红曲霉菌丝体ACE抑制肽干粉使用浓度为10mmol/L，pH为7.3-7.5的PBS缓冲液进行复溶；对复溶后的ACE抑制肽溶液3000r/min条件下离心5min，收集上清液，使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用使用GE公司superdex30pg葡聚糖凝胶柱层析分离，进样量10mL，柱温25℃，流动相为超纯水，流速1mL/min，蛋白检测波长为280nm；收集红曲霉菌丝体ACE抑制肽活性组分峰，编号为组分A-E；

将具有最高的 ACE 抑制活性的组分E在3000r/min条件下离心5min，收集上清液，使用0.22微米的水系微孔滤膜过滤处理，所得滤液采用RP-HPLC进行进一步分离，分离条件为使用Shim-pack PRC-ODS色谱柱，进样量10mL，柱温25℃，流动相为超纯水，流速5mL/min，蛋白检测波长为220nm；收集组分E经RP-HPLC分离所得的活性组分峰，将各组分收集液冷冻干燥后，分离并收集冻干液中的具有最高的 ACE 抑制活性的组分E3，最后采用液相色谱-质谱联用分析测定组分氨基酸序列，制得七肽产品；

方法B、按照固相合成法在2-氯三苯甲基树脂上依次连接以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸，缩合剂为HBTU、DIEA；单个氨基酸的接肽时间为2h，脱保护剂为20%哌啶DMF，脱保护时间20min，获得七肽化合物粗品，再经过反相C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得七肽产品；

所述以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸为Fmoc-L-Asn（trt）-OH，Fmoc-L-Met-OH，Fmoc-L-Thr（Tbu）-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Pro-OH。

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