CN100427502C - 抗肿瘤寡肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域。我们人工合成了具有很强抑瘤作用的寡肽(antitumor oligopeptide，简称AOP)，为八肽，其序列为Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala(X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser)。抗肿瘤寡肽-1(AOP-1)序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；抗肿瘤寡肽-2(AOP-2)序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；抗肿瘤寡肽-3(AOP-3)序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala；抗肿瘤寡肽-4(AOP-4)序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。体外及体内试验表明AOP-1、AOP-2、AOP-3、AOP-4均具有很强的抑制肿瘤细胞生长的作用。对人7721肝癌细胞和人MKN胃癌细胞的生长和增殖有很强的抑制作用，且有剂效关系。还对小鼠移植性肿瘤S180肉瘤、小鼠H22肝癌和小鼠Lewis肺癌的生长有很强的的抑制作用，并有剂效关系。可在制备抗肿瘤药中应用。

Description

抗肿瘤寡肽及其制备方法和应用

一、技术领域

本发明属生物化学中的多肽药物技术领域。

二、背景技术

人们很早就知道尿的药用价值。1943年，Magnelin等首次将尿的提取物用来治疗癌症。1967年Burzynski等从人尿中分离得到了抗瘤酮。目前国外已对抗瘤酮A₂、A₃、A₅和A₁₀进行了I期和II期临床试验，试验结果表明大部分可以完全缓解，少部分缓解，部分稳定，极少恶化。

我们采用适合我国国情的分离纯化方法，从健康男性尿液中得到了抗瘤肽，由Glu、Gly、Leu、Pro、Tyr等氨基酸组成，其分子量小于1000，有明显的抗肿瘤作用。

在人尿抗瘤肽的基础上，我们发现并合成了一定结构的化合物，具有很强的抑瘤作用。

三、发明内容

本发明的目的是用人工合成的方法合成了具有很强抑瘤作用的寡肽(antitumoroligopeptide，简称AOP)，为八肽，其序列为Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala(X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser)。抗肿瘤寡肽-1(AOP-1)序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；抗肿瘤寡肽-2(AOP-2)序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；抗肿瘤寡肽-3(AOP-3)序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala；抗肿瘤寡肽-4(AOP-4)序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。体外及体内试验表明AOP-1、AOP-2、AOP-3、AOP-4均具有很明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用来制备抗肿瘤药物，用于治疗肿瘤。

本发明可以通过以下措施来达到：

1.抗肿瘤寡肽的制备

(1)采用液相合成法和活化酯逐个增长法，将寡肽C端的第二个氨基酸的α-氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，α-羧基用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)活化，然后在KHCO₃溶液中与C端第一个氨基酸30℃反应2天。抽去溶剂，在冰浴中调pH至3～4，抽提，饱和NaCl洗，无水Na₂SO₄干燥，抽干，研磨，得带保护基的二肽。用50％TFA(三氟醋酸)处理，脱去Boc基，再与N端带Boc保护基，C端用HOSu活化的C端第三个氨基酸缩合，用同样的方法逐个接上氨基酸，最后用催化氢化法脱去Glu侧链上的保护基OBzl(苄酯)，用50％TFA脱去八肽N端的Boc基，得粗肽，粗肽用HPLC进行分离纯化，纯度在96％以上。

(2)采用固相合成法，从C端→N端逐个延长。

参考书①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良、何军林等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。

2.抗肿瘤寡肽的鉴定

抗肿瘤寡肽经5.7mol/LHCl水解16小时，用氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析。经氨基酸序列仪分析其序列。经电喷雾质谱测定其分子量。

3.抗肿瘤寡肽的抗肿瘤活性

(1)体外活性测定：

采用细胞培养和细胞计数的方法，人肝癌细胞7721以RPMI1640为培养基，人胃癌细胞MKN以DME/F12(1∶1)为培养基，视不同情况加入10％左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37℃，5％CO₂培养箱中单层培养。

当细胞生长成单层后消化，用含1％小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，37℃、5％CO₂培养箱中培养4h后，加入不同剂量的抗肿瘤寡肽，对照组和实验组均设三个重复孔，对照组加入20μl的PBS，试验组加入不同剂量的抗肿瘤寡肽，继续培养72小时后，吸出培养液，用PBS洗，然后每孔加入200μl消化液消化，待细胞变圆后，加入800μl的PBS，在倒置显微镜下用血球计数板计数。

(2)体内活性测定：

50只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分五组，每组10只，雌雄各半或全部为雄鼠。将已接种S180肉瘤或H22肝癌的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于10⁵，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，连续注射7天后，于停药3天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。对于Lewis肺癌，植瘤24hr后，给药组、生理盐水和CTX组样品连续注射10天后，于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称癌重，计算抑瘤率。

本发明与现有技术相比所具有的效果：

本发明合成了一个具有很强抑瘤作用的寡肽AOP-1。目前虽有文献报道抗肿瘤肽类，但大多数从海洋生物、植物及生物体中分离得到。我们合成的寡肽由天然氨基酸组成，分子量较小，便于人工合成，易于产业化，且抑瘤作用强，对正常白细胞、红细胞无影响，是一种安全、高效、理想的抗癌药物。

我们还合成了AOP-1的三个类似物AOP-2、AOP-3和AOP-4，也具有很强的抗肿瘤作用，可作为抗肿瘤药物。

四、具体实施方式

实施例1：抗肿瘤寡肽AOP-1的液相合成

采用液相合成法和活化酯逐个增长法：氨基酸的氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，羧基用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)活化，谷氨酸的侧链羧基用OBzl(苄酯)保护。

Boc氨基酸羧基活化的方法：Boc氨基酸100mmol于70ml四氢呋喃(A.R)中，微热溶解，加105mmol HOSu，冰浴搅拌下滴加含105mmol DCCI(二环己基碳二亚胺)的65ml四氢呋喃溶液，冰浴搅拌反应6小时，以后让其自然升温，室温过夜。次日过滤除去DCU(二环己基脲)，滤液浓缩，无水乙醚研磨或用异丙醇重结晶。

逐个增长法：将Thr的α-氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，α-羧基用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)活化，BocThrOsu 50mmol溶于40ml四氢呋喃，微热溶解，加入Ala50mmol，加入100mmolKHCO₃，加水20ml，30℃水浴反应2天。抽去四氢呋喃，用2mol/LHCl在冰浴中酸化至pH3～4，乙酸乙酯抽提，饱和NaCl洗3次，无水Na₂SO₄干燥，抽干，无水乙醚研磨，P₂O₅真空干燥。可得BocThr-Ala OH 38.1mmol，产率76.2％。

BocThr-Ala OH 30mmol溶于24ml二氯甲烷，24ml TFA(三氟醋酸)，28℃搅拌反应1小时，减压抽去溶剂，得油状物，用无水乙醚研磨得白色粉末，P₂O₅真空干燥，得TFA·Thr-Ala OH 26mmol，产率86.7％。

BocProOSu 22mmol加20ml四氢呋喃，加入TFA·Thr-AlaOH 22mmol，再加20ml四氢呋喃，以及20ml含44mmolKHCO₃的水溶液，30℃反应2天。抽去四氢呋喃，用2mol/L HCl在冰浴酸化至pH3～4，乙酸乙酯抽提，饱和NaCl洗3次，无水Na₂SO₄干燥，抽干，无水乙醚研磨，得白色粉未，即为Boc-Pro-Thr-Ala OH，产量为14.7mmol，产率66.8％。

Boc-Pro-Thr-Ala OH 10mmol溶于8ml二氯甲烷，8mlTFA，28℃搅拌反应1小时，减后抽去溶剂，得油状物，用无水乙醚研磨得白色粉末，P₂O₅真空干燥得TFA·Pro-Thr-Ala OH 8.3mmol，得率83.0％。

用以上同样的方法依次从C端→N端接上Gly、Pro、Glu、Leu、Tyr，得带保护基的八肽。

用催化氢化法脱去Glu侧链的保护基(OBzl)，具体方法为8mmol带保护基的八肽，加300ml甲醇，加少量催化剂钯黑，通氢气，40℃搅拌约5小时，用薄层层析检查反应是否完全，待反应完全后，过滤去除钯黑，于旋转蒸发仪抽去甲醇，抽干后用乙醚洗，抽滤，P₂O₅真空干燥，得6.89mmol BOC八肽，得率86.1％。

Boc八肽6mmol溶于5ml二氯甲烷，5mlTFA，28℃搅拌反应1小时，减压抽去溶剂，得油状物，用无水乙醚研磨得白色粉末，P₂O₅真空干燥得5.6mmolTFA八肽，即粗肽，得率93.3％。

HPLC分离纯化：用C₁₈制备性HPLC柱分离纯化，柱高25cm，直径2cm。粗肽0.3mmol溶于3ml含0.1％TFA的25％ACN(乙腈)，用25％ACN进行等梯度洗脱，流速8ml/min，收集主峰，抽去TFA，冷冻干燥得0.19mmol八肽，得率63.3％，纯度96％以上。

实施例2：抗肿瘤寡肽AOP-1的固相合成

用固相合成法合成：采用C端→N端逐步延长的方法。用芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护氨基酸的α-氨基，各种Fmoc保护氨基酸的侧链保护基分别为Thr(tBu)、Glu(OtBu)、Tyr(tBu)(tBu和OtBu分别代表叔丁基和叔丁酯)。先将α-氨基保护的C端的第一个氨基酸，即FmocAla OH挂接到树脂上，用50％的哌啶除去Fmoc保护基，依次以二氯甲烷、无水乙醇、二氯甲烷洗涤。再与C端第二个氨基酸即FmocThr(tBu)用二环己基碳二亚胺(DCC)作缩合剂，并加N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)，将FmocThr(tBu)接到Ala的氨基上。用50％哌啶脱去Fmoc保护基，依次以二氯甲烷、无水乙醇、二氯甲烷洗涤，得Thr(tBu)-Ala-树脂。再与FmocPro连接，重复上述步骤，依次接上Gly、Pro、Glu、Leu、Tyr，使肽链按序列从C端→N端逐步延长，用50％哌啶脱去Fmoc保护基，用50％三氟醋酸(TFA)将AOP-1寡肽从树脂上切下，并脱去tBu和OtBu保护基，得到抗肿瘤寡肽AOP-1(粗品)，每步缩合率均在90％以上。再经HPLC分离纯化(同实施例1)，纯度在96％以上。。

实施例3：抗肿瘤寡肽AOP-1的鉴定

抗肿瘤寡肽AOP-1经5.7mol/LHCl水解16小时，进行氨基酸分析，知AOP-1含Ala、Glu、Gly、Leu、Pro、Thr、Tyr 7种氨基酸，其摩尔比为Ala∶Glu∶Gly∶Leu∶Pro∶Thr∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。经氨基酸序列分析，序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala。经电喷雾质谱测定得到一个峰，其分子量为846.9。

实施例4：抗肿瘤寡肽AOP-1对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的抑制作用(体外试验)

应用本专利说明书所述方法，发现抗肿瘤寡肽AOP-1对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，且剂效关系显著，其结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-1对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞增殖的抑制作用

实施例5：抗肿瘤寡肽AOP-1对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(体内试验)

应用本专利说明书所述方法，发现抗肿瘤寡肽AOP-1对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的生长和增殖有明显的抑制作用，其结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-1对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗肿瘤寡肽AOP-1在剂量15、7.5和2.5mg/kg，静脉注射时，对小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生长有明显的抑制作用，且剂效关系明显。

实施例6：抗肿瘤寡肽AOP-2的人工合成

采用与实施例1或实施例2同样的合成方法，不同之处仅在于Ile替代Leu。

实施例7：抗肿瘤寡肽AOP-2的鉴定

抗肿瘤寡肽AOP-2经5.7mol/LHCl水解16小时，进行氨基酸分析，知AOP-2含Ala、Glu、Gly、Ile、Pro、Thr、Tyr 7种氨基酸，其摩尔比为Ala∶Glu∶Gly∶Ile∶Pro∶Thr∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。经氨基酸序列分析，序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala。经电喷雾质谱测定得到一个峰，其分子量为846.9。

实施例8：抗肿瘤寡肽AOP-2对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的抑制作用(体外试验)

应用本专利说明书所述的方法，实验结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-2对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞增殖的抑制作用

抗肿瘤寡肽AOP-2对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，且剂效关系显著。

实施例9：抗肿瘤寡肽AOP-2对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(体内试验)

应用本专利说明书所述的方法，实验结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-2对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗肿瘤寡肽AOP-2在剂量15、7.5和2.5mg/kg，静脉注射时，对小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生长有明显的抑制作用，且剂效关系明显。

实施例10：抗肿瘤寡肽AOP-3的人工合成

采用实施例1或实施例2同样的合成方法，不同之处仅在于Ser替代Thr。

实施例11：抗肿瘤寡肽AOP-3的鉴定

抗肿瘤寡肽AOP-3经5.7mol/LHCl水解16小时，进行氨基酸分析，知AOP-3含Ala、Glu、Gly、Leu、Pro、Ser、Tyr 7种氨基酸，其摩尔比为Ala∶Glu∶Gly∶Leu∶Pro∶Ser∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。经氨基酸序列分析，序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。经电喷雾质谱测定得到一个峰，其分子量为832.88。

实施例12：抗肿瘤寡肽AOP-3对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的抑制作用(体外试验)

应用本专利说明书所述的方法，实验结果如下：

肿瘤寡肽AOP-3对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞增殖的抑制作用

抗肿瘤寡肽AOP-3对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，且剂效关系显著。

实施例13：抗肿瘤寡肽AOP-3对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(体内试验)

应用本专利说明书所述的方法，实验结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-3对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗肿瘤寡肽AOP-3在剂量15、7.5和2.5mg/kg，静脉注射时，对小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生长有明显的抑制作用，且剂效关系明显。

实施例14：抗肿瘤寡肽AOP-4的人工合成

采用与实施例1或实施例2同样的合成方法，不同之处仅在于Ile替代Leu，Ser替代Thr。

实施例15：抗肿瘤寡肽AOP-4的鉴定

抗肿瘤寡肽AOP-4经5.7mol/LHCl水解16小时，进行氨基酸分析，知AOP-4含Ala、Glu、Gly、Ile、Pro、Ser、Tyr 7种氨基酸，其摩尔比为Ala∶Glu∶Gly∶Ile∶Pro∶Ser∶Tyr＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。经氨基酸序列分析，序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。经电喷雾质谱测定得到一个峰，其分子量为832.88。

实施例16：抗肿瘤寡肽AOP-4对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的抑制作用(体外试验)

应用本专利说明书所述的方法，实验结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-4对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞增殖的抑制作用

抗肿瘤寡肽AOP-4对人7721肝癌细胞和人MKN45胃癌细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，且剂效关系显著。

实施例17：抗肿瘤寡肽AOP-4对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑制作用(体内试验)

应用本专利说明书所述的方法，实验结果如下：

抗肿瘤寡肽AOP-4对小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤作用

抗肿瘤寡肽AOP-4在剂量15、7.5和2.5mg/kg，静脉注射时，对小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Lewis肺癌的生长有明显的抑制作用，且剂效关系明显。

Claims (7)

1.抗肿瘤寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽是个八肽，其序列为Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser。

2.根据权利要求1所述抗肿瘤寡肽，其中X为Leu，Y为Thr时，序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala，所述抗肿瘤寡肽的分子量为846.9。

3.根据权利要求1所述抗肿瘤寡肽，其中X为Ile，Y为Thr时，序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala，所述抗肿瘤寡肽的分子量为846.9。

4.根据权利要求1所述抗肿瘤寡肽，其中X为Leu，Y为Ser时，序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala，所述抗肿瘤寡肽的分子量为832.88。

5.根据权利要求1所述抗肿瘤寡肽，其中X为Ile，Y为Ser时，序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala，所述抗肿瘤寡肽的分子量为832.88。

6.权利要求1所述抗肿瘤寡肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求1所述抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于采用液相合成法或固相合成法合成抗肿瘤寡肽。