CN113480597A - 一种来源于紫苏籽粕的ace抑制肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用。所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Val‑Gly‑Ala‑Tyr。通过体外ACE抑制活性测定发现，该紫苏籽粕ACE抑制肽的IC50为0.861 mg/mL，其浓度为0.05 mg/mL时，能有效提高人脐静脉内皮细胞NO的释放量，并且对人脐静脉内皮细胞无毒副作用。本发明提供的紫苏籽粕ACE抑制肽具有结构简单、安全、活性强的特点，且易于进行生产，有望为制备高血压预防药物提供有效成分，或作为功能食品添加剂供高血压患者食用。
Description
技术领域
本发明属于ACE抑制肽技术领域，具体涉及一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用。
背景技术
高血压严重影响着人们的生命安全，根据数据显示，每年有1040万人因高血压而死。尽管大家对高血压的发病机理越来越清楚，也做出了大量的措施来避免，但是高血压的发病率在全球范围内仍在增加，由高血压引起的死亡率也仍在增加。调查结果显示，18～34岁的青年高血压患病率为10.1%、35～44岁的患病率为15.0 %。年龄在60岁以上的男性患者和女性患者占该年龄段人数的41.6%和38.4%。
目前高血压无法根治，患者必须长期服用降压药。临床上使用的降压药有卡托普利、依那普利、雷米普利等，这些合成药物属于血管紧张素转化酶抑制剂型（ACEI）降压药，同样也是通过抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性来实现血压的稳定。尽管降压药能够有效控制高血压，但合成药物价格昂贵，而且经常产生副作用，例如咳嗽，血管性水肿，味觉障碍和皮疹。由于经济性和安全性的需要，开发安全有效的治疗高血压的新型ACEI是非常必要的。食品源的ACE抑制肽，对高血压具有定向抑制功能，且不影响正常血压，相对于传统降血压药而言，对人体无毒、无副作用。
紫苏可以做药用和香料用，其种子可以榨油，营养价值较高。现阶段国内外对于紫苏籽活性肽的研究主要集中于抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗过敏活性，以及制备紫苏籽蛋白呈味肽，而紫苏籽降压肽几乎没有报道。本发明旨在对紫苏籽粕潜在的价值进行开发利用，首次对紫苏籽粕ACE抑制肽进行研究，丰富紫苏籽粕在功能食品中的应用，增加紫苏籽粕的附加值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用，提高紫苏籽粕的附加价值，实现资源的综合利用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽，其氨基酸序列为：Val-Gly-Ala-Tyr，缩写为VGAY，即缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-酪氨酸，通过数据库BIOPEP、NCBI、biopepDB、UniProt比对，发现其为新型肽。
进一步，上述ACE抑制肽来源于紫苏籽粕天然提取或人工合成。
一种制备上述紫苏籽粕ACE抑制肽的方法，具体操作步骤如下：
（1）碱提酸沉法制备紫苏籽粕粗蛋白：粉碎后的紫苏籽粕与石油醚按照1：3（w/v）的比例混合，磁力搅拌6 h除去油脂，溶剂挥发后过80目筛即得脱脂紫苏籽粕粉；将脱脂紫苏籽粕粉与蒸馏水以1：11.6（w/v）的料液比混合，调节pH到9.4，58℃下水浴60 min，水浴结束后，于4℃条件下10000 r/min离心20 min，上清pH调到紫苏籽蛋白等电点4.0，沉淀1 h后，4℃条件下10000 r/min 离心15 min，沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到紫苏籽粕粗蛋白；
（2）酶解制备粗紫苏籽粕ACE抑制肽：选用中性蛋白酶酶解紫苏籽粕粗蛋白，酶解条件为：加酶量7100 U/g、温度55℃、pH值6.5、底物浓度1% w/v、酶解时间2 h，酶解后沸水浴10 min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下10000 rpm离心20 min，取上清液冷冻干燥，即得到粗紫苏籽粕ACE抑制肽；
（3）紫苏籽粕ACE抑制肽的分离纯化：将粗紫苏籽粕ACE抑制肽加入蒸馏水配成浓度为50 mg/mL的溶液，将溶液过0.22μm滤膜后，用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分在214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳ACE抑制活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0-3min，5%（v/v）乙腈；3-43 min，5%-40%（v/v）乙腈；43-53 min，40%（v/v）乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集洗脱时间为23-24 min的洗脱峰，真空冷冻干燥即得所述ACE抑制肽。
上述一种紫苏籽粕ACE抑制肽在制备高血压预防药物中的应用。
上述一种紫苏籽粕ACE抑制肽在制备降血压保健食品中的应用。
附图说明
图1：紫苏籽粕ACE抑制肽Sephadex G-25色谱图。
图2：Sephadex G-25洗脱峰F4的半制备反相高效液相色谱图。
图3：紫苏籽粕ACE抑制肽VGAY质谱图。
图4：VGAY的ACE抑制活性IC50。
图5：不同浓度的VGAY对人脐静脉内皮细胞毒性的影响。
图6：不同浓度的VGAY对人脐静脉内皮细胞NO释放的影响。
图7：VGAY与ACE的分子对接结果。其中，A为ACE与VGAY分子对接结果图；B为相互作用位点放大图；C为相互作用的二维显示图，无虚线连接的ACE上的氨基酸与VGAY的相互作用为范德华力。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
本发明所述ACE抑制肽的分离纯化包括Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。
碱提酸沉法制备紫苏籽粕粗蛋白：粉碎后的紫苏籽粕与石油醚按照1：3（w/v）的比例混合，磁力搅拌6 h除去油脂，干燥后过80目筛以备后续提取紫苏籽蛋白；将脱脂紫苏籽粕粉与蒸馏水以1：11.6（w/v）的料液比混合，调节pH到9.4，58℃下水浴60 min，水浴结束后，于4℃条件下10000 r/min离心20 min，将上清pH调到紫苏籽蛋白等电点4.0，沉淀1 h后，4℃条件下10000 r/min 离心15 min，沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到紫苏籽粕粗蛋白。
酶解制备紫苏籽粕粗多肽：选用中性蛋白酶酶解上述紫苏籽粕粗蛋白，酶解条件为：加酶量7100 U/g、温度55℃、pH值6.5、底物浓度1% w/v、酶解时间2 h，酶解后沸水浴10min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下10000 rpm离心20 min，取上清液冷冻干燥，即得到粗紫苏籽粕ACE抑制肽。
凝胶过滤色谱（Sephadex G-25）分离：将上述粗紫苏籽粕ACE抑制肽溶解于去离子水中，使其浓度为50 mg/mL，于4℃条件下10000 rpm离心10 min。取上清液用0.22 μm微滤膜过滤除杂后上样。Sephadex G-25凝胶柱（1.6 cm×100 cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3 mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集各组分进行ACE抑制活性测定，以检测ACE抑制肽不同分子量的组分的ACE抑制活性情况。组分F4的ACE抑制率最高，其值为70.36%，于是对F4进行富集，以备后续反相高效液相色谱分离纯化。
反相高效液相（RP-HPLC）色谱分离纯化：去离子水溶解上述组分F4冻干粉，浓度为40 mg/mL，采用高效液相色谱柱Gemini 5μ C18 （250mm×10mm）（Phenomenex，UK）进行进一步分离纯化，用水和乙腈（含0.1%（v/v）的三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。参数选择二元泵，A泵为超纯水，B泵为乙腈（含0.1%（v/v）三氟乙酸）；流动相时间参数：0-3 min，5%B；3-43 min，5-40% B；43-53 min，40% B。柱温为25℃，流速为2 mL/min，上样体积为100 μL，紫外检测波长为214 nm，共得到21个洗脱峰，如图2所示。收集7号洗脱峰，冷冻干燥后即得所述紫苏籽粕ACE抑制肽。委托复旦大学对7号峰进行液相色谱质谱联用（LC-ESI-MS/MS）分析和鉴定，所得紫苏籽粕ACE抑制肽的氨基酸序列为Val-Gly-Ala-Tyr（VGAY），质谱图如图3所示。
实施例2
委托上海吉尔生化有限公司固相合成VGAY，纯度为98%以上， 测定其ACE抑制活性IC50方法如下：ACE及N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）均使用100 mM、pH 8.3的硼酸缓冲溶液（含300 mM NaCl）配制，样品组分别依次加入50 μL 1 mM的FAPGG、40 μL不同终浓度（0.05、0.1、0.25、0.5、1和2 mg/mL）的VGAY硼酸缓冲溶液、10 μL0.1 U/mL的ACE（以硼酸缓冲溶液替代多肽溶液作为空白组）到96孔板中，随即测各孔340nm处的吸光度 A0（反应前），接着将96孔板置于37℃培养箱中反应30 min，30 min结束后继续测340 nm吸光度 A1（反应后），平行三次取平均值。分别计算反应前后的吸光度的变化值ΔA（ΔA=A0-A1），ACE抑制活性用吸光度在单位时间内的变化值来表示，ACE抑制率的计算公式为：
式中，ΔAa表示样品孔30 min前后吸光度的变化值；ΔAb表示空白孔30 min前后吸光度的变化值；
如图4所示，得到VGAY的ACE抑制活性IC50为0.861 mg/mL。
实施例3
委托上海吉尔生化有限公司固相合成VGAY，纯度为98%以上，测定其对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）毒性：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液。分别设置样品组、对照组、空白组（无细胞），每个组3个复孔。培养24 h细胞贴壁后，弃旧培养基，空白组和对照组加入100μL DMEM培养基，样品组加入100 μL配制好的含有梯度浓度（0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）VGAY的DMEM培养基。继续培养24 h，弃旧培养基，各孔均加入100 μL新的DMED培养基和10 μL的CCK-8 Solution，置于培养箱中孵育2 h，使用酶标仪测450 nm波长处的吸光度。细胞存活率公式如下：
公式中：A：样品组吸光度；B：对照组吸光度；C：空白组吸光度；
由图5可以发现，当VGAY浓度为0.125、0.25 mg/mL时，对HUVEC细胞不仅没有毒性而且在一定程度上促进了HUVEC细胞的生长；VGAY浓度为0.5、1 mg/mL时，HUVEC细胞存活率略微有下降的趋势，存活率为98.64%、91.88%，但与对照组相比差异不显著。
实施例4
委托上海吉尔生化有限公司固相合成VGAY，纯度为98%以上，测定其降血压功能：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基，制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液。分别设置促血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）组、多肽+Ang Ⅱ组和对照组（不添加多肽和Ang Ⅱ），每个组3个复孔。培养24 h细胞贴壁后，弃旧培养基，空白组和对照组加入100 μL DMEM培养基，样品组加入100 μL配制好的含有VGAY梯度浓度（0.05、0.1 mg/mL）的DMEM培养基。培养2 h后，Ang Ⅱ组、多肽+AngⅡ组分别加入终浓度为0.1 mg/mL的Ang Ⅱ，对照组不做任何处理，继续培养24 h后，取上清50 μL，根据NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）说明书测定HUVEC细胞NO的释放量。
由图6可以发现，与Ang II刺激组相比，VGAY预处理组NO释放量显著增加，并且呈现出剂量依赖性，随着VGAY浓度的增加，NO释放量显著增加。说明在高剂量下多肽VGAY能够促进内皮细胞NO的释放，保护细胞，减少血管收缩剂Ang II对细胞的影响，起到一定的降血压的作用。
实施例5
紫苏籽粕ACE抑制肽VGAY与ACE的分子对接：ACE晶体结构（ID：1O8A）从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得，使用AutoDock Tools 1.5.6结合AutoDock Vina对蛋白和多肽进行对接，对接位点坐标为：x：40.79，y：33.61，z：43.48。由图7可以发现，VGAY与ACE的残基Tyr 146、His 353、Thr 282、Asn 277、Glu 376形成6个氢键，与Asp 453、Glu 376通过静电相互作用结合，与Trp 279、Leu 161、Glu 162分别以π-π、π-烷基、π-阴离子作用力结合，从而起到抑制ACE的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Gly Ala Tyr
1
Claims (5)
1.一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽，其特征在于：所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Val-Gly-Ala-Tyr。
2.根据权利要求1所述的紫苏籽粕ACE抑制肽，其特征在于：所述ACE抑制肽来源于紫苏籽粕天然提取或人工合成。
3.一种如权利要求1所述的紫苏籽粕ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
①碱提酸沉法制备紫苏籽粕粗蛋白：粉碎后的紫苏籽粕与石油醚按照1：3 w/v的比例混合，磁力搅拌6 h除去油脂，溶剂挥发后过80目筛即得脱脂紫苏籽粕粉；将脱脂紫苏籽粕粉与蒸馏水以1：11.6 w/v的料液比混合，调节pH到9.4，58℃下水浴60 min，水浴结束后，于4℃条件下10000 r/min离心20 min，将上清pH调到紫苏籽蛋白等电点4.0，沉淀1 h后，4℃条件下10000 r/min 离心15 min，沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到紫苏籽粕粗蛋白；
②粗紫苏籽粕ACE抑制肽的制备：选用中性蛋白酶酶解紫苏籽粕粗蛋白，酶解条件为：加酶量7100 U/g、温度55℃、pH值6.5、底物浓度1% w/v、酶解时间2 h，酶解后沸水浴10 min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下10000 rpm离心20 min，取上清液冷冻干燥，即得到粗紫苏籽粕ACE抑制肽；
③紫苏籽粕ACE抑制肽的分离纯化：将粗紫苏籽粕ACE抑制肽加入蒸馏水配成浓度为50mg/mL的溶液，将溶液过0.22μm滤膜后，用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分在214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳ACE抑制活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0-3 min，5%v/v乙腈；3-43 min，5%-40% v/v乙腈；43-53 min，40% v/v乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集洗脱时间为23-24 min的洗脱峰，真空冷冻干燥即得所述ACE抑制肽。
4.权利要求1所述紫苏籽粕ACE抑制肽在制备高血压预防药物中的应用。
5.权利要求1所述紫苏籽粕ACE抑制肽在制备降血压保健食品中的应用。
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