CN105200108A

CN105200108A - 一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法

Info

Publication number: CN105200108A
Application number: CN201510677448.1A
Authority: CN
Inventors: 徐永健; 顾伟; 黄娣; 史筱莉; 牟金婷; 宿宇婷
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2015-12-30
Also published as: CN104694604A

Abstract

本发明公开了一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，特点是包括脱脂海马粉制备步骤；将脱脂海马粉依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，过滤得到海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用超滤膜进行超滤收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉的步骤；最后将海马蛋白粉与水混合后加入木瓜蛋白酶进行酶解，将酶解液沸水灭活离心后，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末，最近依次采用Sephadex？G-15凝胶过滤、反相高效液相色谱法进行分离纯化，收集高活性组分即可，优点是工艺简单、操作方便且本法制备多肽水解度高，多肽片段分子量较小，活性高。

Description

一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，尤其是涉及一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法。

背景技术

海马又叫水马、海狗子、马头鱼、龙落子等，为介类硬骨鱼，在分类上属于鱼纲、海龙目、海龙科、海马属的海产鱼类。海马种类较多，分布较广，目前已知的有35种。一般多分布于热带、亚热带的近陆浅海海藻、海草生长丰富的海域中。分布于我国沿海附近的常见海马有：三斑海马（HippocampustrimaculatusLeach）、大海马（H.kudaBleeker）、日本海马（H.japonicusKaup）、刺海马（H.histrixKaup）和线纹海马（H.kelloggiJordanetSnyder）。在中国，海马是一种名贵的中药材，有很多功效，被人们称为“南方人参”。据《本草纲目》记录，海马具“主难产及血气痛，暖水脏，壮阳道，消瘕块，治疗疮肿痛”等功效。在我国海马的药用价值历史悠久，梁代陶弘景在《本草经集注》中已有海马药用的记载，而欧洲18世纪开始也将海马入药。目前海马在医药上的主要功能有：用于阳痿、不育、哮喘、虚烦不眠、腰腿痛、铁打损伤、外伤出血、腹痛、难产、乳腺癌、瘤块等。

据测定，海马中蛋白质含量占海马干重的67.9-73.56%，各类氨基酸含量比较均衡，对海马蛋白进行酶解制备生物活性肽具有重要的意义。生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽在自然界中是广泛存在的，没有肽，就没有活性，就没有生命。现代营养学研究发现：人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小；进一步试验揭示肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。由于生物活性肽具有这些特殊的功能，使得人们对活性肽的需求量急剧增加，目前，已有许多活性肽应用在保健和医疗上。

血管紧张素转化酶抑制肽是一类具有抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性的多肽物质。这类多肽由于其有降血压的功能，所以又称为降血压肽。血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）根据来源可分为天然和人工合成两大类，目前临床上使用的ACEI都是人工合成的。这类药物的作用机理是作为竞争性抑制剂与ACE结合，从而扰乱血管紧张素II的生成。人工合成类高血压药物对人体会产生一定的负作用，如咳嗽、皮肤瘙痒、味觉紊乱及血压过度降低等。因此，天然血管紧张素转化酶抑制肽是今后研究与发展趋势之一。海洋拥有特殊的生态环境，赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构，具有特异的高活性、高药效。近年来对海洋药物的研究越发深入，越来越多的研究发现生物活性肽具有很好的医疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、抗疲劳、增强免疫力等活性。而海马是重要的中药材，因此利用海马蛋白来开发ACE抑制肽具有重要的药用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、操作方便且本法制备多肽水解度高，多肽片段分子量较小、活性高的海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-80℃下冷冻干燥48h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO₂超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；

（2）海马蛋白液制备：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与水按40-60g/L的比例混合后，依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉；

（3）ACE抑制肽制备：将步骤（2）中得到的海马蛋白粉与水按400-600g/L的比例混合后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度为59℃，时间为7.5h，pH为7.7，将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000rpm离心10min，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末；

（4）ACE抑制肽纯化：采用SephadexG-15凝胶过滤对步骤（3）制备得到的ACE抑制肽粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肽粉末浓度为0.05g/mL，洗脱速度1.0mL/min，3mL/管，收集PH-I3、PH-I4和PH-I5三个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH-I3、PH-I4和PH-I5三个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0.1%三氟乙酸的水溶液，B相为含有体积百分数0.1%三氟乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm，其中PH-I3的洗脱条件为0-35min，0-32%B相，流速为1mL/min，收集组分PH-I3-5；PH-I4的洗脱条件为0-10min，100%A相；10-40min，0-24%B相，流速为1mL/min，收集组分PH-I4-3；PH-I5的洗脱条件为0-40min，0-35%B相，流速为0.8mL/min，收集组分PH-I5-3，合并PH-I3-5、PH-I4-3和PH-I5-3三个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肽粉末。

步骤（1）中所述的CO₂超临界萃取技术进行脱脂的条件为：萃取温度为58℃、萃取压强为35MPa、静态萃取10min后调节CO2流量为15L/h、动态萃取时间为125min的萃取条件下对海马骨粉进行脱脂。

步骤（2）中所述的胰蛋白酶的酶解条件为温度45℃、时间4h、pH8.8、添加质量为脱脂海马粉的4%；碱性蛋白酶酶解温度54.70℃、时间6h、pH9.0、添加质量为脱脂海马粉的为4%。

所述的海马包括大海马、三斑海马、线纹海马、日本海马、刺海马。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其利用木瓜蛋白酶酶解海马蛋白制备ACE抑制肽省时、高效，且工艺简单、操作方便、仪器设备要求低，能耗小，避免化学方法制备多肽过程中的残留和污染，且本法制备多肽水解度高，多肽片段分子量较小，更有利人体小肠的吸收。酶解后ACE抑制肽的IC₅₀为2.028±0.110mg/mL，木瓜蛋白酶的ACE的半抑制浓度明显小于其它的蛋白酶，说明木瓜蛋白酶的酶解产物具有较好的降血压功能。通过响应面法对木瓜蛋白酶进行水解条件的优化，以达到海马蛋白最优的水解条件，在最优的酶解条件下，得到多肽ACE的半抑制浓度IC₅₀为1.997±0.094mg/mL。经进一步分离纯化后活性大幅提高，最强活性C₅₀值为75.93±3.59μg/mL。

附图说明

图1为添加量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；

图2为酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；

图3为酶解PH对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；

图4为酶解温度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；

图5为PH-ISephadexG-15蒸馏水洗脱曲线；

图6为PH-I1、PH-I2、PH-I3、PH-I4和PH-I5各组分的ACE抑制活性分析图；

图7为反相高效液相色谱法分离纯化组分PH-I3的色谱图；

图8反相高效液相色谱法分离纯化组分PH-I4的色谱图；

图9反相高效液相色谱法分离纯化组分PH-I5的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验测定方法

1、氨基酸组成成分分析

1.1多肽蛋白样品的酸水解

多肽蛋白样品酸水解：取一定量的多肽蛋白样品，转移至水解管中，加入1mL6N的盐酸，充入N2约10min，之后密封后放置于BlockHeater干式加热器模块中，110℃水解反应24h。反应完毕后，将游离氨基酸溶液转移至1.5mLEP管中，抽真空浓缩至干。

1.2异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法：

混合氨基酸标准品衍生化处理：取25μL混合氨基酸标准品溶液，加入12.5μL1moL/L三乙胺涡旋混合震荡，之后加入12.5μL0.1mol/LPITC涡旋混合震荡室温静置1h，加入100μL正己烷剧烈混合震荡后静置10min，取下层溶液20μL，加入180μL流动相A溶液，混合后0.22μm过滤处理待测试。

样品溶液衍生化处理：取适量流动相A液复溶已冻干样品游离氨基酸，取25μL样品氨基酸溶液，加入12.5μL1moL/L三乙胺涡旋混合震荡，之后加入12.5μL0.1mol/LPITC涡旋混合震荡室温静置1h，加入100μL正己烷剧烈混合震荡后静置10min，取下层溶液20μL，加入180μL流动相A溶液，混合后0.22μm过滤处理待测试。

1.3高效液相色谱测试

衍生化好的氨基酸衍生物通过岛津高效液相色谱仪LC-20A分离检测，相关参数如下：A液为0.05mol/L乙酸钠水溶液，B液为甲醇乙腈水溶液（甲醇:乙腈:水=20:60:20（V:V:V))。流速为：1.0mL/min；柱温：35℃；色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样到氨基酸分析柱。分离梯度为：0分钟-39分钟，B液线性梯度从5%到48%；39分钟-40分钟，B液线性梯度从48%到100%；40分钟-45分钟，B液维持在100%，45分钟---46分钟，B液线性梯度从100%到5%，46分钟-60分钟B液维持在5%。

1.4高效液相色谱数据处理

高效液相色谱LC-20A产生的原始数据由仪器自带软件LCsolution进行手动积分标峰处理，首先对氨基酸混合标准品进行积分标峰并建立外标法对应方法，之后调用建立方法对供试品色谱图进行自动积分标峰处理，并得到供试品的氨基酸组成摩尔百分比。

2、ACE抑制活性的测定

将10uL多肽溶液和l0uL的ACE溶液(0.25U/mL水)加入96微孔板的微孔中，但不混合，然后加入150uL经过预热的底物(1.0mmol/LFAPGG（N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸）溶解于50mmol/LTris-HCl,pH7.5，包含0.3mol/LNaCl)使其开始反应。酶标仪的温度为37℃，每1min记录一次在340nm下的吸光值，共记录20min。空白对照使用10uL的缓冲液(50mmol/L的Tris-HCl，pH7.5，包含0.3mol/LNaCl)代替蛋白水解液。以吸光值(ΔA₃₄₀min^-1)对时间作出曲线，计算出斜率，取6-15min的斜率来计算。

ACE抑制率（%）=（1-ΔA_抑制率/ΔA_空白）×100

半抑制浓度IC₅₀：抑制50%ACE活性时所需样品的浓度。

3、氨基态氮测量方法：本文参照酱油卫生标准的分析方法（GB/T5009.39-2003），甲醛定氮法并加以改进来测定，取酶解液上清液10mL，加入60mL蒸馏水，先将pH调制8.20，再利用标准0.0077mol/L的NaOH溶液进行滴定至pH为9.20，记录所消耗的标准NaOH的量。

DH=(h-h0)÷htot×100%=[(V2-V1)×0.0077×0.014×3]÷htot×100%

DH—水解度，%；

h，h0—分别为试验组和对照组中氨基态氮含量，ug/mL；

htot—脱脂海马骨粉原料总氮ug/mL；

V2，V1—分别为试验组和对照组所消耗的标准氢氧化钠的体积，mL。

二、具体实施例

一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

1、海马前处理：将海马洗净冻好后，于-80℃下冷冻干燥48h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO₂超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，于萃取温度为58℃、萃取压强为35MPa、静态萃取10min后调节CO2流量为15L/h、动态萃取时间为125min的萃取条件下对海马骨粉进行脱脂，得到脱脂海马粉；

2、海马蛋白液制备：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与水按40-60g/L的比例混合后，依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉；其中胰蛋白酶的酶解条件为温度45℃、时间4h、pH8.8、添加质量为脱脂海马粉的4%；碱性蛋白酶酶解温度54.70℃、时间6h、pH9.0、添加质量为脱脂海马粉的为4%；

3、ACE抑制肽制备：将步骤（2）中得到的海马蛋白粉与水按400-600g/L的比例混合后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度为59℃，时间为7.5h，pH为7.7，将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000rpm离心10min，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末。

4、ACE抑制肽纯化：采用SephadexG-15凝胶过滤对步骤（3）制备得到的ACE抑制肽粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肽粉末浓度为0.05g/mL，洗脱速度1.0mL/min，3mL/管，收集PH-I3、PH-I4和PH-I5三个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH-I3、PH-I4和PH-I5三个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0.1%三氟乙酸的水溶液，B相为含有体积百分数0.1%三氟乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm，其中PH-I3的洗脱条件为0-35min，0-32%B相，流速为1mL/min，收集组分PH-I3-5；PH-I4的洗脱条件为0-10min，100%A相；10-40min，0-24%B相，流速为1mL/min，收集组分PH-I4-3；PH-I5的洗脱条件为0-40min，0-35%B相，流速为0.8mL/min，收集组分PH-I5-3，合并PH-I3-5、PH-I4-3和PH-I5-3三个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肽粉末。

上述海马包括大海马、三斑海马、线纹海马、日本海马、刺海马。

三、对比试验

1、PH-I与海马蛋白（SP）氨基酸组成和疏水值（PH-I指超滤得到的分子量>20KDa的多肽，SP就是海马的蛋白质）

表1PH-I和SP中的氨基酸组成/g·100g^-1蛋白质

疏水性氨基酸：缬氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、亮氣酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly），酪氨酸（Tyr）。

支链氨基酸：缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）和亮氨酸（Leu）。

芳香族氨基酸：酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）。

海马蛋白（SP）和高分子蛋白组分（PH-I）氨基酸组成如表1所示。通过比较发现，PH-I中疏水性氨基酸（74.96%）、支链氨基酸（13.21%）和芳香族氨基酸（4.49%）的含量都高于SP。经多元统计分析可知：蛋白质中芳香族氨基酸含量、支链氨基酸含量和疏水性氨基酸的含量较高，蛋白的酶解物所表现的ACE抑制率越高；同时，在一定的程度内，水解度（DH%）与ACE抑制能力呈现正相关的关系，而高分子蛋白组分（PH-I）相比较于海马蛋白（SP）更容易水解。氨基酸的疏水性与蛋白质酶水解物ACE抑制能力密切相关，经观察疏水值大于10以上的氨基酸（Pro，Ile，Leu，Phe）在PH-I中含量均高于SP。由此提示，高分子蛋白组分（PH-I）更适合用酶解法来制备ACE抑制肽。

2、水解海马蛋白用酶的选择

分别选用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶和酸性蛋白酶五种蛋白酶进行酶解实验，实验中蛋白酶添加量为4%，持续水解6h。每种酶都在合适的酶解温度和PH值的条件下进行实验。

具体的工艺流程见具体实施例，其区别在于木瓜蛋白酶，温度为55℃，PH为7.5；菠萝蛋白酶，温度为55℃，PH为6.5；酸性蛋白酶，温度40℃，PH为3.0；复合蛋白酶，温度为50℃，PH为6.5；风味蛋白酶，温度为50℃，PH为6.5。木瓜蛋白酶的ACE半抑制浓度最小为2.028±0.110，ACE的半抑制浓度越小，说明多肽对ACE的抑制率越高。木瓜蛋白酶与其它几种酶相比有着明显的差异。所以选用木瓜蛋白酶来对海马蛋白酶解制备ACE抑制肽。不同蛋白酶的ACE的半抑制的浓度如表1所示。

表2不同蛋白酶的ACE半抑制浓度

a，b，c，d表示在P<0.05的条件下，差异是否显著。其中，a，b，c，d字母不相同表示差异显著，字母相同表示差异不显著。

3、木瓜蛋白酶酶解条件的确定及优化

分别对木瓜蛋白酶进行蛋白酶添加量/底物（E/S），时间（h），PH，温度（℃）进行单因素实验，具体的工艺流程如实施例2-5。

对E/S进行单因素实验，PH为7.5，温度为55℃，酶解时间为6h，E/S分别为2%，3%，4%，5%和6%和五个梯度。结果如图1所示，E/S为5%时，海马蛋白的水解度（DH%）达到最大，与2%，3%和4%有明显的差异，与6%没有差异。所以从节约的角度说，E/S为5%时比较合适。

对时间进行单因素实验，PH为7.5，温度为55℃，E/S为5%，酶解时间分别为1h，3h，5h，7h和9h共5个梯度。结果如图2所示，酶解时间为7h，DH%最大，7h与9h的差异不显著，所以酶解时间为7h适宜。

对PH进行单因素实验，温度为55℃，E/S为5%，时间为7h，PH梯度分别为5.5,6.5,7.5,8.5和9.5共5个梯度。结果如图3所示，当PH为7.5时，DH%最大，且与PH为6.5和8.5有着显著的差异。所以PH值取7.5适宜。

对温度进行单因素实验，E/S为5%，时间为7h，PH值为7.5，温度梯度设置为45℃，50℃，55℃，60℃和65℃共5个梯度。结果如图4所示，当温度为60℃时，DH%最大，并且温度为60℃与55℃和65℃时差异显著。所以最佳的酶解温度为60℃。

从节约的角度来考虑，E/S为5%，对时间、PH和温度三因素通过响应面Box-Behnken来进行工艺优化，确定最优酶解工艺，实验设计及结果如表3、表4、表5所示。

表3木瓜蛋白酶的响应面实验设计

水平	时间/h	pH	温度/℃
				-1	6	6.5	55
0	7	7.5	60
				1	8	8.5	65

表4响应面实验表及结果

实验序号	时间/h	pH	温度/℃	水解度DH%
					1	7（0）	6.5（-1）	55（-1）	17.64±0.28
2	7（0）	7.5（0）	60（0）	20.06±0.10
					3	7（0）	6.5（-1）	65（1）	16.12±0.11
4	7（0）	7.5（0）	60（0）	20.24±0.12
					5	6（-1）	6.5（-1）	60（0）	17.53±0.19
6	7（0）	7.5（0）	60（0）	20.15±0.01
					7	7（0）	7.5（0）	60（0）	20.15±0.05
8	6（-1）	7.5（0）	65（1）	14.91±0.30
					9	8（1）	7.5（0）	65（1）	16.39±0.02
10	7（0）	7.5（0）	60（0）	20.14±0.12
					11	6（-1）	7.5（0）	55（-1）	16.61±0.10
12	8（1）	6.5（-1）	60（0）	19.48±0.34
					13	6（-1）	8.5（1）	60（0）	17.74±0.39
14	7（0）	8.5（1）	65（1）	16.11±0.34
					15	7（0）	8.5（1）	55（-1）	18.32±0.21
16	8（1）	7.5（0）	55（-1）	18.49±0.40
					17	8（1）	8.5（1）	60（0）	19.91±0.13

表5响应面方差分析

source	Sum of sequence	df	Mean square	F-value	P-value
						Model	49.81	9	5.54	434.54	<0.0001**
A	6.99	1	6.99	548.81	<0.0001**
						B	0.21	1	0.21	16.83	0.0046*
C	7.09	1	7.09	556.17	<0.0001**
						AB	0.012	1	0.012	0.95	0.3623
AC	0.040	1	0.040	3.14	0.1197
						BC	0.12	1	0.12	9.34	0.0184*
A²	3.92	1	3.92	307.84	<0.0001**
						B²	1.13	1	1.13	88.57	<0.0001**
C²	28.09	1	28.09	2203.99	<0.0001**
						Residual	0.089	7	0.013
Lack of fit	0.073	3	0.024	5.97	0.0585
						Pure Error	0.016	4	4.070E-003
R²	0.9982
						Adj	0.9959

注：(a)P-valueProb>F值的大小表示模型及各因素的显著水平；(b)P-valueProb>F值大于0.05表示模型及各因素无显著影响，P-valueProb>F小于0.05表示模型及各因素有显著影响，P-valueProb>F小于0.01表示模型及因素有极显著影响。

用Design-Expert8.0.b软件对木瓜蛋白酶进行酶解条件优化，实验数据见表3，方差分析见表4，并得到木瓜蛋白酶的回归方程：

（a）DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C+0.055AB-0.02AC-0.0345BC-0.965A²-0.518B²-0.1033C²

其中，A、B、C分别表示时间、PH和温度。由表4方差分析得出，木瓜蛋白酶的模型Prob>F(a)值小于0.01，表明木瓜蛋白酶的模型是极显著的。失拟项（lackoffit）表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表4中木瓜蛋白酶的模型失拟项的Prob>F(a)值为0.0585大于0.05，模型失拟项不显著，模型选择合适，可以用此模型对海马蛋白进行酶解工艺优化。

根据方程（a）及表4可见，AB、AC对木瓜蛋白酶没有显著影响，A、C、A²、B²、C²对木瓜蛋白酶有极显著影响，B、BC对木瓜蛋白酶有显著影响。回归方程优化后得：

（a）DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C-0.0345BC-0.965A²-0.518B²-0.1033C²可见，对木瓜蛋白酶而言，时间和温度对木瓜蛋白酶酶解效果影响均较大，其次为PH。

由上表可知，海马蛋白用木瓜蛋白酶最佳的酶解工艺为时间为7.5小时，PH为7.72，温度为59℃，预测的水解度为20.49%。其中PH值为了实验方便矫正为7.7。

海马蛋白水解度验证：经测量在木瓜蛋白酶最佳E/S为5%，时间为7.5小时，PH为7.7，温度为59℃的实验条件下，测得海马蛋白的最佳水解度为DH=20.41±0.12%，略小于预测值20.49%，其误差范围在1%之内。说明海马蛋白木瓜蛋白酶酶解工艺优化效果较好。

ACE半抑制浓度的验证：经测量在木瓜蛋白酶最佳E/S为5%，时间为7.5小时，PH为7.7，温度为59℃的实验条件下，测得ACE的半抑制浓度IC₅₀=1.897±0.072，与优化前的ACE半抑制浓度为2.028±0.110相比，有着显著的提高。说明木瓜蛋白酶优化后，ACE的抑制效果较好。故此法证明，在木瓜蛋白酶的优化条件下，能够制备出ACE抑制肽。

4、ACE抑制肽的凝胶过滤分离纯化

采用自然沉降法填装SephadexG-15凝胶柱，用蒸馏水对凝胶柱进行平衡处理。每次取0.1g上述具体实施例中步骤（3）制备得到的多肽粉末溶解在2mL蒸馏水中，0.45μm针孔式滤膜过滤。然后上样进行洗脱，上样量2mL，洗脱速度1.0mL/min，收集3mL/管，在220nm波长处进行检测多肽含量，以洗脱液时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，并根据分管收集各洗脱峰。

结果如图5所示，共出现5个PH-I（PH-I指超滤得到的分子量>20KDa的多肽）洗脱峰，分别为PH-I1、PH-I2、PH-I3、PH-I4和PH-I5；分别对纯化后的五个部分进行ACE抑制活性分析，结果如图6所示，经测定PH-I3、PH-I4和PH-I5抑制肽的活性最好，3个区间的IC₅₀值分别为0.896mg/mL，0.982mg/mL和0.814mg/mL。由于PH-I3、PH-I4和PH-I5的IC₅₀值较低，有必要做出进一步的分离纯化以制备出更高活性的ACE抑制肽。

5、反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化

采用半制备型的反相高效液相色谱柱ZORBAXSB-C₁₈（9.4mmx250mm;5μm）对PH-I3、PH-I4和PH-I5做出进一步的分离纯化。利用水（含有体积百分数为0.1%三氟乙酸）A--乙腈（含有体积百分数为0.1%三氟乙酸）B进行梯度洗脱，检测波长为220nm，其中PH-I3的洗脱条件为0-35min，0-32%B，流速为1mL/min（结果如图7所示）；PH-I4的洗脱条件为0-10min，100%A；10-40min，0-24%B，流速为1mL/min（结果如图8所示）；PH-I5的洗脱条件为0-40min，0-35%B，流速为0.8mL/min（结果如图9所示）。经过进一步的分离纯化后，所获得的高活性的ACE抑制肽的IC₅₀如表1所示。

表1RP-HPLC分离纯化后各组分的IC₅₀值

峰的类型	IC₅₀（μg /mL）	峰的类型	IC₅₀（μg/mL）	峰的类型	IC₅₀（μg/mL）
						PH-I3-1	558.64±5.28	PH-I4-1	471.27±3.55	PH-I5-1	996.57±14.06
PH-I3-2	552.6±7.88	PH-I4-2	817.08±8.31	PH-I5-2	490.91±3.49
						PH-I3-3	532.71±7.47	PH-I4-3	178.67±1.43	PH-I5-3	75.93±3.59
PH-I3-4	358.24±6.95	PH-I4-4	293.07±4.52	-	-
						PH-I3-5	102.77±5.93	-	-	-	-

由表1可知：PH-I3经半制备型的RP-HPLC分离纯化后，第5个组分（PH-I3-5）的活性最强，IC₅₀值为102.77±5.93μg/mL；PH-I4经半制备型的RP-HPLC分离纯化后，第3个组分（PH-I4-3）活性最强，IC₅₀值为178.67±1.43μg/mL；PH-I5经半制备型的RP-HPLC分离纯化后，第3个组分（PH-I5-3）的活性最强，IC₅₀值为75.93±3.59μg/mL。因此，对PH-I3-5、PH-I4-3和PH-I5-3这3个组分进行收集，以制备出高活性的ACE抑制肽。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的CO₂超临界萃取技术进行脱脂的条件为：萃取温度为58℃、萃取压强为35MPa、静态萃取10min后调节CO2流量为15L/h、动态萃取时间为125min的萃取条件下对海马骨粉进行脱脂。

3.根据权利要求1所述的一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的胰蛋白酶的酶解条件为温度45℃、时间4h、pH8.8、添加质量为脱脂海马粉的4%；碱性蛋白酶酶解温度54.70℃、时间6h、pH9.0、添加质量为脱脂海马粉的为4%。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种海马ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的海马包括大海马、三斑海马、线纹海马、日本海马、刺海马。