CN102093471A

CN102093471A - 血管紧张素ⅰ转换酶抑制剂、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102093471A
Application number: CN2009102207566A
Authority: CN
Inventors: 胡建恩; 汪秋宽; 李伟; 赵前程; 曲敏; 马驰宇; 黄晓娟; 王刚; 陈玮
Original assignee: Dalian Fisheries University
Current assignee: Dalian Fisheries University
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明是以牡蛎浆液为原料，通过对牡蛎浆液酶解所产生的牡蛎蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到其氨基酸序列为Vel Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe的新肽，实验证明是有效的血管紧张素I转换酶抑制剂，具有无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的等优点，可广泛应用于制备降低高血压的药品及保健品中。

Description

血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂、制备方法及其应用

技术领域：

本发明涉及一种血管紧张素I转换酶(ACE)抑制肽，尤其是一种以牡蛎为原料，无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的血管紧张素I转换酶抑制剂、制备方法及其应用。

背景技术：

高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。血管紧张素I转换酶在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中，对血压调节起着重要的作用，它可以将血管紧张素I转换为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na⁺、K⁺的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高，如果抑制了血管紧张素I转换酶的活性，就可以起到降压的作用。

现有的作为治疗高血压的合成物卡普托利就是血管紧张素I转换酶的抑制剂，但由于它是由化学药品合成，因此有很多副作用。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种以牡蛎为原料，安全性高、成本廉价、可产业化生产的血管紧张素I转换酶抑制剂、制备方法及其应用。

本发明的技术解决方案是：一种血管紧张素I转换酶抑制剂，其特征是氨基酸序列为Vel Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe。

一种上述血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.将新鲜牡蛎去壳、除内脏，留存的白色蛎肉、鳃和体液用匀浆机在-10℃到10℃的低温状态下制成牡蛎浆液，提取牡蛎粗蛋白粉；

b.将牡蛎粗蛋白粉进行酶解并经过超滤膜过滤制得牡蛎粗蛋白酶解液；

c.将牡蛎粗蛋白酶解液经凝胶柱进行层析分离及RP-HPLC纯化分离。

所述a步骤的提取牡蛎粗蛋白粉是将牡蛎浆液加到等体积PBS溶液中充分搅拌，于4℃条件下静置6小时，5000×g离心25分钟取上清液，向上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵最终浓度达到75％并在4℃条件下静置6小时，5000×g离心25分钟，取沉淀；将沉淀与水混溶，装入MW 10000道尔顿的透析袋中流水透析24小时，再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎粗蛋白粉末；所述PBS溶液是用0.2mol/L NaH₂PO₄和0.2mol/L Na₂HPO₄按体积比39∶61混合的pH 7.0溶液。

所述b步骤是将牡蛎粗蛋白粉末溶于0.05mol、pH 2.0的磷酸缓冲液中使蛋白浓度为2.5％，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与蛋白的质量比为1∶50，在37℃下酶解24小时；所得酶解液加热至100℃并保持10分钟，用碱或者碱性盐(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁，碳酸钠、碳酸钾等)调节酶解液pH为中性，5000×g、室温离心25分钟，经MW 10000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为牡蛎可溶蛋白酶解液。

所述c步骤是取牡蛎可溶蛋白酶解液15ml经Sephadex LH-20柱进行层析分离，进行层析分离，用30％的甲醇溶液洗脱，按管数收集，20分钟/管，检测波长为280nm，收集具有血管紧张素I转换酶抑制剂活性的组分，将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在RP-HPLC上用Hypersil C₁₈柱，流动相A液为：0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为：0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度：

0～60min A液 100％～50％线性降低；B液0％～50％线性升高；

60～80min A液 0％；B液 100％。

上述血管紧张素I转换酶抑制剂在制备降低高血压产品中的应用。

本发明是以牡蛎浆液为原料，通过对牡蛎浆液酶解所产生的牡蛎蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到其氨基酸序列为VYPWTQRF的新肽，实验证明是有效的血管紧张素I转换酶抑制剂，具有无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的等优点，可广泛应用于制备降低高血压的药品及保健品中。

附图说明：

图1是本发明实施例中用Sephadex LH-20柱进行层析分离，检测波长为为280nm的谱图。

图2是应用本发明实施例降血压得效果示意图。

具体实施方式：

a.将新鲜牡蛎去壳，除内脏，留存的白色蛎肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎制成牡蛎浆液。

b.将牡蛎浆液加到等体积的PBS溶液(0.2mol/L NaH₂PO₄和0.2mol/LNa₂HPO₄按体积比39∶61混合，pH 7.0)中，充分搅拌，于4℃条件下，静置6小时后，离心(5000×g，4℃)25分钟取上清液；向上清夜中加入硫酸铵，使硫酸铵最终浓度达到75％，并在4℃条件下，静置6小时，离心(5000×g，4℃)25分钟取沉淀；将沉淀与少量水混溶，装入透析袋(MW 10000道尔顿)流水透析24小时，再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎粗蛋白粉末，-20℃保存；

c.将牡蛎可溶蛋白溶于0.05mol、pH 2.0的磷酸缓冲液中(用1mol/L的HCl调pH 2.0)，蛋白浓度2.5％，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与蛋白的质量比为1∶50，在37℃下酶解24小时；将所得酶解液加热至100℃并保持10分钟，使蛋白酶失活；之后用碱或者碱性盐(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁，碳酸钠、碳酸钾等)调节酶解液pH为中性，离心(5000×g，室温)25分钟，经超滤膜(MW10000道尔顿)过滤，取透过超滤膜的组分即为牡蛎可溶蛋白酶解液；

d.由牡蛎可溶蛋白酶解液15ml经Sephadex LH-20柱进行层析分离，用30％的甲醇溶液洗脱，按管数收集，20分钟/管，检测波长280nm，收集具有较强ACE抑制活性的组分，即收集如图1所示的10管～30管；将所收集具有较强ACE抑制活性的部分继续在RP-HPLC上分离纯化，在RP-HPLC上用HypersilC₁₈柱，流动相A液为：0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为：0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集：

洗脱梯度：

0～60min A液100％-50％线性降低；B液0％-50％线性升高

60～80min A液0％；B液100％。

对所收集的组分用Edman降解(Edmandegradation)法检测，是氨基酸序列为VYPWTQRF的肽，此肽及肽的类似物的盐类均可以用于制备降低高血压的药物、保健品等。

实验例：

1.静脉注射动物实验

选择20只平均收缩压为195mmHg的自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成2组，每一组10只，将本发明实施例的提取物每日按大白鼠体重5-20mg/kg剂量进行静脉注射，结果表明，1周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，从平均收缩压从195mmHg下降到162mmHg，说明此肽具有明显的降血压效果。

2.灌胃动物实验

选择20只平均收缩压为185mmHg的自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分组，将本发明实施例的提取物每日按大白鼠体重20-200mg/kg剂量进行灌胃投入，如图2所示，4周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，从平均收缩压从185mmHg下降到160mmHg，说明此肽具有明显的降血压效果。

上述氨基酸序列为VYPWTQRF的肽类似物的盐类可以用通常的方法生产。公认的与酸反应产生的盐类，比如说盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸，苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸等形成的盐类；公认的与金属离子形成的盐类，包括钠盐，钾盐，钙盐，铵盐；以及氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的限制。

本发明实施例所提取的组分(肽)可用现有技术制成各种剂型，即由各种充填剂形成的散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，悬浮液，乳化液，喷剂，粉剂等，通过口腔摄取或者是注射液的形式使用。

本发明相关的ACE抑制剂，可经口腔和非经口腔投入使用。非经口腔的投入方法比如皮下和静脉注射，肛肠投入等。注射液的制作可以任意选用生理盐水，葡萄糖，安定剂，防腐剂，悬浮剂，乳化剂等。

本发明实施例所提取的组分(肽)可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健食品，食品的形态可以是清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，奶酪，火腿，点心等。

本发明实施例所提取的组分(肽)无毒副作用，使用量是没有特别的限制，具体的要根据高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素适当地确定。

序列表

<110>大连水产学院

<120>血管紧张素I转换酶抑制剂、制备方法及其应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>8

<212>蛋白质或肽

<213>未知

<220>

<223>misc_feature

<400>1

VYPWTQRF 8

Claims

1.一种血管紧张素I转换酶抑制剂，其特征是氨基酸序列为Vel Tyr Pro TrpThr Gln Arg Phe。

2.一种如权利要求1所述血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.将新鲜牡蛎去壳、除内脏，留存的白色蛎肉、鳃和体液用匀浆机在-10℃～10℃状态下制成牡蛎浆液，提取牡蛎粗蛋白粉；

3.根据权利要求2所述的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述a步骤的提取牡蛎粗蛋白粉是将牡蛎浆液加到等体积PBS溶液中充分搅拌，于4℃条件下静置6小时，5000×g离心25分钟取上清液，向上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵最终浓度达到75％并在4℃条件下静置6小时，5000×g离心25分钟，取沉淀；将沉淀与水混溶，装入MW 10000道尔顿的透析袋中流水透析24小时，再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎粗蛋白粉末；所述PBS溶液是用0.2mol/L NaH₂PO₄和0.2mol/L Na₂HPO₄按体积比39∶61混合的pH 7.0溶液。

4.根据权利要求3所述的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述b步骤是将牡蛎粗蛋白粉末溶于0.05mol、pH 2.0的磷酸缓冲液中使蛋白浓度为2.5％，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1∶50，在37℃下酶解24小时；所得酶解液加热至100℃并保持10分钟，用碱或者碱性盐调节酶解液pH为中性，5000×g、室温离心25分钟，经MW 10000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为牡蛎可溶蛋白酶解液。

5.根据权利要求4所述的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述c步骤是取牡蛎可溶蛋白酶解液15ml经Sephadex LH-20柱进行层析分离，用30％的甲醇溶液洗脱，按管数收集，20分钟/管，检测波长为280nm，收集具有血管紧张素I转换酶抑制剂活性的组分，将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在RP-HPLC上用Hypersil C₁₈柱，流动相A液为：0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为：0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度：

0～60min A液 100％～50％线性降低；B液0％～50％线性升高；

60～80min A液 0％；B液100％。

6.一种如权利要求1所述的血管紧张素I转换酶抑制剂在制备降低高血压产品中的应用。