CN101906135A - 一种新型螺旋藻源降血压肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种口服有效的螺旋藻源新型降血压肽及其制备方法，所述降血压肽为一种三肽，序列为异亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)。本发明采用碱性蛋白酶对钝顶螺旋藻进行酶解，通过超滤、凝胶过滤色谱和二次反相高效液相色谱纯化，获得一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。试验表明IQP为ACE的非竞争性抑制剂，在主要胃肠蛋白酶的消化下能保持良好的ACE抑制活性。IQP对原发性高血压大鼠(SHR)具有良好的降压作用，在高血压防治药物和功能食品中具有巨大的应用前景。

Description

一种新型螺旋藻源降血压肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型螺旋藻源降血压肽的制备、纯化方法，可应用于营养产品、保健性功能食品及药品，属食品生物技术领域。

背景技术

生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，不是仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽的形式被直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比同一组成的氨基酸要快。因此，生物活性肽的生物学意义主要体现在其吸收机制优于氨基酸和具有氨基酸不可比拟的生理功能两个方面。

近些年来，大量的科学证据表明天然食物资源是分离、获取生物活性肽的宝贵来源，采用酶法将天然蛋白质水解后，大分子的蛋白质酶切成小分子的肽段，不但利于消化吸收，而且可以获得多种生物活性肽。国内外对食源低聚肽的研究结果表明，经酶解后得到食用肽类制品具有易吸收、抗氧化、抗疲劳、降血脂、降血压、增强免疫力等一系列生理功能，同时研究发现，食源性肽的生物活性和其原料来源、分子量大小、氨基酸序列与组成有密切关系。迄今为止，国内外研究者相继从牛乳、奶酪、海洋鱼类、小麦、玉米、大豆、大米等天然食物来源中获取具有不同生理活性的低聚肽。食源性肽类具有原料来源广泛、可规模化生产、产品功能广泛、价格便宜等优点，已成为国际上极具发展潜力的功能性原料。

目前全世界有将近十亿人口患高血压，高血压正成为严重威胁人类健康的疾病之一。虽然卡托普利(Captopril)等人工合成血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂具有显著的降血压效果，然而这类降血压药物属酶的竞争性抑制剂，它们对酶活性部位的抑制是可逆的，药物作用时间不长，停药后会使血压反弹；而且，这类药物被吸收和排泄的速度较快，经肾脏排出易损害肾功能，同时也会引起诸多的副作用，例如咳嗽、过敏、皮疹、水肿、心律失常和肾脏损害等，所以研发更为安全的天然来源ACE抑制剂十分必要。ACE抑制肽的研究在国外从上世纪六、七十年代开始，而在国内则从九十年代后期开始才逐有报道。国内外研究者已从不同的天然食物来源中分离出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金枪鱼、酪蛋白等，不同来源的ACE抑制肽在氨基酸数目、序列和活性上均存在较大差异。

螺旋藻(Spirulina platensis)为蓝藻属的一个种，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和酶类等多种营养成分，具有护肝、抗氧化、防病毒、抗癌和增强免疫等生理功能。螺旋藻蛋白质占螺旋藻干重的55％～70％，相对于一般概念上营养丰富的鸡蛋(蛋白质含量16％～18％)、大豆(33％～35％)、鱼(17％～25％)等，螺旋藻是迄今发现的蛋白质含量最高的物种之一。螺旋藻蛋白质包含18种氨基酸，具有人体必需的全部8种氨基酸，并且在组成配比上最接近于世界粮农组织(FAO)规定的标准，是获得天然活性肽的潜在宝贵资源。目前，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于其溶解性质的局限性，不利于人体吸收，使其应用受到一定的限制。本研究采用蛋白酶解和色谱分离技术，获取一种高活性的ACE抑制肽，成果可广泛应用于保健性功能食品及药品领域，具有巨大的实用价值和经济效益。

发明内容

本发明的目的是克服大分子蛋白质吸收性差以及目前活性肽品种混杂不清、活性和纯度不高方面的不足，获得具有高体内降血压作用的螺旋藻源降血压肽。

为实现上述目的，本发明采用超低温冻融与超声波破碎相结合的方法，将螺旋藻粉悬浮水中(料液比1∶5～1∶10)，悬浮液用液氮-水浴25～30℃法冻融2～5次。采用超声波破碎3～5min，以4000g～8000g的速率离心20～40min，得到螺旋藻蛋白质溶液。然后采用Alcalase 2.4L酶水解所述螺旋藻蛋白质溶液，酶解pH值7～9，酶与底物的比例为0.02～0.05(v/v)，混合均匀后，酶解温度40℃～60℃，酶解时间6～10小时。酶解结束后混合液在沸水浴中加热8～15min灭酶，然后调节pH值至7.0。所获产物经不同分子量大小的MWCO 10000D、5000D、3000D超滤膜过滤，获得具有不同分子量多肽的滤液。

随后，以体外ACE抑制活性为指标，通过凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对所提取多肽进行纯化，纯化后的多肽使用全自动蛋白多肽序列分析仪和质谱分析仪进行鉴定，并检测对主要胃肠蛋白酶的体外消化稳定性。纯化后多肽的鉴定序列为异亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)，IC₅₀值为5.77±0.09μmol/L，在主要胃肠蛋白酶的消化下能保持良好的抑制活性。活性肽的体内降血压效果以原发性高血压大鼠(SHR)为模型进行验证，证实具有良好的体内降血压效果，可应用于保健性功能食品及药品领域。

在鉴定出序列后，此种具有高体内降血压作用的螺旋藻源降血压肽也可利用肽自动合成仪通过多肽合成方法人工合成，也可从其他蛋白来源中酶解制备，具有显著的体外ACE抑制活性和体内降血压作用。

附图说明

下面对附图进行简要说明。

图1为螺旋藻碱性蛋白酶酶解液(0～3000D)经Superdex Peptide HR 10/30柱凝胶过滤色谱图(下图)和各色谱峰的ACE抑制活性(上图)。

图2是经Cosmosil MS-II C18柱第一次反相高效液相色谱图(下图)和各色谱峰的ACE抑制活性(上图)。

图3是经Cosmosil MS-II C18柱第二次反相高效液相色谱图。

图4是纯化后螺旋藻源ACE抑制肽的质谱分析图。

图5是螺旋藻源ACE抑制肽IQP对SHR大鼠的24h降血压效果。(A)SHR大鼠口服IQP后24h内的加权收缩压变化；(B)SHR大鼠口服IQP后24h内的加权舒张压变化。结果数据以“平均值±标准偏差”表示。在单因素方差分析后，采用Esumi Co.Ltd.(日本东京)的Excel Toukei 6.0版软件进行Scheffe多重比较分析。n＝5，相同时间点的数值未包含相同字母表示差异显著，p＜0.05。

图6是螺旋藻源ACE抑制肽IQP对SHR大鼠的一周降血压效果。(A)SHR大鼠口服IQP一周期间的加权收缩压变化；(B)SHR大鼠口服IQP一周期间的加权舒张压变化。结果数据以“平均值±标准偏差”表示。在单因素方差分析后，采用Esumi Co.Ltd.(日本东京)的ExcelToukei 6.0版软件进行Scheffe多重比较分析。n＝5，同一天的数值未包含相同字母表示差异显著，p＜0.05。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。其具体工艺路线由以下步骤构成：

1.螺旋藻蛋白酶解液的制备

取20g螺旋藻粉悬浮在160mL Milli-Q水中，悬浮液用液氮-水浴25-30℃法冻融五次。采用超声波破碎(200W，振幅60％)3min，在4℃下以6000g的速率离心30min，离心后去除沉淀，得到蛋白上清液，除一部分以Bio-Rad Protein Assay法测定蛋白质含量外，其余上清液迅速真空冷冻干燥并在-20℃下贮藏以备用。

底物浓度为2％(相当于20mg/mL)的螺旋藻蛋白质溶液，调节pH值至8.5，加入Alcalase2.4L酶(酶与底物的比例为0.04(v/v))，混合均匀后，于50℃的温度条件下水解10小时。酶解反应结束的反应液在沸水浴中加热10min进行酶灭活，以终止水解反应。然后迅速置于冰上，调节pH值至7.0。

在6000g、4℃条件下经截留分子量为10000D的Vivascience超滤膜过滤去除酶。滤液再经过MWCO 5000和MWCO 3000D的超滤膜在4℃、6000g下超滤，得到分子量大小范围为0～3000、3000～5000、5000～10000D的水解液。不同分子量范围的水解液迅速真空冷冻干燥得到干燥粉末并在-20℃下贮藏备用。ACE抑制剂活性测定采用荧光共振能量转移法测定(表1)，分子量范围在0～3000D的酶解液的IC₅₀值最低，即ACE抑制活性最高。

表1不同分子量范围酶解液的ACE抑制活性

2.螺旋藻源ACE抑制肽的纯化

分子量0～3000的碱性蛋白酶水解液的冻干粉溶解在10mM Tris-HCl(pH 7.0)中，经Superdex Peptide HR 10/30柱过滤分离，采用10mM Tris-HCl(pH 7.0，包含150mM NaCl)洗脱，在215nm波长处进行检测并收集，然后检测ACE抑制活性，活性最高的收集液迅速进行冷冻干燥(附图1)。

具有最高活性的收集液冻干粉溶解于流动相A中，经COSMOSIL MS-II C18柱进行反相高效液相色谱纯化，色谱柱用100％的流动相A平衡2CV，逐渐升高流动相B的浓度进行梯度分离纯化(0-50％，12CV；50-100％，3CV)，分离及ACE抑制活性检测结果见附图2。抑制率最高的收集液再次反相高效液相色谱纯化(梯度条件：0-15％，1CV；15-20％，15CV；20-100％，2CV)，出现单峰，分离谱图见附图3，其ACE抑制活性IC₅₀值经检测为0.0021±0.0001mg/mL。

流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)溶解于1％乙腈(ACN)/水(v/v)；流动相B：0.1％TFA溶解于90％ACN/Water(v/v)。

3.螺旋藻源ACE抑制肽的生物物理化学分析

纯化后的多肽经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(KRATOS ANALYTICALSHIMADZU，Japan)分析(附图4)及氨基酸测序(PPSQ-31A/33A，SHIMADZU，Japan)，鉴定其氨基酸序列为异亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)，IC₅₀值按其分子量换算为5.77±0.09μmol/L。经酶促动力学分析，IQP为ACE酶的非竞争性抑制剂，Ki值为7.61±0.16μmol/L。

通过胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶分别单独消化IQP，以及先经胃蛋白酶、再经胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶消化IQP，进行体外稳定性试验。反应停止后的混合液分别使用10000MWCO超滤膜在4℃下以6000g离心去除酶，取0.2mL进样RP-HPLC系统以比较消化前后的差异。色谱柱为Hydrosphere C18柱(YMC Co.，日本京都)，先用流动相A平衡15min，再用流动相B对流动相A 0～100％梯度洗脱30min。经不同酶处理的多肽液IC₅₀值和液相色谱谱图特征值如表2所示，前后变化不大，说明此种肽经消化酶消化是稳定的。

表2IQP在主要胃肠蛋白酶消化下的稳定性

4.IQP的动物体内降压作用

按10mg/kg将IQP溶解于0.9％生理盐水中，通过胃管每日上午11:00灌服8周龄雄性原发性高血压大鼠(SHR，Charles River，Japan)，每只大鼠灌服量为1mL时间持续一周。每日灌服前及第一日灌服后2、4、6、8、24小时的尾部动脉收缩压、舒张压、心率采用尾部套管法(BP-98A-L，Softron，Japan)检测。

如附图5所示，首日灌服后4、6、8小时的加权收缩压和舒张压显著低于负对照组(灌服等量的0.9％生理盐水)，和正对照组(灌服降血压药物Captoporil，10mg/kg)结果相近，说明本发明的降血压肽具有显著的体内急性降血压效果。另外，从第三日起，灌服IQP的处理组大鼠的加权收缩压和舒张压显著地低于负对照组(附图6)，说明本发明的降血压肽具有中期降血压的效果。

Claims (6)

1.一种具有高体内活性的降血压肽，所述降血压肽的序列为异亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)。

2.一种制备含有如权利要求1所述序列降血压肽的螺旋藻低聚肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1)将螺旋藻粉悬浮水中(料液比1∶5～1∶10)，悬浮液用液氮-水浴25～30℃法冻融2～5次。采用超声波破碎3～5min，以4000g～8000g的速率离心20～40min，得到螺旋藻蛋白质溶液。

2)采用Alcalase 2.4L酶水解所述螺旋藻蛋白质溶液，酶解pH值7～9，酶与底物的比例为0.02～0.05(v/v)，混合均匀后，酶解温度40℃～60℃，酶解时间6～10小时。酶解结束后混合液在沸水浴中加热8～15min灭酶，然后调节pH值至7.0。

3)采用截留分子量为10000D、5000D和3000D的超滤膜对所述酶解后混合液进行过滤，经喷雾干燥或真空冷冻干燥，从而得到不同分子量范围的螺旋藻低聚肽粉。

3.一种制备如权利要求1所述序列降血压肽的纯化方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1)检测如权利要求2所述不同分子量范围的螺旋藻低聚肽的ACE抑制活性，活性最高的螺旋藻低聚肽经Superdex Peptide HR 10/30柱过滤分离，采用10mM Tris-HCl(pH 7.0，包含150mM NaCl)洗脱，收集并检测ACE抑制活性。

2)具有最高活性的所述收集液相继经反相高效液相色谱进行2次不同梯度的纯化，其中流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)溶解于1％乙腈(ACN)/水(v/v)；流动相B：0.1％TFA溶解于90％ACN/Water(v/v)。

4.如权利要求1所述序列降血压肽的制备方法，其特征在于所述降血压肽可以从其他蛋白来源酶解制备，或利用肽自动合成仪通过合成方法人工合成。

5.如权利要求1所述序列降血压肽作为产品或添加成分在具有降血压作用的保健功能性食品或药剂中的应用。

6.如权利要求2所述螺旋藻低聚肽作为产品或添加成分在具有降血压作用的保健功能性食品或药剂中的应用。

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