CN104877007A - 牦牛乳乳清蛋白源ace抑制肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两条牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽及其制备方法。本发明所述的两条ACE抑制肽，分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。本发明采用酶解牦牛乳乳清蛋白制备出两条有效地ACE抑制肽，以新鲜牦牛乳为原料，选材纯天然，营养价值高，牦牛乳乳清蛋白还具有多种生理功能，且含有人体生长发育所必需的氨基酸，酶解后可制备大量的ACE抑制肽，该产品具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。

Description

牦牛乳乳清蛋白源ACE抑制肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及功能乳品领域，特别涉及两条牦牛乳乳清蛋白源ACE抑制肽及其制备方法。

技术背景

随着社会的进步与发展，人们生活水平逐渐提高，饮食中脂肪与热量的比重逐渐加大，再加上运动量的减少，我国心血管疾病的发病率快速上升，其中高血压占主要地位。

高血压是指在未使用降压药物的情况下，收缩压                                                140mmHg和（或）舒张压90mmHg。目前，常用于抗高血压药物治疗的有6种主要的降压药物，它们分别是利尿剂、α-受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、α-肾上腺素受体阻滞剂和血管紧张素转化酶抑制剂。这些降血压药物能显著的降压，但却存在一定的毒副作用，如咳嗽、过敏性血管水肿及肾功能不全加重等。

血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ACE抑制肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸（His-Leu）的切除，能够把原本无活性的血管紧张素Ⅰ转变为具有活性的血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。

ACE抑制肽一般以无活性的形式存在于蛋白质序列中，但当蛋白质通过热、酸碱的降解、酶制剂的水解或微生物的发酵等，无活性的蛋白质中可以释放出具有降压作用的ACE抑制肽。ACE抑制肽的制备方法主要有5种：化学降解法、酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程法，现在研究最多的是酶解法和微生物发酵法。相对于微生物发酵法，酶法反应迅速，制备ACE抑制肽的活性高，且原料广泛，主要有乳类蛋白、植物类蛋白及动物类蛋白，目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳为原料。

发明内容

本发明基于现有的技术，酶解牦牛乳乳清蛋白制备ACE抑制肽，为降血压提供无副作用药物做出了很大的贡献。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，所述ACE抑制肽包括两条肽，分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。

一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：牦牛乳经过脱脂、酸凝沉淀得到上清，将上清液用1M NaOH调节pH值5.2，加热温度达80-90℃，使之沉淀即为乳清蛋白，冻干得到乳清蛋白冻干粉。

步骤2：将牦牛乳乳清蛋白冻干粉制成乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶进行水解反应2~4 h，酶与乳清蛋白的比为1500~2000 U/g，调整乳清蛋白的温度40℃~50 ℃和pH值6.5~7.5，水解2~4h，得到酶解液；

步骤3：将步骤2所得酶解液在90 ℃水浴中保持15 min使酶失活，使用高速离心机在9000 rpm的条件下离心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解产物；

步骤4：对步骤3所述酶解产物进行一级超滤，收集滤液，得到一级滤液；

步骤5：对步骤4所得的一级滤液进行二级超滤，初步得到具有ACE抑制活性的滤液；

步骤6：将步骤5所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品经层析柱分离（Sephadex G-25，凝胶柱2.6×80cm，超纯水0.6 mL/min 洗脱，波长检测215 nm），多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为E1-E6组分；

步骤7：将步骤6所述E1-E6组分冷冻干燥保存，配置成多肽溶液，测定ACE抑制活性值；

步骤8：经层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分，E5组分含量占凝胶过滤后收集多肽总量的33.5 %，高于E2和E4组分，我们选择E5组分进一步分离，半制备反相液相色谱柱分离E5，将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分，多次重复操作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥，测定E5a到E5e组分多肽含量，配置相同浓度的溶液测定ACE抑制率，保留时间段分别为24-26.5min和31.9-32.3min的E5b和E5e组分的ACE抑制率均大于70 %；

步骤9：将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析，然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到多肽序列。

进一步的，所述牦牛如乳清蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤：

步骤1：将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳；

步骤2：将所得脱脂乳在35-50℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，6000 rpm离心20 min后，得到上清液；

步骤3：将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M NaOH调节pH值5.2，再加热至80-90 ℃，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉。

进一步的，步骤3中所述的一级超滤处理的条件为：

采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7.0，操作压力0.15 MPa，温度45℃，超滤时间2 h。

进一步的，步骤4中所述的二级超滤处理的条件为：压力0.15 MPa，温度45℃，pH 值7.0。

采用MWCO为6 kDa的超滤膜对一级滤液，进行超滤1~3h。

进一步的，步骤5中所述层析柱为SephadexG-25凝胶层析柱。

进一步的，所述凝胶层析的条件为：Sephadex G-25，凝胶柱2.6×80cm，超纯水0.6 mL/min 洗脱，波长检测215 nm。

本发明相比现有技术的有益效果为：

本发明采用酶解牦牛乳乳清蛋白制备出两条有效地ACE抑制肽，以新鲜牦牛乳为原料，选材纯天然，营养价值高，牦牛乳乳清蛋白还具有多种生理功能，且含有人体生长发育所必需的氨基酸，酶解后可制备大量的ACE抑制肽，该产品具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。

附图说明

图1为凝胶层析分离多肽示意图。

具体实施方式

实施例1

一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，所述ACE抑制肽包括两条肽，分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。

一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳；

步骤2：将所得脱脂乳在35-50℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，6000 rpm离心20 min后，得到上清液；

步骤3：将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M NaOH调节pH值5.2，再加热至80-90 ℃，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉；

步骤4：将上述步骤所得乳清蛋白冻干粉制成质量浓度为5 %的乳清蛋白溶液100 ml，用中性蛋白酶进行水解反应3 h，酶与乳清蛋白的比为1800 U/g，用恒温水浴箱及1 M NaOH溶液分别调整乳清蛋白的温度45 ℃和pH值7.0，水解3h；

步骤5：将步骤4所得酶解液在90 ℃水浴中保持15 min使酶失活，使用高速离心机在9000 rpm的条件下离心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解产物；

步骤6：对步骤5所述酶解产物进行一级超滤。采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7.0，操作压力0.15 MPa，温度45℃，超滤时间2h；

步骤7：采用MWCO为6 kDa的超滤膜对步骤5所述滤过液进行二级超滤处理2 h，初步得到具有ACE抑制活性的滤液；

步骤8：将步骤7所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品经SephadexG-25凝胶层析柱分离，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为E1-E6组分；

步骤9：将步骤8所述E1-E6组分冷冻干燥保存，配置成0.5 mg/mL的多肽溶液，利用紫外风光光度法测定ACE抑制活性值，E1组分是最先被洗脱下来的成分，平均分子量最大，ACE 抑制率为50.90 ±1.12%，E2和E4组分，具有相近的ACE抑制率，虽然E3组分的含量较高，但其ACE抑制率仅为35.18±3.35%。E5组分ACE抑制率最高，为77.47±1.12 %，该组分洗脱时间长，其平均分子量小于前4个组分。E6组分为分子量更低的肽组分，也具有一定的ACE抑制活性，但该组分含量低；

步骤10：经凝胶层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分，E5组分含量占凝胶过滤后收集多肽总量的33.5 %，高于E2和E4组分，我们选择E5组分进一步分离。半制备反相液相色谱柱分离E5，将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分，多次重复操作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥。测定E5a到E5e组分多肽含量，配置相同浓度的溶液测定ACE抑制率。保留时间段分别为24-26.5min和31.9-32.3min的E5b和E5e组分的ACE抑制率均大于70 %；

步骤11：将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析，然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到多肽序列；

步骤12：采用化学固相合成法合成多肽，并测定了合成多肽的ACE 酶的体外抑制活性。在合成的这两条多肽八肽MENSAEPE和五肽LDTDY具有较高的ACE抑制率，IC50值分别为27.7μM、112.5μM；

步骤13：以原发性高血压大鼠（SHR）为动物模型，尾脉搏法间接测定大鼠血压收缩，评价牦牛乳乳清蛋白多肽的降血压功能。SHR大鼠连续14日口服1.2 g/kg BW和2.4 g/kg BW剂量的降血压多肽，给药后第4日起，两组SHR大鼠的尾动脉收缩压均显著低于对照组（p<0.05），心率值无差异。停药后1日，多肽组SHR大鼠的血压值仍保持较低的血压，停药后7日，多肽组大鼠血压值与对照组无差异。提示这两条降血压多肽对SHR大鼠有辅助降血压作用。

Claims (7)

1.一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，其特征在于，所述ACE抑制肽包括两条肽，分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。

2.一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：将牦牛乳乳清蛋白冻干粉制成乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶进行水解反应2~4 h，酶与乳清蛋白的比为1500~2000 U/g，调整乳清蛋白的温度40℃~50 ℃和pH值6.5~7.5，水解2~4h，得到酶解液；

步骤2：将步骤1所得酶解液在90 ℃水浴中保持15 min使酶失活，使用高速离心机在9000 rpm的条件下离心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解产物；

步骤3：对步骤2所述酶解产物进行一级超滤，收集滤液，得到一级滤液；

步骤4：对步骤3所得的一级滤液进行二级超滤，初步得到具有ACE抑制活性的滤液；

步骤5：将步骤4所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品经层析柱分离，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为E1-E6组分；

步骤6：将步骤5所述E1-E6组分冷冻干燥保存，配置成多肽溶液，测定ACE抑制活性值；

步骤7：经层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分，E5组分含量占凝胶过滤后收集多肽总量的33.5 %，高于E2和E4组分，我们选择E5组分进一步分离，半制备反相液相色谱柱分离E5，将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分，多次重复操作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥，测定E5a到E5e组分多肽含量，配置相同浓度的溶液测定ACE抑制率，保留时间段分别为24-26.5min和31.9-32.3min的E5b和E5e组分的ACE抑制率均大于70 %；

步骤8：将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析，然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到所述多肽序列，即为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。

3.根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，其特征在于，所述牦牛如乳清蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤：

步骤1：将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳；

步骤2：将所得脱脂乳在35-50℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，6000 rpm离心20 min后，得到上清液；

步骤3：将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M NaOH调节pH值5.2，再加热至80-90 ℃，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉。

4.根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤3中所述的一级超滤处理的条件为：

采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7.0，操作压力0.15 MPa，温度45℃，超滤时间2h。

5.根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤4中所述的二级超滤处理的条件为：采用MWCO为6 kDa的超滤膜对一级滤液，进行超滤1~3h，压力0.15 MPa，温度45℃，pH 值7。

6.根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤5中所述层析柱为SephadexG-25凝胶层析柱。

7.根据权利要求6所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，其特征在于，所述Sephadex G-25凝胶柱2.6×80cm，超纯水0.6 mL/min 洗脱，波长检测215 nm。