CN101845080A - 一种血管紧张素转化酶的抑制肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血管紧张素转化酶的抑制肽，特点是该抑制肽具有下述的氨基酸序列：SEQ NO1：Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro，SEQ NO2：Leu-Leu，SEQNO3：Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg，这些抑制肽的制备包括以下步骤：(1)乳清蛋白浓缩液制备；(2)乳清蛋白水解液制备；(3)含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液的制备；(4)将含抑制肽的浓缩液通过凝胶色谱，反相高压液相色谱进行分离纯化；(5)冷冻干燥得到产品，优点是，首次公开了三种来源于乳清蛋白的血管紧张素转化酶抑制肽的氨基酸序列，并且制备成本低，提取率高。

Description

一种血管紧张素转化酶的抑制肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抑制肽及其制备方法，尤其是涉及一种血管紧张素转化酶的抑制肽及其制备方法。

背景技术

血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，简称ACE)在人体血压调节过程中起重要作用，它存在于各组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆等体液中。它在人体肾素-血管紧张素系统和激肽悉放酶-激肽系统中，对血压调节起到重要作用，可同时作用于血管紧张素I(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His Leu-Val-Ile-His)和舒缓激肽，使血管紧张素I转换成血管紧张素II(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)，同时水解舒缓激肽，使其失活，从而导致血压上升。抗ACE肽是指一类具有抑制ACE活性的多肽物质，它们通过抑制ACE的活性使血管紧张素II的产生和舒缓激肽的失活均减少，从而达到降低血压的目的。

乳清是生产干酪和干酪素的副产物，每年都有大量的乳清产出，乳清资源的再利用问题一直是人们关心的热点。乳清除具有丰富的营养价值外，乳清蛋白中还含有大量的功能性成分，乳清蛋白中包含有多种生物活性序列，这些活性序列可通过适当的蛋白酶对其水解而从乳清蛋白中释放出来，成为具有生理活性的片段。

目前用于治疗高血压的血管紧张素酶(ACE)抑制剂(卡托普利、阿拉普利等)，因吸收排泄速度快，会引起咳嗽，肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用，而来源于乳清蛋白的ACE抑制肽，具有生理功能强，无副作用，安全性高等特点，与其它药物相比，具有较大的优势，但是来源于乳清蛋白中的ACE抑制肽的氨基酸序列目前尚无报道。

现有的制备乳清蛋白源抗ACE肽的方法主要通过酶解法制备，应用的蛋白水解酶较为单一，主要有碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶或中性蛋白酶等，使抗ACE肽在乳清蛋白水解液中的含量低，分离和提纯难度大，生产成本高，同时酶解反应液中产生的抗ACE肽由于未能及时分离从而被进一步水解失活。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种来源于乳清蛋白的血管紧张素转化酶的抑制肽及其生产成本低，提取率高的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种血管紧张素转化酶的抑制肽，该抑制肽通过乳清蛋白浓缩，蛋白酶水解后经超滤、纳滤分离纯化再冷冻干燥得到，该抑制肽具有下述的氨基酸序列：SEQ NO1：Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro，SEQ NO2：Leu-LeuSEQ NO3：Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg。

所述的血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)乳清蛋白浓缩液的制备：将乳清蛋白原料配成乳固体物质量浓度为10％-15％的乳清蛋白水溶液，将乳清蛋白水溶液的pH调为7-8，在压力1.0-1.5MPa，温度38～40℃下，利用200-250KDa的超滤膜进行超滤，滤过液再利用10-15KDa的超滤膜，在压力1.0-1.5MPa，温度38～40℃下进行超滤，所得截留液为乳清蛋白浓缩液；

(2)乳清蛋白水解液的制备：将上述乳清蛋白浓缩液与混合蛋白酶加入到酶解反应容器中进行酶解反应，其中混合蛋白酶的用量为乳清蛋白浓缩液质量的0.002％-0.005％，酶解反应的温度为40～42℃，酶解反应的时间为2～3小时，得到乳清蛋白水解液；

(3)含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液的制备：将上述乳清蛋白水解液通过2KDa的超滤膜，在压力1.0-1.5MPa，温度38～40℃下进行超滤，超滤后的截留液返回至酶解反应容器中继续酶解，然后通过上述2KDa的超滤膜继续超滤，如此循环多次，将所得滤过液通过200-300Da的纳滤膜，在压力2.0-2.5MPa，温度38～40℃下进行纳滤，纳滤后的截留液为含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液；

(4)血管紧张素转化酶抑制肽的制备：将上述含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液通过凝胶色谱进行分离纯化，220nm下检测肽的出峰位置，收集第3至5个吸收峰间的含血管紧张素转化酶抑制肽的组分，冷冻干燥后将该组分进行反相高压液相色谱分离，220nm下检测肽的出峰位置，收集第三吸收峰、第五吸收峰和第六吸收峰间的含血管紧张素转化酶抑制肽的组分，冷冻干燥，得到血管紧张素转化酶抑制肽。

所述的混合蛋白酶包括瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，所述的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、胃蛋白酶与胰蛋白酶混合后的质量比为2∶1∶1。

所述的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶的活性为500～1000U/mg，所述的胃蛋白酶的活性为2000～4000U/mg，所述的胰蛋白酶的活性为1500～2000U/mg。

所述的凝胶色谱采用的过滤介质为Sephadex G-15或Sephadex LH-20，用蒸馏水平衡，上样量为1-2％凝胶色谱柱体积，流速20-30mL/h，采用蒸馏水洗脱。

所述的超滤膜为聚砜膜，所述的纳滤膜为聚乙烯醇膜。

所述的乳清蛋白水溶液的质量为乳清蛋白浓缩液质量的2-5倍。

与现有技术相比，本发明的优点在于：首次公开了三种新的来源于乳清蛋白的血管紧张素转化酶抑制肽的氨基酸序列；由于采用酶膜偶联技术制备来源于乳清蛋白中的抗ACE肽，使蛋白水解酶能反复利用，降低了分离和提纯抗ACE肽的生产成本，并由于抗ACE活性肽能及时被分离纯化，从而避免被进一步水解失活；由于本发明的混合蛋白酶包括瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，水解效果优于单一的水解蛋白酶，可以提高抗ACE肽在乳清蛋白水解液中的含量，使该乳清蛋白水解液的ACE抑制率提高20-30％。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为本发明的设备流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验材料

市售乳清粉、鲜牛奶、市售乳粉、市售脱脂乳粉；瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶500～1000U/mg、胃蛋白酶2000～4000U/mg、胰蛋白酶1500～2000U/mg。

二、ACE抑制活性测定

用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3)将马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu)配成5.0mmol/L的溶液。在10mL试管中加入200μL的5.0mmol/LHip-His-Leu溶液和80μL的乳清蛋白源抗ACE肽，于37℃下保温3分钟后，再加入20μL ACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.1U/mL)，混匀后在37℃下保温30分钟，再加入250μL的1.0mol/L的盐酸溶液以终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，经15秒种振荡混匀后，静置5分钟，用移液管吸取1.0mL的醋酸乙酯层，冷冻干燥后，加入1.0mL蒸馏水，混匀后在228nm处测定吸光度。

ACE抑制率＝[(B-A)/B]]×100％

IC₅₀为抑制50％的ACE活性所需抑制剂的浓度。

其中A为添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度；B为不添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度。

实施例1

一、乳清蛋白源抗ACE肽的制备，包括以下步骤：

1)乳清蛋白浓缩液的制备：选用市售乳清粉1.0kg溶于9kg温度为40℃的温水中，制得乳清溶液，所得乳清溶液先用截留分子量为200KDa的聚砜膜，在压力为1.0MPa，温度为38℃下超滤，滤过液再用截留分子量为10KDa的聚砜膜，在压力为1.0MPa，温度为38℃下超滤，将所得4.5kg乳清蛋白超滤浓缩液的pH值调为8.0；

2)乳清蛋白浓缩液酶解反应：将乳清蛋白浓缩液加入酶解反应容器1中，并加入活力为500U/mg的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、2000U/mg的胃蛋白酶和1500U/mg的胰蛋白酶组成的混合蛋白酶20克，其中瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、胃蛋白酶与胰蛋白酶混合后的质量比为2∶1∶1，通过保温夹套2和温度控制系统3在42℃下水解2小时，并利用搅拌器4不断搅拌，得到乳清蛋白水解液；

3)含抗ACE肽浓缩液的制备：将所得的乳清蛋白水解液流入缓冲贮罐5，经泵6的输送通过2KDa的聚砜膜超滤系统7，在压力1.5MPa，温度40℃下进行超滤，超滤后的截留液返回至酶解反应容器1中继续酶解，然后通过上述2KDa的聚砜膜超滤系统7继续超滤，如此循环5次，将所得滤过液通过200-300Da的聚乙烯醇膜纳滤系统8，在压力2.5MPa，温度40℃下进行纳滤，纳滤后的截留液为含抗ACE肽的浓缩液；

4)抗ACE肽的制备：将所得抗ACE肽浓缩液用凝胶Sephadex LH-20色谱柱进行分离纯化，用蒸馏水平衡充分，上样量为4mL，流速20mL/h，采用蒸馏水洗脱，5min收集一管；220nm下检测肽的出峰位置，收集第3至5个吸收峰间的含抗ACE活性最高的组分，冷冻干燥后将该组分进行反相高压液相色谱分离，220nm下检测肽的出峰位置，得到的第三吸收峰、第五吸收峰和第六吸收峰为抗ACE活性最高的三个组分，将这三个组分冷冻干燥，得到血管紧张素转化酶抑制肽。

二、抗ACE肽RP-HPLC分离及氨基酸序列鉴定

使用Eclipse XD8-C18(21.2×150mm，5μm)色谱柱，采用含0.10％三氟酸(TFA)的乙腈溶液线性洗脱。

洗脱条件：A液(0.1％三氟酸)、B液(60％乙腈，40％蒸馏水，0.1％三氟酸)

洗脱时间：100％A为0～2min、0％～80％B为2～15min、80％～0％B为15～20min

流速：3mL/min

检测波长：UV220nm

进样体积：500μL

将血管紧张素转化酶抑制肽冻干，用0.05％三氟酸(TFA)的乙腈溶液溶解，再用RP-HPLC分离，使用ODS柱，收集第三、五和第六吸收峰即抗ACE活性组分利用液相色谱-质谱连用法测定肽的分子量，并用氨基酸序列分析鉴定肽的氨基酸序列，对比已知的有关乳清蛋白的氨基酸序列，进一步验证抗ACE肽的氨基酸序列。

实施例2：

同实施例1，其区别在于：取12kg鲜牛奶经6000rpm×20min离心除去脂肪后得到脱脂乳，所得脱脂乳再用0.10N的稀盐酸调pH值至4.6，6000rpm×20min离心去除酪蛋白沉淀物得乳清溶液。将所得乳清的pH调为7.8，并用截留分子量为10-15KDa的聚砜膜，在压力为1.5MPa，温度为38℃下超滤，以除去乳糖、盐类、水等小分子物质，然后将所得4kg乳清蛋白超滤浓缩液加入酶解反应容器1中，并加入活力为700U/mg的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、2500U/mg的胃蛋白酶、和1600U/mg的胰蛋白酶组成的混合蛋白酶15克，通过保温夹套2和温度控制系统3在41℃下水解2.5小时，并利用搅拌器4不断搅拌，制得乳清蛋白水解液；

将所得的乳清蛋白水解液流入缓冲贮罐5，经泵6的输送通过2KDa的聚砜膜超滤系统7，在压力1.2MPa，温度39℃下进行超滤，超滤后的截留液返回至酶解反应容器1中继续酶解，然后通过上述2KDa的聚砜膜超滤系统7继续超滤，如此循环8次，将所得滤过液通过200-300Da的聚乙烯醇膜纳滤系统8，在压力2.0MPa，温度38℃下进行纳滤，纳滤后的截留液为含抗ACE肽的浓缩液。

实施例3：

同实施例1，其区别在于：取1.2kg乳粉溶于9kg温度为45℃的温水中，经6000rpm×20min离心除去脂肪后得到脱脂乳，所得脱脂乳再用稀盐酸调pH值至4.6，6000rpm×20min离心去除酪蛋白沉淀物，得乳清溶液。将所得乳清的pH调至7.8，并用截留分子量为10-15KDa的聚砜膜，在压力为1.5MPa，温度为39℃下超滤，以除去乳糖、盐类、水等小分子物质，然后将所得0.5kg乳清蛋白超滤浓缩液加入酶解反应容器1中，并加入活力为800U/mg的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、3000U/mg的胃蛋白酶和1800U/mg的胰蛋白酶组成的混合蛋白酶2克，通过保温夹套2和温度控制系统3在41.5℃下水解2.8小时，并利用搅拌器4不断搅拌，制得乳清蛋白水解液；

将所得的乳清蛋白水解液流入缓冲贮罐5，经泵6的输送通过2KDa的聚砜膜超滤系统7，在压力1.3MPa，温度38.5℃下进行超滤，超滤后的截留液返回至酶解反应容器1中继续酶解，然后通过上述2KDa的聚砜膜超滤系统7继续超滤，如此循环10次，将所得滤过液通过200-300Da的聚乙烯醇膜纳滤系统8，在压力2.2MPa，温度39℃下进行纳滤，纳滤后的截留液为含抗ACE肽的浓缩液。

实施例4：

同实施例1，其区别在于：取1.2kg脱脂乳粉溶于9kg温度为45℃的温水中，经5000rpm×20min离心除去脂肪后得到脱脂乳，所得脱脂乳再用稀盐酸调pH值至4.6，6000rpm×20min离心去除酪蛋白沉淀物，得乳清溶液。将所得乳清的pH调至7.5，并用截留分子量为10-15KDa的聚砜膜，在压力为1.0MPa，温度为38℃下超滤，以除去乳糖、盐类、水等小分子物质，然后将所得5kg乳清蛋白超滤浓缩液加入酶解反应容器1中，并加入活力为1000U/mg的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、4000U/mg的胃蛋白酶和2000U/mg的胰蛋白酶组成的混合蛋白酶25克，通过保温夹套2和温度控制系统3在42℃下水解3小时，并利用搅拌器4不断搅拌，制得乳清蛋白水解液；

将所得的乳清蛋白水解液流入缓冲贮罐5，经泵6的输送通过2KDa的聚砜膜超滤系统7，在压力1.0MPa，温度38℃下进行超滤，得超滤后的截留液返回至酶解反应容器1中继续酶解，然后通过上述2KDa的聚砜膜超滤系统7继续超滤，如此循环12次，将所得滤过液通过200-300Da的聚乙烯醇膜纳滤系统8，在压力2.4MPa，温度38.5℃下进行纳滤，纳滤后的截留液为含抗ACE肽的浓缩液。

序列表

<110>宁波大学

<120>一种血管紧张素转化酶的抑制肽及其制备方法

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<400>1

Arg Leu Ser Phe Asn Pro

 1               5

<210>2

<211>2

<212>PRT

<213>Artificial

<400>2

Leu Leu

 1

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial

<400>3

Ala Leu Pro Met His Ile Arg

 1               5

Claims (7)

1.一种血管紧张素转化酶的抑制肽，该抑制肽通过乳清蛋白浓缩，蛋白酶水解后经超滤、纳滤分离纯化再冷冻干燥得到，其特征在于：该抑制肽具有下述的氨基酸序列：

SEQ NO1：Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro，SEQ NO2：Leu-Leu，

SEQ NO3：Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg。

2.权利要求1所述的血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)乳清蛋白浓缩液的制备：将乳清蛋白源料配成乳固体物质量浓度为10％-15％的乳清蛋白水溶液，将乳清蛋白水溶液的pH调为7-8，在压力1.0-1.5MPa，温度38～40℃下，利用200-250KDa的超滤膜进行超滤，滤过液再利用10-15KDa的超滤膜，在压力1.0-1.5MPa，温度38～40℃下进行超滤，所得截留液为乳清蛋白浓缩液；

(2)乳清蛋白水解液的制备：将上述乳清蛋白浓缩液与混合蛋白酶加入到酶解反应容器中进行酶解反应，其中混合蛋白酶的用量为乳清蛋白浓缩液质量的0.002％-0.005％，酶解反应的温度为40～42℃，酶解反应的时间为2～3小时，得到乳清蛋白水解液；

(3)含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液的制备：将上述乳清蛋白水解液通过2KDa的超滤膜，在压力1.0-1.5MPa，温度38～40℃下进行超滤，超滤后的截留液返回至酶解反应容器中继续酶解，然后通过上述2KDa的超滤膜继续超滤，如此循环多次，将所得滤过液通过200-300Da的纳滤膜，在压力2.0-2.5MPa，温度38～40℃下进行纳滤，纳滤后的截留液为含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液；

(4)血管紧张素转化酶抑制肽的制备：将上述含血管紧张素转化酶的抑制肽浓缩液通过凝胶色谱进行分离纯化，220nm下检测肽的出峰位置，收集第3至5个吸收峰间的含血管紧张素转化酶抑制肽的组分，冷冻干燥后将该组分进行反相高压液相色谱分离，220nm下检测肽的出峰位置，收集第三吸收峰、第五吸收峰和第六吸收峰间的含血管紧张素转化酶抑制肽的组分，冷冻干燥，得到血管紧张素转化酶抑制肽。

3.根据权利要求2所述的一种血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的混合蛋白酶包括瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，所述的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶、胃蛋白酶与胰蛋白酶混合后的质量比为2∶1∶1。

4.根据权利要求3所述的一种血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的瑞士乳杆菌胞壁蛋白酶的活性为500～1000U/mg，所述的胃蛋白酶的活性为2000～4000U/mg，所述的胰蛋白酶的活性为1500～2000U/mg。

5.根据权利要求2所述的一种血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的凝胶色谱采用的过滤介质为Sephadex G-15或Sephadex LH-20，用蒸馏水平衡，上样量为1-2％凝胶色谱柱体积，流速20-30mL/h，采用蒸馏水洗脱。

6.根据权利要求2所述的一种血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的超滤膜为聚砜膜，所述的纳滤膜为聚乙烯醇膜。

7.根据权利要求2所述的一种血管紧张素转化酶的抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的乳清蛋白水溶液的质量为乳清蛋白浓缩液质量的2-5倍。

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