CN103242430A

CN103242430A - 血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103242430A
Application number: CN2013102129915A
Authority: CN
Inventors: 刘睿; 吴皓; 朱蕴菡; 程建明; 卞慧敏; 王令充; 王欣之
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: CN103242430B

Abstract

本发明公开了一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用，该抑制肽的氨基酸序列为：Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met。本发明采用现代生化技术手段，对四角蛤蜊中的抑制血管紧张素转化酶的活性成分进行跟踪筛选和评价，通过酶解、超滤、反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到，实验结果表明，该抑制肽具有很好的抑制血管紧张素转化酶的作用，具有很好的抗高血压的功效，并且安全性能好，具有很好的应用前景。

Description

血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种活性多肽，具体涉及一种从四角蛤蜊软体酶解物中分离得到的具有抑制ACE活性的多肽，属于生物医药技术领域。

背景技术

血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)是一种锌离子依赖型的二肽羧基肽酶，广泛存在于哺乳动物组织中，能将血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ)转化血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)，后者为强烈的血管收缩剂，促使血压升高；另一方面，ACE可以使具有血管舒张作用的舒缓激肽(bradykinin) 转化为失活的片段，抑制降压系统——激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin System，KKS)，同样导致血压升高。因此，抑制ACE的活性，可以达到缓解血压增高，具有治疗高血压的作用。

现代研究表明，活性肽与蛋白质及单一氨基酸相比，具有更强的生物活性和营养价值。活性肽专属性强、生物活性高、毒副作用小，易被消化吸收，具有多种功能，作为预防和治疗疾病的医药产品进行研究有着巨大的开发潜力。而食源性的ACE抑制剂控制高血压起效快、作用强、安全性高，目前己经在临床治疗高血压和心血管疾病中发挥了重要的作用。

四角蛤蜊(Mactra veneriformis)属于软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲(Lamellibranchia)，真瓣鳃目(Eulamellibranchia)蛤蜊科(Mactridae)，广泛分布于我国沿海，江苏省每年的产量巨大，约占全国产量的1/3，是江苏沿海的一种大型低值经济贝类。四角蛤蜊肉质鲜嫩、营养丰富，沿海地区百姓多有食用；传统中医理论认为其贝壳和软体部份均可入药，蛤蜊肉咸、冷、无毒，归胃、肝、膀胱经，宋代《嘉祐本草》中关于蛤蜊有记载：“润五脏，止消渴，开胃，解酒毒。现代研究也表明蛤蜊具有抗肿瘤、抗氧化、保护心脑血管等多种生物活性。但是来源于四角蛤蜊中的ACE 抑制肽目前尚无报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是在四角蛤蜊现有研究的基础之上，通过大量实验筛选，采用现代生化技术手段，对四角蛤蜊中的抑制血管紧张素转化酶的活性成分进行跟踪评价，通过超滤、反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到一种血管紧张素转化酶抑制肽，该抑制肽具有很好的抑制血管紧张素转化酶的作用，具有很好的抗高血压的功效。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种血管紧张素转化酶抑制肽，该抑制肽具有下述的氨基酸序列：Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met（亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-苏氨酸-蛋氨酸）。

本发明提供的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其包括以下步骤：

（1）四角蛤蜊酶解物的制备：

将四角蛤蜊软体洗净泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3至8倍量水匀浆后，加入酶酶解，酶的加入重量为肉渣重量的0.01%-2.0%，酶解的温度为37至50 ℃，酶解的pH为 7至9，酶解反应时间为2至6 h；酶解结束后于沸水浴灭活，然后离心，取上清液；

（2）超滤纯化：

取步骤（1）酶解得到的上清液，用0.45 μm微孔滤膜抽滤，抽滤液透过平板膜进行超滤，取分子量小于3k Da的部分，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；

（3）反向色谱分离纯化：

取步骤（2）超滤后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相为；A相：甲醇，B相：体积浓度为0.05%三氟乙酸水溶液，洗脱程序为：0至15分钟，A相甲醇体积由2％－40％洗脱，流速：20 mL/min；柱温：30 ℃，检测波长为220nm，收集保留时间约为5.4min的色谱峰，冷冻干燥，得到氨基酸序列为Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met的血管紧张素转化酶抑制肽。

作为优选方案，以上所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，所述的酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶活性为10000至50000U/g。

作为优选方案，以上所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，所述的酶的加入重量为肉渣重量的1.0%，酶解的温度为48 ℃，酶解的pH为 8.5，酶解反应时间为2.h。本发明通过大量试验筛选最佳的酶解工艺，经过活性跟踪评价结果表明，采用胰蛋白酶作为水解酶，并且加入量为四角蛤蜊肉渣重量的1.0%，酶解的温度为48 ℃，酶解的pH为 8.5，酶解反应时间为2.h时，具有最佳的酶解效果，可以将具有血管紧张素转化酶抑制活性的多肽分解出来，有利于后续进一步纯化得到活性肽，具有很好的技术效果。

本发明所述的血管紧张素转化酶抑制肽在制备防治高血压药物中的应用。

有益效果：本发明提供的血管紧张素转化酶抑制肽和现有技术相比具有以下优点：

本发明通过大量试验对四角蛤蜊中具有抑制血管紧张素转化酶活性的多肽成分进行跟踪筛选，通过优选工艺的酶解，超滤和反相高效液相色谱分离纯化方法，获得具有很好的抑制血管紧张素转化酶活性的多肽。并且本发明对活性多肽进行氨基酸序列分析，确定氨基酸序列为Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met。本发明工艺设计合理，可操作性强，为低值贝类开发新的临床用途，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的血管紧张素转化酶抑制肽的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其包括以下步骤：

（1）四角蛤蜊酶解物的制备：

将四角蛤蜊软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次45分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3量水匀浆后，加入酶活性为30000U/g的胰蛋白酶酶解，胰蛋白酶的加入重量为肉渣重量的1.0%，酶解的温度为48 ℃，酶解的pH为 8.50，酶解反应时间为2 h；酶解结束后于沸水浴灭活15 min，然后于10000 rpm，4 ℃离心20 min，取上清液；

（2）超滤纯化：

（3）反向色谱分离纯化：

取步骤（2）超滤后的冻干粉以甲醇溶解，通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统分离纯化分离，流动相为；A相：甲醇，B相：体积浓度为0.05%三氟乙酸水溶液，洗脱程序为：0至15分钟，A相甲醇体积由2％－40％洗脱，，流速：20 mL/min；柱温：30 ℃，检测波长为220nm，收集保留时间约为5.4min的色谱峰，冷冻干燥，得到血管紧张素转化酶抑制肽。

实施例2 血管紧张素转化酶抑制肽的序列分析

取实施例1制备得到的血管紧张素转化酶抑制肽，采用ESI-Q TOF MS/MS分析多肽的氨基酸序列，质谱条件为：ESI源，扫描方式：正离子模式，质量扫描范围：50～1000 m/z；分析得到活性多肽分子量为619.42 Da，质谱检测图如图1所示，测定得到氨基酸序列为：Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met。

实施例3 血管紧张素转化酶抑制肽的合成

根据实施例2获得的氨基酸序列，采用固相合成的方法，合成血管紧张素转化酶抑制肽Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met，合成后的多肽通过HPLC分析纯度为98%，质谱测定分子量为619.46 Da,与纯化多肽分子量一致，二级质谱碎片与纯化多肽碎片一致。

实施例4 血管紧张素转化酶抑制肽活性测试

本发明采用高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制活性，具体步骤如下：取实施例1和实施例3分别制备得到的抑制肽溶于0.1 mol/L硼酸缓冲液(含0.3 mol/L NaCl，pH 8.3)制成相应的样品液。血管紧张素转化酶（ACE）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）分别用0.1 mol/L硼酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl，pH 8.3)配成100 mU/mL ACE溶液和5 mmol/L HHL溶液。将30 μL HHL和10 μL样品(或缓冲溶液)混匀后，于37 ℃保温5 min，再加入20 μL的ACE启动反应，混匀后继续于37 ℃下反应1 h，迅速加入70 μL HCl(1 mol/L)终止反应，用高效液相色谱分析结果。同时用硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对照。

色谱条件：Xbridge-C₁₈柱(4.6×250 mm，5 μm，美国Waters公司)；流动相：甲醇-0.05%三氟乙酸水溶液，流速：1.0 mL/min；检测波长：228 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。梯度条件：甲醇25%～70%(0～30 min)。

ACE抑制率(%)=[1-(Ai/Aj)] ×100

式中：Ai为样品组马尿酸峰面积，Aj为空白组的马尿酸峰面积。

测定得到本发明实施例1和实施例3制备得到的血管紧张素转化酶抑制肽Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met的体外ACE抑制IC₅₀均为59.81μM，显示出了很好的活性。

本发明从四角蛤蜊中提取纯化制备得到具有血管紧张素转化酶抑制活性的多肽，具有很好的抗高血压活性，并且安全性能高，具有广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京中医药大学

<120> 血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ala Ser Pro Thr Met

1 5

Claims

1.一种血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于，该抑制肽具有下述的氨基酸序列：Leu-Ala-Ser-Pro-Thr-Met。

2.权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）四角蛤蜊酶解物的制备：

（2）超滤纯化：

（3）反向色谱分离纯化：

取步骤（2）超滤后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相为；A相：甲醇，B相：体积浓度为0.05%三氟乙酸水溶液，洗脱程序为：0至15分钟，A相甲醇体积由2％至40％洗脱，流速：20mL/min；柱温：30 ℃，检测波长为220nm，收集保留时间约为5.4min的色谱峰，冷冻干燥，得到血管紧张素转化酶抑制肽。

3.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，所述的酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶活性为10000至50000U/g。

4.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，所述的酶的加入重量为肉渣重量的1.0%，酶解的温度为48 ℃，酶解的pH为 8.5，酶解反应时间为2h。

5.权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽在制备防治高血压药物中的应用。