CN112646003B - 一种方格星虫ace抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用,属于生物技术领域。本发明通过单因素实验和正交实验,确定了酶解方格星虫的最佳工艺参数为复合酶粉(胰酶‑中性蛋白酶=3:1)、料液比为1∶10、酶与底物质量比1%、酶解pH 9.5、酶解温度为45℃、酶解时间4h,酶解产物通过金属螯合色谱柱层析分离纯化,利用高效液相色谱‑串联质谱鉴定得到三条多肽氨基酸序列,利用得到的ACE抑制肽制备得到了方格星虫降压肽口含片。本发明提供了新的方格星虫降压肽,确定了最佳的制备工艺,为进一步制备具有降血压作用的药物打下了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用。
背景技术
随着我国经济的发展,人民的生活水平不断提升,我国高血压患病人数也在不断增加。据估测2020年我国高血压患者人数可能超过3亿人。现有降压药多是人工合成的化学药物,其在临床应用过程中易产生多种副作用,且生产成本较高。因此成本低廉、安全性高、降压效果好的生物降压肽成为了近年来的研究重点。
由于海洋生态环境的特殊性(如高压、低温等),海洋生物源蛋白质具有多种特异性氨基酸的组成和序列以及低抗原性的特点,安全性高,无毒副作用。因此海洋生物源蛋白质是制备生物肽的重要药源。方格星虫(Sipunculus nudus),又称光裸星虫、沙蚕等,主要分布在大西洋、太平洋以及我国的广东、广西、海南和福建沿海。《中华本草》中记载星虫具有降血压的作用。
血管紧张素转化酶抑制肽(angiotensin converting enzymeinhibitorypeptides)是一种对ACE活性具有抑制作用的多肽类物质,一般由2~20个氨基酸残基组成,一般是由蛋白质酶解而得,其通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)的活性,阻碍血管紧张素Ⅱ的生成以及抑制血管舒缓激肽的分解而达到降血压的作用。ACE抑制肽的活性,取决于多肽的氨基酸种类、序列及其空间结构,其均会被酶解工艺参数影响。因此在生物肽的制备过程中,酶解工艺参数的确定以及后期的筛选及分离纯化成为技术的关键所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用,以解决上述现有技术存在的问题,提供具有良好降压效果的方格星虫ACE抑制肽,并确定最佳的酶解工艺参数和筛选分离纯化技术。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种方格星虫ACE抑制肽组合物,所述的方格星虫ACE抑制肽组合物包括如下的一种或多种多肽:
1)如SEQ ID NO.1所示的多肽;
2)如SEQ ID NO.2所示的多肽;
3)如SEQ ID NO.3所示的多肽。
本发明还提供所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
1)酶解提取:将绞碎的方格星虫加纯水混匀后,加入以纯水溶解成浆的复合酶粉,45℃,酶解4-6h,之后95℃灭酶5min,离心去除沉淀,上清液进行超滤透析,截取100kDa的超滤液;所述复合酶粉为胰蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1配成;酶粉浆加入量为方格星虫重量的0.5%-1%;
2)纯化:聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质进行色谱柱层析,上样缓冲液为内含0.5mol/L氯化钠的pH6.8磷酸钠缓冲液,洗脱缓冲液为pH5.0柠檬酸缓冲液,收集三段色谱峰得到纯化的小分子肽,即为方格星虫ACE抑制肽组合物。
优选的,步骤1)中,绞碎的方格星虫与纯水的料液比为1:10-1:15。
优选的,步骤1)中,绞碎的方格星虫与纯水混匀后,用1%的氢氧化钠溶液调节pH为7.5。
优选的,步骤1)中,酶粉浆加入量为方格星虫重量的1%。
优选的,所述步骤2)中的聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质为聚乙二醇修饰铜离子螯合琼脂糖。
本发明还提供所述的方格星虫ACE抑制肽组合物在制备降血压的药物中的应用。
本发明还提供一种降压肽口含片,所述的降压肽口含片配方为:按质量份数计,权利要求1所述的方格星虫ACE抑制肽组合物10-15%,辅料35-50%,甜味剂15-20%,酸味剂5-10%。
本发明还提供所述的降压肽口含片的制备方法,将主料、辅料和食品添加剂混合,向混合物缓慢喷洒50%-70%乙醇作为润湿剂,同时不断搅拌均匀,制成软硬适中的软料;以18目筛作为制颗粒的工具,压过18目筛,使软料变成颗粒状制备软材,之后将颗粒状制备软材压片,置于50-60℃干燥1-2小时直到含水量2-4wt%,得到所述降压肽口含片。
优选的,压片时颗粒状制备软材中加入1-1.5wt%的硬脂酸镁作为润滑剂。
本发明公开了以下技术效果:
(1)ACE抑制肽的活性,取决于多肽的氨基酸种类、序列及其空间结构,在酶解过程中,蛋白质大分子首先被蛋白酶切割成多肽片段,随着酶解程度加深,多肽被进一步酶解切割形成游离氨基酸。因此,控制好酶解工艺参数(包括酶的种类、用量、pH值、温度、酶解时间),可控制切割位点及酶解程度,这对于多肽片段的大小及结构具有决定作用。在方格星虫匀浆液的酶解过程中,若酶解不足,则星虫蛋白以大分子状态存在,不能切割得到具有ACE抑制活性的肽段,若酶解过度,则肽段被进一步切割形成游离氨基酸,不具有活性结构,从而失去了ACE抑制活性。本工艺经过大量实验,确定的酶解工艺参数具有良好的酶解效果,能得到高活性的ACE抑制肽。
(2)酶解液经超滤脱盐后,使用截留分子量100KDa的超滤膜,获得分子量小于100KDa的组分,该组分活性较高,经小试分离得到序列肽段为9肽-11肽,分子量约1KDa,酶解液中大量残留的部分大分子蛋白难以去除,影响活性多肽的纯度。常规的凝胶排阻色谱可根据分子量纯化蛋白质及多肽,但耗时长、处理量小,限制了工业化应用。固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术以其对蛋白质吸附容量大,易洗脱,易再生等优点,可有效应用于蛋白质或小分子肽的分离纯化。在表面接枝长链结构的聚乙二醇(PEG)可以使介质具备对大分子的体积排阻功能,因此,选择IMAC分离活性小分子肽时,可通过在介质表面修饰PEG减少非目标大分子吸附,以提高对目标小分子的分离效果。利用PEG形成半渗透屏障制备的新型限进介质能够在有效的抑制大分子蛋白吸附的同时提高对小分子肽的选择性吸附。本发明选择在混合体系中具有一定的限进作用的聚乙二醇单甲醚-5000(mPEG5000)修饰的IMAC介质,成功从复杂的生物体系中分离出低浓度的活性小分子肽。
(3)本发明提供的口含片制备工艺简单,适于人体吸收,能够起到较好的降压作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为方格星虫水解肽色谱图;
图2为方格星虫降压肽FNVINGGSH的序列鉴定图;
图3为方格星虫降压肽GLGGLSPEK的序列鉴定图;
图4为方格星虫降压肽AGGLASGPGRP的序列鉴定图;
图5是本发明制备的三种方格星虫降压肽的ACE抑制率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明所使用的材料、试剂及实验仪器,如无特殊说明,均可由商业途径获得。
实施例1
1、方格星虫ACE抑制肽的制备及纯化
(1)新鲜方格星虫翻面去除内脏,洗净,称取500g,斩拌机绞碎;加入纯水5L,混匀,用1%的氢氧化钠溶液调节pH为7.5-9.5;适量酶粉(胰蛋白酶-中性蛋白酶=3:1,w/w)加纯水溶解成浆,制成酶粉浆;将酶按照方格星虫重量的0.5%-1%缓慢加入方格星虫液中,边加边搅拌混匀,设置温度为45℃,酶解4-6h;
以pH为7.5,加酶量为方格星虫质量的1%,酶解时间为4h为基础,酶解产物的ACE抑制率为指标进行单因素实验,每次改变一个参数,研究了pH为7.5、8.5、9.5,加酶量为方格星虫质量的0.5%、0.8%、1%,酶解时间为4h、5h、6h对酶解结果的影响,并通过正交实验确定最佳酶解参数为复合酶粉(胰酶-中性蛋白酶=3:1)、料液比为1∶10、加酶量为方格星虫质量的1%、酶解pH 9.5、酶解温度为45℃、酶解时间4h,此时ACE抑制率约为85%。
(2)酶解完毕升温至95度保温5min灭酶;使用低温高速离心机进行离心处理(离心参数为9000rpm,4℃离心30min),固液分离,弃去沉淀,上清备用。将离心的上清液过100kD超滤膜,截取10w以内的酶解液,冷冻干燥获得样品。
(3)将保存的聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质(聚乙二醇修饰铜离子螯合琼脂糖Chelating Sepharose Fast Flow,mPEG-CSFF-Cu),采用自然沉降法装柱,柱体积为200ml,用蒸馏水洗脱以除去未结合的金属离子,然后用PH6.8的磷酸钠(内含0.5mol/L氯化钠)缓冲液洗脱至平衡,冻干蛋白粉用缓冲液溶解后上样。
(4)上样缓冲液为PH6.8磷酸钠(内含0.5mol/L氯化钠)缓冲液,洗脱缓冲液为PH5.0柠檬酸缓冲液。收集洗脱下来的小分子肽即为纯化的方格星虫降压肽。
(5)经金属螯合色谱柱层析,收集三段色谱峰(图1)得到纯化小分子肽,高效液相色谱-串联质谱鉴定得到多肽,氨基酸序列分别为Ⅰ:FNVINGGSH(SEQ ID NO.1,图2);Ⅱ:GLGGLSPEK(SEQ ID NO.2,图3);Ⅲ:AGGLASGPGRP(SEQ ID NO.3,图4)。
(6)小分子肽液经透析脱盐浓缩,真空冻干,保存备用即得方格星虫降压肽。
2、多肽降压效果的确认
2.1实验方法
将ACE溶于硼酸缓冲液中至终浓度为0.1U/mL以便用于后续实验测定。将冻干所得样品溶解在去离子水中,浓度为10mmol/L;然后将180μL马尿酰-组氨酰-亮氨(HHL)溶液与30μL一定浓度的肽溶液混合,将混合物在37℃下孵育5分钟,随后将15μL、0.1U/mLACE添加到上述混合物中以启动反应。将反应在37℃保持60分钟,然后添加225μL的1M HCl以终止反应。将反应液用0.22μm滤膜过滤,用针管抽取20μL过滤后的反应液加载到RP-HPLC中,并在228nm处检测其吸光度。所有测定均重复三次,取其平均值作为多肽的ACE抑制率平均。
ACE活性计算如下:
其中,AInhibitor是ACE和HHL与抑制剂(ACEI)反应得到的马尿酸(HA)峰的相对面积。AControl是无抑制剂的ACE和HHL的反应所得的马尿酸(HA)峰的相对面积。
2.2实验结果
三种方格星虫降压肽的ACE抑制率如图5所示,其中多肽Ⅰ的ACE抑制率为84.78%,多肽Ⅱ的ACE抑制率为88.61%,多肽Ⅲ的ACE抑制率为85.12%。可见本发明制备的三种方格星虫降压肽均具有较高的ACE抑制率,能够有效抑制ACE活性。
实施例2
方格星虫降压肽口含片的制备
1配方
主料:方格星虫降压肽10-30%
辅料:乳糖粉、麦芽糊精、微晶纤维素中的一种或多种,25-45%
甜味剂:麦芽糖醇、山梨糖醇、蔗糖、木糖醇中的一种或多种,15-28%
酸味剂:柠檬酸、苹果酸、乳酸中的一种或多种,5-10%
2制法
将主料、辅料、甜味剂和酸味剂混合,向混合物缓慢喷洒50%-70%乙醇作为润湿剂,同时不断搅拌均匀,制成软硬适中的软料。以18目筛作为制颗粒的工具,压过18目筛,使软料变成颗粒状制备软材。软材要求握之成团、触之即散。软材压片干燥后即得方格星虫降压肽咀嚼片。
乙醇作为润湿剂,干燥后挥发,不在最终产品中。乙醇水溶液中乙醇浓度低水多,则干燥后颗粒易结块开裂、乙醇浓度高水少,则干燥后颗粒松散。优选的干燥温度是软材置于50-60℃干燥1-2小时,含水量2-4wt%。压片时加入1-1.5wt%的硬脂酸镁作为润滑剂涂于压片机器表面,防止粘连。。
方格星虫降压肽咀嚼片(无味)的最佳工艺配方为:方格星虫肽添加量为94g,65%的乙醇35mL,150g麦芽糊精、4g微晶纤维素为辅料,2%硬脂酸镁为润滑剂;
方格星虫降压肽咀嚼片(酸甜口味)的最佳工艺配方为:方格星虫肽添加量为180g,55%的乙醇160mL,200g麦芽糊精、12g微晶纤维素、122g乳糖粉为辅料,6g山梨糖醇,3g苹果酸为矫味剂,2%硬脂酸镁为润滑剂。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广东湛江海洋医药研究院
<120> 一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Leu Gly Gly Leu Ser Pro Glu Lys
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Gly Gly Leu Ala Ser Gly Pro Gly Arg Pro
1 5 10
Claims (10)
1.一种方格星虫ACE抑制肽组合物,其特征在于,所述的方格星虫ACE抑制肽组合物包括如下的一种或多种多肽:
1)如SEQ ID NO.1所示的多肽;
2)如SEQ ID NO.2所示的多肽;
3)如SEQ ID NO.3所示的多肽。
2.一种权利要求1所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
1)酶解提取:将绞碎的方格星虫加纯水混匀后,加入以纯水溶解成浆的复合酶粉,45℃,酶解4-6h,之后95℃灭酶5min,离心去除沉淀,上清液进行超滤透析,截取100kDa的超滤液;所述复合酶粉为胰蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1配成;酶与底物质量比为方格星虫重量的0.5%-1%;
2)纯化:聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质进行色谱柱层析,上样缓冲液为内含0.5mol/L氯化钠的pH6.8磷酸钠缓冲液,洗脱缓冲液为pH5.0柠檬酸缓冲液,收集三段色谱峰得到纯化的小分子肽,即为方格星虫ACE抑制肽组合物。
3.根据权利要求2所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法,其特征在于,步骤1)中,绞碎的方格星虫与纯水的料液比为1:10-1:15。
4.根据权利要求2所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法,其特征在于,步骤1)中,绞碎的方格星虫与纯水混匀后,用1%的氢氧化钠溶液调节pH为7.5。
5.根据权利要求2所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法,其特征在于,步骤1)中,酶粉浆加入量为方格星虫重量的1%。
6.根据权利要求2所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中的聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质为聚乙二醇修饰铜离子螯合琼脂糖。
7.一种权利要求1所述的方格星虫ACE抑制肽组合物在制备降血压的药物中的应用。
8.一种降压肽口含片,其特征在于,所述的降压肽口含片配方为:按质量份数计,包括权利要求1所述的方格星虫ACE抑制肽组合物10-30%,辅料25-45%,甜味剂15-28%,酸味剂5-10%。
9.一种权利要求8所述的降压肽口含片的制备方法,其特征在于,将主料、辅料和食品添加剂混合,向混合物缓慢喷洒50%-70%乙醇作为润湿剂,同时不断搅拌均匀,制成软硬适中的软料;以18目筛作为制颗粒的工具,压过18目筛,使软料变成颗粒状制备软材,之后将颗粒状制备软材压片,置于50-60℃干燥1-2小时直到含水量2-4wt%,得到所述降压肽口含片。
10.根据权利要求9所述的降压肽口含片,其特征在于,压片时颗粒状制备软材中加入1-1.5wt%的硬脂酸镁作为润滑剂。
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