SU1012786A3 - Способ получени протеинового комплекса,стимулирующего секрецию инсулина - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА, заключающийс  в том, что патогенные штаммы микроорганизмов , относ вциес  к виду BordeteEKa pertussis, в 1-ой фазе культивируют в жидкой питательной среде при встр хивании , полученную культуральную жидкость прогревают, отдел ют надосадочную жидкость, пропускают ее через колонку, элюируют целевой продукт фосфатным буфером с 0,5 М NaC8 рН 7,0, полученный элюат концентрируют , очищают и раздел ют протеиновый комплекс методом ступенчатой хроматографии на компоненты КС-1 с мол.вес. 63000+5200, KC-1I с мол.вес. 31000±4500 и/или КС-111 с мол.вес. 12500+1500..

Description

ю

ас сх Изобретение относитс  к микробиологии и касаетс  получени  прот нового комплекса, который может бы использован в медицине, при лечени и предотвращении различных видов диабетов. Цель изобретени  - получение пр теинового комплекса, стимулирующег . секрецию инсулина. Цель достигаетс  тем, что спосо получени  протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, заключаетс  в том, что патогенные штаммы микроорганизмов, относ щиес к виду Bordete eа pertussis, в 1-о фазе культивируют в жидкой питательной среде при встр хивании, получе ную культуральную жидкость прогревают , отдел ют надосадочную жидкос пропускают ее через колонку, элюир целевой продукт фосфатным буфером 0,5м NaCe рН 7,0, полученный элюа концентрируют, очищают и раздел ют протеиновый комплекс методом ступе чатой хроматографии на компоненты КС-1 с мол. вес. 63000+5200, КС-1Г с мол. вес. 31000+4500 и/или КС-Ш с мол.вес. 12500+1500. Протеиновый комплекс, стимулирую щий секрецию инсулина,  вл етс  белковым веществом, которое может быть получено при культивировании, микроорганизмов, принадлежащих к ми роорганизмам BordeteCCa pertussis, которые  вл ютс  патогенными бактери ми например, бациллы коклюша, паракоклюша и бронхиальной -септице мии), причем наиболее предпочтитель ными  вл ютс  BordeteEGa pertussis первой стадии. Способность патогенных микроорганизмов вида BordeteCpa pertussis по продукции протеинового комплекса приведена Е табл. 1. Таблица Штаммы Относительный выход Патогенные Мае по (контрольный) Tohama 3379 В 18-323 7341 Непатогенные Sakairi Miyazaki Вьщеление и очистку протеинового ; комплекса из культуры осуществл ют с помощью известных способов, например осаждени ,.хроматографического метода, метода с использованием молекул рных .сит, электрофоретического и биологического методов, причем с использованием либо каждого в отдельности , либо в соответствующих сочетани х .5 Способ с использованием хроматографической колонки  вл етс  удобным дл  выделени  и очистки комплекса, при этом надорадочную жидкость культуральной среды,пропускают через колонку, заполненную такими носител ми , как гидроксиапатит, СМ-сефароза , Coh А-сефароза 4 В или РАМАсефароза 6МВ. Протеиновый комплекс адсорбируетс  в колонке, а затем элюируетс  из нее подход щим элюирующим веществом, например буфером 0,1 М фосфата (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCC. Очищенный продукт подвергают диализу, чтобы избавитьс  от ненужных солей, после чего получают чистый протеиновый комплекс. Комплекс присутствует также в культивируемых клетках бактерий, при необходимости его выдел ют, добавл   NaCt к суспензии дл  выцелачивани  комплекса в раствор. Дл  получени  протеинового комплекса можно использовать метод осаждени  сульфатом аммони , в этом случае твердый сульфат аммони  добавл ют к надосадочной жидкости культуры до точки, приближающейс  к растворимости насыщени , и устанавливают рН 6-7 разбавленной аммиачной водой. Затем осадок промывают водой, а комплекс экстрагируют из 0,1 М трисбуфера (рН 8), содержащего 0,5 М NaCf. Порошок протеинового комплекса, полученного сушкой при температуре ниже точки замерзани , после обессоливани  не расплываетс  на влажном воздухе, белого или светло-коричневого цвета, раствор етс  в воде при комнатной температуре в концентраци х о 3-5 мг/мл. Если его поместить в 6 н.НСЕ, то он образует нераствориый белый осадок. Раствор етс  в пиидине , додецилсульфате натри , мераптоэтаноле и растворе цистина. При обавлении смеси сухого льда с ацеоном или этанолом, трихлоруксусной ислоты или раствора хлористого цина или раствора, содержащего некотоые другие типы ионов металлов, к аствору очищенного активного материаа в охлажденном состо нии () поучают мутно-белый осадок. Если ротеиновый комплекс помещают в смеанный раствор воды и хлороформа или -бутанола, то он становитс  нерастворимым и собираетс  около поверхости раздела обеих жидкостей. Если водный раствор протеиновогб комплекса нагревать до или выш он становитс  мутно-белым. Таким же образом, если этот комплекс растворить в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,5 М NaC, а затем подвергнуть диализу, использу в качестве внешней жидкости дистиллированную воду, комплекс постепенн становитс  мутно-белым, однако при продолжении диализа комплекс снова раствор етс  н бела  муть исчезает. Если раствор с высокой концентрацие подвергнуть тщательному диализу с использованием 0,01 М ацетатного бу фера (рН 4,5), то комплекс может пр н ть светло-коричневую окраску и растворитьс . Молекул рный вес протеинового комплекса 77000+6400. Содержание белка более 95 вес.%, а содержание глюцида приблизительно 1%, концентраци  липидов меньше нижнего предел определени . Композиционное отношение мкМ/100 16-или 24-часовой гидролиз при ИО в 6 н.нее, Аспаргинова  кислота 7,5-7,9, треонин 6,8-7,6, серин 5,9 7,6, глутаминова  кислота 9,7-10,8, пролнн 5,5-6,4, глицин 8,7-9,6, аланин 9,1-10,8, цистин 1,5-2,6, ва лин 5,6-6,6, метионин 2,5г-3,3, изолейцин 3,6-4,1, лейцин 7,5-8,0, тирозин 5,1-6,6, фенилаланин-3,33 ,9, лизин 3,1-4,4, гистидин 1,41 ,6, аргинин 6,1-6,6. Протеиновый комплекс оказывает стимулирующее действие на секрецию инсулина, это действие длитс  от нескольких недель до нескольких мес цев после введени  единичной дозы Остра  токсичность LDj составл ет 200 мкг/кг живого веса дл  мьлией шт ма ddy. Протеиновый комплекс раздел. ют на три компонента с Помощью хромато рафии н-а колонке в присутствии известных среДств дл  .денатурации бел ков , таких как 8 М мочевина и 6 М хлоргидрат гуанидина. Гель-фильтраци  в присутствии 8 М мбчевинн предусматривает раство рение протеинового комплекса в 0,1 фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 8 М мочевины и О,.5 М ЫаСВ, зате полученную смесь подверггиот гельфильтрации на колонке, заполненной Сефакрил S-200, наход щимс  в равно весии с указанным буфером. В резуль тате протеиновый комплекс раздел ют на три компонента с различным молекул рным весом (KC-I с мол.вес. 63000t5200, KC-1I с мол. вес.31000+ 4500 и KC-I11 с мол.вес. 12500+ 1500), и дополнительна  гель-фильтраци  на той же колонке приводит к тому, что эти компоненты при дисковом электрофорезе выход т как отдельные вещества. Другим способом вьщелени  и очистки комплекса может быть хроматографирование на колонке с ДЕАЕ-цеЛлюлозрй , при этом протеиновый комплекс раствор ют в 0,01 М фосфатном буфере (рН 8,0) , содержащем 8 М мочевины, затем пропускают через колонку с целлюлозой ДЕЛЕ, уравновешенной тем же сакшм буфером. Соответственно, KC-I и KC-II адсорбируютс  на этой колонке, KC-1II не адсорбируетс , а протекает вниз, КС-1 элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины, а KC-II элюируют 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0) . Эти компоненты при дисковом электрофорезе про вл ютс  как отдельные вещества после гель-фильтрации через колонку с Сефакрилом S-200, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором, содержсццим, 4 М мочевины и 0,5 М хлористого натри . Полученные тажим образом компоненты КС-Г, КС-11 и KC-I11 облгщают более , низкой стимулирующей активностью секреции инсулина, чем исходный протеиновый комплекс. При некоторых услови х разделени  протеиноЕОго комплекса на составл ющие его компоненты каждый из компонентов можно разделить далее на более мелкие белковые фрагменты. Например , разделение протеинового комплекса с использованием 0,1 М фосфатного буферного раствора, содержащего 4 М мочевины, 1% 2-меркаптоэтанбПа и 0,5 М NaC с последукнцей гельфильтрсщией через колонку с сефакрилом S-200, Уравновешенным указанным буферным раствором, приводит к получению 5 белковых фрагментов, которые содержат два дополнительных компонента вдобавок к трем компонентам. В отдельности вещества КС-1, КС-11, КС-Ill обладают недостаточной активностью стимулирующей секреции, но их соединение в определенные группы, например, КС-1 и КС-111, КС-11 и КС-1II и КС-1 и КС-Ill приводит к высокой активности, а сочетание КС-1 и КС-11  вл етс  неактивным. Когда компоненты КС-1 и КС-111, КС-11 и КС-111, КС-1, КС-11 и KC-ill и КС-1 и КС-11 взаимодействуют в определенном буферном растворе, они образуют отдельные белковые ассоциированные соединени , которые названы ассоциированными веществами КСА-1, KQA-1I, KCA-lIi и КСА-1У соответственно. Белковые ассоциированные вещества получают следующим образом. Смешивают соответствующие сочетани  элементарных веществ, вз тых в соотношени х КС-1: КС-11 5:1 в случае КСА-1, КС-11: КС-1 II 2:1 в случае КСА-11; КС-1:КС-11:КС:111 5:2:2 в случае КСА-111, и КС-1:КС-11 2:1 в случае КСА-1У (вде соотношени  по весу белка) , в ОД М фосфатном буфе ном растворе (рН 7,0) , содержащем 2 М мочевины и 0,5 М хлористого нат ри , затем встр хивают в течение 24 ч при 37°С, при этом вещества в соответствующих комбинаци х взаимодействуют друг с другом. Потом эти смешанные растворы концентрируют и подвергают гель-фильтрации на колон ке с сефакрилом S-200, уравновешенны 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 2 М мочевины и 0,5 М хлористого натри , или ионооб менному хроматографическому разделе нию ассоциированных и неассоциированных элементарных веществ, получив при этом отдельные ассоциированные вещества КСА-1, КСА-11, КСА-111 и КСА-1У соответственно. Выходы ассоциированных продуктов сильно измен ютс  в зависимости от условий обработки и температуры,рН, времени, плотности и ионных сил. Обнаружено также, что новые белковые ассоциированные вещества, хот  практически равны по основной активности протеинового комплекса, обладгиот менее 1/50 лейкоцитозной активности менее 1/10 активности повышени  чувствительности к гистамину, менее 1/25 актигенности и менее 1/3 велйчи ны LDjQ по сравнению с соответствующими значени ми дл  протеинового комплекса. Свойства и растворимость элементарных и ассоциированных веществ. Тонкойзмельченные.порошки всех обессоленных и высушенных при температуре ниже точки замерзани  элементарных и ассоциированных веществ  вл ютс  порошками, кчэторые не расплываютс  на влажном воздухе (из-за гигроскопичности). КС-111, КСА-11 и KCA-II1 растворимы в воде в количествах до 1 мг/мл при комнатной температуре, тогда как другие плохо раствор ютс  в воде, но раствор ютс  до 4 мг/мл в 0,1 М фосфатном буферном растворе, содержащем 4 М мочевины и О,5 М NaCG. Водные растворы указанных веществ станов тс  мутно-белыми и образуют Осадок, когда к ним добавл ют суль1фат аммони , сухой лед с ацетоном, этанол. Трихлоруксусную кислоту или ансшогичные соединени  при 4с. Каждое из веществ, помещенное в смешанный раствор воды и хлороформа ил  и-бутанола, собираетс  вокруг поверхности раздела жидкостей. Молекул рный вес соответствующих элементарных веществ, определенных гель-Фильтрацией на колонке (1,5х 95 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенным 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины и 0,5 М Nace, следующий: КС-1,63000+5200; KC-I1 31000±4500г КС-111 12500+1500. Молекул рный вес соответствующих ассоциированных веществ, как было определено с помощью колонки (1,5х 95 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенным 0,1.М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержгицим 4 М мочевины и 0,5 М NaCe, следующий: КСА-1 75000+8500; КСА-И 35000+4500 КСА-И1 85000± 13000, КСА-1У 88000+6300. Изоэлектрические точки рН соответствующих веществ, измеренные при помощи методики электрофокусировки акриламидного гел , следующие: КС-1 5,6+0,3; КС-11 5,4+0,4; КС-111 8,3+0,3; КСА-1, 6,8±0,4; КСА-11 6,3 0,зТ КСА-111 8,2±0,5; КСА-1У 5,6+0,4. В табл. 2 представлены составы протеинового комплекса. Таблица 2 Состав аминокислот белковой составл ющей и процентное содержание композиции (мкМ/100 мкМ) приведены в табл. 3. Таблица 3

:Аспарагинова  кислота (Асп)8,1

Треонин (Тр)8,5

9,3

5,3 7,7 4,8

Серии (Сер) Глутаминова  кислота

Пример 1. Получение и очистка протеинового комплекса.

Высушенные при температуре ниже точки измерени  и хранившиес  бактерии BordetefEа pertussis штамм МаеЪо 1 фазы культивируют а чашках в среде Bordet-gengon при 2 дн  потом платиновую петлю с культурой указанной бактерии инокулируют во встр хиваемую колбу емкостью 500 мл, в которой было 200 мл ионообменной смолы, с добавкой модифицированной, среды Cohen Wheeler (CW-среда), состав которой указан в табл. 4, а да-. тем встр хивают эту культуру 20-22 ч при 37°С. Концентрацию бактерий в растворе культ-урн определ ют с помощью спектрофотометра (длина волны 650 нм), и этот раствор добавл ют в двухлитровую встр хиваемую колбу, в которую ввод т 1 л ионообменной смолы с добавкой CW-сре ы, таким образом, что окончательна  концентраци  бактерий приблизительно 0,1х . 10 клеток/мл, после чего встр хивание ку Тьтуры продолжают 48 ч (частот |встр хиваний 97 раз/мин при . Микологические свойства вь иеуказанного штамма соответству рт данным дл  штамма бактерий коклюша 1 стадии

Продолжение табл. 3

9,8

7/9

6,2

Таблица 4

|1ервичный кислый фосфонокислый калий, г

Растворимый крахмсШ, г

0,5%-ный раствор сульфата меди, мл

1%-ный раствор хлористого кальци , мл

4%-ный раствор хлористого магни , мл

Полипептон, г

1%-ный раствор цистина , мл Продолжёние табл. 4 0,5%-ный раствор сульфата железа, мл Хлористый натрий, г При использовании мадифицированной жидкой среды ее добавл ют с дистиллированной водой, довед  полн количество до 1000 мл и после установлени  рН 7,2 20%-ным раствором NaOH к раствору среды добавл ют еще 3 г анионообменной смолы (Diaion SA-20 АР, Mit-subishi Kasei Co.), а затем подвергают стерилизации паром высокого давлени  при 15 мин. Полученный в результате 48-часового встр хивани  раствор культуры нагревают при 5б°С 30 мин, а затем центрифугируют (15000 об/мин) при 4°с дл  того, чтобы разделить нгщоса дочную жидкость и клетки бактерий. Полученную таким образом надосадочную жидкость из раствора культуры используют в качестве исходного мате риала дл  очистки и вьще.рени  целевого протеинового ко14плекса. 10 л полученной таким образом надосадочной жидкости после установлени  рН 6,0 с помощью 1 н, нес пропускают через колонку (2,5x4 см), за полненную оксиапатитом при скорости потока 200 мл/ч в качестве первой стадии очистки. Больша  часть белка проходит через колонку, не абсорбиру сь на ней Концентраци  белка, определенна  по методу Лоури, приведена в табл. 5 Дл  определени  абсорбированного вещества колонку промывают вначале 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0), а затем, после повышени  мол рной концентрации фосфатного буферного раствора до 0,1 при рН 7,0, абсорбированные белки эффективно элюируют из колонки. Однако при этих услови х протеиновый комплекс из колонки не был элюирован. Поэтому провод т дополнительное элюирование фосфатным буферным раствором той же композиции, но содержащи.м 0,5 М NaCC В этих услови х целевой протеиновый комплекс удаетс  вьщелить с высокой степенью активности в соответствии с элюированным белком. Полученный таким образом протеино вый комплекс концентрируют и после помещени  его в мембрану дл  диализа с максимальной проницаемостью дл  мол. веса 8000, дважды подвергают диализу (в течение 12 ч) с дистилли-i рованной водой и дважды (в течение 12 ч) с 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Дл  дгшьнейшей очистки раствор, содержащий протеинбвый комплекс, пропускают через колонку (1,5x10 см), заполненную карбоксиметилсефаровой С8-6В, уравновешенной 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Материал, который не был абсорбирован в этой колонке , не обладает активностью. После повышени  мол рной концентрации к рН фосфатного буферного раствора до величин 0,1 и 7,0 соответственно провод т аналогичное элюирование, добавив 0,5 М физиологического раствора , после чего получают протеиновый комплекс в соответствии с элюированным белком. Так как при определении методом дискового электрофореза полученный продукт еще содержит небольшое количество примесей, этот протеиновый комплекс концентрируют далее и, после помещени  в мембрану дл  диализа, дважды подвергают диализу (всего в течение 12 ч) с дистиллированной водой и дважды (всего в течение 12 ч) с 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0). Полученный после диализа образец пропускают через колонку (1,58 см), заполненную Con А-сефарозой 4в, которую уравновешивают 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0) . При обработке тем же буферным раствором элюируют следовые количества белка, однако эта белкова  фракци  не обладает активностью. При дальнейшем элюировании 0,1 М фосфатHtJM буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 М Ыасг, получают протеиновый комплекс в соответствии с элюированным белком. Так как эта порци  белка еще содержит мельчайшее количество примесей при определении с помощью дискового электрофореза, ее собирают, концентрируют и подвергают диализу с- 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCE. дбразец после диализа подвергают гель-фильтрации на колонке (2,8 60 см), заполненной биогелем Р-100, уравновешенным тем же буферным раствором . В результате получают чистый активный фактор, соответствующий белковой фракции, дающей пик молекул рного веса около 80000. Эффективность выделени , очистки и другие, данные, полученные на этой стадии очистки, приведены в табл. 5. в качестве стандарта используют коровий сывороточный альбумин. Чистоту вещества определ ют в соответствии с данными дискового электрофореза на полиакриламидном геле (концентраци  полиакриламида 7,5%, 1 н.КОН - лед на  уксусна  кислота в качестве буферного раство ра (рН 4,3). Количество образца на гель ссхзтавл ет 30 мкг (в виде белка). Эксп римент провод т, подава  ток 4 МА в течение 2 ч, про вл   амидочерным 10 В и обесцвечива  7%-ным растворо уксусной кислоты. Образец, полученный на этой конечной стадии,  вл етс  отдельным веществом, практически свободным от примесей, и стимулирующа  секреци  инсулина .хорошо согласуетс  с актив ностью дл  этого выделенного вещест ва. Дл  определени  структуры субъе ницы этого вещества его подвергают затем дисковому электрофорезу с SDS (додецилсульфат - натри ) в соответствии с методикой Шапило. 50 мкг пробы вещества (в расчете на белок) добавл ют к смеси 1% SDS 1% меркаптоэтанола и 4 М мочевины. После 2 ч инкубировани  при полученную смесь нанос т на 10%-нБй полиакриламидный гель, содержащий 1% SDS, затем 4 ч пропускают ток 8 мА/гель, про вл ют Coomsie голубы и обесцвечивают 7,5 уксусной кислотой . Полученные результаты приведены в табл.9. Высушенные при температуре ниже точки замерзани  и хранившиес  бактерии коклюша Bordete ea стадии 1, штамма Tohama- культивируют .в среде Bordet gendon (Bg-среда), содержаще 20% дефибринизированной лошадиной крови, при 3 дн , потом в тече ние 20-24 ч культивируют в В скоТаблица 5 шенной среде при , а затем платиновую петлю культуры бактерий инокулируют в .500-миллиметровую лстр хиваемую колбу, в которую предварительно помещают 200 мл ионообменной СМОЛЫ, к которой добавл ют полусин-. тетическую жидкую питательную среду (модифицированна  среда Cohen-WheeKег), состав которой приведен в табл. б, после чего культуру встр хивают в течение 20-24 ч при 37°С. Концентрацию бактерий в растворе культуры определ ют с помощью спектрофотометра (длина волны 650 нм)., и полученный раствор добавл ют в двухлитровую встр хиваемую колбу, в которую перед этим помещают 1л указанной CW-среды, так что окончательна  концентраци  бактерий достигает 0,07 до 0,1510 клеток/мл. После этого культуру встр хивают в течение 4 ч при 37°С (частота встр хивани  100-120 раз/мин). Полученный таким образом встр хиваемый раствор нагревают при 30 мин, затем центрифугируют (со скоростью 15000 об/мин) при 4°С дл  того, чтобы отделить надосадочную жидкость от клеток бактерий . Т а б л и ц а 6 Количество Состав модифицированной среды Казаминова  кислота, г10 Дрожжевой экстракт, г1 Первичный кислый фосфор;нокислый калий, г0,5 Растворимый крахмал, г2 0,5%-ный раствор сульфата меди, мл1 Продолжение табл. 1%-ный раствор хлористого кальци , мл 4%-ный раствор хлористого магни , мл Полипептон, г 1%-ный раствор цисти на, мл 0,5%-ный раствор сульфата железа, мл Хлористый натрий, г При использовании этой жидкой среды ее разбавл ют дистиллированн водой до получени  общего количест ва 1000 мл, и после установлени  в личины рН 7,2 с помощью 20%-ного раствора NaOH к ней еще добавл ют 3 г анионообменной смолы (Диаион А-20АР), после чего стерилизуют 1520 мин паром высокого давлени  при 21°С. 10 л полученной таким образом на досадочной жидкости культурной сред пропускают через колонку (5- 2 см, скорость потока 60 мл/ч), заполненн океиапатитом, промывают 100 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 6,0). После этого колонку промывают 300 мл О,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0), и 0,1 фосфатным буферным раствором (рН 7, содержащим 0,5 М хлористого натри , со скоростью 15 мл/ч дл  элюировани целевого активного фактора. Полученный таким образом протеиновый комплекс концентрируют до 15 мл с полиэтиленгликолем (средний мол.вес 20000) и подвергают диализу четыре раза за 24 ч с 2 л дистиллированной воды, затем еще четыре раза подвергают диализу за 24 ч с 1 л 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 6,0) до равновеси . Затем полученный продукт пропускают через колонку (1,5-10 см), заполненную Асп Тр Сер Глу Про Гли Ала Цис/2 Вел нем ты тво °° Примечание. Гидролиз в6 н. НС боксиметилсефарозой CL-бв, уравнове- шейной тем же самым буферным раствором , что и ранее. Тот материаш, который не был абсорбирован в колонке, не обладает активностью. После повышени  мол рной концентрации и рН фосфатного буферного раствора до 0,1 М и 7,0 соответственно провод т аналогичную обработку, добавив 0,5 М хлористого натри , и получают протеиновый комплекс, соответствующий элюированному блоку. Этот протеиновый комплекс концентрируют до 10 мл и подвергаиот диализу 4 раза за 24 ч с 2 л дистиллированной воды, после чего провод т 4-кратный диализ в течение 24 ч в равновесии с 1 л 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 4,5 раствора, содержащего 0,1 М хлористого натри , или рН 4,5 при содержании 0,1 М литийхлорид - сол на  кислота). Этот раствор пропускают со скоростью 5 мл/ч через колонку (1,28 см), заполненную Р-ацетоксимеркуранилин-сефарозой 6МВ, уравновешенной указанным буферным раствором , с последующей тщательной, промывкой им (около 200 мл). Абсорбированный материал элюируют тем же буферным раствором, в который добавл ют 0,01 М г-цистина. В неабсорбированной фракции нет протеинового комплекса, весь он в окончательном элюате. Этот протеиновый комплекс шесть раз подвергают диализу в течение 48 ч с 2 л дистиллированной воды, .высушивают при температуре ниже точки замерзани ,в результате чего получают 7,3 мг светло-коричневого порошка. Полученный продукт дает отдельную полосу при электрофорезе на полиакриламидном геле (используетс  гель с рН 4,3) а его изоэлектрическа  точка рН составл ет 7,8+0,5. Продукт содержит, вес.%: белок около 92, глюцид 1,8-5,6 и липиды 0-2. Молекул рный вес этого вещества по данным гель-фильтрации (с использованием биогел  Р-150 на колонке разме- / ром 1,8-95 см и 0,01 М ацетатным буферным раствором с рН 4,5) 510001. 4300. В табл. 7 представлен состав амийокислот полученного продукта. Таблица 7 Mem Ил Лей Тир Фе Лиз Гис Apr при 110°с в течение 16 ч. Эффективность ввделени , чистота и другие данные, полученные на ука Стимулирующа  секрецию инсулина активность составл ет 1,349 U мкг, остра  токсичность LDcQ 232 мкг/кг дл  самцов ГФпаей и 174 мкг/кг дл  мышей-самок. Пример 2. Получение и очистка компонентов. 1.20 мг очищенного протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, раствор ют в 3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора ( рН 7,0), содержгидего 8 М мочевины и 0,5 М хлористого натри , и после выстаивани  смеси в течение 2 ч при 37°С ее подвергают гель-фильтрации на колонке {1,595 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенной указанным буферным раствором. Таким способом протеиновый комплекс разде л ют на три компо ента с различным молекул рным весом (KC-I, КС-Г1 и КС-Ill в пор дке возрастани  молекул рного веса). Дл  того, чтобы пр вести дальнейшую очистку этих компо нентов, их фракции собирают, концентрируют и снова подвергают г.ельфильтрации на той же колонке. 2 .20 мг очищенного протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, раствор ют в 3 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора ( рН 8,5), содержащего 8 М мочевины и после выстаивани  смеси в течение 2 ч при его пропускают через колонку (1, см), заполненную ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную указанным буферным раствором. КС-11 проходит через колонку, не абсорбиру сь на ней, а КС-1 и KC-1I абсорбируютс  в колонке. КС-1 элюируют 0,02 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины, а КС-11 - 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0). Дл  дальнейшей очистки занной окончательной стадии, приведены в табл. 8. Таблица8 тих материалов, их концентрируют затем подвергают гельфильтрации на колонке (1,5-95 см), заполненной ефакрилом S-200, уравновешенной 0,1 М фосфатнвлм буфером (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины и О,5 М хлористого натри . КС-1 имеет две 1;1 подгруппы на высокомолекул рной стороне протеинового комплекса, КС-II соответствует подгруппе промежуточного молекул рного веса протеинового комплекса, а КС-111 - подгруппе низкого молекул рного веса. Пример 3. Получение и очистка компонентов. Компоненты КС-1, КС-11 и КС-111, полученные в примере 2, ассоциируют в соответствующих сочетани х, в результате чего получают новые компоненты , стимулирующие секрецию инсулина под названием КСА-1 (ассоциаци  КС-1 и КС-111), КСА-11 (ассоциаци  КС-11 и КС-111), KCA-I11 (ассоциаци  КС-1, КС-11 и КС-111) и КСА-1У (ассоциаци  КС-1 иКС-11). Оптимальные услови  получени  этих веществ КСА-1, КСА-11, КСА-Г11 и КСА-1У следующие. В случае КСА-1 КС-1 и КС-111 смешивают в соотношении 5:1 в водном растворе и после установлени  рН 7,0 полученную смесь встр хивают при в течение более 24 ч. Дл  получени  КСА-11 - КС-11. и КС-111 смешивают в соотношении 2:1 и после установлени  рН 7,0 полученную смесь встр хивсоот при в течение более 1ч.- Дл  получени  KCA-1II - КС-1, КС-11 и КС-111 смешивают в соотношении (в расчете на протеин) 5:2:2, устанавливают величину рН 7., 6 и в течение 24 ч встр хивают при , дл  полу чени  КСА-1У - КС-1 и КС-11 смешивают в соотношении 2:1, затем устанавливают рН 7,0 и встр хивают в течение 24 ч при . В указанных услови х все эти вещества можно получить с выходом волее 95%, однако дл  того, чтобы иск лючить неассоциированные вещества, полученные продукты подвергают дале гель фильтрации через колонку (1,5-95 см), заполненную сефакрилом S-200, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), со держащим 2 М мочевины и 0,5 М хлористого натри . Полученные таким способом компоненты про вл ютс  при дисковом электрофорезе как отдельные соединени . Пример 4. Фармакологическо действие. 1. Определение стимулирующей секреции инсулина. Стимулирующую секрецию инсулина каждого из компонентов можно определить , измер   реакцию животных на различные типы стимул торов секреции инсулина, обычно дл  этих целей в качестве стимул тора выбирают глю козу. Используют самцов крыс Wistar (весом 130-140 г). Тестова  методика. Компоненты различной силы раствор ют в физиологическом сол ном растворе и по 0,2 мл каждого из этих растворов ввод т внутривенно при анестезии эфиром в бедренную вену подопытных крыс. Через три дн  определ ют стимулирующую секрецию инсули на дл  каждого из веществ. Перед экспериментом крысы голодают 18-20 ч Дл  определени  стимулирующей секреции из хвостовой вены каждой крысы отбирают О,1 мл крови, сразу после этого осуществл ют внутрибрюшинную инъекцию 30%-ного раствора глюкозы в количестве 1 мл на 100 г веса, и через 15 мин снова таким же способом отбирают 0,1 йл крови. Стимулирующую секрецию инсулина определ ют по разнице в уровне содержани  сахара в крови и концентрации инсулина в крови до и после введени  глюкозы. Уровень сахара в крови определ ют по ме тоду глюкозооксидазы в концентрацию инсулина по двойному методу антител Потенциальную иммуноактивность компонентов можно определить с помощ различных экспериментальных систем. Тестовые животные: самки крыс штамма Wistar.(вес тела 200+10 г) и

30

10

КС-1

16

10 самцы крыс штамма Wistar (вес тела 250±20 г). Тестова  методика заключаетс  в следующем, динитрофенил-аскарис (ДИФ-АС), полученный при св зывании нитрофенильной группы с протеином, полученным из Ascaris suura, используют в качестве антигена. 1 мл такого антигена и различные активные вещества раствор ют в О,5 мл физиологического раствора, полученные таким образом растворы ввод т подкожно в подошвы как передних, так и задних .конечностей самцов крыс, наход щихс  под эфирной анестезией, дл  первичной иммунизации. Дл  контрол  1 мг ДНФ-АС раствор ют в О,5 мл физиологического раствора, содержащего 10 погибших клеток бактерий. В.pertussis и аналогичным образом сенсибилизируют дл  осуществлени  первичной иадлунизгщии. Через 5 дней после первичной иммунизации 0,5 мл физиологического раствора , содержащего 0,5 мг ДНФ-АС, ввод т в спинную мышцу крыс под эфирной анестезией, и еще через 3 дн  определ ют уровень содержани  антител анти-ДНФ-ЛС в сыворотке. Это определение провод т следующим образом . 0,1 мл крови, полученной из хвостовой вены крысы, помещают в тестовую пробирку с 0,2 мл физиологического раствора, содержащего гепарин , и после разделени  на центрифуге при скорости вращени  3000 об/мин при 4°С в течение 15 мин вьщел ют надосадочную жидкость дл  приготовлени  п тикратно разбавленной сыворотки . Уровень содержани  антител в полученной таким образом сыворотке определ ют, использу  пассивную кожную анафилактическую реакцию по методу Тада. Уровень содержани  антител в сыворотке выражают через максималь-, ное разбавление сыворотки, при котором по вл ютс  синие п тна более 5 мм, а активность промотировани  выделени  антител (силу) каждого препарата выражают в единицах активности , причем активность, соответствующую lCl -24-кратному уровню антител, обозначают как 1000 единиц. Удельную активность определ ют путем делени  единицы силы на вес. Г Стимулирующа  секреци  инсулина и потенциальна  имлуноактивность представлены в табл. 9. Т а б, л и ц а 9 1АР - протеиновый компле Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, выделенный и очищенный в соответствии с изобретением , не только действует как стимулируюишй секрецию инсулина агент у млекопитакнадх и поддерживающий уро вень сахара в крови в нормальных пределах, но также пригоден дл  стимул ции выделени  антител и дл  повышени  клеточной иммунности. Поскольку этот протеиновый комплекс оказывает указанные действи  в чрезвычайно малых дозах, его можно использовать как лечебный или профилак тический препарат дл  различного рода диабетов, или в качестве лечебного препарата против заболеваний, возникающих в результате нарушенных иммунофункций (например, злокачественные опухоли, апластическа  анеми , ревматоидные артриты и т.д.). Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, его составные компоненты KC-I, КС-11 и KC-1I1 и ассоциированные из них вещества КСА-1, KCA-I1, КСА-Ш и КСА-1У обладают активностью по отношению к стимулирующей секреции инсулина и потенциальной иммуноактивностью. Компоненты протеинового комплекса каждый в отдельности, облсщают слабой стимулирующей активностью секреции инсулина, а при соединении друг с другом - высокой активностью. В частности все без исключени  вещества , включающие КС-111, обладают высокой стимулирующей секрецией инсулина , поэтому именно этот компонен КС-И1 играет важную роль в развитии стимулирующей секреции инсулина. Побочные эффекты и токсичность. Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, выделенный и очищенный, обладает высокой стимулирующей активностью секреции инсулина в чрезвычайно малых дозах и поэтому может быть с высокой эффективностью использован дл  лечени  и предотвращени  различных видов диабетов. Одна ко этот протеиновый комплекс облада также целым р дом побочных эффектов

Продолжение табл. 9 стимулирующий секрецию инсулина, таких как повышение содержани  лейкоцитов и восприимчивость к гистамину. jKpoMe того, отмечена сильна  антигенность комплекса. Эта антигенность столь высока, что может вызвать анафилактический шок при втором и последующих введени х. Вещества КСА-1, КСА-11, KCA-1II И КСА-1У, полученные в результате образовани  из уже разделенных компонентов протеинового комплекса, обладают заметно пониженными побочными эффектами. В частности, КСА-1, хот  практически и соответствует протеиновому комплексу по стимулирующей секреции инсулина, отличаетс  в 50 раз меньшей активностью в плане повышени  содержани  лейкоцитов , в 10 раз меньшей активностью в плане повышени  чувствительности к гистамину и в 30 раз меньшей антигенностью по сравнению с комплексом. Остра  токсичность LDjQ продуктов из этих веществ соответственно понижаетс . Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию и-нсулина, вызывает изменение чувствительности к гистамину и активность и промотировании лейкоцитоза , а также высокую антигенность в чрезвычайно малых дозах. Компоненты КС-Г, КС-11 и КС-П1 протеинового комплекса обладают обычно более чем в 10 раз низшим уровнем побочных эффектов, чем сам комплекс. В частности , KC-I и КС-11 практически не дают побочных эффектов, однако, КС-11 в заметной степени провоцирует эти побочные эффекты. Ассоциированные вещества обычно гораздо слабее с точки зрени  побочных эффектов, чем протеиновый комплекс . В частности, КСА-Г вообще не обладает побочными эффектами, даже при введении в дес тикратной дозе, что св зано с отсутствием в нем КС-11, который и  вл етс  ответственным за побочные эффекты. Остра  токсичность LDjQ (мкг/кг живого веса) протеинового комплекса, стимулирукицего секрецию инсулина.

его компонентов КС-1, КС-11 и КС-И1 и их ассоциированных веществ КСА-1, КСА-1, отлича сь высокой активностью промотировани  секреции инсулина , обладает и другими полезными в фармакологии действи ми, такими как улучшенна  толерентность глюкозы повышенна  реакци  секреции инсулина способствует лечению диабетов, вызванных стрептозотоцином и улучшает устойчивость толерантности глюкозы при наследственных диабетах. Эти активности поддерживаютс  в- течение от нескольких недель до нескольких мес цев после одного приема вещества . Предлагаемые вещества могут быть применены в качестве лечебных препа ратов дл  д:иабетиков. В насто щее ;врем  лечение диабетов основано на инъекци х инсулина или оральном при еме антидиабетических препаратов, однако они представл ют собой прост препарат дл  лечени  симптомов. Кроме того, пациенты должны каждый день посещать больницы дл  инъекций инсулина, прием антибиотических пре паратов заключает в себе опасность вызвать ненормальное падение уровн  сахара в крови. Протеиновый комплек

КСА-И, KCA-ill и КСА-1У приведена в табл.10.

Таблица 10 стимулирует секрецию инсулина, но также обладает способностью повышать концентрацию инсулина в крови только тогда, когда уровень содержани  сахара в крови уже поднимаетс  под действием различных-условий (накопление глюкозы в услови х повышенного уровн  содержани  сахара в крови, например во врем  приема пищи), и быстро снижает повышенное содержание сахара в крови до нормального уровн . Кроме того, предлагаемое вещество сохран ет активность в течение от нескольких недель до нескольких мес цев после единственного приема. Поэтому, когда снижаетс  реакци  секреции инсулина на уровень сахара в крови, приём этого вещества вызывает нормальную активность секреции инсулина. Благодар  этим свойствам, вещество находит широкую сферу дл  применени , т.е. оно не только полезно в качестве лечебного препарата дл  диабета/ но и  вл етс  эффективным в применении на предшествующей диабету стадии заболевани ,или в качестве предотвра-. щающего, лечебного иди диагностического препарата дл  начальной стадии диабета.

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО СЕКРЕ

   ЦИЮ ИНСУЛИНА, заключающийся в том, что патогенные штаммы микроорганизмов, относящиеся к виду BordeteEEa pertussis, в I-ой фазе культивируют в жидкой питательной среде при встря хивании, полученную культуральную жидкость прогревают, отделяют надосадочную жидкость, пропускают ее через колонку, элюируют целевой продукт фосфатным буфером с 0,5 М NaC8 pH 7,0, полученный элюат концентрируют, очищают и разделяют протеиновый комплекс методом ступенчатой хроматографии на компоненты КС-I с мол.вес. 63000+5200, KC-II с мол.вес. 31000±4500 и/или KC-ΪΙΙ с мол.вес. 12500+1500. : \ §