JPS6019733B2 - 蛋白質性活性物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インシュリン分泌増強活性因子の構成成分で
ある新規な各要素物質及びこれらの要素物質を結合して
成る各種会合物質に係る。

本発明者は、ボルデテう属に属する微生物の菌体及び培
養上蒲中にインシュリン分泌を促進し、且つ血糖値を正
常に維持調整するという驚くべき薬理作用を有し、した
がって各種糖尿病の治療及び予防薬として極めて有用で
ある成分が存在することを発見した。

更に、この成分の単離・精製を行ない、新規な蛋白性物
質をインシュリン分泌増強活性因子として単離・同定す
ることに成功したものである。このインシュリン分泌増
強活性因子は極めて徴量（約０．１ムタ／ｋＱ体重）で
インシュリン分泌増強活性を示し各種糖尿病の治療及び
予防薬として有用である。しかし乍ら、このインシュリ
ン分泌増強活性因子は、目的とする活性以外に白血球数
を増加させる作用、ヒスタミンに対する感受性を増加さ
せる作用及び抗原性等の所謂副作用を示すことが判明し
た。糖尿病の治療及び予防に有効であるインシュリン分
泌増強活性以外の副作用を除去することは、より安全で
あるべき医薬品として望ましいことは云うまでもない。
本発明者は、この目的の達成のために、インシュリン分
泌増強活性因子をその構成成分である要素物質に分離、
精製することに成功し、且つこれ等の要素物質を更に会
合させることによりインシュリン分泌増強活性を低下さ
せることなくしかも副作用の大幅に減亭暮した新規な各
種会合物質の製造を達成したものである。すなわち、本
発明の蛋白質性活性物質は、式： （ＫＳ−１）そ（ＫＳ−○）ｍ（ＫＳ−ｍ）ｎ（式中Ｋ
Ｓ−１は、ゲルろ過法による分子量が６３０００±５２
００：山ｗｒｙ法による蛋白質９７重量％以上、フェノ
ール・硫酸法による糟質１．３±０．４重量％であり、
且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（ムＭ／１０
０ムＭ）は、Ａｓｐ８１，Ｔｈｒ８．５，Ｓｅｒ７９，
ＧＩｕ９．６，Ｐｒｏ５．０，ＧＩｙｌｏ．０，ＡＩａ
９．５，１／２Ｃ侭１，１，Ｖａ１６．２，Ｍｅｔｌ．
８，山ｅ４．５，仏ｕ６．５，Ｔｙｒ７．６，Ｐｈｅ２
．８，Ｌ＄２．１，Ｈｉｓｌ．６，及び〜幻．３であり
；等軍点ｐＨ５．６±０．入且つ弱いインシュリン分泌
増強活性を示す蛋白質性物質を示し、ＫＳ−□は、 ゲルろ過法による分子量が３１０００十４５００：山ｗ
ひ法による蛋白質９５重量％以上、フェノール・硫酸法
による糖質１．２±０．箱重量％であり、かつ蛋白質成
分のアミノ酸組成及び組成比（仏Ｍ／１００仏Ｍ）は、
Ａｓｐ９．３，Ｔｈｒ７．７，Ｓｅｒ９８，ＧＩｕｌｌ
．８，Ｐｒｏ４．６，ＧＩｙ９．８，ＡＩａｌｌ．３，
１／次ｙｓＮ．Ｄ．，Ｖａ１７．４，Ｍｅｔｌ．９，Ｉ
Ｌｅ４．０，Ｌｅｕ５．３，Ｔｙｒ６．２，Ｐｈｅ２．
５，Ｌ侭１．９，ＨｉｓＩ．１，および〜ｇ５．４であ
り；等露点ｐＨ５．４土０．４、且つ弱いインシュリン
分泌増強活性を示す蛋白質性物質を示し、ＫＳ一ｍは、 ゲルろ過法による分子量が１２５００±１５００；山ｗ
ひ法による蛋白質９６重量％以上、フェノール・硫酸法
による糠質１．５±０．母重量％であり、且つ蛋白質成
分のアミノ酸組成及び組成比（仏Ｍ／１００〃Ｍ）は、
Ａｓｐ５．３，Ｔｈｒ４．８，Ｓｅｒ６．２，ＧＩｕ９
．６，Ｐｒｏ９．３，ＧＩｙ８．１，山ａ９．３，１／
本流２．３，Ｖａｌｌｏ．２，Ｍｅｔ６．０，ＩＬｅ２
．２，Ｌｅｕ８．６，Ｔｙｒ２．５，Ｐｈｅ４．５，Ｌ
＄５．８，Ｈｉｓｏ．５，及び〜ｇ４．８であり；等霞
点ｐＨ８．３±０．３且つ前記物質ＫＳ−１又はＫＳ−
０のインシュリン分泌増強活性の発現に係る蛋白質性物
質を示し、そ，ｍ及びｎは蛋白質性物質の重量比を示し
且つ夕は０乃至５の整数であり、ｍは０乃至２の整数で
あり及びｎは０乃至２の整数である。

但し、Ｚ，ｍ及びｎが共に０とはならない。）で示され
る。以下、本発明の構成につき詳細に説明する。

インシュリン分泌増強活性因子本発明に於ける出発物質
であるインシュリン分泌増強活性因子（以下、“活性因
子”と略称する）は、病源性菌として公知のボルデテラ
属にする微生物（百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支血症
菌）、特に好ましくは百日咳１相菌（靴ｒ船ｔｅｌｌａ
ｐｅｎｕｓｓｉｓｐｈａｓｅ ｌ）を固形培地や液体塔
地にて培養し、その菌体もしくは培地から採取、精製し
て得られる蛋白性物質である。

／菌体ならびに培養物からの活性因子の有利な採取およ
び精製は、溶解度法、クロマトグラフィー法、分子節法
、亀気泳動法および生物学的方法の一つ又は、これ等の
方法の組合せなど、当該分野で汎用の多くの分別精製方
法により達成され得、従って本発明は特定の採取精製法
に何等限定されるものではない。活性因子の極めて有利
な採取精製方法の１例として、カラムクロマトグラフイ
ー的手段を提示し得る。

この場合、微生物の培養上清液は、ハイドロキシアパタ
ィト（生化学工業■製）、カルボキシメチルセフアロー
スＣＬ−曲（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製
）、コンＡーセフアロース−の（同社製）又は後記ＰＡ
ＭＡ−セファロース母ＭＢなどの充填材より成るカラム
を通される。活性因子はこれらのカラムに極めて選択的
に吸着され、次いで０．９ＭＮａＣぞ含有の０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７．０）等の適切に選定された溶出液
により溶離されて精製物を与える。この精製物に透析操
作を適宜施こすことにより、不要な塩類が除去されて高
活性の活性因子が得られる。又、活性因子は菌体内にも
存在するので、所望の場合には、例えば菌体浮遊液にＮ
ａＣ〆を添加して菌体内活性因子を溶液中に浸出せしめ
る手段などを採用してもよい。当該分野で汎用されてい
る所謂硫安沈澱法も又、活性因子の製造方法として使用
し得る。

この場合、微生物培養上蒲液に固体（Ｎ日）２Ｓ０４を
飽和溶解度近傍まで添加し、希アンモニア水でｐＨを６
〜７に調整する。

次いで、沈澱物を水洗後、０．９のＮａＣそを含む０．
１ＭＴｒｊｓ緩衝液（ｐＨ８）により活性成分は溶解抽
出されて活性因子を与える。活性因子を産坐するボルデ
テラ属の微生物は、前記の通り百日咳菌、パラ百日咳菌
及び気管支敗血症菌として周知であるが、他方、これら
の病源菌を、培地組成の変更、紫外線、Ｘ線等の各種放
射線照射又は変異誘起剤の適用等の慣用の各種手段で変
異せしめて得られる変異株も又、活性因子産生菌として
有用である。

培養方法としては、液体振縁培養方法が活性及び収率の
点で好ましいが、他の方法によることも妨げない。

なお、ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性質、培養
条件等はＢｅｒｇｙ′ｓＭａｎｕａｌ 。

ｆ Ｄらｔｅｎｈｉｎａｔｉｖｅ鞠ｃｔｅｒｊｏｌ
ｏ鋤第８版１９７４年母ｌｔｉｍｏｒｅ：ｍｅ Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ＆ＷｉｌｌｋｎｓＣＯ．，Ｊ・Ｅｘｐ・Ｍｅ
ｄ．１２９：５２３〜５５０（１９６９）、細菌学実習
提要：第３版第６頁以下、昭和４７年（丸善■発行）、
等に記載されている。

次に、活性因子の各種物性に付き詳述する。

存在状態及び溶解特性：脱塩後、凍結乾燥して得られる
粉末は、非潮解性白色または淡褐色粉末であり、約３〜
５柵／財までは室温で水に溶解、鮒ＨＣそ中では不溶性
白次を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、メル
カプトェタノール、システィン溶液に溶解する。

冷時（４００）、精製活性物質の溶液に硫安、ドライア
イス・アセトンあるいはエタノール、トリクロル酢酸、
塩化亜鉛溶液及びその他の数種の金属イオンを含む溶液
等の添加により、各々白濁、沈澱を生ずる。水とク。ロ
ホルムあるいはｎーブタノール混合液では不溶性となり
両液の界面に集まる。活性因子の水溶液を８０ｑ０以上
に加湿すると白濁する。

０．８ ＭＮａＣ〆含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に対し本活性因子を溶解し、次いで蒸留水を外液
として透析すると、一時白濁するが透析の続行により完
全に再溶解し、白濁は消失する。

また、高濃度溶液では０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５）に対し、徹底的に透析すると淡褐色に着色して溶解
することもある。分子量： ０．９Ｍ ＮａＣそを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）で平衡化させたバイオーゲルｐ−１００（
ＢＩＯ．ＲＡＤ社製）カラム（２．８×８０肌）を用い
たゲルろ過法による分子量は、７７０００土鼠００であ
る。

組成： 山ｗひ法による蛋白質９５重量％以上、フェノール・硫
酸法による糖質約１重量％、脂質は検出限界値以下であ
る。

尚、各成分の測定方法は下記各文献に依った。

蛋白質Ｌｏｗひ，０．日．，Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕ
劫，Ａ．Ｌ．Ｆａｍ，ａｎｄＲ．Ｊ．Ｒａｎ舷１１．Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５１９５１糠質Ｐ
ｈｅｎｏｌ−日交０４法Ｄｕｂｉｓ，Ｍ．，Ｋ．Ａ．Ｏ
ｉｌｅｓ，Ｊ．Ｋ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｐ．ＡＲｅにｒ
ｓ，ａｎｄ Ｆ．Ｓｍｉ比．Ａｈａｌ．Ｃｈｅｍ．２８
３５０，１９５６脂質総脂質、結合脂質はクロロホル
ム、クロロホルムーメタノール、ヘプタンに加水分解の
前後に物質を抽出し、Ｍａ母ｈａｎｄＷｅｉｍｔｅｉｎ
の方法で測定Ｊ．Ｂ．Ｍａ岱ｈａｎｄＤ．Ｂ．Ｗｅｉｎ
ｓｔｅｉｎ：Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，７ ５７４，１
９６６蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（仏Ｍ／１
００ＡＭ；鮒ＨＣそで１１０ｑｏ、１６又は２独時間加
水分解）：アスパラギン酸（Ａｓｐ）７．５〜７．９、
スレオニン（Ｔｈｒ）６．８〜７．０ セリン（Ｓｅｒ
）５．９〜７．６、グルタミン酸（ＧＩｕ）９．７〜１
０．８、プロリン（Ｐｒｏ）５．５〜６．４、グリシン
（ＧＩｙ）８．０〜９．６、アラニン（Ｎａ）９．１〜
１０．８、シスチン／２（Ｃ＄／２）１．５〜５．６、
バリン（Ｖａｌ）５．６〜６．６、メチオニン（Ｍｅｔ
）２．５〜３．３イソロイシン（ｌｉｅ）３．６〜４．
１、ロイシン（仏ｕ）７．５〜８．い チロシン（ＴＭ
）５．１〜６．０ フエニルアラニン（Ｐｈｅ）３．３
〜３．９、リジン（Ｌｙｓ）３．１〜４．４、ヒスチジ
ン（Ｈｉｓ）１．４〜１．０アルギニン（Ａｒｇ）６．
１〜６．６であった。

等亀点ｐＨ：８．０±０．５ディスク電気泳動パターン
： アクリルアミドゲル（ボリアクリルアミド濃度７．５％
、ＩＮＫＯＨ−氷酢酸緩衝液（ｐＨ４．３））、試料３
０山夕、通電４ｍＡ、２時間／ゲル１本、アミドプラッ
ク１服による染色、７％酢酸溶液による脱色の条件下で
のディスク電気泳動において、距離（スベーサ・ゲル先
端を基準として）２．３土０．２弧の位置の極めて先鋭
な単一のバンドを与える。

生物学的性質：俺乳動物に対しインシュリン分泌増強作
用及び耐糖館良化作用を有し、これらの作用は１回の投
与で数週間乃至数ケ月にわたって持続する。

急性毒性（ＬＤ５０）はｄｄｙ系マウス（静注）で約２
００ｒ夕／ｋ９体重である。活性因子構成成分（要素物
質）及び会合物質１ 前記活性因子は、母け尿素、母け
塩酸グアニジン等々の当該分野で汎用の各種蛋白変性剤
の共存下、力ラムクロマィトグラフ法等により分別され
て三種の構成成分（要素物質）に分離され、この各要素
物質はディスク電気泳動的に単一物質であることが確認
された。

各要素物質の有利な単離精製法の１例として、母Ｍ尿素
存在下に於けるゲルろ過法を提示し得る。

則わち、活性因子を母Ｍ尿素及び０．９ＭＮａＣそ含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同じ緩
衝液で平衝化したセルアクリルＳ−２００（ファルマシ
ア・ファインケミカルス社製）カラムによりゲルろ過を
行なう。その結果、活性因子は分子量の異なる三種の構
成成分（以下、分子量の大きい順に蛋白性物質ＫＳ−１
、ＫＳ−０及びＫＳ−ｍとそれぞれ命名する）に分離さ
れ、これらの構成成分は更に同一カラムによる再ゲルろ
過により、ディスク電気泳動的に単一な物質として得ら
れる。他の有利な単離精製法の１例としては、 ＤＥＡＥセルロース（セルバ社製）カラムクロマトグラ
フ法を例示し得る。

則わち、活性因子を母の尿素含量０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に溶解し、次いで同じ緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥセルロースカラムを通過させる。その結果
、ＫＳ−１及びＫＳ−０‘まこのカラムに吸着し、他方
、ＫＳ−ｍは吸着されず流出する。

次に、ＫＳ−１は母の尿素含有０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）により漆出され、同じくＫＳ−ロは０．
０９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出される。各要
素物質は、更にぬけ尿素及び０．９Ｍ塩化ナトリウム含
有０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したセフアクリルＳ一
２００力ラム（フアルマシア・ファイン・ケミカルズ社
製）によるゲルろ過を行なうことにより、ディスク電気
泳動的に単一な物質として得ることができる。

このようにして得られた要素物質ＫＳ−１、ＫＳ−０及
びＫＳ−ｍは、それぞれ単波ではインシュリン分泌増強
活性因子に比べて弱いインシュリン分泌増強活性しか示
さないが、白血球を増加させる作用、ヒスタミンの感受
性を増加させる作用及び抗原性等の所謂副作用がそれぞ
れの物質に不均一に分布され、且つ減弱する。

また、ＫＳ−１、ＫＳ−０‘ま、酸性蛋白質であり、他
方、ＫＳ−ｍは塩基性蛋白質であることが確認された。
２ 前記各要素物質、ＫＳ−１、ＫＳ−０及びＫＳ‐ｍ
は、単独では殆んど目的とするインシュリン分泌増強活
性を示さないが、或る種の組合せに於いて当該活性を強
く示し、しかも前記各種副作用及び毒性が著るしく低減
されることが判明した。

則わち、ＫＳ−１とＫＳ一ｍ、ＫＳーロとＫＳ−ｍ及び
ＫＳ−１とＫＳーロとＫＳ−ｍ、の組合せに於いて強い
当該活性が再現し、他方、ＫＳ−１とＫＳ−０の組合せ
では当該活性を殆んど示さない。

更に研究の結果、各要素物質は適当な緩衝液中で相互に
会合して単一の蛋白性会合物質を与えるものであること
が知見された。即わち、要素物質ＫＳ−１とＫＳ一ｍ、
ＫＳ−０とＫＳ−ｍ、ＫＳ−１とＫＳ−０とＫＳ−ｍ及
びＫＳ−１とＫＳ−ロ、の各組合せを適当な緩衝液中で
会合反応させることにより会合物質ＫＳＡ−１、ＫＳＡ
−０、ＫＳＡ−ｍ及びＫＳＡ−Ｗとそれぞれ命名された
ディスク電気泳動的に単一の各蛋白性会合物質が生成さ
れる。各蛋白性会合物質の有利な製法の１例を下記に示
す：ＫＳＡ−１で・は、ＫＳ−１：ＫＳ−ｍ＝５：１、
ＫＳＡ−ロではＫＳ−０：ＫＳ一ｍ＝２：１、ＫＳＡ一
ｍでは、ＫＳ−１：ＫＳーロ：ＫＳ一ｍ＝５：２：２及
びＫＳＡ−ＮではＫＳ−１：ＫＳ−０＝２：１の各蛋白
重量比で、ａけ尿素及び０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．１リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合し、３７ｏ
０で２４時間振渇することにより各要素物質は、会合す
る。

次いで、これらの混合液を濃縮し、２Ｍ尿素及び０．９
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）で平衡化されたセフアクリルＳ−２００力ラム（
フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）にてゲルろ
過を行なうか、又はイオン交換クロマトグラフィーを行
なうことにより、未会合のそれぞれの要素物質と会合物
質とを分離し、単一物質である前記ＫＳＡ−１，ＫＳＡ
−ロ，ＫＳＡ−ｍ及びＫＳＡ−Ｗがそれぞれ得られる。

これ等の会合生成物の収量は、温度、ｐＨ、時間、濃度
、イオン強度等の条件により著しく異なる。

更に、これ等の新規な蛋白性会合物質は、インシュリン
分泌増強活性因子に比べて、例えば、その本来の活性は
、同程度であるが、白血球を増加させる作用は１′５０
以下、ヒスタミンに対する感受性を増加させる作用は１
／１０以下、抗原性は１／２５以下に減弱し、ＬＤ５０
値は１／１０以下に減弱することが確認された。

３ 要素物質及び会合物質の諸性質、存在状態及び溶解
性：脱塩後、凍結乾燥した全ての要素物質及び会合物質
の精製粉末は、非潮解性白色粉末であり、ＫＳ−肌ＫＳ
−０及びＫＳＡ−ｍは室温で１の９／泌程度まで水に可
溶、他は極めて鍵燐であるが、４Ｍ尿素及び０．３ＭＮ
ａＣそ含有０．１Ｍリン酸緩衝液には４の９／泌程度ま
で溶解。

各物質の水溶液は、冷時（４℃）、硫安、ドライアイス
アセトン、エタノ−ル、トリクロロ酢酸等の添加により
各々白濁、沈澱を生成。

水とクロロホルム或いはｎーブタノール混合液に於いて
、各物質は両液の界面に集まる。分子量：８Ｍ尿素及び
０．９ＭＮａＣそ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化させたセフアクリルＳ−２００力ラム（フ
アルマシア・フアインケミカルス社製）（１．５×９＆
ネ）を用いたゲルろ過法による各要素物質の分子量は、
ＫＳ−１６３０００±５２０以ＫＳーロ３１０００±４
５００、ＫＳ一ｍ１２５００土１５００。

４Ｍ尿素及び０．８ＭＮａＣそ含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化させたセフアクリルＳ−２０
０カラム（１．５×９５伽）を用いた各会合物質の分子
量は、ＫＳＡ−１７５０００土８５００、ＫＳＡ−０３
５０００±４５００、ＫＳＡ−ｍ８５０００±１３００
０、ＫＳＡ−Ｗ８８０００±６３００。等露点ｐＨ： アクリルアミドゲル、エレクトロフオーカシング法によ
る等露点ｐＨは、ＫＳ−１５．６±０．３、ＫＳ−０５
．４土０．４、ＫＳ一ｍ８．３±０．３、ＫＳＡ−１６
．８土０．４、ＫＳＡ−０６．３±０．３、ＫＳＡ一ｍ
８．２±０．５、ＫＳＡ−Ｗ５．６±０．も組成： 蛋白質（Ｌｏｗｒｙ法） 糠質（フェノーノし．硫酸法
）ＫＳ−１ ＞９７ １．３ ± ０．４ＫＳ−
□ ＞９５ １．２ 土 ０．３ＫＳ−ｍ ＞９
６ １．５ 土 ０．６ＫＳＡ−１ ＞９６
１．３ ± ０．３ＫＳＡ−Ｄ ＞９６ １．
３ 十 ０．４ＫＳＡ−ｍ ＞９６ １．３ 十
０．２ＫＳＡ−Ｗ ＞９５ １．３ ± ０．３※
）数値は重量多蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（
〃Ｍ４００〃肌：※）６Ｎ塩酸、１１０℃、１６時間加
水分解実施例 １活性因子の製造及び精製 １ 百日咳１相菌前野株（範ｒｄｅｔｅｌｌａｐｅ比ｕ
ｓｓｉｓｐｈａｓｅ ｌ，ＭａｅｎｏＳｔｒａｉｎ）の
凍結乾燥保存菌株（北里大学薬学部微生物学教室提供）
を恥ｒｄｅｔ‐戊増ｏｕ平板培地で３７℃、２日間培養
後、下記第１表に組成を示すイオン交換樹脂加Ｃｏｈｅ
ｎ−Ｗｈｅｅｌｅｒの変法塔地（ＣＷ塔地）２００の【
を分注した５００の‘の振糧コルベンに１白金耳薮極し
、３でＣ、２０〜２時間振遼培養した。

この培養液の菌量を、分光光度計（波長６５仇ｍ）で測
定し、加えた時の菌量が最終濃度約０．１×１び個／泌
となるように、イオン交換樹脂加ＣＷ培地１〆を分注し
た２〆の振麹コルベンに加え、３７０、４印時間振鍵培
養（振濠回数９７回／分）を行つた。尚、上記菌株の菌
学的性質は、先にあげた百日咳１相菌に関する文献の記
載と一致した。

第１表Ｃｏｈｅｎ−Ｗｈｅｅｌｅｒの変法塔地組成カザ
ミノ酸 １．０夕酵母エキス
１夕リン酸二水素カリウム
０．５タ可溶性濃粉
２夕０．５％硫酸鋼液 １の【
１％塩化カルシウム液 １の【４％塩化
マグネシウム液 １の【ポリベプトン
５夕１％シスチン液
２．５の【０．５％硫酸鉄液
１の【塩化ナトリウム ２
．５夕（蒸留水を加えて総量１０００の‘とし、２０％
ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．２に調整後、陰イオン交換樹
脂（ダイヤイオンＳＡ−２０ＡＰ：三菱化成■製）３夕
を加え、１２１００で１５分間、高圧蒸気滅菌して使用
に供した。

）得られた４斑時間振濠培養液を、５６℃で３世分間加
溢した後、４℃で遠心分離（１５００仇ｐｍ）して培養
上糟液と菌体とに分離した。

得られた培養上清液を活性因子の精製単離のための出発
材料とした。１０その培養上蒲液をＩＮ塩酸でｐＨ６．
０に調整後、第１精製工程としてハイドロキシアパタィ
トカラム（生化学工業株式会社製）（２．５×４仇）に
流速２００の‘／時間で流した。

大部分の蛋白質は吸着されずそのままカラムを通過し、
目的とするインシュリン分泌増強活性（後記活性測定法
参照）も殆んど検知されなかった。

尚、蛋白質濃度の測定は後記第２表註記の山ｗｒｙの方
法による。その後、吸着された物質についてはまず０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でカラムを洗い、次
いでリン酸緩衝液のモル濃度を０．１ＭにｐＨを７．０
に夫々上げて吸着された蛋白質を順次溶出する。

しかし目的の活性因子はまだこの条件では溶出されず：
更に同じ条件のリン酸緩衝液に０．８ＭのＮａＣ〆を含
む同組成のリン酸緩衝液で藩出した。この条件で溶出さ
れた蛋白質に一致して目的活性因子を効率よく回収する
ことができた（第１図）。得られた活性因子を濃縮し、
ついで透過分子量限界８０００の透析膜（Ｔｈｏｍａｓ
社製Ｃａｔ．ＮＯ．３７８７一Ｆ２５）に入れた後蒸留
水に対して２回（計１２時間）０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）に対して２回（計１勿時間）夫々透析し
た。

更に精製を進める為に、上記透析後の活性因子を含む溶
液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化さ
れた力ルポキシメチルセフアｏースＣＬ−紐力ラム（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）（１．５×１
０肌）に通した。このカラムに吸着されない物質には全
く活性は存在しなかったが、次いでリン酸緩衝液のモル
濃度を０．１ＭにｐＨを７．０に上げ、更に食塩０．９
けを加えて綾出された蛋白質に一致した活性因子が得ら
れた（第２図）。この部分は、ディスク電気泳動法的に
は未だわずかな不純物を含むため、この活性因子を濃縮
し、ついで透析膜（上託と同規格）に入れた後、蒸留水
に対して２回（計１幼時間）、０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で２回（計１２時間）、透析した。

透析後の試料を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したコンＡ−セルァロース伍カラム（ファルマ
シア・ファイン・ケミカルズ社製）（１．５×８伽）に
通した。先ず同一緩衝液で展開すると微少量の蛋白質が
溶出されるがこの部分に活性はなく、次いで０．８Ｍ、
ＮａＣ夕を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
溶出される蛋白質部分に一致した活性因子が得られた（
第３図）。

この部分は、ディスク電気泳敷法的に極微量の不純物を
含むため、この部分を集めて濃縮後０．８Ｍ ＮａＣそ
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して
透析し、透析後の試料を同一緩衝液で平衡化されたバイ
オ−ゲルＰ−１００（ＢＩ○・ＲＡＤ社製）カラム（２
．８×６０ｃｍ）によってゲルろ過を行なった。

その結果、分子量８００００前後の位置にピークを示す
蛋白質成分と一致して純粋な活性因子が得られた（第４
図）。以上の精製工程による活性の回収率、精製度等は
第２表に示す通りである。尚、この物質の各種物性値は
、前記“活性図」の各種物性”の項に記載した通りであ
る。

第 ２ 表 ※ 蛋白濃度はＬｏＭｙの方法（Ｌｏｗｒｙ，０，日．
，Ｎ．Ｊ。

Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ，Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ，Ｒ．Ｊ．
Ｒａｎｄａｌｌ（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
１９３，２６５）に従って測定し、対照には牛血清アル
ブミンを用いた。上記最終工程で得られた物質の純度を
ポリアクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度７．
５％、ＩＮＫＯＨ−氷酢酸緩衝液（ｐＨ４．３））ディ
スク電気孫勤法によって検定した。

実験方法は、Ｊ．Ｖ．Ｎねｉｚｅｌ．Ｊｒの方法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ＄．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９６
３，１３ ４８３）によつた。

尚、ゲル１本当りの試料は３０山夕（蛋白質として）、
通電は４ｍＡで２時間、染色はアミド・ブラック１肥、
脱色は７％酢酸溶液による。得られた結果を第５図（ゲ
ル状態図及びデンシトメータによる泳敷図）に示す。こ
の結果、最終工程による試料は不純物を全く含まない単
一物質であり且つ後記実施例Ｗで定義のインシュリン分
泌増強活性は単離されたこの物質に一致することが確認
された。この物質のサブュニツト構成を見るため、ＡＬ
．Ｓｈａｐｉｌｏの方法（Ａ．Ｌ．Ｓｈａｐｉｌｏ ｅ
ｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
ｃｏｍｍ．，１９６７，２８ ８１５）により、ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）ディスク電気泳動法を次の
通り実施した。１％ＳＤＳ，１％メルカプトェタノール
，４Ｍ尿素に本物質５０仏タノチュープ（蛋白質として
）を加え３７ｏ０、２時間インキュベートした後、この
混合物を１％ＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲ
ルにアプライし、８ｍＡ／ゲル１本当り、４時間通電し
、クマシ−（Ｃ肌ｍｓｉｅ）ブルーで染色、７．５％酢
酸で脱色。

得られた結果を第６図（ゲル状態図及びデンシトメータ
による漆動図）に示す。

２ 百日核１相菌東浜株（耽ｒｄｅｔｅｌｌａＰｅｒｔ
ｕｓｓｉｓＰｈａｓｅｌ，ＴｏｈａｍａＳｔｒａｉｎ）
の凍結乾燥保存菌株（ゴヒ里大学薬学部微生物学教室提
供）を脱繊維馬血液を２０％含む歌ｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇ
ｏ山宅地（８０培地）で３７０３日間培養した後、ＢＧ
斜面培地で３７０３０〜２岬時間培養し、下記第３表に
組成を示すイオン交換樹脂加半合成液体培地（Ｃｏｈｅ
ｎ−Ｗｈｅｅｌｅｒの変法液体塔地＝ＣＷ塔地）２００
の‘を分注した５００の‘の振盤コルベンに１白金耳接
種し、３７０２０〜２４時間振燈培養した。

この培養液の菌量を分光光度計（波長 ６５Ｍｍ）で測定し、加えた時の菌量が最終濃度０．０
７〜０．１５×１ぴ個／磯となるようにイオン交換樹脂
力にＷ培地１〆を分注した２〆の振濠コルベンに加え、
３７０４錨時間振燈培養（振盤回数１００〜１２０回／
分）を行なった。

得られた４潮時間振濠培養液を５がｏで３び分間加溢し
た後、４℃で遠心分離（１５００比ｐｍ）して培養上情
液と菌体とに分離した。

第３表 Ｃｏｈｅｎ−Ｗｈｅｅｌｅｒの変法塔地組成（液体半合
成培地）カザミノ酸 １０夕酵母
エキス １夕リン酸二水素カリ
ウム ０．５タ可溶性澱粉
２夕０．５％硫酸鋼液
１私１％塩化カルシウム液 １の
‘４％塩化マグネシウム液 １凧【ポリベ
プトン ５夕１％シスチン液
２．５の上０．５％硫酸鉄液
１の【塩化ナトリウム
２．５タ蒸留水を加え総量ｌｏｏ０泌とし２０
％ＮａＯＨ水溶液でｄＨ７．２に調整後、陰イオン交換
樹脂（ダイヤイオンＳＡ−２０ＡＰ：三菱化成■製）３
夕を加え１２１℃で１５〜２０分間高圧蒸気滅菌して使
用した。

前記のようにして得られた培養上情１０そをハイドロキ
シアパタィトカラム（生化学工業株式会社製）（カラム
サィズ５×２の、流速６０Ｍ／ｈｒ）に通し、次いで０
．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００の‘で洗浄
し、更に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００Ｍ
を流す。最終的に０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９Ｍ塩化
ナトリウムを含む。ｐＨ７．０）を流速１５私／ｈｒで
流し、目的とする活性因子を漆出した。その活性因子ポ
リエチレングリコール（平均分子量２００００）で約１
５のとまで濃縮した後、蒸留水２〆に対し４回計２４時
間透析し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１夕
に対して４回計２独特間透析平衡化する。

これを同一緩衝液で平均化したカルボキシメチルセフア
ロースＣＬ−曲（ファルマシアファインケミカルス社製
、カラムサィズ：１．５×１０の）カラムに通した。こ
のカラムに吸着されない物質には全く活性は存在しなか
ったが、次いでリン酸緩衝液のモル濃度を０．１Ｍにｐ
Ｈを７．０に上げ、更に塩化ナトリウム０．８Ｍを加え
て溶出された蛋白質に一致した活性因子が得られた。こ
の活性因子を約１０の‘に濃縮し、次いで蒸留水２のこ
対して４回計２４時間透析した。更に０．０１Ｍ酢酸緩
衝液（０．１Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ４．ふ又は０．
１Ｍ塩化リチウム−塩酸ｐＨ４．５）１そに対して４回
計２４時間透析平衡化した。この溶液を同一緩衝液で平
衡化した、ｐ−アセトキシマーキユリアニリンーセファ
ロースａけＢ（下記注の調整法参照、サイズ：１．２×
８ｃｍ）カラムに流速５の‘／ｈｒで流し同一緩衝液で
充分に洗浄（約２００肌使用）した後、吸着された物質
は０．０１Ｍ山一システィンを加えた同一緩衝液で溶出
した。ここで非吸着部には活性因子は全く含まれず、最
終溶出部に集中して得られた。この活性因子を蒸留水２
のこ対して６回計４斑時間透析後、凍結乾燥して淡褐色
粉末７．３の９を得た。本品は第７図に示す如くディス
ク電気泳動（ｐＨ４．３ゲル使用）で単一なバンドを与
え、等露点ｐＨは７．８±０．５を示した。またその組
成は、蛋白質約９２重量％、糖質１．８〜５．母重量％
及び脂質０〜２重量％であり、かつアミノ酸組成および
組成比は、第４表に示す通りであった。また、ゲル炉過
法（バイオゲルｐ−１５Ｍ吏用）、カラムサィズ：１．
８×９５弧、緩衝液：０．０１Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ４．５
）により分子量は５１０００±４３００と推定された。
以上の精製工程における活性の回収率、精製度等は第５
表に示す通りであった。またＳＤＳディスク電気泳動（
１％ＳＯＳ、１％メルカプトェタノール、４Ｍ尿素）で
第８図の如く３つのバンドを与えるた。インシュリン分
泌増強活性は１，私９Ｕ／山夕であり急性毒性値ＬＤ５
０はマウス１１２３２山夕／ｋ９、マウス子１７４ｒ夕
／ｋ９であった。注）ｐーアセトキシマーキュリアニリ
ン （ＰＡＭＡ） ーセフアロース即位の調整法： ＣＮＢｒ−活性化セルフアロースａＭＢ（ファルマシア
ファインケミカルス社製）４夕をｌｏ‐３ＮＨＣとＩＺ
を用い、グラスフィルター上で洗浄、膨潤を繰り返す。

別に０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ塩化
ナトリウム含有、ｐＨ８．３）の６０％ジメチルホルム
ァミド溶液５０の‘に１７２の９（０．靴Ｍ）のＰーア
セトキシマーキユリアニリンを熔解したものを調整して
おく。ゲルの洗浄、膨？閏が完了したら直ちにこの溶液
を加え、室温（２２〜２〆０）で２時間よく振縁混合す
る。反応終了後同一緩衝液でよく洗浄後、ＩＭエタノー
ルアミン（ｐＨ９．０）５０肌をゲルに加え室温で２時
間よく振縄混合する。次いでゲルをグラスフィルターで
吸引炉適し、０．１Ｍ棚酸緩衝液（ｐＨ８．５）１夕と
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）ＩＺで交互に数回に
分けて洗浄し、最終的に０．０１Ｍ酢酸緩衝液（０．１
Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ４．５）又は０．１Ｍ塩化リ
チウム一塩酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化して使用す
る。また予め１％メルカブトェタノールを含む同緩衝液
でゲルを処理した後、同緩衝液で充分に洗浄して平衡化
し、使用する。第４表 アミノ酸組成（６Ｎ−塩酸１１０℃１６時間加水分解）
〃Ｍ／１００〃Ｍ第 ５ 表 実施例 ０ 要素物質の製造及び精製 −１ 精製したインシュリン分泌増強活性因子（実施例
１−１の精製標品）２０の９を母け尿素および０．秋塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０
）３叫中に溶解し、３７℃で２時間保った後、同じ緩衝
液で平衡化したセフアクリルＳ−２００力ラム（フアル
マシア・フアイン・ケミカルズ社製）（１．５×９＆ス
）を用いてゲルろ化を行なった。

この結果を第９図に示した。インシュリン分泌増強活性
因子はこの操作により３種の分子量の異なる構成成分（
前記の通り分子量の大きい順に、ＫＳ−１，ＫＳ−０及
びＫＳ一ｍと命名）に分離された。これ等の構成成分は
さらに製精度を高める目的で、各分画を集め、濃縮度、
同じカラムにより再ゲルろ過を行なった。−２ 精製し
たインシュリン分泌増強活性因子（実施例１一２の精製
標品）２０雌を、母Ｍ尿素を含む０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８．５）３泌に溶解し、３７０、２時間保持後
、同じ緩衝液で平衡化したＤＡＥＥ・セルロースカラム
（セルバ社製）（１．５×２０仇）に流す。

ＫＳ−ｍはこのカラムに吸着せず通過して来るが、ＫＳ
−１およびＫＳ−川ま吸着される。ＫＳ−１は母Ｍ尿素
を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて溶出
され、又、ＫＳ−Ｄは０．０８Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
．０）にて溶出される。この溶出パターンを第１０図に
示した。これ等の構成成分の精製度を更に高める目的で
、濃縮後、乳け尿素および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨＯ．７）で平衡化したセ
フアクリルＳ−２００力ラム（フアルマシア・フアイン
・ケミカルズ社製）（１．５×９５の）でゲルろ過を行
なった。−３ 上記各例で単離精製された各要素物質は
、第１１図に示す通り、ディスク電気泳動的に単一物質
であることが確認された。

又、インシュリン分泌増強活性因子と各要素物質とをＳ
ＤＳ・ディスク電気泳動法により比較検討した結果を、
第１２図に示す。

図より、ＫＳ−１は活性因子の高分子側二つのサブュニ
ツトを１：１の比率で有しており、ＫＳ−川ま活性因子
の中間の分子量のサブュニットに対応し、ＫＳ−ｍは低
分子量のサブュニットと一致している。尚、各要素物質
の物性値等は、前記“要素物質及び会合物資の諸性質”
の項に詳記した通りである。又、各電気泳動の実験条件
は、実施例１一１に準ずる。実施例 ｍ 会合物質の製造及び精製 実施例０で得られた要素物質ＫＳ−１，ＫＳ−ロ，ＫＳ
−ｍは、任意な組み合せにより会合し、インシュリン分
泌増強活性を示すＫＳＡ−１（ＫＳ−１とＫＳ−ｍとの
会合）、ＫＳＡーロ（ＫＳ−ロとＫＳ一ｍとの会合）、
ＫＳＡ−ｍ（ＫＳ−１とＫＳ−０とＫＳ−ｍとの会合）
およびＫＳＡ−Ｗ（ＫＳ−１とＫＳ−０との会合）と前
記の通り夫々命名された新規な会合物質を生成する。

ＫＳＡ−１，ＫＳＡ−０，ＫＳＡ−ｍおよびＫＳＡ−Ｎ
を製造する最適条件は、ＫＳＡ−１については、ＫＳ−
１とＫＳ−ｍを蛋白量比５：１で水溶液中で混合し、ｐ
Ｈを７．０に調整し、３７０で２独特間以上振とうする
。

又、ＫＳＡ一０‘ま、ＫＳーロとＫＳ−ｍを蛋白量比２
：１で混合し、ｐＨを７．０に調整し、３７００で１時
間以上振とうする。ＫＳＡ−ｍはＫＳ−１とＫＳ−０と
ＫＳ−ｍを蛋白量比５：２：２で混合し、ｐＨを７．０
に調整し、３７０で２独寿間振とうする。ＫＳＡ一Ｗは
、ＫＳ−１とＫＳ−０を蛋白量比２：１で混合し、ｐＨ
を７．０に調整し、３７０で２岬時間振とうする。以上
の条件で生成した会合物質ＫＳＡ−１，ＫＳＡ−ロ，Ｋ
ＳＡ−ｍおよびＫＳＡ−Ｗは９５％以上の収量で得られ
るが、禾会合の要素物質を除去する為に、２Ｍ尿素およ
び０．９Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で、平衡化したセフアクリルＳ一２００
力ラム（フアルマシア．フアィン・ケミカルズ社製）（
１．５ｘ９５凧）でゲルろ過を行なう。

この操作により全ての会合物質はディスク電気泳動的に
単一な物質として得られる。この製造過程で、上述した
様な最適条件をはずしても会合物質は得られるが、その
生成収量は著しく低下する。尚、本例で単機、精製され
た各会合物質の物性値等は、前記“要素物質及び会合物
質の諸性質”の項に記載した通りである。

実施例 Ｗ 薬理効果 −１ インシュリン分泌増強活性測定法 各活性物質の当該活性は種々のインシュリン分泌刺激物
質に対する動物の反応性で測定出釆るが、通常はグルコ
ースを刺激物質として用いる。

ｏ 検定用便用動物ウィスター系雄性ラット（体重１３
０〜１４０夕）ｏ 試験方法各力価の活性物質を生理食
塩液に溶解し、その０．２の‘をエーテル麻酔下で股静
脈内に注入し、３日後にインシュリン分泌増強活性を測
定する。

なお実験開始前１８〜２０時間絶食させる。測定方法は
、ラット尾静脈より０．１の【の血液を採取後、直ちに
３０％グルコース溶液を体重１００夕当り１のＺ腹蛭内
に投与し、正確に１５分後、０．１舷の血液を再び採取
する。インシュリン分泌増強活性は、グルコース投与前
、後の血糖値および血中インシュリン値の差より求める
。血糖値はグルコースオキシダーゼ法、インシュリンは
二抗体法にて測定する。血糖値及びインシュリンの測定
方法は夫々下記文献及びキットによる。皿糖値：グルコ
ースオキシダーゼ法 Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，日，一Ｕ．，ａｎｄ Ｂｅｍｅｔ
，Ｅ．ｉｎ“ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍ
ａｔｊｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ”Ｂｅｒｇｍｅｙｅて
， 日．一 Ｕ．， ｅｄＳ， Ｎｅｗ ＹｏｒｋＡｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ Ｐ １２３（１〜６３）グル
コスタツトインシュリン：二抗体法 Ｍｏｔｇａｎ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｒａｚａｒｏｗ，Ａ
．Ｄｉａｂｅｔｅｓ１２ １１５（１９６３）インシュ
リンリアキットーダィナポット社製まず以下の式に従っ
た活性物質投与群休び対照群ラットの△１／△Ｇ値を求
める。

△１／Ａ．Ｐ【〆０／−ン グ〃コース技与後の風中インクュリソ値‘〆０イ〆）‐
クル３一ス技．与鮒の畑中インシュリン櫨【１０入り）
クルコ−ス投与後の山鰭は【ね／山）−ク〃コ−ス技‐
Ｓ髄の舷橘は【鱗ノＹ．，尚、血糖値を活性の計算に用
いるのは分泌さるインシュリン量が血糖値によって大き
く影響されるためである。

次に活性物質の力価は、単位（Ｕｎｉｔ）＝（本物質投
与群ラツトの平均△１′△Ｇ−対照群の平均△１／△Ｇ
）ＸＩ。

〇対照群の平均△１′△Ｇで求める。

各物質の比活性は力価単位を、重量で除したものとする
。

−２ 免疫増強活性測定法 活性物質の当該活性は種々の実験系に於いて測定可能で
あるが、１例として液性抗体産生系に於けるアジュバン
ト活性による方法を下記に示す。

ｏ 検定用便用動物ゥィスター系雌性ラット（体重１０
０±１０多）ゥィスター系雄性ラット（体重２５０±２
０のｏ 試験方法ブタ回虫（Ａｓｃａｎｓｓｕｕｍ）よ
り得たタンパク質にジニトロフェニール基を結合させた
ジニトロフェニールーアスカリス（ＤＮＰ−ＡＳ）を抗
原とし、この１の９と種々の活性物質を生理食塩水０．
５机上に溶解し、エーテル麻酔下で雌性ラットの前後股
の足蹴に皮内注射し、一次免疫とする。

また対照として、ＤＮＰ−ＡＳＩ他を百日核死菌１びｏ
個を含む生理食塩溶液０．５Ｍな洋解し前述と同様に感
作し一次免疫とする。一次免疫後５日目にＤＮＰ−ＡＳ
Ｏ．５ｍｏを含む生理食塩水０．５の‘をエーテル麻酔
下に、ラット背筋内に注射し、その後３日目に血清中の
抗ＤＮＰ−ＡＳ抗体価を測定する。測定方法は、ラット
尾静脈より０．１机‘の血液を、あらかじめへパリン加
生理食塩液０．２の上を入れた試験管に採取混合し、４
℃３００仇．ｐ．ｍ．１５分間遠心分離後、上清を採取
し、これを５倍希釈血清とする。次に、得られた血清中
の抗体価を多田らの方※法により受身皮膚アナフィラキ
シー反応を用いて測定する。血清中の抗体価は５肋以上
の青色斑を示す血清の最高希釈倍数を以つて示し、各際
品の抗体産生増強活性力価は１０２４倍の抗体価を示す
活性を１００仇ｍｉｔとする。比活性は力価単位を重量
で除したの 。※ Ｔａ地，Ｔ，ａｎｄ０ｋ山ｍ川ａ，
Ｋ．Ｊ．ｌｍｍｕ肌１．，１０６ １００２．（１９７
１）−３ インシュリン分泌増強活性および免疫増強活
性本発明者が単離精製したインシュリン分泌増強活性因
子は０甫乳動物のインシュリン分泌を促進し、且つ血糖
値を正常値に維持調整する作用を示し、さらには抗体産
生を増強し、細胞性免疫を高める作用をも示す。

本活性因子は極めて徴量でこれ等の作用を示す事から各
種糖尿病の治療および予防薬として、或いは免疫機能の
異常による疾患（例えば、悪性腫湯、再生不良性貧血、
リュゥマチ関節炎等）に対する医療として有用である。
本発明者は、この様な有効な二つの活性を示す活性因子
を、その構成成分に分離する事により、これ等の薬理作
用が不均一に分布する事を見し、出し、さらにこれらの
構成成分を会合させる事により、これ等二つの薬理活性
を個々に示す新規な単一物質を得る事に成功した。イン
シュリン分泌増強活性因子、その構成成分である要素物
質ＫＳ−１，ＫＳ−０，ＫＳ−ｍおよび会合物質ＫＳＡ
−１，ＫＳＡ−０，ＫＳＡ−ｍ，ＫＳＡ−Ｗは、前記方
法で測定したインシュリン分泌増強活性および免疫増強
活性を示した（第６表）。

インシュリン分泌増強活性は、活性因子の構成成分単独
では弱い活性しか示さないが、これ等構成成分の会合物
では、強い活性を示す様になる。

特にＫＳ−ｍを含む会合物では例外なく強い活性を示し
ており、この構成成分ＫＳ−ｍがインシュリン分泌増強
活性の発現に大きな役割を演じているものと考えられる
。第６表 ｌＡＰ：インシュリン分泌増強活性因子 −４ 副作用および毒性 本発明者が単離、精製したインシュリン分泌増強活性因
子は、きわめて微量で、インシュリン分泌増強活性を示
し、各種糖尿病の治療および予防薬として極めて有用と
考えられる。

しかしこのインシュリン分泌増強活性因子には、本来の
活性とは別に、白血球数を増加させる作用、ヒスタミン
に対する感受性を増加させる作用等のいわゆる副作用を
示し、さらに強い抗原性を示す事が判明した。特に抗原
性は、二回目以後の投与時にアナフイラキシーショック
等の童篤な結果をもたらしかねない。ィンシュリン分泌
増強活性因子は極めて徴量で、本来の効果を示すことか
ら、この副作用が発現する可能性は少ないものと考えら
れるが、より安全で有効な医薬品と言う意味からは、本
来の効果を低下させないで、副作用を除去する事が望ま
しい事は言うまでもない。本発明者はインシュリン分泌
増強活性因子の構成成分を分離し、再び会合させる事に
より、生成した新規物質、ＫＳＡ−１，ＫＳＡ−０，Ｋ
Ｓ−ｍおよびＫＳＡ−Ｎは、これ等の副作用が著しく減
弱されている事を発見した。

特にＫＳＡ−１はインシュリン分泌増強活性はィンシュ
ＩＪン分泌増強活性因子と同種度であるが、白血球を増
加させる「用は１′５０以下、ヒスタミンに対する感受
性を糟力させる作用は１／１０以下、又抗原性は１／３
０以下に弱した。さらにこれ等の結果を総括すると考え
られるが、急性葛性値（Ｌは。値）も減少する事が確認
された。＜各副作用の測定法＞ ｏ 白血球の増加活性の測定 ｄｄｙ系雌性マウス（５週令）に、試料を０．２の上尾
静脈に投与し、３日後に尾より２０ｒそ採血し、生理食
塩水にて、５０Ｍ苦１こ希釈したのち、ミクロセルカウ
ンターにて白血球数を測定する。

白血球増加活性は次式で示す。処理群の白血球増加分 対照群の白血球増加分 （文献） Ｓｔｅｐｈｅｎ ｌ．ＭｏｒＳｅ ａｎｄ
Ｋａｒｅｎ Ｋ．欧ｒａｙ；Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１
２９，５２３〜５５０，１９６９ｏ ヒスタミンに対す
る感受性増加活性の測定ｄｄｙ系雌性マウス（５週令）
１群６匹に、試料を０．２の【尾静脈に投与し、３日後
に１の９のヒスタミンを腹腔内に投与する。

ヒスタミン投与後１時間で生死の判定を行い、活性は死
亡数で表現した。（文献） Ｓにｐｈｅｎｌ．Ｍｏ岱ｅ
ａｎｄＪａ肥日．ＭｏｒＳｅＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１
４３，１４８３−１５０２，１９７６ｏ 抗原性ハート
レィ系雄性モルモット（体重２５０夕）一群６匹に、試
料を連日３回投与し、投与後２２日目に、同じ試料Ｉｍ
ｐを静脈内に注射し、その後のアナフィラキシーショッ
クによる死亡数を観察した。

■ インシュリン分泌増強活性因子およびＫＳ−１，Ｋ
Ｓ−０，ＫＳ−ｍの副作用：インシュリン分泌増強活性
因子およびＫＳ−１，ＫＳ−ロ，ＫＳ−ｍの副作用を第
７表に示した。

インシュリン分泌増強活性因子は、極めて徴量で、ヒス
タミンに対する感受性および白血球数を増加させ、又強
い抗原性を示す。

インシュリン分泌増強活性因子の構成成分、ＫＳ−１，
ＫＳ−Ｄ，ＫＳ−ｍは、一般的にこの活性因子より１ぴ
音以上副作用が低下している。特にＫＳ−１およびＫＳ
−ｍにはほとんど作用が見られない。しかしＫＳ−Ｄ‘
まこれ等の副作用を明らかに示しており、インシュリン
分泌増強活性因子の強い副作用はこのＫＳ−０が大きな
役割を演じているものと考えられる。■ ＫＳＡ−１，
ＫＳＡ−０，ＫＳＡ−ｍおよびＫＳＡ−Ｗの副作用：イ
ンシュリン分泌増強活性因子の構成成分より会合したＫ
ＳＡ−１，ＫＳＡーロ，ＫＳＡ一ｍおよびＫＳＡ−Ｗの
インシュリン分泌増強活性と副作用を一括して第８表に
示した。

インシュリン分泌増強活性因子に比較して、ＫＳＡ−Ｗ
を除く各会合物質は、インシュリン分泌増強活性はほと
んど変らない。

しかし白血球数を増加させる作用は各会合物質とも著し
く減弱している。特に、ＫＳＡ−１は、インシュリン分
泌増強活性因子の１ぴ音量を投与してもこの作用をほと
んど示さない。又ヒスタミンに対する感受性はＫＳＡ−
１は、約５び音の減少、ＫＳＡ−０，ＫＳＡ−ｍでも１
０〜１５倍の減少をみている。抗原性は、ＫＳＡ−１で
は、インシュリン分泌増強活性因子の１／３０以下に減
弱し、ＫＳＡ−０，ＬＳＡ一ｍでも約１／５に減弱して
いる。この様に会合物質は一般にインシュリン分泌増強
活性因子に比べて著しい副作用の減弱を見、特にＫＳＡ
−１については１０倍量に投与しても全く副作用は認め
られなかった。

インシュリン分泌増強活性因子の構成成分のうち、ＫＳ
−０がこの副作用の発現に大きな役割を演じている事か
ら、この成分を除去したＫＳＡ−１は当然の事ながら富
。作用が著しく減少しているものであろう。■ 毒性： インシュリン分泌増強活性因子およびその構成成分：Ｋ
Ｓ−１，ＫＳ−０，ＫＳ−ｍおよびその会合物質：ＫＳ
Ａ−１，ＫＳＡ−０，ＫＳＡ−ｍ，ＫＳＡ一Ｗのマウス
における急性毒性値ＬＤ５。

（メタ／ｋｇ体重）を第９表に示した。第７表 ｌＡＰ：インシュリン分泌増強活性因子 ＬＰ活性：白血球数の増加活性 ＨＳ活性：ヒスタミンに対する感受性の増加活性ＡＳＡ
：抗原性第 ８ 表 ｌＡＰ ： インシュリン分泌増強活性因子ｌＡＰ活
性： インシュリン分泌増強活性ＬＰ活性 ： 白血球
数の増加活性 ＨＳ活性 ： ヒスタミンに対する感受性の増加活性Ａ
ＳＡ ：抗原性第９表 ｌＡＰ：インシュリン分泌増強活性因子 −５ 各活性に関する薬理効果の要約 以下、インシュリン分泌増強活性については前記実施例
ｍで得られた会合物質ＫＳＡ−１精製標品、免疫増強活
性については前記実施例０で得られた要素物質ＫＳ−０
精製際品をそれぞれ典型例として、各薬理作用等に付き
要約して示す。

Ａ インシュリン分泌増強活性に関する薬理効果の要約
ＫＳＡ−１はインシュリン分泌増強活性を主作用とし、
その他に耐糖能の良化作用、インシュリン分泌活性、ス
トレプトゾトシン誘起糖尿病の治療を促進する作用、更
に遺伝性糖尿病の耐糖能を改善するなど、薬理的に有用
な効果がみられる。

更に、これらの作用は本物質の１回きりの投与で、いず
れも数週間から数ケ月にわたって持続する。これらの活
性はマウス・ラット及び犬において詳細に検討されたが
、各種共に全く同様の現象が観察されることから本物質
の薬理作用には種差は影響しないと考えられる。本物質
は主に糖尿病治療薬として有用と考えられるが、現在糖
尿病に対する薬物療法は、インシュリン注射あるいは血
糖降下薬の経口投与のみでいずれも対症療法にすぎず、
殆んど不治の病と言ってさしつかえない。

しかもインシュリン注射のために毎日通院しなければな
らない繁雑さがあり、皿糖降下薬の投与では皿糖値の異
常低下の発現が常に危険視されている。本物質の特徴は
、これ自身インシュリン分泌活性を有するのみならず皿
糖値をいろいろな条件で高めた時（高皿糖状態、特に摂
食時に類するグルコース負荷時）にのみ血中インシュリ
ンを増加させて皿糖値をすみやかに正常に戻す作用があ
り、更に、この物質の利点としては、１回投与で数週間
から数ケ月にわたって活性が持続することである。従っ
て血糖値に対するインシュリン分泌の反応が低下した様
な場合にはこの物質の投与によりインシュリン分泌が再
賦宿化される。以上の点より、本物質は糖尿病、糖尿病
の合併症及び糖尿病が起因となる様々な成人病の治療薬
としてばかりでなく、前糖尿病状態への適用や、現在全
く治療法がなく悲惨な状態にある若年型糖尿病の予防及
び治療薬ならびに診断薬として有用である。動物実験例
の幾つかを下記に示す。

インシュリン分泌増強作用 実験条件は活性測定法の項と同様であるがラットへの本
活性物質投与３日別こ各インシュリン分泌刺激物質に対
する反応性を正常群と比較した（第１項表）。

最も生理的な因子であるグルコース投与では、グルコー
スの投与経路の違いにもかかわらず、対照群に比し顕著
な血中インシュリン濃度の増加がみられた。またグルカ
ゴン（１の９／ｋ９）、エピネフリン（２００〃夕／ｋ
９）などのホルモン刺激に対する反応性も著明に増加し
ていた。更に現在臨床で使用されている血糖降下薬であ
るトルブタミド（２００雌／ｋ９）、グリベンクラミド
（２の夕／ｋ９）のインシュリン分泌活性の増強もみら
れた。以上の知見から、本活性物質投与はインシュリン
分泌刺激物質に対する生体の反応性を著しく増強するこ
とが確認された。第 １０ 表 注１ 血中インシュリン値、注２ 投与量／１００タ体
重、注３ 投与後の採血時間（分）、処置は、本物質を
１０００Ｕ本実験の３日前に静注した。

数値は各５例の平均値と標準誤差を示す。ビーグル犬に
ＫＳＡ−１を静脈内に投与し、３日後にグルカゴン（２
５ムタ／ｋ９体重、静注）あるいはグルコース（０．３
夕／ｋ９体重、静注）刺激を行いインシュリン分泌増強
活性を調べた。

実験開始前１鰯寺間絶食した。グルカゴン刺激時の実験
結果を第１１表に示した。

５０Ｕ（活性物質として、以下同様）／ｋ９（体重）で
弱いながらグルカゴン投与５分後にインシュリン分泌の
増強が対照群と比較してみられ、投与量の増加と共にイ
ンシュリン分泌の増強がみられ、１０００Ｕ／ｋ９でほ
ぼ反応は最高に達した。

以上の結果以外にも、グルコース（経口投与、静脈内投
与）及びェピネフリンによっても同様にインシュリン分
泌作用の増強がみられたことから、犬においてもインシ
ュリン分泌刺激物質に対する反応性が本活性物質の投与
により著しく高まっていると考えられる。第 １１ 表 活性物質前処置犬におけるグルカゴン投与後のインシュ
リン分泌の増強注１ 〃Ｕノ秋各３例の平均値 耐糖熊良化作用 前記と同種のラットにおいて経口的にグルコースを負荷
し、負荷後の血糖値の減衰と血中インシュリン値の増加
を測定し耐糖能を判定した。

１８〜２加持間絶食後にグルコースをラットでは０．５
夕／１００タ体重投与した。

ラットで本活性物質処置群では対照群に比較し、皿中グ
ルコースの上昇は著明に抑制される一方、血中インシュ
リン値は明らかな増加をみせ、その後血糖億の正常化と
一致してインシュリン値はグルコース負荷前の値にすみ
やかに戻り、インシュリンの過剰分泌による低血糖の発
現はみられなかった（第１２表）。

従って、本活性物質処理敷物では、耐糖能が著しく良化
していることが示された。第 １２ 表 ラットにおける糠負荷後の皿糖値と血中インシュリンの
変動処置群は活性物質を本実験開始３日前に５００Ｕ静
脈内に投与した。

各５例の平均値 ±標準誤差作用持続性 本活性物質の各薬理活性は投与数時間後から発現し３〜
７日目に最高に達しその后徐々に各活性は低下するがラ
ツト（５００Ｕｎｉｔ）を用いての作用の持続性の実験
結果について述べる。

ラットで本活性物質投与１，３，７，１４，２１’４２
および６０日目にィンシュＩＪン分泌増強活性を調べた
。

その結果４２日目においてもなお充分な増強活性が示さ
れた（第１横長）。以上の結果から用量の関係でその作
用の強弱はあるが、作用は数週間から数ケ月持続すると
考えられる。

第 １３ 表 ※ ３０％グルコ−ス投与１５分後と投与前の血中イン
シュリンの差（〃Ｕイ秋） Ｂ 免疫増強活性についての要約 実施例０で得られたＫＳ−０精製標品マウスに於けるヒ
ツジ赤血球に対する抗体産生増強活性精製標品の５０皿
ｎｉｔｓと、ヒツジ赤血球２×１ぴ個を含むハンクス氏
液０．１叫をＣ５７Ｂ／６Ｊマウスの足藤皮内に注射し
、注射２週間後、マウスの尾静脈より採血し、血清を得
、血清中の赤血球凝集抗体値を測定した。

抗体値の測定は、各血清を生理食塩水溶液で倍々希赦し
た液０．１Ｍに、２％ヒツジ赤血球生理食塩液０．０１
の‘を加えよく混和後、３７ｑ０、２時間インキュベー
ション後の凝集像を観察し、凝集の認められる血清の最
大希釈倍数を以つて血清中の抗体価とした。その結果、
ヒツジ赤血球単独で免疫した場合の血清中の抗ヒツジ赤
血球抗体価は６４倍であるのに対し、本精製標品ととも
に免疫した場合には抗体価は１０２ぴ音を示し、あきら
かに、抗体産生の増強がみられた。従って、本精製標品
はヒツジ赤血球に対する抗体産生においてあきらかに、
アジュバンド活性を示すことからも、免疫機能に異常を
きたした種々疾患に対し、その治療に有用と結論される
。Ｃ 以上、詳述の通り、本発明各物質は、糖尿病の治
療および予防薬、免疫調節剤として極めて有用であり、
人体に対する有効量は、活性物質の比活性に応じて固形
物として、インシュリン分泌増強活性用途においては約
数１０Ｕｎｉｔｓ／ｋ９（体重）〜数万Ｕｎｉｔｓ／ｋ
９（体重）の範囲であり、免疫強活性用途については約
数１０Ｕｎｉｔｓ／ｋ９（体重）〜数万Ｕｎｉｔｓ／ｋ
９（体重）の範囲である。

患者に対する投与方法は、各活性用途とも静内投与が最
も有効であり、その他腹腔内、筋肉および皮下投与、あ
るいは消化管内への直授与、経口投与、直腸内投与およ
び舌下、皮内、粘膜、動脈、リンパ乃至気管投与も有効
である。投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐
剤、腸熔、胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示し得る
。注射液の最も単純な組成を例示すれば、インシュリン
分泌増強活性１００００Ｕｎｉｔｓ，ＮａＣＺ９燐およ
び滅菌蒸留水で１奴としたものをあげ得る。又、薬剤に
調合する際に、活性を劣化せしめることのない任意の他
成分を混合し得ることも当業者にとり自明である。

【図面の簡単な説明】

第１乃至１２図は、本発明実験説明図であり、第１図は
ハイドロオキシァパタィトカラムクロマトグラフィ一、
第２図はＣＭ−セフアロースＣＬ−磁力ラムクロマトグ
ラフィ‐、第３図はＣｏｎａ−セフアロース山Ｂ力ラム
によるアフイニテークロマトグラフイー、第４図はＢｉ
ｏーゲルーＰ−１００カラムによるゲル炉過、第５図は
Ｄｉｓｃ−電気決動図、第６図はＳＤＳ−Ｄｉｓｃ電気
泳動図、第７図はＤｉｓｃ−露気泳動図、第８図はＳＤ
Ｓ−Ｄｉｓｃ電気決勤図、第９図はゲル炉適法による要
素物質の分離、第１０図はＤＥＡＥ・セルロースカラム
クロマトグラフィー法による要素物質の分離、第１ １
図は要素物質のＤｉｓｃ電気漆勤図、第１２図は要素物
質のＳＤＳ−Ｄｉｓｃ電気泳動図である。 第１図 第５図 第２図 第３図 第４図 第６図 第７図 第８図 第９図 第１０図 第１１図 第１２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： （ＫＳ−I）ｌ（ＫＳ−II）＿ｍ（ＫＳ−III）＿ｎ（式
   中ＫＳ−Iは、ゲルろ過法による分子量が６３０００±
   ５２００；Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９７重量％以上、
   フエノール・硫酸法による糖質１．３±０．４重量％で
   あり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ
   ／１００μＭ）は、Ａｓｐ８．１，Ｔｈｒ８．５，Ｓｅ
   ｒ７．９，Ｇｌｕ９．６，Ｐｒｏ５．０，Ｇｌｙ１０．
   ０，Ａｌａ９．５，１／２Ｃｙｓ１．１，Ｖａｌ６．２
   ，Ｍｅｔ１．８，ＩＬｅ４．５，Ｌｅｕ６．５，Ｔｙｒ
   ７．６，Ｐｈｅ２．８，Ｌｙｓ２．１，Ｈｉｓ１．６，
   及びＡｒｇ７．３であり；等電点ｐＨ５．６±０．３且
   つ弱いインシユリン分泌増強活性を示す蛋白質性物質を
   示し、ＫＳ−IIは、ゲルろ過法による分子量が３１００
   ０±４５００；Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９５重量％以
   上、フエノール・硫酸法による糖質１．２±０．３重量
   ％であり、かつ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（
   μＭ／１００μＭ）は、Ａｓｐ９．３，Ｔｈｒ７．７，
   Ｓｅｒ９．８，Ｇｌｕ１１．８，Ｐｒｏ４．６，Ｇｌｙ
   ９．８，Ａｌａ１１．３，１／２ＣｙｓＮ．Ｄ．，Ｖａ
   ｌ７．４，Ｍｅｔ１．９，ＩＬｅ４．０，Ｌｅｕ５．３
   ，Ｔｙｒ６．２，Ｐｈｅ２．５，Ｌｙｓ１．９，Ｈｉｓ
   １．１，およびＡｒｇ５．４であり；等電点ｐＨ５．４
   ±０．４，且つ弱いインシユリン分泌増強活性を示す蛋
   白質性物質を示し、ＫＳ−IIIは、ゲルろ過法による分
   子量が１２５００±１５００；Ｌｏｗｒｙ法による蛋白
   質９６重量％以上、フエノール・硫酸法による糖質１．
   ５±０．６重量％であり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組
   成及び組成比（μＭ／１００μＭ）は、Ａｓｐ５．３，
   Ｔｈｒ４．８，Ｓｅｒ６．２，Ｇｌｕ９．６，Ｐｒｏ９
   ．３，Ｇｌｙ８．１，Ａｌａ９．３，１／２Ｃｙｓ２．
   ３，Ｖａｌ１０．２，Ｍｅｔ６．０，ＩＬｅ２．２，Ｌ
   ｅｕ８．６，Ｔｙｒ２．５，Ｐｈｅ４．５，Ｌｙｓ５．
   ８，Ｈｉｓ０．５，及びＡｒｇ４．８であり；等電点ｐ
   Ｈ８．３±０．３且つ前記物質ＫＳ−I又はＫＳ−IIの
   インシユリン分泌増強活性の発現に係る蛋白質性物質を
   示し、ｌ，ｍ及びｎは蛋白質性物質の重量比を示し且つ
   ｌは０乃至５の整数であり、ｍは０乃至２の整数であり
   及びｎは０乃至２の整数である。 但し、ｌ，ｍ及びｎが共に０とはならない。）で示され
   る蛋白質性活性物質。２ 蛋白質性活性物質が、式中、
   ｌが１で且つｍ及びｎが０で示される蛋白質性物質ＫＳ
   −Iであることを特徴とする特許請求の範囲第１項の蛋
   白質性活性物質。 ３ 蛋白質性活性物質が、式中、ｌが０でｍが１で且つ
   ｎが０で示される蛋白質性物質ＫＳ−IIであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質性活性物
   質。 ４ 蛋白質性活性物質が、式中、ｌ及びｍが０で且つｎ
   が１で示される蛋白質性物質ＫＳ−IIIであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質性活性物
   質。 ５ 蛋白質性活性物質が、式中、ｌが５で、ｍが０で且
   つｎが１で示される蛋白性会合物質ＫＳＡ−Iであつて
   、且つゲルろ過法による分子量７５０００±８５００；
   Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９６重量％以上、フエノール
   ・硫酸法による糖質１．３±０．３重量％、且つ等電点
   ｐＨ６．８±０．４の特性を示すことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の蛋白質性活性物質。 ６ 蛋白質性活性物質が、式中、ｌが０で、ｍが２で、
   且つｎが１で示される蛋白性会合物質ＫＳＡ−IIであつ
   て、且つゲルろ過法による分子量３５０００±４５００
   ；Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９６重量％以上、フエノー
   ル・硫酸法による糖質１．３±０．４重量％で、等電点
   ｐＨ６．３±０．３の特性を示すことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の蛋白質性活性物質。 ７ 蛋白質性活性物質が、式中、ｌが５で且つｍ及びｎ
   が２で示される蛋白性会合物質ＫＳＡ−IIIであつて、
   且つゲルろ過法による分子量８５０００±１３０００；
   Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９６重量％以上、フエノール
   ・硫酸法による糖質１．３±０．２重量％、等電点ｐＨ
   ８．２±０．５の特性を示すことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載の蛋白質性活性物質。 ８ 蛋白質性活性物質が、式中、ｌが２でｍが１で且つ
   ｎが０で示される蛋白性会合物質ＫＳＡ−IVであつて、
   且つゲルろ過法による分子量８８０００±６３００；Ｌ
   ｏｗｒｙ法による蛋白質９５重量％以上、フエノール・
   硫酸法による糖質１．３±０．３重量％で、等電点ｐＨ
   ５．６±０．４の特性を示すことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載の蛋白質性活性物質。