RO121474B1 - Polipeptide modificate chimic - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o polipeptidă modificată chimic, având activitate de factor de stimularea coloniei de granulocite, la un procedeu de producere a polipeptidei modificate chimic ?i la o compoziţie farmaceutică cu această polipeptidă.

Description

Prezenta invenție se referă la o polipeptidă modificată chimic, la un procedeu de producere a polipeptidei modificate chimic și la o compoziție farmaceutică pentru tratamentul unui pacient având un număr redus de granulocite sau trombocite folosind polipeptidă modificată chimic.

Sunt cunoscute polipeptide modificate chimic în care cel puțin una dintre grupările amino, grupările carboxil, grupările mercapto sau grupările guanidino din molecula de peptidă este modificată cu un derivat polialchilen glicol din WO 95/023165 și modificarea grupărilor de tiol libere din resturile de cisteină din molecula de peptidă din EP 0668353. Cu toate acestea, atunci când cel puțin una dintre grupările amino, grupările carboxil, grupările mercapto, grupările guanidino sau grupările de tiol libere din resturi de cisteină din molecula de peptidă este modificată cu un derivat polialchilen glicol, activitatea polipeptidei poate fi pierdută în totalitate sau în mare măsură.

De exemplu, activitatea interleukinei-15 dispare complet atunci când gruparea (sau grupările) ei amino sunt modificate cu polietilen glicol [J. Biol..Chem., 272: 2312 (1977)].

Nu se cunoaște nimic în legătură cu polipeptidă modificată chimic în care cel puțin una dintre grupările hidroxil din molecula de peptidă este modificată cu un derivat polialchilenglicol.

O mare atenție a fost îndreptată către dezvoltarea:

(1) unei metode pentru analiza influențelor grupărilor hidroxil asupra activității polipeptidei, într-un caz în care gruparea hidroxil implicată este în partea activă a polipeptidei, (2) unei metode noi de modificare chimică, care să poată evita cazul probabil, în care activitatea biologică a polipeptidei este deteriorată în mod considerabil atunci când polipeptida este tratată printr-o metodă chimică convențională și polipetida modificată chimic obținută prin această metodă, și (3) unei metode noi, care să poată îmbunătăți rezistența polipeptidei față de protează, agenți de congelare-topire și agenți de denaturare.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a realiza o polipeptidă modificată chimic, un procedeu pentru producerea polipeptidei modificate chimic și o compoziție farmaceutică care să conțină polipeptidă modificată chimic.

Polipeptidă modificată chimic, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că cel puțin una din grupările hidroxil din molecula polipeptidei care conține grupări hidroxil și are activitate fiziologică sau farmacologică este modificată cu un agent chimic de modificare, care cuprinde un derivat de polialchilglicol.

Procedeul pentru producerea unei polipepetide modificate chimic cuprinde următoarele etape:

- selectarea unei polipeptide care conține grupări hidroxil și are o activitate fiziologică sau farmacologică și un agent chimic de modificare care cuprinde un derivat de polialchilenglicol,

- amestecarea polipeptidei selectate și a agentului chimic de modificare care cuprinde un derivat de polilachilenglicol selectat și, apoi

- reacția a cel puțin uneia din grupările hidroxil din molecula de polipeptidă cu agentul chimic de modificare ce conține un derivat de polialchilenglicol.

Compoziția farmaceutică înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că cuprinde o cantitate eficientă din polipeptidă modificată chimic, descrisă în oricare dintre revendicările de la 1 la 7 și un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- se poate evita scăderea activității biologice a polipeptidei atunci când polipeptidă este tratată prin metoda de modificare chimică convențională,

- se îmbunătățește rezistența polipeptidei la protează, la agenți de congelaredezghețare.

RO 121474 Β1 în ceea ce privește polipeptida care poate fi utilizată în prezenta invenție, poate fi folosită orice polipeptidă atâta timp cât ea conține o grupare hidroxil și are o activitate fiziologică sau o activitate farmacologică. Exemplele le includ pe acelea avâd o activitate cum este asparaginaza, glutaminaza, uricaza, dismutaza superoxid, lactoferin, streptochinaza, plasmin, deaminaza adenosin, interleukin-1 până la 13, inbterleukin-15, interferon-α, interferon-β, interferon-γ, factorul de stimulare a coloniei de granulocite umane (denumit aici în continuare hG-CSF) și altele asemenea.

Exemple de polipeptide având o activitate hG-CSF includ o polipeptidă cuprinzând secvența de aminoacizi reprezentată prin SECV. ID NR.: 1, o polipetidă cuprinzând o secvență parțială de aminoacizi a secvenței, o polipeptidă cuprinzând o secvență de aminoacizi în care anumite părți ale aminoacizilor secvenței sunt substituite cu diferiți aminoacizi [Nature, 319: 415 (1986), cererea de brevet japonez neexaminată publicată nr. 267292/88, cererea de brevet japonez neexaminată publicată nr. 299/88, WO 87/01132] și altele asemenea. Exemple specifice de polipeptide cuprinzând o secvență de aminoacizi în care anumite părți ale aminoacizilor secvenței de aminoacid reprezentate prin SECV. ID NR.: 1 sunt substituite cu diferiți aminoacizi (derivați hG-CSF) sunt arătate în tabelul 1.

Tabelul 1

Poziția fată de aminoacidul Nterminal (hG-CSFa SECV. ID NR.:1)

Amino acid substituit în diferiți derivați hG-CSF

a)

b)

c)

d)

θ)

0

g)

h)

i)

j)

k)

l)

Primul (Thr)

★

Val

Cis

Tyr

Arg

*

As n

Ile

Ser

*

Ala

*

Al 3/lea(Leu)

Glu

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Glu

Thr

Thr

*

Thr

*

AI4/lea(Gly)

Lis

Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Tyr

★

A15/lea‘Pro)

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

*

Arg

*

A117/lea(Cis)

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

* Aminoacid nesubstituit

Exemple de derivați polialchilen glicol includ derivați polietilen glicol, derivați polipropi- 37 len glicol, derivați copolimer polietilen-polipropilen glicol și alții asemenea.

Polipeptida modificată chimic din prezenta invenție poate fi produsă folosind un agent39 de modificare chimic cuprinzând un derivat polialchilen glicol de mai sus, și compușii reprezentați prin formula I care urmează pot fi exemplificați ca agenți de modificare chimică pre- 41 ferați.

Compușii includ derivați polialchilen glicol reprezentați prin formula:43

R¹-(M)_n-X-R² (I) (în care R¹ reprezintă o grupare alchil sau o grupare alcanoil);45

RO 121474 Β1

M reprezintă

- OCH₂CH₂ -, - OCH₂CH₂CH₂- sau

- (OCH₂CH₂)t - (OCH₂CH₂CH₂)_s - (în care r și s sunt identici sau diferiți, și fiecare reprezintă un număr întreg pozitiv în mod opțional modificabil); n este un număr întreg pozitiv în mod opțional modificabil; X reprezintă o legătură, O, NH sau S; și R² reprezintă:

R³

(în care R³ reprezintă OH, halogen sau

- X^a-(M^a)_na-R^1a- (în care X^a, M^a, R^1a și na are fiecare aceeași semnificație ca și X, M, R¹ și respectiv n de mai sus); și Y reprezintă halogen sau

-Z-(CH₂)_p-(O)_m-W (în care Z reprezintă O, S sau NH; și W reprezintă o grupare carboxil sau un derivat reactiv al acestuia, sau

NH/ . Hal

II

-C-OR⁴ (în care R⁴ reprezintă o grupare alchil, și Hal reprezintă un halogen); p este un număr întreg de la 0 la 6, și m este 0 sau 1)] >,

- (CO)_m - (CH₂)_t - W (în care t este un număr întreg de la 0 la 6; și m și W au aceeași semnificație cu cea definită mai sus),

NH/ . Hal

II

- (CH₂) - C - OR^4a (în care Hal^a, pa și R^4a fiecare are aceeași semnificație cu Hal, p și respectiv R^4a de mai sus),

- CO - NH- (CH₂)₄ - CH - W

R³ - CO - NH (în care R³ și W au aceleași semnificații ca cele definite mai înainte),

(în care R³, t și W au aceleași semnificații ca cele definite mai înainte),

RO 121474 Β1

(în care W are aceeași semnificație cu cea definită mai înainte) O

II

- csch₂cnh₂

II s

sau

- C - ΝΉ - R⁵ - W

O (în care R⁵ reprezintă un rest în care o grupare aminoacid și o grupare carboxil sunt 17 îndepărtate din aminoacid; și W are aceeași semnificație ca cea definită mai sus).

în ceea ce privește compusul de mai sus reprezentat prin formula I, exemple de gru- 19 pari alchil reprezentate prin R¹, R⁴ sau altele asemenea includ grupări alchil liniare sau ramificate având 1 până la 18 atomi de carbon, cum sunt metil, etil, propil, izopropil, butii, izobutil, 21 sec-butil, terț-butil, pentil, izopentil, hexil, izohexil, heptil, octil, izooctil, decil, dodecil, tetradecil, hexadecil, octadecil, și altele asemenea; exemple de grupări alcanoil reprezentate prin 23 R¹ includ grupări alcanoil liniare sau ramificate având 1 până la 18 atomi de carbon, cum sunt formil, acetil, propionil, butiril, valeril, pivaloil, pentanoil, lauroil, miristoil, palmitoil, stearoil, și 25 altele asemenea; exemple de halogen reprezentate prin R³, Y, Hal sau altele asemenea includ atomi de clor, brom și iod; exemple de derivați reactivi ai grupării carboxil reprezentată 27 prin W sau altele asemenea includ halogenuri acide cum este o clorură acidă, o bromură acidă și altele asemenea; esteri activi, cum este esterul p-nitrofenil, esterul N-oxisuccinimidă 29 și alții asemenea; și anhidride acide mixte cu monoetil carbonat, monoizobutil carbonat și altele asemenea; și exemple de aminoacid reprezentați prin R⁵ includ glicină, L-alanină, L- 31 valină, L-leucină, L-serină, D-alanină, D-valină, D-leucină, D-serină, β-alanină, și altele asemenea. Numărul întreg pozitiv reprezentat prin n, rsau s este 1 până la 20.000, preferabil 33 50 până la 5.000 pentru n și 1 până la 5.000 pentru r și s.

Derivații polialchilen glicol au o greutate moleculară de la 50 la 1.000.000, preferabil 35 3.000 până la 1.000.000.

O multitudine de grupări hidroxil pot fi prezente în molecula de polipeptidă și modifica- 37 rea a cel puțin uneia dintre aceste grupări poate fi suficientă atunci când polipeptidă este chimic modificată. 39

Exemple de grupare hidroxil în molecula de polipeptide includ o grupare hidroxil a unei serine sau al unui rest de treonină, preferabil o grupare hidroxil a unui rest de serină. 41 Polipeptidă poate fi modificată chimic prin reacția cu un agent de modificare chimic, cum este un derivat polialchilen glicol selectat dintr-un grup constând din derivați polietilen 43 glicol, derivați polipropilen glicol, derivați copolimer polietilen-polipropilen glicol și alții asemenea, cu o polipeptidă având o grupare hidroxil. 45

Exemple de metode pentru reacția grupării hidroxil dintr-o moleculă de peptidă cu un agent de modificare chimic cum sunt derivați polietilen glicol sau derivați polipropilen glicol 47 includ metode descrise în cererea de brevet japonez neexaminată publicată Nr. 316400/89,

RO 121474 Β1

8/otecf). Left., 14: 559-564 (1992), BIO/TECHNOLOGY, 8: 343-346 (1990) și altele asemenea și metode modificate ale acestora. Aceasta înseamnă că exemple specifice de metode care pot fi utilizate includ metode în care un derivat polietilen glicol sau un derivat polipropilen glicol este adăugat la o soluție apoasă dintr-o proteină, care a fost ajustată la o valoare a phului de 6 până la 10, într-o cantitate de 1 până la 200 moli per proteină și este lăsat să reacționeze la o temperatură de 0 până la 37°C timp de 1 h până la 3 zile.

Exemple de metode pentru reacția grupării hidroxil dintr-o moleculă de peptidă cu un derivat copolimer polietilen glicol-polipropilen glicol includ metodele descrise în cererea de brevet japonez neexaminată publicată nr, 176586/85, WO 89/06546, EP 0539167A2 și altele asemenea, și metode modificate ale acestora. Aceasta înseamnă că exemple specifice de metode care pot fi utilizate includ metode în care un agent de modificare chimic selectat dintrun grup constând din derivați copolimer polietilen glicol-polipropilen glicol este adăugat la o soluție aposă de proteină, care a fost ajustată la o valoare a pH-ului de 6 până la 10, într-o cantitate de 1 până la 200 moli per proteină, și este lăsat să reacționeze la o temperatură de 0 până la 37°C timp de 1 h până la 3 zile.

Modificarea a cel puțin unei grupări hidroxil din molecula peptidei cu un derivat polialchilen glicol prin metoda de mai sus poate asigura:

(1) o metodă pentru analiza influențelor grupării hidroxil asupra activității unei polipeptide, în cazul în care gruparea hidroxil implicată este în partea activă a polipeptidei, (2) o nouă metodă de modificare chimică care poate evita scăderea activității biologice a polipeptidei atunci când polipeptidă este tratată prin metoda de modificare chimică convențională, și cu această metodă este obținută o polipeptidă modificată, și (3) o nouă metodă care poate îmbunătăți rezistența polipeptidei la protează, agenți de congelare-desghețare sau agenți de denaturare, și polipeptidă modificată chimic având o rezistență îmbunătățită față de protează, agenți de congelare-desghețare sau agenți de denaturare.

Polipeptidă modificată chimic din prezenta invenție, descrisă în mod specific, este un exemplu în care o polipeptidă având o activitate hG-CSF este utilizată drept o polipeptidă.

O polipeptidă modificată chimic în care cel puțin o grupare hidroxil în hG-CSF sau un derivat al hG-CSF este modificată chimic cu un agent reprezentat prin formula care urmează (la) sau (Ib) poate fi exemplificată drept o polipeptidă modificată chimic în conformitate cu prezenta invenție.

Agentul de modificare chimică (la)

R¹ - (OCH₂CH₂)_n - X - R^2a (la) în care R¹, n și X au aceleași semnificații cu cele definite mai sus, și R^2a reprezintă:

_R3a

Y în care R^3a reprezintă OH, halogen sau

- X^B - (CH₂CH₂O)_nb - R^1b în care X^h, R^1b și nb fiecare are aceeași semnificație ca ce pentru X, R¹ și respectiv n.

RO 121474 Β1

Agentul de modificare (Ib):1

R³3

R¹—(M)_n—X—^ ^(U>>5

N=(

Z-iCH^-O-W* în care R¹, M, R³, Z, n și p au aceleași semnificații cu cele definite mai înainte; și W^a reprezintă o grupare carboxil sau un derivat reactiv al acesteia).11

Cel puțin o moleculă cu derivați polietilen glicol, derivați polipropilen glicol sau deivați copolimer polietilen glicol-polipropilen glicol este legată la hG-CSF modificat chimic sau la 13 un derivat hG-CSF modificat chimic. Astfel, hG-CSF modificat chimic sau un derivat hG-CSF modificat chimic poate fi utilizat ca amestec sau prin separarea compusului la care sunt ata- 15 șate una sau mai multe molecule.

Separarea hG-CSF modificat chimic sau a derivatului hG-CSF modificat chimic poate 17 fi efectuată folosind diferite tipuri de cromatografii, cum arfi cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia de filtrare cu gel, cromatografia cu fază inversă, cromatografia hidrofobică, și 19 altele asemenea, și metode cum ar fi fracționarea sulfatului de amoniu și altele asemenea, care sunt în mod obișnuit utilizate pentru separarea polipeptidelor cu lanț lung și altele 21 asemenea.

Gradul de modificare chimică poate fi confirmat prin monitorizarea schimbărilor în 23 ceea ce privește mobilitatea hG-CSF modificat chimic folosind o metodă de electroforeză cu gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacnlamidă (SDS-PAGE). 25

Conținutul de polipeptide în conformitate cu prezenta invenție poate fi măsurat prin următoarele metode de testare. 27

Metoda de testare 1:

Conținutul de polipeptide este măsurat prin metoda Lowry (Lowry O. H. și colab., 29 J. Biol. Chem., 193: 265 (1951)).

Metoda de testare 2: 31

Conținutul de polipeptide este calculat prin efectuarea SDS-PAGE în conformitate cu metoda Laemmli [U. K. Laemmli, Nature, 227: 680 (1970)], marcarea polipeptidei separate 33 de pe gel cu Comassie Briliant Blue și apoi măsurarea ei cu ajutorul unui cromatoscaner (CS930, Shimadzu Corp.). 35

Polipeptida modificată chimic în conformitate cu prezenta invenție poate fi utilizată ca atare sau în diferite formulări de dozare. 37

Preparatele farmaceutice din prezenta invenție pot fi produse prin amestecarea uniformă a unei cantități eficiente dintr-o peptidă modificată chimic drept ingredient activ cu un 39 agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Este de preferat ca aceste preparate farmaceutice să fie obținute sub forma unei unități de doză adecvată pentru administra- 41 rea lor pe cale injectabilă.

Injecțiile pot fi preparate ca soluții folosind o polipeptidă modificată chimic și un agent 43 purtător cuprinzând apă distilată, o soluție salină, o soluție de glucoză sau un amestec de soluțe salină și o soluție de glucoză. Ele sunt de asemenea preparate ca soluții, suspensii 45 sau dispersii pe cale convențională folosind materiale auxiliare adecvate. Ele pot fi de asemenea preparate prin uscare prin congelare a soluțiilor. Cu toate că condițiile de uscare 47 prin congelare nu sunt în mod special limitate, un produs obținut prin uscare prin congelare

RO 121474 Β1 este în general obținut prin congelare la temperatura de -50°C timp de 1 până la 5 h, uscare la temperatura limită de -20°C până la 0°C timp de 24 până la 48 hsub un vacuum cuprins între 50 și 150 mTorr și apoi uscare la o temperatură limită de 10 până la 30’C timp de 16 până la 24 h sub un vacuum de 50 până la 100 mTorr.

Preparatele de polipeptide modificate chimic pot conține de asemenea diferiți agenți purtători utilizați în mod obișnuit în scopuri farmaceutice, agenți de umplutură, diluanți, stabilizatori, agenți de prevenire a adsorbției și alții asemenea.

în cazul unei polipeptide modificate chimic în conformitate cu prezenta invenție, de exemplu un preparat de intensificare a creșterii neutrofilelor și trombocitelor, conținând hGCSF modificat chimic sau un derivat al hG-CSf modificat chimic, doza acestuia și schema de administrare pot fi decise în funcție de modul de administrare, vârsta și greutatea corporală a fiecărui pacient, maladia ce urmează a fi tratată și starea patologică a fiecărui pacient; cu toate acestea, un preparat farmaceutic conținând hG-CVSF modificat chimic sau un derivat al hG-CSF modificat chimic într-o cantitate de 15 pg până la 1,5 mg, preferabil 25 până la 500 pg, per adult este în mod obișnuit administrat odată până la 7 ori pe săptămână.

Exemple de metode de administrare a preparatului de polipeptide modificate chimic în conformitate cu prezenta invenție includ injecțiile intravenoase, injecțiile subcutanate și altele asemenea, precum și administrarea sub formă de supozitoare sau picături nazale.

în continuare se prezintă 24 de exemple de realizare a invenției și exemple de testare a activităților farmacologice ale polipeptidelor modificate chimic în conformitate cu prezenta invenție.

Exemplul de testare 1. Activitatea de promotare a creșterii a hG-CSF modificat chimic și a derivaților hG-CSF modificați chimic asupra celulelor lecemice NFS 60 la șoarece

Activitatea derivatului G-CSF, a derivatului hG-CSF modificat chimic și a G-CSF modificat chimic obținut în exemplul de referință 1 și exemplele 5,14,17 și 20, care sunt descrise aici în continuare, pentru a intensifica creșterea celulelor leucemice NFS 60 la șoarece [K. Holmes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 82: 6687 (1985)] a fost măsurată în conformitate cu metoda Asano et al. [Yakurito Chiryo, 19:2767 (1991)]. Fiecare compus, în concentrațiile respective arătate în tabelele 2-1 și 2-2, a fost lăsat să acționeze asupra celulelor rezultatele fiind de asemenea prezetnate în tabelele 2-1 și 2-2.

Tabelul 2-1

Compusul	Conc. (ng/ml)	Activitatea de promotare a creșterii celulelor NFS 60 (%)1)
Derivat hG-CSF din Ex. Ref 1	12,5	100
Monosubstituit 1 din Ex. 5	12,5	100
Monosubstituit 2 din Ex. 5	12,5	100
D/'-substituit din Ex. 5	12,5	100
Τ/7-substituit 1 din Ex. 5	12,5	72
Tri-substituit 2 din Ex. 5	12,5	93
HG-CSF	5	100
Monosubstituit 1 din Ex. 14	5	86
Monosubstituit 2 din Ex. 14	5	81
D/-substituit din Ex. 5	5	81

¹¹ Prezentată ca valoare relativă (%) în raport cu activitatea (= 100) a derivaților hG-CSF (12,5 ng/ml) obținuți în exemplul de referință 1 sau a hG-CSF (5 ng/ml)

RO 121474 Β1

Tabelul 2-2

Compusul	Conc. (ng/ml)	Activitatea de promotare a creșterii celulelor NFS 60 (%)1)
Derivat hG-CSF din Ex. Ref 1	25	100
7n-substituit 1 din Ex. 17	25	92
7n-substituit 2 din Ex. 17	25	80
D/-substituit din Ex. 17	25	99
Tri-substituit 1 din Ex. 20	25	65
Tri-substituit 2 din Ex. 20	25	72
D/-substituit din Ex. 20	25	98

¹⁾ Prezentată ca valoare relativă în raport cu activitatea (n=100) a derivatului hG-CSF (25 ng/ml) obținut în exemplul de referință 1.

Exemplul de testare 2. Efectul privind promotarea recuperării trombopeniei la șoareci, cu iradiația totală a corpului

Patru animale per grup de șoareci de sex masculin BALB/c (în vârstă de 6 săptămâni) au fost iradiați pe întreg corpul (denumiți aici mai jos ca fiind ”Rx) cu 3 Gy per șoarece de la o sursă de radiații 137 Cs (RI-433, produsă de Toshiba) și apoi crescuți pe un stelaj înzestrat cu mijloace de creștere în condiții libere de patogeni specificați (SPF-specified pathogenfree). Li s-a asigurat apă potabilă și hrană la discreție. Ca grup de control netratat, au fost crescuți, într-un mod similar cu cel de mai sus, șoareci care nu au fost iradiați în prealabil.

Fiecare dintre derivații hG-CSF modificați chimic, obținuți în exemplul 4, care va fi descris mai departe, a fost dizolvat în ser fiziologic și soluția de derivat hG-CSF modificat chimic a fost administrată subcutanat șoarecilor în ziua următoare iradierii (Rx) într-o doză de 5 pg/0,2 ml pe animal.

Au fost colectate în mod periodic probe de sânge din vena murină a bazei ochiului pentru a măsura numărul de plateleți cu ajutorul unui contor automat de numărare a celulelor sanguine (CC-180 A, produs de Toa lyo Denshi). Rezultatele acestui test sunt arătate în tabelul 3.

La șoarecii tratați cu o iradiere totală a corpului de 3 Gy, s-a observat o scădere con- 29 siderabilă a numărului de plateleți care a devenit minim la 8 până la 9 zile după iradiere (Rx) și apoi a crescut gradat, dar nu s-a recuperat la nivelul dinainte de tratamentul cu iradiere. 31 Pe de altă parte, scăderea numărului de plateleți a fost inhibată la șoarecii la care a fost administrat derivatul hG-CSF modificat chimic și numărul acestora a crescut substanțial în 33 și după a 8-a până la a 9-a zi, și s-a recuperat complet în cea de a 11-a până la a 12-a zi, la același nivel cu cel dinainte de tratamentul de iradiere. Un efect similar a fost observat la 35 grupul la care administrarea a fost efectuată în ziua următoare și la 5 zile după iradiere.

Tabelul 3 37

Derivat hG-CSF modificat chimic	Numărul mediu de paleți (%)1)
Zile după iradiere	0	6	8	10	11	12
Neadministrat		100	58,9	26,6	35,1	38,3	45,1
Di-substituit din Ex. 4		100	55,1	30,5	62,7	98,5	103,6

¹⁾Prezentată ca valoare relativă (%) în raport cu numărul mediu de plateleți (= 100) din grupul de control netratat prin iradiere pe întregul corp. 45

RO 121474 Β1

Exemplul de testare 3. Acțiunea de creștere a leucocitelor la șoarece

Folosind șoareci SPF/VAF (specie BALB/cAnNCrj, masculi, în vârstă de 8 săptămâni, 4 animale per grup) care au fost crescuți în prealabil după achiziționare de la Charles River Japan, a fost confirmată activitatea de creștere a leucocitelor la șoareci normali.

Un derivat disubstituit obținut în exemplul 5 (0,34 mg/ml) a fost diluat la 100 sau 10 pg/ml folosind ser fiziologic și a fost administrat pe cale subcutanală odată într-o cantitate de 10 μΙ/g (greutate corp șoarece). în acest fel, doza a fost de 1 sau 0,1 mg/kg. La grupul de control, s-a administrat o dată, pe cale subcutanală, doar ser fiziologic. Au fost colectate probe de sânge înainte de administrare și, în mod periodic, în ziua următoare, după administrare, și s-a măsurat numărul de celule sanguine periferice folosind un contor automat de numărare a celulelor sanguine (Sysmex F 800).

Drept rezultat, numărul de leucocite în ambele grupuri, la care s-a administrat compusul conform invenției a crescut la un nivel de 2,4 până la 2,6 ori mai ridicat decât cel din grupul de control la 2 zile după administrare. După aceasta, ca efect al medicamentului, acesta a scăzut la grupul căruia i s-a administrat 0,1 mg/kg și a revenit la un nivel similar celui din grupul de control la 4 zile de la administrare, dar numărul de leucocite în grupul căruia i s-a administrat 1 mg/kg a continuat să crească chiar la 2 zile după administrare și a atins nivelul de 3,5 ori mai ridicat decât cel din grupul de control la 4 zile de la administrare. După aceasta, numărul a revenit la un nivel similar celui din grupul de control în a 7-a zi de la administrare.

Exemplul 1. Prepararea soluției de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol

Derivatul hG -CSF preparat în exemplul de referință 1 a fost ajustat la 4,6 mg/ml folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal 7,5), și 12 ml din această soluție ajustată a fost amestecată cu 205,5 mg de ester N-hidroxisuccinimidă al propionatului de monometoxipolietilen glicol (M-SPA-20.000, produs de Shearwater Polymer) și amestecul a fost agitat la temperatura de 4°C timp de o zi și o noapte pentru a prepara o soluție de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol (1).

Exemplul 2. Prepararea soluției de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol

Derivatul hG-CSF preparat în Exemplul de referință 1 a fost ajustat la 4,6 mg/ml folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal cu 7,5), și 12 ml din această soluție ajustată a fost amestecată cu 469,8 mg de ester N-hidroxisuccinimidă al carboximetil-monometoxipolietilen glicolului (M-SCM-20.000, produs de Shearwater Polymer) și amestecul a fost agitat la temperatura de 4°C timp de o zi și o noapte pentru a prepara soluția de reacție a derivatului hGCSF modificat cu polietilenglicol (2).

Exemplul 3. Prepararea soluției de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol:

Derivatul hG-CSF preparat în exemplul de referință 1 a fost ajustat la 4,6 mg/ml folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal cu 7,5) și 6,6 ml de soluție astfel ajustată a fost amestecată cu 96,9 mg de ester N-hidroxisuccinimidă a propionatului de monometoxipolietilen glicol (M-SSPA-20.000, produs de Sherwater Polymer) și amestecul a fost agitat la temperatura de 4°C timp de o zi și o noapte pentru a prepara o soluție de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol (3).

Exemplul 4. Izolarea componetului modificat cu polietilen glicol

Soluția de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol (2) preparată în exemplul 2 (conținut de proteine, 55 mg) a fost diluată de 5 ori cu 20 mM de soluție tampon de acetat (pH egal cu 4,5) conținând clorură de sodiu 150 mM și trecută printr-o coloană cu

RO 121474 Β1 umplutură de Sefacril S-400 (produsă de Pharmacia) care a fost echilibrată în prealabil cu 1 aceeași soluție tampon și eluatul a fost fracționat. Prin această operație s-a obținut o fracțiune conținând în principal un component modificat cu două molecule de polietilen glicol (Di- 3 substituit) și o fracțiune brută conținând, în principal, un component modificat cu o moleculă de polietilen glicol (Monosubstituit). 5

Fiecare dintre aceste fracțiune a fost trecută printr-o coloană umplută cu TSK gel G 4000 SW_XL (7,8 mm diametru interior x 300 mm, produsă de Tosoh Corp.) pentru a se obține 7 o fracțiune conținând component Di-substituit sau component Monosubstituit. După aceasta, fiecare dintre aceste fracțiuni a fost purificată folosind SP-5 PW (21,5 mm diametru interior 9 x 150 mm, produsă de Tosoh Corp.) în următoarele condiții pentru a obține o specie de component principal D/-substituit (0,39 mg/ml x 3,0 ml) și o specie de component principal Mono- 11 substituit (0,55 mg/ml x 3,0 ml).

Condiții de purificare SP-5 PW:13

Coloană: SP-5 PW (21,5 mm diametru interior x 150 mm) (produsă de Tosoh Corp.) Detectare: 280 nm15

Soluția A: 20 mM soluție tampon acetat (pH 4,5)

Soluția B: 20 mM soluție tampon acetat (pH 4,5) conținând 0,5 M clorură de sodiu. 17 Eluția: eluție cu gradient de densitate liniar din soluția A în soluția B.

Exemplul 5. Izolarea componentului modificat cu polietilen glicol:19

Soluția de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol (1) preparată în exemplul 1 (conținut de proteine, 55 mg) a fost diluată de 5 ori cu 20 mM soluție tampon de 21 acetat (pH egal cu 4,5) conținând 150 mM de clorură de sodiu și trecută printr-o coloană umplută cu Sefacril S-400 (produsă de Pharmacia) care a fost echilibrată în prealabil cu 23 aceeași soluție tampon, și eluatul a fost fracționat. Prin această operație s-a obținut o fracțiune brută, conținând component modificat cu trei molecule de polietilen glicol (Tri-substituit), 25 o fracțiune brută conținând un component modificat cu două molecule de polietilen glicol (Disubstituit) și o fracțiune brută conținând un component modificat cu o moleculă de polietilen 27 glicol (Monosubstituit).

Fiecare dintre aceste fracțiuni a fost trecută printr-o coloană umplută cu TSK gel G 29 4000 SW_XL (7,8 mm diametru interiorx 300 mm, produsă de Tosoh Corp.) pentru a se obține o fracțiune conținând component 7r/-substituit, Di- substituit sau Monosubstituit. După 31 aceasta, fiecare dintre aceste fracțiuni a fost purificată folosind o coloană cu schimbători de cationi, SP-5PW (produsă de Tosh Corp.), în aceleași condiții descrise în exemplul 4, pentru 33 a se obține două specii de component principal trisubstituit (Tri-substituit 1: 1,4 mg/ml x 0,5 ml, Tri-substituit 2:1,0 mg/ml x 0,8 ml), o specie de component principal D/-substituit 8 35

0,34 mg /ml x 3,0 ml) și două specii de component principal monosubstituit (Monosubstituit 1: 0,48 mg/ml x 0,4 ml, Monosubstituit 2. 1,58 mg/ml x 0,5 ml).37

Așa cum este descris în ultimile exemple, gruparea hidroxil de la poziția 66 Ser numărată de la N-terminus a componentului Monosubstituit 1 și Met de la N-terminus a componen-39 tului Monosubstituit 2 au fost modificate cu o moleculă de polietilen glicol

Exemplul 6. Izolarea componentului modificat cu polietilen glicol:41

Soluția de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol (3) preparată în exemplul 3 (conținutul de proteine, 30 mg) a fost diluată de 5 ori cu 20 mM soluție tampon 43 de acetat (pH egal cu 4,5) conținând 150 mM clorură de sodiu și trecută printr-o coloană umplută cu Sefacril S-400 (produsă de Pharmacia) care a fost echilibrată în prealabil cu 45 aceeași soluție tampon și eluatul a fost fracționat. Prin această operațiune, s-a obținut o fracțiune conținând component modificat cu două molecule de polietilen glicol (D/'-substituit). 47

RO 121474 Β1

Aceasta fracțiune a fost trecută printr-o coloană umplută cu TSK gel G 4000 SW_XL (7,8 mm diametru interior x 300 mm, produsă de Tosoh Corp.) pentru a se obține o fracțiune conținând component D/-substituit.

Fracțiunea astfel obținută a fost purificată folosind o coloană cu schimbători de cationi, SP-5PW (produsă de Tosoh Corp.) în aceleași condiții cu cele descrise în exemplul 4, pentru a se obține o specie de component principal (0,43 mg/ml x 3,0 ml).

Exemplul 7. Cartografierea peptidei din derivatul hG-CSF

Derivatul hG-CSF preparat în Exemplul de referință 1 a fost ajustat la 2 mg/ml folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal cu 7,5) o porțiune de 1,0 ml din această soluție ajustată a fost tratată cu V8 protează (produsă de Seikagaku Kogyo) în aceleași condiții cu cele descrise în High Performance Liquid Chromatography of Protein and Peptide (II), Kagaku Zocan 117 (153-160 (1990); publicată de Kagaku Dojin) și apoi o porțiune de 50 pl din această soluție tratată a fost injectată într-o coloană cromatografică de înaltă performanță, pentru a efectua analiza cromatografică în următoarele condiții:

Condiții pentru analiza HPLC:

Coloană: PROTEINE & PEPTIDE C 18 (4,6 mm diametru interior x 250 mm, VYDAC) Soluția A: 0,1% acid trifluoroacetic

Soluția B: 90% acetonitril conținând 0,1% acid trifluoroacetic

Eluția: eluție cu gradient de densitate liniar de la soluția A la soluția B

Detectare: 215 nm

Debit: 0,5 ml/min.

Au fost găsite nouă pic-uri pe modelul analitic al derivatului hG-CSF digerat cu V8 protează. După ce pic-urile au fost separate și s-a efectuat analiza greutății lor moleculare, aceste pic-uri au fost delimitate așa cum este arătat în tabelul 4:

Tabelul 4

Cartografierea peptidei derivatului hG-CSF cu V8 protează

Pic No.	Fragment de Peptidă	Greutatea moleculară analizată (calculată)
1	94-98	524,5* (502)
2	20-33	1512,8 (1514)
3	34-46	1648,8(1649)
4	163-174	1438,9 (1440)
5	-1-19	2241,7 (2241)
6	124-162	4028,0 (4029)
7	105-123	2263,8* (2240)
8	47- 93	5060,5 (5060)
9	99-123	2836,9 (2836)

* Adăugare de Na

Exemplul 8. Estimarea poziției de legare a polietilen glicolului prin cartografierea peptidei

Fiecare dintre componenții Monosubstituit 1, Monosubstituit 2, D/'-substituit, 7/7-substituit 1 și Tri-substituit 2 obținuți în exemplul 5 au fost digerați cu protează pmtr-o procedură similară cartografierii peptidei derivatului hG-CSF descrise în exemplul 7.

RO 121474 Β1

Drept rezultat, dispariția sau reducerea considerabilă a picurilor specificate a fost 1 găsită în componenții Monosubstituit 1, Di-substituit, 777-substituit 2 obținuți în exemplul 5 (tabelul 5).3

Tabelul 55

Cartografierea peptidei componentului derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol purificat (comparație cu derivatul hG-CSF nemodificat)7

Component	Dispariția sau reducerea substanțială a nr. de pic-uri
Monosubstituit 1 din Ex. 5	8
Monosubstituit 2 din Ex. 5	5
D/-substituit din Ex. 5	5,8
Tn-substituit 1 din Ex. 5	3, 5,8
Tri-substituit 2 din Ex. 5	3, 5, 8

Se crede că pic-urile cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC) ale frag- 15 mentelor de peptide legate de polietilen glicol se modifică atunci când se compară cu modelul analitic al derivatului hG-CSF din exemplul 7. Pe baza rezultatelor din tabelul 4, s-a estimat 17 că poziția de legare a polietilen glicolului a fost cel puțin un rest de peptidă (incluzând o grupare amino N-terminal) corespunzând unui fragment de -1 până la 19 resturi de aminoacid 19 (pic-ul 5) al derivatului hG-CSF în cazul componentului Monosubstituit 2, D/'-substituit, Trisubstituit 1 și Τ/7-substituit 2 prezentați în exemplul 5. 21 în ceea ce privește componentul monosubstituit 2, s-a găsit că restul Met de lacapătul N-terminal al componentului monosubstituit 2 a fost modificat cu o moleculă de polietilen 23 glicol, întrucât secvența N-terminală a acestuia nu a fost observată atunci când secvența a fost măsurată folosind un aparat de măsurare a secvenței proteinelor PPSQ -10 fabricat de 25 Shimadzu Corp.

în ceea ce privește componentul trisubstituit 1 și trisubstituit 2, s-a estimat că polieti- 27 len glicolul a fost de asemenea legat la cel puțin un rest de peptidă (incluzând o grupare amino de la Lys) corespunzând unui fragment de 34 până la 46 resturi de aminoacid (pic 3) 29 a derivatului hG-CSF.

în plus, întrucât pic-ul 8 a dispărut sau a fost redus considerabil în fiecare component 31 monosubstituit 1, disubstituit, trisubstituit 1 și Tn-substituit 2, s-a estimat că polietilen glicolul a fost de asemenea legat la un rest de peptidă (excluzând grupările amino libere ale lisinei 33 și altele asemenea) corespunzând unui fragment de 47 până la 93 resturi de aminoacid a fiecăruia dintre acești componenți. 35

Exemplul 9. Estimarea poziției de legare a polietilen glicolului prin cartografierea peptidei: 37

Fracțiune de component disubstituit obținut în exemplul 6 a fost digerat cu o pretează printr-o procedură similară cu cartografierea peptidei derivatului hG-CSF descrisă în 39 exemplul 7.

Dacă se compară cu modelul analitic al derivatului hG-CSF din exemplul 7, dispariția 41 sau reducerea considerabilă a pic-urilor specificate, arătată în tabelul 6, a fost găsită în componentul disubstituit, obținut în exemplul 6. 43

RO 121474 Β1

Tabelul 6

Cartografierea peptidei a componentului derivatului hG-CSF' modificat cu polietilen glicol purificat (comparație cu derivatul hG-CSF nemodificat)

Component	Dispariția sau reducerea considerabilă a nr. de pic-uri
D/-substituit din Ex. 5	5,8

S-a anticipat că pic-urile cromatografiei pe lichid de înaltă performanță ale fragmentelor de peptidă legate de polietilen glicol se modifică atunci când se compară cu modelul analitic al derivatului hG-CSF din exemplul 7. Pe baza rezultatelor din tabelul 5, similar cazului din exemplul 8, s-a estimat că pozițiile de legare ale polietilen glicolului au fost un rest de peptidă (incluzând gruparea amino N-terminal) corespunzând fragmentului de la -1 până la 19 resturi de amino acid și un rest de peptidă (excluzând grupările amino libere ale lisinei și altele asemenea) corespunzând unui fragment de la 47 până la 93 resturi de amino acid ale derivatului hG-CSF în cazul componentulti D/'-substituit arătat în exemplul 6.

Exemplul 10. Estimarea poziției de legare a polietilen glicolului prin cartografierea peptidei

Poziția de legare a polietilen glicolului la componentul disubstituit obținut printr-o procedură similară celei din exemplul 4 a fost examinată prin cartografierea peptidei într-un mod similar celui din exemplele 7 și 8. S-a estimat că polietilen glicolul a fost de asemenea legat la un rest de peptidă (incluzând gruparea amino de la N-terminal) corespunzând unui fragment de la -1 până la 19 resturi de amino acid și la un rest de peptidă (excluzând grupările amino libere ale lisinei și altele a semenea) corespunzând unui fragment de la 47 până la 93 resturi de aminoacid ale derivatului hG-CSF în cazul compunentului disubstituit prezentat în exemplul 4.

Exemplul 11. Purificarea peptidei modificată cu polietilenglicol

Un fragment de peptidă legată la polietilen glicol a fost izolat din componentul disubstituit prin următoarea procedură, în scopul de a examina legarea polietilen glicolului la resturile de amino acid în fragmentul de peptidă corespunzând poziției de la 47 până la 93 a resturilor de amino acid neconținând grupări amino libere, a derivatului hG-CSF sau a hG-CSF, care a fost poziția de legare a polietilen glicolului confirmată în componentul disubstituit din exemplele 4, 5 și 6, trisubstituit 1 și trisubstituit 2 din exemplul 5, monosubstituit 1 din exemplul 5, monosubstituit 1 și disubstituit din exemplul 14, disubstituit, trisubstituit 1 și trisubstituit 2 din exemplul 17 sau disubstituit, trisubstituit 1 și trisubstituit 2 din exemplul 20.

Aceasta înseamnă că 30 ml de fracțiune conținând component disubstituit drept component principal (concentrația proteinei, 2,2 mg/ml) au fost obținute cu ajutorul unei coloane cromatografice schimbătoare de cationi, SP-5PW, într-un mod similar celui din exemplul 5 din soluția de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol preparată într-un mod similar celui din exemplul 1. în continuare, acesta a fost digerat cu termolisină (produs de Sigma). Folosind o coloană filtrantă cu gel (Sefacril S- 300, produsă de Pharmacia), soluția de reacție a enzimei a fostfracționată pentru a obține fracțiunea de peptidă cu polietilen glicol legat (aproximativ 30 mg).

Rezultatul spectrometriei de masă (MALDI-TOF MS) a unei fracțiuni de peptidă a fost 22155,89 (Μ + H) și rezultatul analizei de amino acid a arătat Ser 2,7 (3), Pro 1,0(1), Leu 1,0 (1) și Cis 0,9(1).

Pe baza rezultatelor spectrometriei de masă și a analizei de amino acizi, s-a estimat că proba izolată prin procedura de mai sus a fost un fragment în care polietilen glicolul a fost legat la o peptidă a restului cu poziția 61 până la poziția 66 [rest de Leu Ser Ser Cys Pro Ser (leucil-seril-seril-S-amidometilcisteenil-prolil-serină] a derivatului hG-CSF.

RO 121474 Β1

Exemplul 12. Determinarea poziției de legare a polietilen glicolului cu ¹H-RMN: 1

O peptidă, Leu Ser Ser Cis Pro Ser (leucil-seril-seril-cisteinil-prolil-serină) corespunzând poziției de la 61 la 66 a resturilor de amino acid a derivatului hG-CSF a fost sintetizată 3 perintr-o metodă de sinteză a fazei solide de peptidă (PSSm 8, Shimadzu Corp.) și amidometilată în condițiile arătate în High Performance Liquid Chromatography ofprotein and Peptide 5 (II), Kagaku Zokan 117 (153-160 (1990); publicată de Kagaku Dojin) și apoi peptidă astfel amidometilată (leucil-seril-S-amidometilcisteinil-prolil-serină) a fost purificată cu ajutorul cro- 7 matografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC) cu fază inversă. O porție de 0,6 mg din peptidă amidometilată a fost dizolvată în dimetil sulfoxid substituit cu deuterium (d₆-DMSO) 9 pentru a efectua analiza ¹H-RMN (500 MHz). într-un mod similar, analiza ¹H-RMN a fost efectuată folosind 20 mg de peptidă cu polietilen glicol legat obținută în exemplul 11. Deplasarea 11 chimică a protonilor (alții decât cei având ca origine polietilen glicol) observată la fiecare analiză este arătată în tabelele 7 și 8. Din rezultatele obținute, toți protonii generați din grupările 13 γΟΗ a trei resturi Ser au fost confirmați în peptidă amidometilată obținută prin sinteză.

Pe de altă parte, s-au observat anumite fenomene în peptidă cu polietilen glicol legat, 15 obținută în exemplul 11, suplimentar față de semnalul protonilor generați din polietilen glicol, și anume faptul că protonul generat din gruparea γΟΗ de la poziția 66 a restului Ser a deriva- 17 tului hG-CSF nu a fost observat, faptul că β protonul din același rest Ser a fost deplasat la aproximativ 0,6 ppm - câmp magnetic inferior și faptul că protonul amido al aceluiași rest Ser 19 a dat un semnal larg în comparație cu alți protoni amido. Pe baza rezultatelor de mai sus a fost confirmat faptul că poziția de legare a polietilen glicolului a fost poziția 66 a restului Ser 21 al derivatului hG-CSF.

Tabelul 7 Deplasarea chimică (ppm) a protonilor în analiza RMN a peptidei amidometilate sintetizate

Rest	NH	CaH	ΰβΗ	Altele
Leu 61	8,06	3,86	1,52, 1,57	γΗ 1,67, 0CH3 0,92
Ser 62	8,66	4,47	3,57, 3,64	γΟΗ 5,13
	8,66	4,49	3,63	yOH 5,04
Ser 63	8,03	4,32	3,58	γΟΗ 4,85
	8,06	4,32	3,57	yOH 4,80
Cys64	8,19	4,68	2,63, 2,96	CH23,12, NH2 7,05, 7,42
	7,79	4,60	2,63, 2,90	CH23,12, NH27,10, 7,45
Pro 65		4,42 4,80	1,91,2,02 1,98, 2,20	γΗ 1,86, δΗ 3,61 γΗ 1,83, δΗ 3,45, 3,40
Ser 66	7,98	4,23	3,60, 3,70	γΟΗ 4,94
	8,40	4,24	3,80, 3,72	yOH 4,90

Notă: Cifrele scrise cu scrierea italică reprezintă Cis-Pro

RO 121474 Β1 în continuare urmează tabelul 8.

Tabelul 8

Deplasarea chimică (ppm, excluzând miezul de polietilen glicol) a protonilor în analiza NMR a peptidei modificate cu polietilen glicol izolată din derivatul hG-CSF modificat cu polietilen glicol

Rest	NH	CaH	ΰβΗ	Altele
Leu 61		3,66 3,73	1,44, 1,56 1,47, 1,60	yH 1,70, 0CH3 0,90 yH 1,67, 0CH3 0,90
Ser 62	8,51 8,90	4,43 4.37	3,57, 3,64 3,64	γΟΗ 5,17
Ser 63	8,03 8,06	4,30 4,21	3,60 3,58, 3,63	γΟΗ 4,85
Cys64	8,18 8,08	4,68 4,62	2,68, 3,03 2,67, 2,90	CH2 3,12, NH2 7,05, 7,43 CH23,12, NH2 7,02, 7,62
Pro 65		4,33 4,60	1,87,2,02 2,12, 2,04	γΗ 1,86, δΗ 3,67 yH 1,72, 1,83, δΗ 3,40, 3,52
Ser 66	7,88 7,66	4,28 4,21	4,17,4,32 4,16, 4,46

Notă: Cifrele scrise cu scrierea italică reprezintă Cis-Pro

Exemplul 13. Prepararea soluției de reacție a hG-CSF modificat cu polietilen glicol O porție de 4,0 ml dintr-o soluție de 4,0 mg/ml de hG-CSF preparată folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal cu 7,5) a fost amestecată cu 83 mg de ester N-hidroxisuccinimidă a propionatului de monometoxipolietilen glicol (M-SPA-20.000, produs de Shearwater Polymer) și amestecul a fost agitat la temperatura de 4°C timp de o zi și o noapte.

Exemplul 14. Izolarea componentului modificat cu polietilen glicol

Soluția de reacție modificată cu polietilen glicol, preparată în exemplul 13 (conținut de proteine, 16 mg) a fost diluat de 5 ori cu o soluție tampon de acetat 20 mM (pH egal cu 4,5) conținând 150 mM de clorură de sodiu și fracționat folosind o coloană cu umplutură de Sefacril S-400 (produsă de Pharmacia) care a fost echilibrată în prealabil cu aceeași soluție tampon. Prin această operație s-au obținut o fracțiune conținând în principal un component modificat cu două molecule de polietilen glicol (disubstituit) și o fracțiune brută conținând în principal un component modificat cu o moleculă de polietilen glicol (monosubstituit). Fiecare din aceste fracțiuni a fost introdusă într-o coloană umplută cu TSK gel G 4000 SW_XL (7,8 mm diametru interior x 300 mm, produsă de Tosoh Corp.) pentru a obține o fracțiune conținând componentul disubstituit sau monosubstituit. După aceasta, fiecare din aceste fracțiuni a fost purificată utilizând SP-5PW (21,5 mm diametru interior x 150 mm, produsă de Tosoh Corp.) pentru a se obține o specie de component principal disubstituit (0,61 mg /ml x 0,6 ml) și două specii de component principal monosubstituit (monosubstituit 1:0,46 mg /ml x 1,0 ml, monosubstituit 2: 0,61 mg/ml x 0,7 ml).

Exemplul 15. Estimarea poziției de legare a polietilenglicolului prin cartografierea peptidei

Fiecare dintre componenții monosubstituit 1, monosubstituit 2 și disubstituit, obținuți în exemplul 14, a fost digerat cu o protează printr-o procedură similară cartografierii peptidei derivatului hG-CSF, descris în exemplul 7.

RO 121474 Β1

Drept rezultat, dispariția sau reducerea considerabilă a pic-urilor specificate a fost 1 găsită atunci când s-a comparat modelul analitic al hG-CSF așa cum a fost găsit în exemplul 8. 3

Conform metodei similare celei din exemplul 8, poziția de legare a polietilenglicolului a fost estimată după cum urmează: 5

Monosubstituit 1:

Poziția a fost în interiorul fragmentului de peptidă (neincluzând grupările amino libere 7 ale lisinei și altele asemenea) corespunzând resturilor poziția 47 până la 93 ale secvenței de amino acid reprezentată prin SECV. ID NR.: 1, și a fost confirmat, în conformitate cu metoda 9 descrisă în exemplul 12 faptul că gruparea hidroxil de la Ser poziția 66 numărată de la capătul N-terminal a fost modificată cu o moleculă de polietilen glicol. 11

Monosubstituit 2

Poziția a fost în interiorul fragmentului de peptidă (incluzând gruparea amino de la N- 13 terminal) corespunzând resturilor de la poziția -1 până la 19 a secvenței de amino acid reprezentată prin SECV. ID NR.: 1, și a fost confirmat, în conformitate cu metoda descrisă în 15 exemplul 7, faptul că Met de la N-terminal a fost modificat cu o moleculă de polietilen glicol.

Di-substituit: 17

Fragmentul de peptidă (incluzând o grupare amino la N-terminal) corespunde resturilor de la poziția-1 până la 19 și un fragment de peptidă (neincluzând grupări amino libere 19 ale lizinei și alte resturi asemenea) corespunde resturilor de la poziția 47 până la 93 a secvenței de amino acid reprezentată prin SECV. ID NR.: 1. 21

Exemplul 16. Prepararea soluției de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol 23

Derivatul hG-CSF preparat în exemplul de referință 1 a fost ajustat la 0,9 mg/ml folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal cu 7,2) pentru a obține 600 ml de soluție ajustată. 25 în timp ce este răcită într-o baie cu gheață, soluția astfel obținută este amestecată cu 8,7 g de ester N-hidroxisuccinimidă a 2,4-bis (o-metoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s- 27 triazină obținută printr-o metodă similară celei din exemplul de referință 2, și amestecul este agitat la temperatura de 4’C timp de 48 h, pentru a prepara soluția de reacție a derivatului 29 hG-CSF modificat cu polietilen glicol (4).

Exemplul 17. Izolarea componentului modificat cu polietilen glicol 31

Soluția de reacție (4) a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol preparată printr-o metodă similară celei din exemplul 16 (conținutul de proteină, 40 mg) a fost trecută 33 printr-o coloană cu umplutură de Sefacril S-300 (produsă de Pharmacia) care a fost echilibrată în prealabil cu o soluție tampon de acetat 20 mM (pil egal cu 4,5) conținând 150 mM de 35 clorură de sodiu și eluatul format a fost fracționat. Prin această operație s-a obținut o fracțiune brută conținând un component modificat cu trei molecule de polietilen glicol (trisubstituit) 37 și o fracțiune brută conținând un component modificat cu două molecule de polietilen glicol (disubstituit) 39

Fiecare dintre aceste fracțiuni a fost purificată folosind o coloană cu schimbători de cationi SP-5PW (produsă de Tosoh Corp.) într-un mod similar celui din exemplul 4, pentru 41 a obține două specii de componente principale trisubstituite (trisubstituit 1: 0,49 mg/ml x 1,3 ml, trisubstituit 2: 0,57 mg/ml x 1,5 ml) și o specie de component principal disubstituit 43 (1,94 mg /ml x 1,2 ml).

Exemplul 18. Estimarea poziției de legătură a polietilen glicolului prin cartografierea 45 peptidei

Pozițiile de legare a polietilen glicolului la componenții disubstituit, trisubstituit 1 și tri- 47 substituit 2, obținuți în exemplul 17, au fost examinate printr-o procedură similară cartografierii peptidei descrisă în exemplele 7 și 8. 49

RO 121474 Β1

De asemenea, în componentele disubstituit, trisubstituit 1 și trisubstituit 2, obținute în exemplul 17, s-a estimat că polietilen glicolul a fost legat la un fragment de peptidă (incluzând gruparea amino de la N-terminal) corespunzând resturilor poziția-1 până la 19 a derivatului hG-CSF și unui fragment de peptidă (neincluzând grupările ammo libere ale lisinei și altele asemenea) corespunzând resturilor poziția 47 până la 93 a derivatului hG-CSF. în componentele trisubstituit 1 și trisubstitutit 2, s-a estimat că polietilen glicolul a fost de asemenea legat la cel puțin un fragment de peptidă (incluzând o grupare amino de la Lys) corespunzând resturilor poziția 34 până la 46 (pic 3) a derivatului hG-CSF.

Exemplul 19. Prepararea soluției de reacție a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol

Derivatul hG-CSF preparat în Exemplul de referință 1 a fost ajustat la 0,9 mg/ml folosind o soluție tampon de fosfat (pH egal cu 7,3) pentru a obține 560 mg de soluție ajustată, în timpul răcirii pe o baie de gheață, soluția astfel obținută a fost amestecată cu 22,4 g de ester N-hidroxisuccinimidă a 2,4-bis (o-metoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin, obținut printr-o metodă descrisă similară celei din exemplul de referință 4 și amestecul a fost agitat la temperatura de 4°C timp de 48 h pentru a prepara soluția de reacție (5) a derivatului hG-CSF modificat cu polietilen glicol.

Exemplul 20. Izolarea componentului modificat cu polietilen glicol

Sdoluția de reacție (5) a derivatului hG-CVSF modificat cu polietilen glicol preparată printr-o metodă similară celei din exemplul 19 (conținut de proteină, 15 mg) a fost trecută printr-o coloană cu umplutură de Sefacril S-400 (produsă de Pharmacia) care a fost echilibrată în prealabil cu o soluție tampon de acetat 20 mM (pH egal cu 4,5) conținând 150 mM de clorură de sodiu, și eluatele au fost fracționate. Prin această operație s-au obținut o fracțiune brută conținând un component modificat cu trei molecule de polietilen glicol (trisubstituit) și o fracțiune brută, conținând un component modificat cu două molecule de polietilen glicol (disubstituit)

Fiecare dintre aceste fracțiuni a fost purificată folosind o coloană cu schimbători de cationi SP-5PW (produsă de Tosoh Corp.) într-un mod similar celui din exemplul 4 pentru a obține două specii de component principal trisubstituit (trisubstituit 1:3,53 mg/ml x 0,4 ml, trisubstituit 2: 0,26 mg /ml x 2,1 ml) și o specie de component principal disubstituit (0,84 mg/ml x 1,2 ml).

Exemplul 21. Estimarea poziției de legare a polietilen glicolului prin cartografierea peptidei

Pozițiile de legare a polietilen glicolului a componenților disubstituit, trisubstituit 1 și trisubstituit 2 obținuți în exemplul 20 au fost examinate printr-o procedura similară cartografierii peptidei descrisă în exemplele 7 și 8. De asemenea, în componentele disubstituit, trisubstituit 1 și trisubstituit 2 obținute în exemplul 20, s-a estimat că polietilen glicolul a fost legat la un fragment de peptidă (incluzând gruparea amino de la N-terminal) corespunzând resturilor poziția-1 până la 19 a derivatului hG-CSF și unui fragment de peptidă (neincluzând grupările amino libere de lizină și altele asemenea) corespunzând resturilor poziția 47 până la 93 a derivatului hG-CSF. în componentul trisubstituit 1 și trinsubstituit 2 s-a estimat că polietilen glicolul a fost de asemenea legat la cel puțin un fragment de peptidă (incluzând gruparea amino de la Lys) corespunzând resturilor poziția 34 până la 46 a derivatului hG-CSF.

Exemplul 22. Rezistența la protează a polipeptidei modificate chimic

O porție de 0,5 ml din fiecare dintre componenții obținuți în exemplul 14 a fost trecută printr-o coloană filtrantă cu gel [Sefadex G-25 (NAP-5, produsă de Amersham Pharmacia)] care a fost echilibrată cu o soluție tampon de fosfat 10 mM (pH egal cu 5,0) și eluatele au fost recuperate în porțiuni a câte 1,0 ml.

RO 121474 Β1

Fiecare dintre aceste fracțiuni astfel recuperate a fost diluată cu o soluțe tampon de 1 fosfat 10 mM (pH egal cu 5,0), pentru a ajusta concentrația proteinei la valoarea de 0,2 mg/ml. 3

O porție de 2 ml din fiecare dintre fracțiunile astfel diluate a fost amestecată cu 0,2 mg /ml de termolisină (enzimă/substrat în raport de 1/50) și amestecul a fost lăsat să reacționeze 5 la temperatura de 30°C.

Probele au fost colectate în mod periodic din soluțiile de reacție în porțiuni de 100 pl 7 și amestecate cu 2 pl de acid acetic, pentru a completa reacția.

Folosind 50 μΙ din fiecare dintre probele reacției complete, analizele, cromatografice 9 de lichid de înaltă performanță au fost efectuate în următoarele condiții.

Condițiile analizei cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC):11

Coloană: TSK gel G 4000 SW_XL (7,8 mm diametru interior x 300 mm) (produsă de Tosoh)13

Detectare: 280 nm

Faza mobilă: 150 mM clorură de sodiu/20 mM acetat de sodiu (pH egal cu 4,5)15

Debit: 0,8 ml/min

Componenții Monosubstituit 1 și 2 au fost eluați la un timp de retenție de 12 min. 17 Atunci când acești componenți monosubstituiți au fost hidrolizați cu termolisin, pic-ul detector găsit la poziția corespunzătoare timpului de 12 min a scăzut astfel, încât gradul de hidroliză 19 a acestor componenți monosubstituiți cu termolisin a putut fi confirmat.

Tabelul 9arată modificările periodice în raportul rezidual al componențilorMonosubst- 21 ituiți, calculat din raportul descrescător al pic-ului detector găsit la poziția corespunzătoare timpului de 12 min. 23

Tabelul 9

Stabilitatea fată de termolisin 25

Timp de reacție (ore)	Monosubstituit 1 din Ex. 14	Monosubstituit 2 din Ex. 14
0	100	100
15	95	72
23	89	68

Pe baza rezultatelor arătate în tabelul 9 s-a găsit că componentul monosubstituit 1, în care Ser a fost modificat cu polietilen glicol a fost mai rezistent la termolisin decât compo- 33 nentul monosubstituit 2, în care N-terminus a fost modificat.

Exemplul 23. Stabilitatea polipetidei modificate la congelare-dezghețare: 35

O porție de 1 ml din fiecare dintre cele două specii de component monosubstituit obținute în exemplul 5 a fost trecută prin două coloane filtrante cu gel Sefadex G/25 (NAP-10, 37 produsă de Amersham-Pharmacia) care au fost echilibrate în prealabil cu soluție tampon de acetat de sodiu 5 mM (pH egal cu 4,5) sau cu soluție tampon de acetat de sodiu 5 mM (pH 39 egal cu 5,0) și eluatele de la fiecare coloană au fost recuperate în porțiuni a câte 1,5 ml.

Concentrația proiteinei în fiecare dintre aceste fracțiuni recuperate a fost ajustată la 41 valoarea de 300 pg/ml.

Fiecare dintre aceste fracțiuni astfel ajustate a fost împărțită în porțiuni a câte 500 μΙ, 43 congelate la temperatura de -30°C și apoi desghețate într-o baie cu apă la temperatura camerei. 45

RO 121474 Β1

Acest tratament de congelare-desghețare a fost repetat de patru ori și apoi cantitatea rămasă (randament de recuperare) din fiecare polipeptidă modificată a fost măsurată în condițiile cromatografiei de lichid de înaltă performanță (HPLC), filtrante cu gel, descrise în exemplul 22.

Rezultatele sunt arătate în tabelul 10.

Tabelul 10

Produs modificat cu polietilen glicol	Randament de recuperare (%) după patru tratamente de congelare-dezghețare
pH 4,5	pH 5,0
Monosubstituit 1 din Ex. 5	100	101
Monosubstituit 2 din Ex. 5	91,3	85,5

Ca urmare a rezultatelor arătate în tabelul 10, s-a găsit că componentul Monosubstituit 1 în care Ser a fost modificat cu polietilen glicol a fost mai stabil la congelare-desghețare decât componentul Monosubstituit 2, în care a fost modificat N-terminus.

Exemplul 24. Activitatea în ritm a polipeptidei modificate chimic

Activitatea a două specii de component Monosubstituit obținute în Exemplul 14 de a intensifica creșterea celulei leucemice NFS 60 la șoarece [K. Holmes și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 82:6687 (1985)] a fost măsurată în conformitate cu metoda Asano și colab., [Yakuri to Chiryo, 19: 2767 (1991)] prin următoarele două metode de diluție în serie.

O suspensie de celule spălate cu mediu (-) G-CSF a fost împărțită în porțiuni a câte 50 pl în godeurile unei plăci cu 96 de godeuri.

Componentul monosubstituit 1 obținut în exemplul 14 a fost ajustat la o concentrație de 25 ng/ml și o porție de 50 μΙ din soluția ajustată a fost adăugată la primul godeu și amestecată bine, pentru a ajusta soluția la 12,5 ng/ml.

O porție de 50 pl din soluție a fost îndepărtată din godeu, adăugată la cel de al doilea godeu și amestecată bine pentru a ajusta soluția la 6,25 ng/ml. Prin repetarea acestei proceduri, au fost preparate 11 trepte de dublă diluție în serie.

în același mod au fost preparate seriile de dublă diluție folosind componentul monosubstituit 2 (25 ng/ml) obținut în exemplul 14 și o soluție standard (5 ng/ml) conținând derivatul hG-CSF din exemplul de referință 1. Prin această metodă, au fost preparate seriile de diluție ale componentului monosubstituit 2 din 12,5 ng/ml și seriile de diluție a soluției standard de 2,5 ng/ml în porțiuni a câte 50 μΙ în respectivele godeuri.

Activitatea de creștere a celulelor NFS 60 a fost măsurată de trei ori pentru fiecare dintre soluțiile probă și soluțiile standard, și a fost calculată activitatea relativă a fiecărui component Monosubstituit pe baza activității (=100) a soluției standard.

Componetul Monosubstituit 1 a arătat o activitate de 1,06 până la 1,13 ori mai ridicată decât componentul Monosubstituit 2.

Exemplul de referință 1 în conformitate cu metoda descrisă în exemplul de referință 3 a cererii de brevet japonez examinate nr. 096558/95, a fost obținut un derivat al hG-CSF (compusul k din tabelul 1) din hG-CSF având secvența de amino acid arătată în SECV. ID NR.: 1 prin înlocuirea treoninei din poziția 1 cu alanină, a leucinei din poziția 3 cu treonină, a glicinei dm poziția 4 cu tirozină, a pralinei din poziția 5 cu arginină și a cistinei din poziția 17 cu serină.

RO 121474 Β1

Aceasta înseamnă că o tulpină de Escherichia coli, W3110 strA (Escherichia coli 1 EcfBD 28, FERM BP-1479), care are o plasmidă pCfBD 28 conținând un fragment AND care codifică derivatul hG-CSF descris mai înainte, a fost cultivată la temperatura de 37°C timp 3 de 18 h în mediu LG [preparat prin dizolvarea a 10 g de Bacto Trvptone, 5 g de extract de drojdie, 5 g de clorură de sodiu și 1 g de glucoza într-un litru de apă și ajustat pH-ul la valoa- 5 rea de 7,9 cu hidroxid de sodiu].

O porțiune de 5 ml din bulionul de cultură a fost inoculat în 100 ml de mediu MCG 7 (0,6% fosfat monoacid de sodiu, 0,3% fosfat diacid de potasiu, 0,5 % clorură de sodiu, 0,5 % acid casamino, 1 mM sulfat de magneziu și 4 pg/ml de vitamină B1, pH egal cu 7,2) conți- 9 nând 25 pg/ml de triptofan și 50 pg/ml de ampicilină și amestecul a fost cultivat la temperatura de 30°C timp de 4 până la 8 h. Apoi, s-a adăugat la mediul respectiv 10 pg/ml de stimu- 11 lent (agent de inducere) triptofan acid 36-indolacrilic (denumit aici în continuare AAI) și s-a continuat cultura un timp adițional de 2 până la 12 h. Bulionul de cultură rezultat a fost centri- 13 fugat la 8000 rot/min timp de 10 min și celulele astfel colectate au fost spălate cu 30 mM clorură de sodiu și 30 mM tampon Tris-HCI (pH egal 7,5). Celulele astfel spălate au fost sus- 15 pendate în 30 ml din soluția tampon descrisă mai sus și sfărâmate cu ultrasunete folosind un aparat de ultrasunete (SINIFIER CELL DISRUPTOR 200, OUTPUT CONTROL 2, produs 17 de BRANSON SONIC POWER COMPANY). Suspensia de celule după sfărâmare ultrasonică a fost centrifugată la 9.000 rot/min timp de 30 min, pentru a se obține restul celular. 19

După aceasta, derivatul hG-CSF a fost extras și purificat dm restul celular și solubilizat și regenerat, în conformitate cu metoda Marston et al. [F:A:O:Marston și colab., BIO 21 TECHNOLOGY, 2:800 (1984)].

Exemplul de referință 2. Producerea esterului N-hidroxisuccinimidă a 2,4-bis (o- 23 metoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin

412 mg (4,0 mmol) de acid γ-aminobutiric a fost dizolvat în 300 ml de soluție tampon 25 borat 0,1 M (pH egal 10) și soluția rezultată care a fost răcită într-o baie cu gheață a fost amestecată cu 20 g (2 mmol) de 2,4-bis (o-metoxipolietilen glicol)-6-cloro-s-triazin (produsă 27 de Seikagaku Kogyo) și amestecul a fost lăsat să reacționeze la temperatura de 4°C timp de o zi și o noapte și apoi la temperatura camerei timp de 6 h. 29

Soluția de reacție a fost ajustată la o valoare a pH-ului de 1 prin adăugare de acid clorhidric 1 N și apoi 2,4-bis (o-metoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin a fost 31 extras cu cloroform. Faza de cloroform a fost uscată pe sulfat de sodiu anhidru, părțile insolubile au fost îndepărtate prin filtrare și apoi solventul a fost evaporat sub presiune redusă, 33 pentru a se obține derivatul acid carboxilic.

Derivatul acid carboxilic a fost recristalizat din acetonă uscată, pentru a se obține 35 15,8 g (1,6 mmol) de cristale de derivat acid carboxilic.

O porție de 10 g (1,0 mmol) de cristale și 230 mg de N-hidroxisuccinimidă au fost 37 dizolvate în 100 ml de clorură de metilen anhidră și pe durata răcirii în baie de gheață sub un flux de argon, soluția rezultată a fost amestecată cu 413 mg de N,N c-diciclohexilcarbo- 39 diimidă (DCC) și amestecul a fost agitat timp de 30 min. După terminarea agitării, temperatura amestecului de reacție a fost readusă la temperatura camerei și acesta a fost agitat un 41 timp adițional de 1,5 h, părțile insolubile au fost îndepărtate prin filtrare și apoi filtratul rezultat a fost concentrat până la un volum de 40 ml sub presiune redusă. 43

Concentratul a fost adăugat prin picurare la 600 ml de dietil eter anhidru pentru a forma un precipitat. Precipitatul a fost spălat cu dietil eter anhidru și apoi solventul a fost înde- 45 părtat sub presiune redusă, pentru a se obține 7,7 g (0,77 mmol) de ester N-hidroxisuccinimidă a 2, 4-b/s(o-metoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazm (randament, 77 %) 47

RO 121474 Β1

Exemplul de referință 3. Producerea a 2, 4-bis (o-metoxipolietilenglicol)-6-(3carboxipropilamino)-s-triazin

100 g (8,33 mmol) de monometoxipolietilenglicol bine uscat având o greutate moleculară medie de 12000 (produs de Nippon Oii & Fats), 9,3 g de oxid de zinc (Waco Pure Chemical Industries) și 83,5 g de site moleculare (Tip 4 A) (Wako Pure Chemical Industries au fost dizolvate în benzen uscat, și soluția a fost lăsată să stea la temperatura camerei timp de o zi și o noapte într-un flux de argon.

După îndepărtarea sitelor moleculare, soluția de reacție a fost distilată la temperatura de 80°C în flux de argon, folosind un aparat de distilare și apoi supusă distilării azeotropice timp de o zi și o noapte la temperatura de 80°C în flux de argon folosind un extractor Soxhlet (pentru utilizarea fazei solide) care a fost umplut cu aproximativ 100 g de site moleculare (Tip 4 A).

Soluția de reacție obținută la dehidratrea refluxului a fost răcită, amestecată cu 736 mg (4,0 mmol) de clorură cianurică și apoi distilată azeotropic timp de 5 zile într-un mod similar celui descris mai înainte. Apoi, această soluție a fost răcită la temperatura camerei, amestecată cu 300 ml de benzen uscat și apoi amestecul a fost centrifugat la 3600 rot/min timp de 10 min, pentru a îndepărta substanțele insolubile.

Supernatantul astfel obținut a fost concentrat până la un volum de 300 ml sub presiune redusă și adăugat prin picurare la 3000 ml de dietil eter uscat, pentru a forma un precipitat. Precipitatul a fost recuperat și spălat cu dietil ester uscat, și apoi solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă, obținându-se un precipitat uscat.

Sub răcire într-o baie cu gheață, 100 g de precipitat uscat a fost adăugat la o soluție preparată prin dizolvarea a 1,24 g (12,0 mmol) de acid γ-aminobutiric în 1000 ml de soluție tampon borat 0,1 M (pH egal 10), și amestecul a fost agitat la temperatura de 4’C timp de o zi și o noapte. După un timp adițional de 6 ore de agitare la temperatura camerei, acesta soluție a fost ajustată la o valoare a pH-ului de 1,0 cu acid clorhidric 1N și apoi 2,4-b/s(ometoxipolietilenglicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin a fost extras cu cloroform.

Faza de cloroform conținând compusul a fost uscată pe sulfat de sodiu anhidru și filtrată și apoi solventul a fost îndepărtat din filtratul rezultat sub presiune redusă. Solidul de culoare albă astfel format a fost recristalizat din acetonă uscată pentru a se obține aproximativ 90 g de 2,4-b/s(o-metoxipolietilenglicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin (randament 90 %).

Exemplul de referință 4. Producerea esterului N-hidroxisuccinimidă a 2, 4-bis (ometoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin g (1,0 mmol) de 2, 4-bis (o-metoxipolietilen glicol)-6-(3-carboxipropilamino)-striazin care a fost sintetizat într-un mod similar celui din exemplul de referință 3 și bine uscat și 240 mg de N-hidroxisuccinimidă au fost dizolvate în 400 ml de clorură de metilen uscată și sub răcire într-o baie cu gheață sub flux de argon, soluția rezultată a fost amestecată cu 431 mg de Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimidă (DCC) și amestecul a fost agitat timp de 30 min.

După terminarea agitării, amestecul de reacție a fost readus la temperatura camerei și agitat un timp adițional de 1,5 h, părțile insolubile (Ν,Ν'-diciclohexiluree (DCU)) au fost îndepărtate prin filtrare și apoi filtratul rezultat a fost concentrat până la un volum de 160 ml, sub presiune redusă.

Concentratul a fost adăugat treptat prin picurare la 2400 ml de dietil eter anhidru pentru a forma un precipitat. Precipitatul a fost spălat cu dietil eter anhidru și apoi solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă, obținându-se 21,4 g (0,89 mmol) de ester Nhidroxisuccinimidă al 2,4-b/s(o-metoxipolietilenglicol)-6-(3-carboxipropilamino)-s-triazin (randament, 89 %).

RO 121474 Β1

SEMNIFICAȚIA SECVENȚEI	1
SECV. ID NR.: 1	3
LUNGIMEA SECVENȚEI: 174
TIPUL SECVENȚEI: aminoacid 1	5

GRAD DE RĂSUCIRE: simplu

TOPOLOGIE: liniar 7

TIPUL MOLECULEI: proteină

SECVENȚA 9 t

Mec

Thr

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Ser

Leu

Fro

Gin

Ser

Phe

Leu

Leu

11

-1

1

R O

10

15

4Q

Lys

Cys

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Ala

Leu

I o

20

25

30

15

Gin

Glu

Lys

Leu

Cys

Ala

Tht

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Glu

Leu

35

40

45

17

Val

Leu

Leu

Gly

nis

Ser

Leu

Gly

ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Ser

50

55

60

19

Cys

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Gir.

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

Kis

65

70

75

21

Ser

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

80

35

90

95

23

Ser

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

25

100

105

110

Asp

Phe

Ala

Thr

Thr

Ile

Tr?

Gin

Gin

Met

Glu

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

27

115

120

125

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ah

29

130

135

140

Phe

Gir.

Arg

Arg

Ala

Gly

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Sar

His

Leu

Gin

Ser

31

145

150

•55

Phe

Leu

•', •w W

Vel

Ser

.yr

Arg

Vai

Leu

Arg

His

Leu

Aia

Gin

Pro

33

160 -65 170

Claims (9)

1. Polipeptidă modificată chimic, caracterizată prin aceea că, cel puțin una din grupările hidroxil din molecula polipeptidei care conține grupări hidroxil și are activitate fiziologică sau farmacologică este modificată cu un agent chimic de modificare, care cuprinde un derivat de polialchilglicol.

2. Polipeptidă modificată chimic, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că gruparea hidroxil din molecula de polipeptidă este o grupare hidroxil derivată dintr-un rest de serină.

3. Polipeptidă modificată chimic, conform revendicării 1 sau 2, caracterizată prin aceea că este o polipeptidă care are activitate de factor de stimulare a coloniei.

4. Polipeptidă modificată chimic conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că polipeptidă având activitate de factor de stimulare a coloniei are secvența de aminoacizi reprezentată de SECV. ID. NR. 1, sau o polipeptidă care cuprinde o secvență de aminoacizi în care cel puțin unul dintre aminoacizi este eliminat, substituit sau adăugat în secvența de aminoacizi reprezentată de SECV. ID. NR.: 1 și care are o activitate de factor de stimulare a coloniei de granulocite.

5. Polipeptidă modificată chimic, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că derivatul polietilen glicol are o greutate moleculară de 500 până la 1000000 Da.

6. Polipeptidă modificată chimic, conform revendicării 1 sau 2, caracterizată prin aceea că agentul de modificare chimică este underivat de polialchilen glicol reprezentat prin următoarea formulă I:

R¹-(M)_n-X-R² în care R¹ reprezintă o grupare alchil sau o grupare alcanoil;

M reprezintă:

-OCH₂CH₂-, -OCH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)f-(OCH₂CH₂CH₂)_sîn care r și s sunt identici sau diferiți și fiecare reprezintă un număr întreg pozitiv, în mod opțional modificabil; n este un număr întreg pozitiv în mod opțional modificabil; X reprezintă o legătură, O, NH sau S; și R² reprezintă:

R³ în care R³ reprezintă OH, halogen sau

-X^a-(M^a)_na-R^1a în care X^a, M^a, R^1a și na fiecare au aceeași semnificație ca X, M, R¹ respectiv n de mai sus și Y reprezintă halogen sau

Z-(CH₂)_p-(O)_m-W în care Z reprezintă O, S sau NH; și W reprezintă o grupare carboxil sau un derivat reactiv ala acesteia, sau

NH/· Har —C-OR⁴

RO 121474 Β1 în care R⁴ reprezintă o grupare alchil și Hal reprezintă halogen; p este un număr întreg de la 0 la 6; și m este 0 sau 1,

-(CO)_m-(CH₂)_t-W în care t este un număr întreg între 0 până la 6; și m și W au aceleași semnificații cu cele definite mai sus, în care Hal^a, pa și R^4a fiecare au aceleași semnificații cu Hal, p și respectiv R⁴ de mai sus,

CO-NH-iCH^-CH-W

R³- CO-NH în care R³ și W au aceleași semnificații ca cele definite mai sus, (CH₂x-w în care R³, t și W au aceleași semnificații ca cele de mai sus, în care W are aceeași semnificație ca cea definită mai sus,

O —csch₂cnh_{2 r(} Z * s

sau în care R⁵ reprezintă un rest în care o grupare amino și o grupare carboxil au fost îndepărtate din aminoacid; și W are aceeași semnificație ca cea definită mai sus.

7. Polipeptidă modificată chimic conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că agentul de modificare chimică este un derivat de polialchilen glicol reprezentat prin următoarea formulă 1b:

RO 121474 Β1 <Ib) în care R¹, M, R³, Y, n și p au aceleași semnificații ca cele definite mai înainte; în W^a reprezintă o grupare carboxil sau un derivat reactiv al acesteia.

8. Procedeu pentru producerea unei polipepetide modificate chimic, definită în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde următoarele etape;

- selectarea unei polipeptide care conține grupări hidroxil și are o activitate fiziologică sau farmacologică, și un agent chimic de modificare care cuprinde un derivat de polialchilenglicol,

- amestecarea polipeptidei selectate și a agentului chimic de modificare care cuprinde un derivat de polilachilenglicol selectat ,și apoi

- reacția a cel puțin uneia din grupările hidroxil din molecula de polipeptidă cu agentul chimic de modificare ce conține un derivat de polialchilenglicol.

9. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, cuprinde o cantitate eficientă din polipeptida modificată chimic descrisă în oricare dintre revendicările de la 1 la 7 și un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.