JP5137821B2 - Peg化されたg−csfポリペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、不安定なPEG部分(PEG moiety)をPEG化(PEGylated)G−CSF蛋白質から除去し、安定性および均一性を増加させる方法、およびその結果得られるPEG化G−CSF蛋白質に関する。本発明は、また、該PEG化蛋白質を含む医薬組成物および該医薬組成物を投与することによる治療方法に関する。
蛋白質またはポリペプチドへのポリエチレングリコール(PEG)の共有結合(「PEG化」)は、蛋白質またはポリペプチド、とりわけ医薬蛋白質の性質を改善するための、例えば、循環半減期を改善するため、および/または蛋白質エピトープを隠し、よって、望まれない免疫応答の可能性を低減するためのよく知られた技術である。活性化されたPEGに基づく数多くの技術が、蛋白質上の1以上の基にPEG部分を結合させるために利用できる。たとえば、mPEG―スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA、Nektar Therapeuticsより入手可能)は、通常、アミド結合を介して、N末端およびリジン残基のイプシロン−アミノ基に特異的に結合するものとして考えられている。しかしながら、実際には、mPEG-SPAは、必ずしも排他的にこれらの基に結合しないだけでなく、エステル結合を介して、セリン、チロシンまたはスレオニン残基の水酸基にも結合し得る。この技術を用いて調製されたPEG化蛋白質は十分な程度の均一性を有しない可能性があり、意図したもの以外の数多くの異なるPEG異性体を含み得る。このことは、かかる蛋白質の特徴づけをより複雑にするという事実を含む、さまざまな理由により望まれない。さらに、意図したもの以外の基に結合したPEG部分は、相対的に不安定であり得る。例えば、mPEG-SPAのようなアミン特異的PEGの場合、エステル結合を介して水酸基に結合したPEG部分は、アミド結合を介してN末端またはリジン残基に結合した部分に比較して相対的に不安定である傾向がある。製剤化および貯蔵条件によって、このことは、これらの不安定なPEG基の望まれない損失を導き得、よって、時間経過と共にPEG化蛋白質の性質が変化する可能性がある。さらに、1以上のPEG部分が、患者に投与された後に体内で蛋白質から離れる危険があり、PEG化蛋白質医薬の潜在的な制度上または安全上の問題であり得る。
本発明は、かかる不安定なPEG基を簡単に除き、それによって、より均一で安定なPEG化蛋白質生産物となる方法を提供することにより、これらの問題を解決する。
本発明は、一般的に、リジン残基またはN末端に結合した少なくとも1つのPEG部分および水酸基に結合した少なくとも1つのPEG部分を有するPEGかポリペプチドの安定性および均一性を増加させる方法であって、水酸基に結合したPEG部分を除去するために好適な時間、変化されたpHに該ポリペプチドを置き、その後pHを本件ポリペプチドの長期間保管に好適なpHに調整することを含む方法に関する。
図1は、本明細書で記載されているPEG化、部分的脱PEG化、そして精製されたG−CSF改変体のSDS−PAGE分析のスキャンを示す。
図2は、本明細書で記載されているPEG化、そして部分的脱PEG化されたG−CSFのSDS−PAGE分析のスキャンを示す。
図3は、本発明によって調製された部分的脱PEG化生成物プールのカチオン交換クロマトグラムを示す。
図4は、本発明による脱PEG化されなかった精製されたPEG化G−CSF改変体のカチオン交換クロマトグラムを示す。
定義
本明細書および特許請求の範囲の文脈において、以下の定義が適用される:
用語「ポリペプチド」または「蛋白質」は、本明細書において互換して用いられ得、いずれの特定の長さのアミノ酸配列に限定されないで、アミノ酸のポリマーをいう。これらの用語は、完全長の蛋白質だけでなく、いずれの与えられた蛋白質またはポリペプチドの、例えば、断片、短縮バージョン、改変体、ドメインも含むことが意図される。
mPEG-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA):
上記のように、本発明の一態様は、リジン残基のイプシロンアミノ基またはN末端アミノ基に結合した少なくとも1つのPEG部分および水酸基に結合した少なくとも1つのPEG部分を有するPEG化G−CSFポリペプチドの安定性および均質性を高める方法であって、該ポリペプチドを、約8.0を超える高められたpHに、水酸基に結合したPEG部分を取り除くために好適な時間置き、そして、約8.0またはそれ以下にpHを低下させることを含む方法に関する。本発明の方法は、いずれの哺乳類G−CSFポリペプチドにも適しているが、ポリペプチドは、好ましくは、ヒトG−CSFポリペプチド、つまり、配列番号:1のアミノ酸配列を有するポリペプチド、場合によりN末端にメチオニン残基を有するもの、またはそれらの改変体である。G−CSF改変体の場合、これらは、天然、野生型のG−CSFポリペプチド、典型的には、ヒトG−CSF(配列番号:1)に比較して、1またはそれ以上の置換、挿入または欠損、および/または、1またはそれ以上のアミノ酸残基のN末端および/またはC末端の欠失体、例えば1から15の置換、例えば6、8、10または12までの置換を有し得る。好ましいG−CSF改変体は、WO 01/51510およびWO 03/006501に開示されるものを含む。
本発明によるPEG化されたG−CSFポリペプチドは、本分野で知られた、例えば、WO 03/006501(引用により本明細書に組み込まれる)に記載されたような、いずれの好適な方法によっても製造され得る。かかる方法は、該ポリペプチドをコードする核酸配列の構築および好適な形質転換された、または遺伝子導入された宿主における該配列の発現を含む。しかしながら、本発明のポリペプチドは、相対的に非効率ではあるが、化学合成または化学合成および組換えDNA技術によって製造され得る。本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分をコードする核酸配列は、配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有するhG−CSF等の、親G−CSFをコードする核酸配列を単離し、または合成し、そして、核酸配列を変化させ、関連アミノ酸残基の導入(つまり、挿入または置換)または欠失(つまり、削除または置換)に影響させる、ことによって構築され得る。
生成されたG−CSFポリペプチドは、それから、当業者に知られた様々な方法によりPEG化され得る。例えば、G−CSFポリペプチドは、アミン特異的活性化ポリエチレングリコール(PEG)でPEG化されることができる。
脱PEG化工程のための高められたpHの選択は、脱PEG化が起こる温度、脱PEG化工程の時間、およびPEG化工程が実施されたpHを含む、PEG化に用いられた条件等の因子に基づく。一般的に、脱PEG化の間に使用されたpHが高いほど、脱PEG化工程は早い。したがって、当業者は、pH、時間および温度等の脱PEG化条件が、与えられ等状況で所望の結果を得るように各々調整され得ることを認識できる。例えば、比較的低い、高められたpH、例えば8および9の間を使用することが可能であるが、例えば、9および11の間、例えば9および10の間のより高いpHの使用は、早い脱PEG化をもたらす。典型的には、したがって、高められたpHは、約8.5から約11.0、例えば、約8.5から約10.5、例えば、約9.0から約10.0の範囲であり得る。高められたpHは、例えば、約9.2から約9.8、例えば約9.5の範囲であり得る。
この方法は、リジン残基のイプシロンアミノ基またはN末端のアミノ基に結合した少なくとも1つのPEG部分を有し、そして、水酸基に結合したPEG部分が実質的にないPEG化G−CSFポリペプチドをもたらす。ある実施態様において、本発明のこの実施態様は、約7.0−9.0のpHでのPEG化、その後、pHを不安定なPEG部分を取り除くために高めることを用いて、実施される。他の実施態様において、PEG化は、9.0以上、例えば、9−11の範囲のpH、例えば、9.2から10.0で、例えば、約9.5の比較的高いpHで実施され得る。この場合、PEG化および脱PEG化は、単一工程で、単一pH値で、N末端およびリジン残基で所望のPEG化が起こり、一方、望まれない水酸基へのPEG部分の結合を回避するために十分な時間実施され得る。
上記に示したように、本発明の方法は、相違するPEG位置異性体の数の観点から、PEG化ポリペプチドの均一性が高められることに利点がある。結合基の数および使用される特定のPEG化化学に依存して、本発明は、別なやり方で可能である以上に、より均質で、より安定なPEG化G−CSFの単離を可能にする。例えば、野生型ヒトG−CSFに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有するPEG化G−CSFポリペプチドが見出されてきており、少なくとも約90−95%のポリペプチドのPEG位置異性体が、3つの結合されたPEG部分を有する、生産物を得ることが可能である。
本発明の他の態様は、本発明に従ったPEG化G−CSFポリペプチドを含む医薬組成物に関する。したがって、本発明の一実施態様は、医薬的に許容される担体およびPEG化G−CSFポリペプチドを含む組成物に関し、ここで、ポリペプチドは、野生型ヒトG−CSF(配列番号:1)に比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、そして、ここで、ポリペプチドのPEG位置異性体の少なくとも80%は、3つの結合されたPEG部分を有する。典型的には、3つの結合されたPEG部分を有するPEG位置異性体の割合は、少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約90%、であり得、そして、さらに高く、例えば少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、または少なくとも約95%であり得る。更なる他の実施態様において、本発明は、医薬的に許容され得る担体およびPEG化G−CSFポリペプチドを含む医薬組成物に関し、ここで、ポリペプチドは、野生型ヒトG−CSF(配列番号:1)に比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kのみを含み、ポリペプチドの少なくとも約80%のPEG位置異性体は、3つの付加PEG部分を有する。典型的には、3つの付加PEG部分を有するPEG位置異性体の割合は、少なくとも約85%、好ましくは約90%、であり得、そして、さらに高く、例えば、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、または少なくとも約95%であり得る。
本発明の他の態様は、治療方法および本発明のPEG化G−CSFポリペプチドを用いた医薬の製造方法に関する。白血球減少症(白血球の低下したレベル)および好中球減少症(好中球の低下したレベル)は、あらゆるタイプの感染症に罹患しやすくなる。好中球減少症は、例えば、HIVに罹患した患者で慢性であり、化学療法または放射線療法を受ける癌患者で急性である。重篤な好中球減少症の患者にとっては、例えば、化学療法の結果として、相対的に少ない感染症でさえも重大であり得、好中球減少症は、しばしば、化学療法プロトコールの中断を要求する。本発明のPEG化G−CSFポリペプチドは、ある種の化学療法、放射線治療および骨髄移植を受ける癌患者の感染症の予防または治療、末梢血液前駆細胞移植のための前駆細胞銀行のための輸送、重篤で慢性的な、または相対的な白血球減少症の治療、急性骨髄性白血病を有する患者の治療、AIDSまたは他の免疫不全疾患の治療、および抗真菌治療、とりわけ全身性または侵襲性カンジダ症にとりわけ好適である。本発明の目的のための「患者」は、本発明の治療方法がヒト患者の治療を主たる目的としているが、ヒトおよび他の哺乳類の両方を含む。
・アルキル化剤、例えばマスタードガス誘導体、例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、メクロレタミンまたはメルファラン;エチレンイミン類、例えば、ヘキサメチルメラミンまたはチオテパ;アルキルスルホネート類、例えば、ブスルファン;ヒドラジン類およびトリアジン類、例えば、アルトレタミン、デカルバジン、プロカルバジンまたはテモゾロミド;ニトロソウレア類、例えば、カルムスチン、ロムスチンまたはストレプトゾシン;および無機金属錯体試薬、例えば、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン;
・植物アルカロイド類、例えば、タキサン類(例えば、ドセタキセルまたはパクリタキセル)、ビンカ・アルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビノレルビン)、カンプトテカン(camptothecan)誘導体(例えば、イリノテカンまたはトポテカン)およびポドフィロトキシン類(エトポシドまたはテニソピド);
・抗腫瘍抗生物質、例えば、アンスラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、またはミトキサントロン;クロモマイシン類、例えば、ダクチノマイシンまたはプリカマイシン;および他の抗腫瘍抗生物質、例えば、ブレオマイシンまたはマイトマイシン;
・代謝拮抗物質、例えば、葉酸拮抗剤、例えば、メトトレキサート;ピリミジン拮抗剤、例えば、カペシタビン、シタラビン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ホキシウリジン(Foxuridine)またはゲムシタビン;プリン拮抗薬、例えば、6−メルカプトプリンまたは6−チオグアニン;アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン(Cladribine)、フルダラビン、ネララビンまたはペントスタチン;およびリボヌクレアーゼレダクターゼ阻害剤、例えばヒドロキシウレア;
・トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポイソメラーゼI阻害剤、例えば、イロノテカン(Ironotecan)またはトポテカン;およびトポイソメラーゼII阻害剤、例えば、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェートまたはテニポシド。
部分的に脱PEG化されたG−CSF改変体の製造および分析
サンプルの調製および脱PEG化
野生型ヒトG−CSF(配列番号:1)に比較した置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有するG−CSFを、WO 03/006501に実質的に記載されたCHO−K1細胞より製造した。4.5mg/mlのG−CSF改変体200ml(900mgG−CSF)を、mPEG−SPA5000(Nektar Therapeutics)を用いてPEG化した。簡単には、mPEG−SPA5000の13.2%(w/w)溶液100mLを、G−CSF溶液の200mLに10分に渡って添加し、ゆっくり攪拌し十分な混合を確保した。サンプルを21±3℃、pH8.5で44分インキュベートし、ゆっくり攪拌した。サンプル混合物を、その後、800mMホウ酸、pH10.0のストック溶液を用いてpH9.5に調整した。そして、サンプルを21±3℃で24時間、攪拌せずにインキュベーションした。その後、サンプルを100 mmol/kg クエン酸、20 mmol/kg NaOH、pH 2.5を用いて、約2.5倍に濃縮し、最終pHを3.5とした。
pHを3.5に低下させた後、直ぐに、サンプルを、20 mmol/kg クエン酸、15 mmol/kg NaOH、pH 3.4で平衡化させた約225 mLのSP-Sepharose HP (Amersham, GE Healthcare)を充填したVL44(Millipore)カラムに載せた。物質を載せた後、遊離のmPEG−酸等の非結合物質を取り除くために、カラムを洗浄した。25−100%溶出緩衝液(20 mmol/kg クエン酸、20 mmol/kg NaOH、200 mmol/kg NaCl、pH 3.5)の直線グラジエントを用い、カラムよりPEG化G−CSFを溶出した。グラジエントを25 CV(カラム体積)に対して展開した。カラム工程を21±3℃で実施し。使用した全ての緩衝液を同じ温度に調整した。カラムの搭載は4.1mg蛋白質/mlレジンであり、流速は8CV/時間であった。
し、30kDaの分子量カットオフ(MWCO)の2つの50 cm2 Millipore Pellicon XL membraneを備えたMillipore LabScale TFF系を用いて、4.9 mg/mLに濃縮した。
生成物プールを10 mM 酢酸ナトリウム、43 mg/ml マンニトール、pH 4.0中で限外ろ過およびジアフィルトレーションを行い、物理化学的特徴付けを行った。図1は、上記したPEG化、部分的脱PEG化、および精製したG−CSF改変体のSDS−PAGE分析のスキャンを示し、7つのレーンは、以下を示す:
1.分子量マーカー
2.PEG化後
3.pH9.5、T=0h
4.pH9.5、T=24h
5.カチオン交換カラムへの添加物
6.カチオン交換カラムからの流出物
7.精製産物
この手順の収量は、精製、ポリペプチド分子当たり主に3PEG基を有する部分的脱PEG化G−CSFの450mgであり、これは、全体の50%の収量であった。
部分的脱PEG化G−CSFの製造および解析
サンプル調製、脱PEG化および精製
野生型ヒトG−CSF(配列番号:1)に比較した、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有するG−CSF改変体を、CHO−K1細胞から製造し、その後、実質的に上記実施例1に記載したように、mPEG−SPA5000を用いてPEG化した。これを、10 kDa MWCOフィルターを備えたVivaspinろ過装置を用い、150mMホウ酸ナトリウム、pH9.5にジアフィルトレーションした。最終サンプルの濃度は4.7mg/mLであった。そして、サンプルを21±3℃、42時間インキュベーションした。
シアリダーゼ前処理と組み合わせたカチオン交換HPLC(CIEX-HPLC)を用いて、多様なPEG化種を含む生成物プール中の異なる位置異性体の組成について、データを得た。相違する位置異性体の存在によるPEG化後の不均一性に加えて、PEG化G−CSFは、また、0、1または2個のシアル酸基を有する、1つのO-グリコシレーション部位(Thr133)を含むという点で、不均一である。シアル酸基の相違する数の結果として、クロマトグラムにおけるピークの数を減少させるために、分析前に、シアリダーゼ酵素前処理工程が含まれる。シアリダーゼ処理は、最初に、必要であれば、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.0で1mg/mlに希釈し、その後、μg蛋白質当たり0.05μl(0.25m単位)のシアリダーゼを添加し、サンプルを37℃で18時間インキュベーションし、シアル酸を除くことによって、実施される。そして、サンプルを同日に解析するか、または解析の日まで4℃で保存する。HPLCを、PolySULFOETHYL A(登録商標)カチオン交換HPLCカラム(PolyLC Inc.)を用いて、214nmのUV検出で実施する。異なるピークの特徴付けをPolySULFOETHYL A(登録商標)CIEXカラムから手動のコレクションの後、SDS−PAGE分析により実施した。
緩衝液を交換したサンプルをSDS−PAGE分析により解析し、時間の関数としての、PEG損失の程度を評価した。結果(図2参照)は、実施例1に対する図1に示されるものと同様であり、24または42時間インキュベーションしたサンプル間に認められた全体的なPEG化の程度における僅かな変化のみが存在した(図2、レーン4および5)。
図3は、上記に記載されたような、SDS−PAGE分析により判断される主に3個のPEG5000基を含む、本発明の部分的脱PEG化G−CSF化生成物プールのカチオン交換クロマトグラムを示す。2つの大きなピークは、それぞれ、3個のPEG500基を有するメジャーな位置異性体を示す。3つの小さなピークは、4個のPEG基を有する2つの位置異性体および2個のPEG基を有する1つの位置異性体を示す。
異性体A:N末端、Lys23およびLys159
異性体B:N末端、Lys105およびLys159
これら2つのメジャーな異性体は、サンプルに存在する位置異性体の95%より多いことが示された。
比較例
比較する目的のために、図4は、本発明の脱PEG化を行わなかった精製、PEG化G−CSF改変体のカチオン交換クロマトグラムの結果を示す。この場合、G−CSF改変体は、実施例1および2で上記に示されたのと同じ、天然ヒトG−CSFに比較した5つの置換、つまり、K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを有した。それは、製造され、不安定なPEG部分を取り除くためにpH9.5でインキュベーションしたことを除いて、実施例1で実質的に記載されたようにmPEG−SPA5000でPEG化された。結果として、PEG化改変体は、2−6付加PEG部分を有する多くの相違するPEG異性体の混合物を含んだ。この位置異性体の混合物を、実施例1に実質的に記載されたようなカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。主に4−5付加PEG部分を含むフラクションを単離し、実質的に実施例1に記載されたような限外ろ過およびジアフィルトレーションの後、上記に記載したようなCIEX-HPLC分析にかけた。このフラクションは、実施例1および2に記載した3−PEGフラクションに相当するが、部分的に脱PEG化された3−PEG生成物に比較して1または2の位置で付加された(不安定な)PEG基が結合されており、つまり、この場合は、精製産物は、主として4−5付加PEG基を含む。
N末端、K23、S66、K159、Y165 (5-PEG)
N末端、S66、K105、K159、Y165 (5-PEG)
N末端、K23、S66、K159 (4-PEG)
N末端、K23、S66、Y165 (4-PEG)
N末端、S66、K105、K159 (4-PEG)
N末端、S66、K105、Y165 (4-PEG)。
安定性データ
結合されたPEG部分の安定性を、4つの相違する温度で保存された相違する水性製剤において試験した。ポリペプチドは、実施例1で記載されたように、製造された後、PEG化され、部分的に脱PEG化され、そしてまた精製された、実施例1で挙げられた5つの置換を有するG−CSF改変体であった。試験された製剤は以下のようである:
CIEX-HPLCを用いて、各サンプルのPEG異性体の分布を、26日、56日および89日後測定し、PEG化の安定性を検討した。結果を以下の表に示す。
Claims (13)
- PEG化G−CSFポリペプチドのPEG位置異性体の混合物を含む組成物であって、ポリペプチドが、野生型ヒトG−CSFに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、少なくとも80%のポリペプチドのPEG位置異性体が、3つの結合したPEG部分を有するリジン/N末端PEG位置異性体であり、該少なくとも80%の3つの結合したPEG部分を有するPEG位置異性体が、2つのPEG位置異性体からなり、該異性体の一つが、N末端、Lys23およびLys159で結合しているPEG部分を有し、そして、他の異性体が、N末端、Lys105およびLys159で結合しているPEG部分を有する、組成物。
- 少なくとも85%のポリペプチドのPEG位置異性体が、3つの結合したPEG部分を有するリジン/N末端PEG位置異性体であり、該少なくとも85%の3つの結合したPEG部分を有するPEG位置異性体が、2つのPEG位置異性体からなり、該異性体の一つが、N末端、Lys23およびLys159で結合しているPEG部分を有し、そして、他の異性体が、N末端、Lys105およびLys159で結合しているPEG部分を有する、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも90%のポリペプチドのPEG位置異性体が、3つの結合したPEG部分を有するリジン/N末端PEG位置異性体であり、該少なくとも90%の3つの結合したPEG部分を有するPEG位置異性体が、2つのPEG位置異性体からなり、該異性体の一つが、N末端、Lys23およびLys159で結合しているPEG部分を有し、そして、他の異性体が、N末端、Lys105およびLys159で結合しているPEG部分を有する、請求項1に記載の組成物。
- PEG化G−CSFポリペプチドのPEG位置異性体の混合物を含む組成物であって、ポリペプチドが、野生型ヒトG−CSFに比較して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、そして、少なくとも80%のポリペプチドのPEG位置異性体が、5℃の温度で、3ヶ月間、水性参照組成物中の貯蔵後に、3つの結合されたPEG部分を有するリジン/N末端PEG位置異性体であり、該少なくとも80%の3つの結合したPEG部分を有するPEG位置異性体が、2つのPEG位置異性体からなり、該異性体の一つが、N末端、Lys23およびLys159で結合しているPEG部分を有し、そして、他の異性体が、N末端、Lys105およびLys159で結合しているPEG部分を有する、組成物。
- 医薬的に許容され得る担体、および請求項1−4のいずれかに記載の組成物を含む、組成物。
- 野生型ヒトG−CSFに比較して置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む、組換えG−CSFポリペプチドの、リジン/N末端PEG位置異性体の混合物を製造する方法であって、
a)宿主細胞に組換えG−CSFポリペプチドを発現させ;
b)組換えG−CSFポリペプチドを単離し;
c)単離された組換えG−CSFポリペプチドとアミン特異的活性化PEGを反応させ、複数の組換えG−CSFポリペプチドのPEG位置異性体を製造し、該アミン特異的活性化PEGはmPEG-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA)であり;そして、
d)9から10の範囲のpHで12時間から30時間の期間、複数のPEG位置異性体を反応させ、複数の部分的に脱PEG化された組換えG−CSFポリペプチドのリジン/N末端PEG位置異性体を製造する、ここで、混合物中の少なくとも80%の部分的に脱PEG化されたリジン/N末端PEG位置異性体は、3つの結合されたPEG部分を有するリジン/N末端PEG位置異性体であり、該少なくとも80%の3つの結合したPEG部分を有するPEG位置異性体が、2つのPEG位置異性体からなり、該異性体の一つが、N末端、Lys23およびLys159で結合しているPEG部分を有し、そして、他の異性体が、N末端、Lys105およびLys159で結合しているPEG部分を有する、
ことを含む方法。 - 工程d)において、複数のPEG位置異性体が9.2から9.8の範囲のpHで、12時間から30時間の期間反応させられる、請求項6に記載の方法。
- さらに、複数の組換えG−CSFポリペプチドのリジン/N末端PEG位置異性体を、1以上のクロマトグラフィー精製工程にかけ、精製されたG−CSFポリペプチドのリジン/N末端PEG位置異性体の混合物を製造することを含む、請求項6−7のいずれかに記載の方法。
- さらに、組換えG−CSFポリペプチドのリジン/N末端PEG位置異性体の精製された混合物の有効用量を、少なくとも1つの医薬的に許容され得る賦形剤と混合し、医薬組成物を製造することを含む、請求項6−8のいずれかに記載の方法。
- 有効量の請求項1−4のいずれかに記載の組成物および医薬的に許容され得る担体を含む、不十分な好中球レベルに罹患している、またはその危険性のある、患者における、好中球のレベルを増加させるために有用な医薬組成物。
- 不十分な好中球レベルが、化学療法または放射線療法の結果である、請求項10に記載の医薬組成物。
- 不十分な好中球レベルに罹患している、またはその危険性のある患者における好中球のレベルを増加させる医薬の製造のための、請求項1−4のいずれかに記載のPEG化G−CSF組成物の使用。
- 不十分な好中球レベルが、化学療法または放射線療法の結果である、請求項12に記載の使用。
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