KR100241257B1

KR100241257B1 - 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질 및 그것의 제조방법

Info

Publication number: KR100241257B1
Application number: KR1019970020054A
Authority: KR
Inventors: 이영익; 손미진; 오수완; 허강민
Original assignee: 한승수; 제일약품주식회사; 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2000-02-01
Also published as: KR19980084301A; WO1998053072A1

Abstract

본 발명은 인체 과립구 콜로니 자극 인자 cDNA 를 함유하는 재조합 플라스미드 pYHM-G-CSF 를 제조하여 그것을 대장균에 형질전환시킴으로써 얻어지는 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질 및 그것의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의해 얻어지는 인체 콜로니 자극 인자 활성물질은 형질전환된 대장균 세포내에서 신호 펩티드와 결합되어 있는 형태로, 125 mg/l 정도의 높은 양으로 존재한다.

Description

인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질 및 그것의 제조방법

본 발명은 신규의 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질 및 그것을 제조하는 방법에 관한 것이다.

종래의 2층 연한천 배양법을 이용하여 상층에는 표적세포로서 골수세포를 넣고, 하층에는 신장세포나 태아세포를 넣어 배양하면, 상층의 세포의 일부가 증식분화하여 호중구계 과립구나 단구 대식세포 콜로니가 형성된다. 이 발견으로 생체내에 콜로니 형성을 촉진하는 인자가 존재한다는 것을 알 수 있게 되었다 [Pluznik and Sach, J. Cell Comp. Physiol., 66:319 (1965); Bradley and Metcalf, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44:287 (1966)]. CSF 로 총칭되는 이 인자는 정상적으로 생체내에 널리 분포하는 세포, 예를 들면 T 세포, 단구 대식세포, 섬유아세포, 내피세포등으로부터 생산되는 것으로 알려져 있다. CSF 는 과립구나 단구 대식세포의 간세포 (stem cell) 에 작용하여 그것의 증식을 자극하고 분화를 유도하여 연한천중에서 과립구나 단구 대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 과립구-단구 대식세포 CSF (GM-CSF), 주로 단구 대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 단구 대식세포 CSF (M-CSF), 보다 미분화한 다능성 간세포에 작용하는 다능성 CSF (multi-CSF), 또는 주로 과립구계 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 과립구 CSF (G-CSF) 등으로 나누어지며, 각각에 의한 표적세포의 분화단계도 다르다는 것이 이미 널리 알려져 있다.

인체에서 유래되는 인체 과립구 CSF (hG-CSF) 에 관해서는 이제까지 인체 정상조직 유래의 G-CSF 나 인체 종양 세포에서 유래되는 G-CSF 에 대하여 다수 보고되어 있으며, 그 중에서도 인체의 증식성 종양 조직으로부터 유래된 인체 G-CSF 에 대해, 이것이 177 개의 아미노산, 536 bp 로 구성되어 있다는 것이 이미 알려져 있다 (미국 특허 제 4,833,127 호).

hG-CSF는 단독으로 또는 다른 조혈인자와 혼합하여 무형성 빈혈과 같은 조혈불량의 치료에 사용되며, 종양의 방사선요법 및 기타 약물요법으로 인해 발생하는 조혈결핍의 치료에도 사용된다 (미국특허 제 5,186,931 호, 미국 특허 제 5,202,117 호, 국제특허공개 92-11022호, 국제특허공개 92-14480호).

hG-CSF 의 이와 같은 치료적 유효성 때문에, hG-CSF 를 다량으로 생산하고자 하였고, 그것은 유전자재조합기술을 도입하여 가능하게 되었지만, 이 때 생산되는 hG-CSF 는 융합단백질 형태로 발현되므로 절단하여 정제하는 단계를 거쳐야만 했고, 따라서 hG-CSF의 최종수율은 낮다는 문제점이 대두되었다.

또한 예를 들면 사람의 생체 시료로부터 추출, 분리, 및 정제한 hG-CSF, 사람 G-CSF 생성 세포를 배양하여 그 배양 상층액으로부터 단리시킨 hG-CSF, 세포 융합법을 이용하여 사람 G-CSF 를 생산하는 하이브리도마를 형성하여 그것으로부터 수득한 hG-CSF, 유전자 재조합에 의하여 대장균, 동물세포 등의 숙주를 형질전환시켜서 얻은 형질전환체로부터 생성시켜 단리한 hG-CSF, 또는 천연의 사람 G-CSF 의 아미노산 서열에 화학적인 변형을 가하여 얻은 hG-CSF 등 여러 종류의 hG-CSF 가 개발되어 왔으나, 그 어느 것도 수율이 높지 않았으며, 여러 단계의 정제를 필요로 하므로 경제적으로도 실제적이지 못하였다.

그러므로 본 발명의 목적은 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질을 높은 수율로 및 고도로 정제된 형태로 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인체 과립구 콜로니 자극 인자를 코드화하는 cDNA 를 함유하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 상기의 목적 및 다른 장점 및 특징들은 하기의 상세한 설명을 토대로 분명하게 드러날 것이다.

도 1 은 인체 과립구 콜로니 자극 인자를 코드화하는 cDNA를 합성하기 위한 cDNA 단편들을 도시한다.

도 2 는 인체 과립구 콜로니 자극 인자를 코드화하는 cDNA 를 함유하는 재조합 플라스미드 pYHM-G-CSF 의 구성을 나타낸다.

도 3 은 정제된 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질에 대해 수행된 12 % SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 결과를 도시한다.

레인 1 : 유도되지 않은 pYHM-G-CSF 세포

레인 2 : 0.1 mM IPTG 로 유도된 세포

레인 3 : 정제된 hG-CSF

도 4 는 M-NFS-60 세포주에서의 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질의 활성을 측정한 결과를 그래프로 도시한 것이다.

본 발명자들은 형질전환된 대장균에 IPTG 를 투여하여 T7/lac 프로모터에 의해 발현량을 증폭시키고, 동시에 신호 펩티드가 절단되어 hG-CSF 가 분비되도록 직접적인 발현 벡터인 pET 22b(+) 의 멀티클로닝부위 (MCS) 에 hG-CSF 유전자를 삽입함으로써 플라스미드 pYHM-G-CSF 를 제조하였다.

그러나 본 발명자들은 상기와 같이 발현시켜 정제하여 얻은 물질이 대장균 세포내에서 신호 펩티드가 절단되지 않은 채, 세포내에 125 ㎎/l 의 많은 양 (이 때 최적 발효조건은 아니었음) 으로 축적되어 있었으며, 신호 펩티드가 결합되어 기존의 hG-CSF 보다 20 개의 아미노산이 N-말단 부위에 결합되어 있음에도 불구하고 hG-CSF 활성을 갖고 있음을 확인하였고, 이에 본 발명을 완성하게 되었다. 이 물질은 이제까지 보고된 바 없는 신규한 것으로, 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질로 명명하였다. 본 발명의 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질은 임상적으로 사용할 수 있으며, hG-CSF의 전구물질로 사용되는 동시에 시약으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 또다른 특징은 본 발명의 목적에 따라 고순도의 인체 과립구 콜로니 자극 인자를 제공하기 위하여 디자인한 플라스미드 pYHM-G-CSF 에 의해 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질의 발현량이 높으며, 정제한 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질을 산화성 재접힘 (oxidative refolding) 방법 (이영익 등, 한국특허출원 제 95-2424호) 으로 활성화시켜 다량으로 hG-CSF 를 얻을 수 있다는 점이다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하기로 한다. 단 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 hG-CSF_CDNA의 합성

문헌에 기재된 방법에 따라 도 1 에서와 같은 전략으로 hG-CSF_CDNA 단편들을 합성하고, Mupid-2 (Cosmo Bio Co.사 제품) 를 이용하여 회수하였다 (미국특허 제 4,833,127 호). 회수한_CDNA 단편들을 도 1 에 도시된 올리고머의 번호 순서대로 어닐링한 다음 결찰시켰다 (어닐링 및 결찰 조건은 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed. by Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 참조]. 그런 다음 생성된 cDNA 의 5' 및 3' 각각에 제한 효소 NcoI 과 BamHI 에 적합한 제한 말단을 합성하였다.

〈실시예 2〉 플라스미드 pYHM-G-CSF 의 구성

pET 22b(+) (Novagen사 제품) 를 제한효소 NcoI 과 BamHI 으로 소화시키고, 실시예 1 에서 제조한 NcoI 스티키 단부와 BamHI 스티키 단부를 가지고 있는 hG-CSF_CDNA 를 삽입하여 결찰시킴으로써 5.9 kb 크기의 플라스미드 pYHM-G-CSF 를 제조하였다.

대장균 BL21 (DE3) 를 플라스미드 pYHM-G-CSF 로 형질전환시켰다. 본 형질전환체는 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자은행에 KCTC 8784P 로 1997년 2월 21일에 기탁하였다. 이 형질전환체를 암피실린이 100 ug/ml 첨가되어 있는 LB 배지에서 하루밤 배양하였다.

〈실시예 3〉 발현

대장균 BL21/ pYHM-G-CSF 을 LB 배지 100 ml (박토-트립톤 0.01 g, 박토-이스트 추출물 0.005 g, 및 NaCl 0.01 g/ml, 수산화 나트륨으로 pH 7.5 로 조정함) 중에서, 600 nm 에서의 흡광도가 0.3 이 되도록 37 ℃ 에서, 1.5 시간동안 배양하였다. 그런 다음 IPTG 를 최종농도가 O.5 mM 이 되도록 첨가한 다음 7 시간 더 배양하였다.

이 배양액 일정액에 대하여 12 % SDS-PAGE (Laemmli, 1970) 를 행하여 분자량 19 kd 위치의 단백질을 확인하였다. hG-CSF 는 대장균내 전체 단백질의 40-45 % 를 차지하였다.

〈실시예 4〉 정제

대장균 BL21/pYHM-G-CSF 을 암피실린이 100 ug/ml 첨가되어 있는 LB 배지에서 4 시간동안 배양하고, IPTG 를 0.25 mM 이 되도록 첨가한 후 9 시간 더 배양하였다. hG-CSF 단백질은 125 mg/l 정도로 생성되었다. 대장균을 원심분리하여 회수하고, 분산액 (50 mM Tris-Cl 완충액 pH 7.5 에 1 mM 의 EDTA를 첨가함) 30 ml 에 분산시켰다.

초음파파쇄기 (Branson, Sonifier 450) 를 사용하여 대장균을 파쇄한 다음, 4 ℃, 5000 rpm 에서 원심분리하였다. 침전물을 회수하여 4 M 요소 완충액 (4 M 요소, 0.5 % Tween 20, 1 mM EDTA in 50 mM Tris-Cl, pH 8.0) 으로 2회 세척하고, 8 M 요소 완충액 (8 M 요소, 10 mM DTT, 1 mM EDTA in 40 mM Tris-Cl, pH 8.0) 에 녹였다.

이 용액을 DEAE-세파로스-CL-6B 칼럼 (4.5 × 15 cm) 을 통과시켜 결합되지 않은 분획을 회수하여, 한외여과장치 (아미콘사 제품)을 사용하여 농축하고, 다시 세파크릴 S-200 HR (2 × 130 cm) 칼럼으로 겔여과하였다. 단백질 샘플을 12 % SDS-PAGE 로 분리한 다음, 쿠마찌 형광 블루 용액으로 염색한 후, 겔을 건조시켰다. 결과는 도 3 에 도시하며, 단백질은 99.5 % 의 순도를 보였다.

전기영동한 SDS 겔을 190 mM 글리신/25 mM Tris-Cl pH 8.3 에 30 분동안 담가두었다가 니트로셀룰로스막에 옮기고, 5 % 탈지우유액으로 처리한 다음, 1차 항체로서 다클론성 토끼 항-hG-CSF 항체 (Genzyme 사 제품) 1:200 희석액과 1 시간동안 반응시킨 후, 2차 항체로서 염소 항-토끼 lgG 알칼리성 포스파타제 포합체 (Pierce 사 제품) 1:1000 희석액과 다시 1 시간동안 반응시킨 다음, NBT/BCIP 기질용액으로 발색시켰다.

결과는 분자량 19,000 에서 특이적으로 반응하였다.

이상에서 정제된 단백질은 순수하며, hG-CSF 과 비슷한 분자량을 갖고 있음을 알 수 있었다.

〈실시예 5〉 N-말단 서열의 결정

펩티드 서열 자동분석기 (Miligen/Biosearch 사 제품, 모델 6600 prosequencer) 를 이용하여, 실시예 4 에서 제조한 단백질의 N-말단 서열을 결정하였다.

신호 펩티드에서 유래된 lys, tyr, leu, leu, pro, thr, ala, ala, ala, gly, leu, leu, leu, leu, ala, ala, gln, pro, ala 과 hG-CSF 에서 유래된 10 개의 아미노산, met, thr, pro, leu, gly, pro, ala, ser, ser, leu 가 일치하였다. 따라서 본 발명에서 제조한 물질을 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질로 명명하였다.

〈실시예 6〉 산화성 재접힘

2 mM 환원형 글루타티온을 첨가한 인산완충액 (pH 7.5) 에 환원형 hG-CSF 를 0.5 mg/ml 농도로 넣고 실온에서 3시간 동안 녹였다.

G-CSF의 수율은, YMC-Pack 단백질-RP 칼럼을 사용하는 HPLC 방법으로 220 nm 에서의 흡광도를 측정하여 나타나는 피크의 면적비로 계산하였다. HPLC 분석은 3불화아세트산을 0.1 % 함유하고 있는 아세토니트릴과 물을 분당 0.8 의 유속으로 흘려주는 조건하에서 수행하였다. 아세토니트릴 대 물의 비율을 35:65 에서 65:35 으로 하여 45 분간, 그 후에는 65:35 에서 100:0 으로 하여 5 분간의 구배로 용출하면, 24 분 위치에서 비정합형을, 23 분 위치에서 활성형을, 그리고 27.3 분 위치에서 환원형 G-CSF 를 검출할 수 있었다 (검출시간은 실험실마다 다를 수 있다). 활성형 G-CSF 의 수율은 60 % 이상이었다.

〈실시예 7〉 활성측정

골수성 백혈병에서 분리한 M-NFS-60 세포주를, RPMI 배지 1640 (+ 2 mM 글루타민, 0.05 mM 2-메르캅토에탄올, G-CSF 10 ng/ml) 에서 ml 당 10⁶세포를 넘지않도록 2-3 대 계대한 다음, 원심분리하여 세포를 회수하고, 헝스 완충액으로 3회 세척하였다. 세척물을 동일한 완충액으로 10⁵cell/ml 로 희석하였다.

96-웰 플레이트에 50 ul 씩 나누어 넣고, 농도별 (0.1, 1, 및 10 ng/ml) 로 희석한 본 발명의 G-CSF 를 100 ul/웰로 첨가한 다음, 37 ℃, 5 % 탄산가스를 공급하면서 22 시간동안 배양하였다.

³H-티미딘 (아머샴사 제품) 을 37 KBg/50 ul/웰이 되도록 첨가하고, 6 시간동안 더 배양한 다음, 헝스 완충액으로 3 회 세척하고, 0.1 M NaOH 100 ul 을 첨가하였다. 회수한 세포를 액체 신틸레이션 카운터용 앰퓰에 옮기고, 2.5 ml 씩의 칵테일 용액 (cocktail solution, 아머샴사 제품) 을 첨가한 다음, 액체 신틸레이션 카운팅하였다. 카운팅은 대조표준으로 일본 중외제약의 그라신을 사용하였고, 3 회 반복하였다. 그 결과를 도 4 에 도시한다.

도 4 에 도시된 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질은 일본 중외제약의 그라신과 유사한 활성을 나타냈다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 플라스미드 pYHM-G-CSF 로부터 발현시킨 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질은, 형질전환된 대장균 세포내에서 신호 펩티드가 절단되지 않은 채 세포내에 125 mg/1 이상으로 많은 양이 축적되어 있으며, 비교적 간단히 정제할 수 있고, 산화성 재접힘 방법으로 활성화되어 실질적으로 순수한 hG-CSF 로서 작용할 수 있었다.

Claims

인체 과립구 콜로니 자극 인자의 N-말단에 신호 펩티드가 결합되어 있는 형태의 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질.
제 1 항에 있어서, 상기 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질을 코드화하는 cDNA 가 형질전환되어 있는 대장균 세포내에 125 mg/l 이상의 양으로 축적되는 것을 특징으로 하는 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성 물질.
인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질을 코드화하는 cDNA 를 함유하고 있는 재조합 플라스미드 pYHM-G-CSF.
재조합 플라스미드 pYHM-G-CSF 로 형질전환되어 있는 대장균 BL21 (DE3) (KCTC 8784P).
재조합 플라스미드 pYHM-G-CSF 를 사용하여 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활설물질을 제조하는 방법으로서,

플라스미드 pYHM-G-CSF 가 형질전환되어 있는 대장균 BL21 (DE3) 을 LB 배지에서 배양함으로써 hG-CSF 를 발현시키고, 원심분리에 의하여 대장균을 회수한 후, 초음파로 파쇄하여 얻어진 침전물을 요소 농축액에 녹이고, 이 용액을 DEAE-세파로스-CL-6B 칼럼을 통과시켜 결합되지 않은 분획을 회수한 다음, 한외여과 장치를 사용하여 농축시키고, 세파크릴 S-200 HR 칼럼으로 겔여과함으로써 정제한 후, 산화성 재접힘 방법으로 활성화시키는 것으로 이루어지는, 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성물질의 제조방법.