KR101096678B1 - 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 막관통 부위 및 엑토도메인의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 일부가 추가로 결손된 인체 티로시나제의 N-말단에 단백질 태그가 연결된 융합 단백질을 제조함으로써 정제 효율, 효소의 활성 및 기질결합력이 증가하여 티로시나제 저해제를 스크리닝하거나, 또는 멜라닌 저색소증 질환을 개선 또는 치료하기 위해 사용할 수 있는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

티로시나제, 단백질 태그, 막관통 부위, 엑토도메인, 멜라닌 저색소증

Description

재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 및 이의 용도{Recombinant human tyrosinase fusion protein and use thereof}

본 발명은 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 막관통 부위 및 엑토도메인의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 일부가 추가로 결손된 인체 티로시나제의 N-말단에 단백질 태그가 연결된 융합 단백질을 제조함으로써 정제 효율, 효소 활성 및 기질결합력이 증가하여 티로시나제 저해제를 스크리닝하거나, 또는 멜라닌 저색소증 질환을 개선 또는 치료하기 위해 사용할 수 있는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

티로시나제(tyrosinase, EC 1.14.18.1)는 티로신(tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는데 필요한 중요한 효소로, 멜라노좀의 막에 결합되어 있는 66kDa의 당단백질이다. 활성 부위에 한 쌍의 구리함유 단백질(copper-containing protein)이며, 막단백질(membrane bound protein)라고도 불린다. 유전자는 염색체 11q14-21에 위 치하고 있으며, 5개의 엑손(exon)으로 구성되어 있다. 또한, 529개의 아미노산에 N-말단의 18개 신호전달 펩타이드를 가지고 있는 type I 막 당단백질로, 성숙된 티로시나제 단백질은 N-말단에 455개의 아미노산으로 이루어진 내강 엑토도메인(lumenal ectodomain), 단일 막관통 도메인(single transmembrane domain), 그리고 C-말단에 세포질성 꼬리(cytoplasmic tail)의 세 부분으로 나누어지며, 인체 티로시나제의 엑토도메인(ectodomain)에 효소 활성을 가진다. 두 개의 시스테인 잔기는 각각 절단되는 신호 전달 펩티드와 세포질성 꼬리(cytoplasmic tail)에 포함되어 있으며, 15개 시스테인은 소포체(endoplasmic reticulum) 내강(lumen)의 이황화(disulfide) 결합을 형성할 수 있도록 남겨져 있다. 미생물과 식물의 티로시나제는 수용성 단백질로 존재하고 포유동물의 티로시나제는 막 단백질로 수용성과 비수용성을 모두 포함하고 있다(King et al. Mol. Biol. Med., 8, 19-29, 1991). 포유동물에서 티로시나제는 골지체에서 동종이량체(homo dimer)로 단백질구조가 생성되며, 멜라노좀에서 protein kinase C(PKC) 신호전달기전에 의해 TRP-1과 이종이량체(hetero dimer)로 형성되어 멜라닌이 활성화된다(Park et al., J. Biol. Chem., 274(23), 16470-16478, 1999).

또한, 티로시나제는 멜라닌 생합성 이외에도 외피형성, 질병에 대한 저항, 항생효과, 면역방어와 같이 질병과 관련이 있는 기능을 담당하고 있다(Mayer et al., Phytochem., 26, 11-20, 1987). 티로시나제의 변이로 인해 멜라닌 생합성의 이상에 따라 백반이나 색소침착과 같은 비정상적인 멜라닌 착색을 유발한다. 이로 인해 나타나는 증상은 백색증, 백반증, 헤르만스키-푸들라크 증후군(Hermansky- Pudlak syndrome, HPS), 피부암(melanomas)등의 질병으로 나타나고 있으며, 그 중에서도 백색증(albinism)은 멜라닌 색소의 분포와 합성 대사과정에 결함이 생겨서, 출생 시부터 피부와 머리카락, 홍채에 소량의 색소를 가지거나 전혀 없는 희귀 질환이다(Giebel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3255-3259, 1990).

인체 티로시나제를 흑색종(melanoma)을 포함하는 피부암과 피부 색소 결핍증 등 피부 질환의 의학적인 연구에 사용하기 위해 대량 생산하는 노력들이 있어 왔다. 국제공개특허 WO 90/12869에는 비멜라닌 생성세포형 진핵세포(non-melanocytic eukaryoticcell)를 이용하여 활성 인체 티로시나제를 생성하는 방법이 개시되어 있는데, 인체 티로시나제를 암호화하는 DNA를 리트로바이러스(retrovirus) 등과 같은 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 상기 재조합 발현 벡터를 섬유아세포(fibroblast) 등과 같은 진핵세포에 도입한 후, 도입된 진핵세포를 배양하여 인체 티로시나제를 생산하는 기술이다. 그러나, 상기 방법은 기술적으로 복잡하고 어려워 대량 생산에 의한 상업화가 곤란하다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 개선하고자 대장균과 같은 숙주세포를 이용하였으나, 상당수의 재조합 단백질은 대장균 내에서 완전한 폴딩(folding)을 이루지 못하고, 다양한 기작에 의해 활성을 잃은 상태의 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하게 된다(Gongquin et al., Arch Biochem. Biophys. 236: 135-142). 특히, 재조합 티로시나제의 경우 대장균에서 발현시 불용성 응집체를 형성하는 것으로 보고된 바 있다(Kong et al., CBP , 125: 563-569, 2000). 이러한 불용성 단백질은 초기 분리단계가 용이하여 순도가 높은 순수 단백질을 얻을 수 있으나, 단백질로서의 활성을 갖지 못한다. 따라서, 불용성 단백질을 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질로 전환시키기 위한 변성화(denaturation) 및 재폴딩(refolding) 과정이 필요하다. 그러나, 상기 과정은 많은 시간과 비용을 필요로 할 뿐 아니라, 상기 과정에서 대부분 단백질의 많은 양이 소실된다.

이러한 문제점을 개선하고자 활성형 재조합 인체 티로시나제를 대장균과 같은 숙주세포에서 대량생산하는 기술들이 발표되고 있으나, 정제 수율이 낮은 단점이 있고, 재조합 기술의 경제적 측면에서 최소 구조를 가지면서도 기질과의 결합력이 높은 활성형 재조합 인체 티로시나제에 대한 연구는 미비한 편이다.

본 발명의 목적은 재조합 인체 티로시나제의 발현 또는 정제 효율을 높이면서도 효소 활성이 높은 활성형 재조합 인체 티로시나제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 인체 티로시나제를 이용하여 티로시나제 저해제를 스크리닝하기 위한 키트 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 인체 티로시나제를 이용하여 멜라닌 저색소증 질환을 개선 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 멜라닌 저색소증 질환을 개선 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 개체에 투여하여 멜라닌 저색소증 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 막관통 부위 결손을 갖는 인체 티로시나제 및 이의 N-말단에 연결되는 단백질 태그를 포함하되, 상기 티로시나제는 서열목록 서열번호 13 및 17로 이루어진 그룹으로 선택된 하나 이상의 서열이 추가로 결손된 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 티로시나제 저해제 스크리닝용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 티로시나제 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 치료학적으로 효과적인 양의 본 발명의 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 멜라닌 저색소증 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 막관통 부위 및 엑토도메인의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 일부가 결손된 인체 티로시나제의 N-말단에 단백질 태그를 연결하여 재조합 융합 단백질을 제조함으로써 발현 및 정제 수율이 증가하고, 효소 활성이 높아 티로시나제 저해제를 스크리닝 하거나, 멜라닌 저색소증 질환의 개선 또는 치료에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 막관통 부위 결손을 갖는 인체 티로시나제 및 이의 N-말단에 연결되는 단백질 태그를 포함하되, 상기 티로시나제는 서열목록 서열번호 13 및 17로 이루어진 그룹으로 선택된 하나 이상의 서열이 추가로 결손된 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 도 1을 참조하여 구체적으로 설명하면,

상기 인체 티로시나제는 인체에서 유래한 티로시나제 유전자로부터 코딩된 막관통 부위와 엑토도메인(ectodomain)의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 중 어느 하나가 결손된 것으로, 바람직하게는, C-말단의 18개의 아미노산(서열번호 13), N-말단의 91개의 아미노산(서열번호 17), 또는 상기 C- 및 N-말단의 아미노산(서열번호 13 및 서열번호 17)이 결손될 수 있다. 따라서, 상기 막관통 부위와 엑토도메인의 C-말단 일부가 제거된 인체 티로시나제는 서열번호 15의 아미노산 서열, 막관통 부위와 엑토도메인의 N-말단 일부가 제거된 인체 티로시나제는 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 막관통 부위와 엑토도메인의 C- 및 N-말단 일부가 둘 다 제거된 인체 티로시나제는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 단백질 태그는 융합 단백질의 정제 효율을 높이고, 기질과의 결합력이 높은 활성형태로 발현하기 위해 N-말단에 결합될 수 있다.

바람직하게는, (His)₆-태그, 말토오스 결합 단백질, 헤마글루티닌 A, 베타-갈락토시다제, 티미딘 키나제, 트랜스페린, myc-태그, VP16, FLAG, 또는 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 (His)₆-태그, 또는 말토오스 결합 단백질이 좋다. 가장 바람직하게는 말토오스 결합 단백질이 좋다.

본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질은 숙주세포에서 발현 및 정제 효율이 좋을 뿐만 아니라 기질 결합력이 높은 활성형 효소로 발현될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

상기 융합 단백질의 코딩 유전자는 막관통 부위 및 엑토도메인의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 둘 다 결손을 갖는 인체 티로시나제를 코딩하는 핵산 분자 및 이의 N-말단에 연결되는 단백질 태그를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

상기 인체 티로시나제를 코딩하는 유전자는 막관통 부위와 엑토도메인(ectodomain)의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단 둘 다가 결손된 것으로, 바람직하게는, C-말단의 18개의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자(서열번호 14), N-말단의 91개의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자(서열번호 18), 또는 상기 C-말단의 18개 아미노산과 상기 N-말단의 91개 아미노산을 코딩하는 핵산 분자가 모두 결손된 것일 수 있다. 따라서, 막관통 부위와 엑토도메인의 C-말단이 제거된 인체 티로시나제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 16에 기재된 염기서열, 막관통 부위와 엑토도메인의 N-말단이 제거된 인체 티로시나제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 20에 기재된 염기서열, 또는 막관통 부위와 엑토도메인의 C- 및 N-말단이 모두 제거된 인체 티로시나제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 22에 기재된 염기서열을 가질 수 있다.

상기 단백질 태그를 코딩하는 핵산 분자는 융합 단백질의 정제 효율을 높이고, 높은 효소 활성을 나타내기 위하여 인체 티로시나제를 코딩하는 핵산 분자의 N-말단에 결합될 수 있다.

바람직하게는, (His)₆-태그, 말토오스 결합 단백질, 헤마글루티닌 A, 베타-갈락토시다제, 티미딘 키나제, 트랜스페린, myc-태그, VP16, FLAG, 또는 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제의 코딩서열로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 (His)₆-태그, 또는 말토오스 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 좋다. 가장 바람직하게는 말토오스 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 좋다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 발현용 벡터에 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pET16b(+)를 사용하였으나 이에 특별히 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터인 pET16b(+) 벡터를 사용하여 막관통 부위가 제거되거나, 엑토도메인의 C-말단 일부(18개 아미노산을 코딩하는 핵산 분자), N-말단 일부(91개의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자), 상기 C- 및 N-말단이 모두 제거된 인체 티로시나제 코딩 유전자 및 이의 N-말단에 단백질 태그를 코딩하는 핵산 분자가 연결된 DNA 절편을 삽입하여 재조합 벡터, "pET16-hTyr(C-), pET16-hTyr(N-), 또는 pET16-hTyr(N&C-)"라 명명하였다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체에 관한 것이다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 융합 단백질은 통상의 배양방법에 따라 형질전환체를 배양하고, 이온 교환체 컬럼 크로마토그래피, 및 금속 친화력 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 거쳐 분리 정제하는 것이 바람직한데, 이는 인체 티로시나제의 막관통 부위 및/또는 엑토도메인의 C-말단, N-말단, 또는 C- 및 N-말단의 결손으로 인해 단백질 고차 구조 형성이 어렵기 때문이다.

본 발명은 또한 상기의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 티로시나제 저해제 스크리닝용 키트에 관한 것이다.

상기 키트에서 융합 단백질 또는 이의 코딩 핵산 분자는 어레이 형태의 고체 지지체에 포함될 수 있다.

상기 키트는 정제 수율이 높고 활성 형태로 발현되는 티로시나제 융합 단백질을 포함하고 있어 티로시나제 저해제 또는 미백 물질 스크리닝 시 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 티로시나제 저해제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

상기 시료의 종류는 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, 천연 추출물, 단백질, 펩타이드, 또는 핵산 분자 등일 수 있다.

본 발명은 또한 상기의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물은 멜라닌 세포의 손실이 원인이 되거나, 멜라닌 생성 저해가 원인이 되어 멜라닌 생성이 정상 수준에 이르지 못하여 발생하는 모든 질환에 사용될 수 있는데, 예컨대 백반증, 백색 증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증, 또는 점상 백피증 등에 사용될 수 있다.

보다 바람직하게는, 멜라닌 생성 감소로 인하여 발생하는 질환 즉 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증, 점상 백피증 등에 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물은 그 유효성분인 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양으로 포함할 수 있는데, 통상적으로는 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 내지 15 중량부로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태로서, 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 이외에 약제학적으로 허용되는 공지의 성분들을 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 성분들은 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현 탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 윤활제, 습윤제 등으로 사용될 수 있는 성분들은 당업계에 공지되어 있어 당업자는 필요에 따라 적당한 성분을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 성분들은 본 발명의 약제학적 조성물의 전체 중량에 대하여 85 내지 약 99.99 중량부로 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있는데, 예컨대 경구 또는 직장에의 직접 투여되거나, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 등에 주사 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부나 모발에 직접 도포되는 경우이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 연고 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 1일 투여량이 통상 0.001 내지 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태로서, 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효성분으로서 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 이외에 피부와의 접촉 시 인체가 적응 가능한 이상의 독성이 없는 한, 화장품 조성물의 제조에 통상 사용되는 성분들을 포함하여 제조될 수 있다.

그러한 통상의 성분들로서는 예컨대 유분, 계면활성제, 보습제, 다가알콜, 증점제, 수용성 고분자, 피막 형성제, 비수용성 고분자, 분말, 안료, 염료, 레이크, 저급 알콜, 자외선 흡수제, 금속이온 킬레이트제, 유기 아민류, pH 조정제, 약효성분, 당류, 방부제, 산화방지제, 향료, 물 등을 들 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제조에 통상 사용되는 성분들은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 성분들을 선택하여 사용할 수 있는데, 몇 가지를 예시하면, 예컨대 유분으로는 올리브유, 아보카도유, 피마자유, 야자유 등을 사용할 수 있고, 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산에 스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌경화피마자유 등을 사용할 수 있으며, 보습제로서는 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으며, 증점제로서는 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 사용할 수 있으며, 자외선 차단제로서는 파라아미노안식향산, 옥틸메톡시신나메이트, 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트 등을 사용할 수 있으며, 아민류로서는 모노에탄올아민, 트리에탄올아민 등을 사용할 수 있으며, 산화방지제로서는 토코페롤류, 디부틸하이드록시톨루엔 등을 사용할 수 있으며, 방부제로서는 에틸파라벤, 부틸파라벤, 안식향산나트륨 등을 사용할 수 있다.

상기 화장료 제조에 통상 사용되는 성분들은 본 발명의 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 85 내지 99.99 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 껌류, 비타민 복합제, 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 이외에, 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 또는 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류가 첨가될 수 있고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜이 또한 첨가될 수 있고, 타우린, 스테비아 추출물과 같은 감미제 등이 또한 첨가될 수 있으며, 나아가 여타의 식품 첨가물이 첨가될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 치료학적으로 효과적인 양의 본 발명의 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 멜라닌 저색소증 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물, 그의 효능, 투여방법 및 투여량 등에 관한 내용 은 상기한 바와 같다. 본 발명의 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 막관통 부위가 제거된 재조합 인체 티로시나제의 제조

막관통 부위가 제거된 재조합 인체 티로시나제의 N-말단에 단백질 태그로 (His)₆-태그 또는 말토오스 결합 단백질이 결합되어 있는 pET16-hTyr(TM-) 및 pMal-hTyr(TM-)의 재조합 벡터를 제조하였다.

(인체 티로시나제 유전자의 클로닝)

막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제의 유전자를 클로닝하기 위해 GenBank의 M27160 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다(표 1). HeLa cell human 5'-stretch plus cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 티로시나제 유전자를 클로닝하였다.

pET16 벡터용 PCR 반응 조성은 주형 유전자(human tyrosinase) 100ng, 각 최 종 농도 0.2mM의 dNTP 혼합물(Takara), 0.6μM 프라이머, 10×Ex-Taq buffer 5㎕, EX-Taq polymerase(Takara) 1㎕를 포함하는 총 50㎕를 반응액으로 하여 시행하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 1분; 95℃에서 1 분, 55℃에서 1분 30초, 72℃에서 3분의 35 사이클로 반응시켰다.

pMal 벡터용 PCR 반응 조성은 10×rxn bufffer 5㎕, 100mM dNTP mix(25mM of each dNTP) 0.2㎕, DNA 주형 1㎕, N-Primer 1㎕, C-Primer 1㎕, Picomax polymerase 1㎕, 25mM MgCl₂ 1㎕, DW 39.8㎕을 반응액으로 하여 시행하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 30초; 95℃에서 30초, 57℃에서 1분 30초, 68℃에서 16분의 16 사이클로 반응시켰다.

반응이 끝난 후 1% 아가로우즈 젤에서 증폭된 DNA를 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 1368bp부분에서 DNA 밴드를 확인하였다. 확인된 PCR 생성물은 즉시 pGEM-T easy 클로닝 벡터와 4℃에서 12시간 반응시킨 후 supercompetent cell(RBC, USA)에 형질전환 하였다. 생성된 pGEM-hTyr 유전자는 대장균으로부터 분리한 후 제한효소 Nde I 과 BamH I 으로 절단하여 1% 아가로우즈 젤 전기영동으로 확인하였다. 전기영동 결과 클로닝 벡터는 5300bp에서, 티로시나제 유전자는 1368bp에서 확인하였다(미도시됨).

(재조합 벡터 pET16-hTyr(TM-)의 구축)

막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제의 N-말단에 히스티딘 태그가 연결되는 재조합 벡터 pET16-hTyr(TM-)를 제조하기 위해, 상기에서 증폭된 막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제 유전자를 제한효소 NdeI과 BamH I(10×K buffer 사용)을 사용하여 37℃에서 12시간 절단(digestion)하였다. T7 프로모터를 가진 발현 벡터 pET-16b(+) 유전자는 티로시나제 유전자와 같은 조건으로 절단하였다. 각각의 절단된 유전자를 아가로우즈 젤을 사용하여 유전자를 분리한 후, DNA Extraction kit(Takara)으로 유전자를 정제하였다. 정제된 hTyr(TM-)와 pET-16b(+) 유전자는 각각 T4 DNA 리가아제를 사용하여 4℃에서 24시간 반응하였다. 라이게이션 결과 생성된 pET16-hTyr(TM-)의 DNA 양을 증가시키기 위해 50mM CaCl₂에 의해 컴피턴트(competent)화 된 DH 5α(RBC, USA)에 형질전환 하였다. 형질전환은 다음과 같이 실시하였다. 라이게이션 샘플 10㎕를 DH 5α 컴피턴트 세포에 혼합한 후, 42℃에서 50초간 열 충격(heat shock)을 가해 세포막에 붙어 있던 pET16-hTyr(TM-) 유전자가 DH 5α 세포 내로 들어가게 하였다. 형질전환 샘플을 분리하기 위해 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB-아가 플레이트에서 12시간 배양하였다. 이때 자란 콜로니를 액체 LB 배지에서 배양하고, DNA purification kit(Takara)을 이용하여 pET16-hTyr(TM-) 플라스미드 유전자를 분리하였다. 재조합 유전자를 확인하기 위해, pET16-hTyr(TM-) 플라스미드를 Nde I과 BamH I으로 절단한 후 아가로스 겔 전기영동하였다. 확인된 유전자는 대량발현을 위해 숙주 E. coli BL21 star(DE3)(Novagen, USA)에 형질전환 하였다. 형질전환 여부를 알아보기 위하여 DH 5α와 같은 방법을 이용하였으며, pET16-hTyr(TM-)은 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB-아가 플레이트에서 12 시간 배양하여 자란 콜로니만을 대량발현에 이용하였다. 모든 실험 과정은 클린 벤치(clean bench)에서 진행하였다(도 3).

평판 LB 배지에서 배양하여 자란 콜로니만을 선택하여 다시 액체 LB 배지에서 배양한 후 pET16-hTyr (TM-) 플라스미드 DNA를 얻고, 이것을 다시 제한효소 Nde I 과 BamH I 으로 절단하여 형질전환 여부를 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 발현 벡터 pET-16b(+)는 5300 bp에서, 인체 티로시나제는 1368bp에서 각각 그 크기를 나타내었다.

(재조합 벡터 pMal-hTyr(TM-)의 구축)

막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제의 N-말단에 말토오스 결합 단백질이 연결되는 재조합 벡터 pMal-hTyr(TM-)를 제조하기 위해, 증폭된 인체 티로시나제 유전자를 제한효소 EcoRⅠ과 HindIII (10×M buffer 사용)을 사용하여 37℃에서 18시간 절단하였다. 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein)을 가진 발현 벡터 pMal 유전자는 티로시나제 유전자와 같은 조건으로 절단하였다. 이때 EcoRI의 star 활성으로 인해 각 벡터 및 증폭산물에, EcoRI는 3시간, Hind III는 15시간 처리하였다. 이후 과정은 삽입 유전자 확인을 위해 제한 효소로 EcoRⅠ과 HindIII를 사용하는 것을 제외하고는 상기 재조합 벡터 pET16-hTyr(TM-)의 제조 과정과 동일하게 실시하였다(도 5).

pMal-hTyr(TM-) 플라스미드 DNA를 얻고, 제한효소 EcoR Ⅰ과 Hind III로 절단하여 형질전환 여부를 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 발현벡터 pMal-c2g는 6646 bp, 인체 티로시나제는 1368bp에서 각각 그 크기를 나타내었다. 확인이 끝난 유전자는 아미노산 서열 분석을 위하여 Cosmogenetech (Seoul)사에 의뢰하여 주형으로 삼았던 염기서열(M27160)과 동일한 서열 결과를 얻었음을 확인하였다.

(대장균을 이용한 인체 티로시나제의 대량 발현)

pET16-hTyr(TM-)/BL21 star(DE3), pMal-hTyr (TM-)/ TB1의 대량 발현을 위해 50 ㎍/㎖의 앰피실린과 1mM Cu²⁺가 포함된 1L LB 배지에 2~3시간 동안 37℃에서 배양하였다. UV로 OD₆₀₀ 값을 측정하여 0.3~0.4 에 이르면, 발현유도제인 IPTG를 최종농도가 0.4mM 되도록 첨가한 뒤, 12시간 이상을 배양하여 대량발현을 유도하였다. 대량발현을 통해 얻은 균체를 20mM 포타슘 포스페이트 완충용액 (pH 6.8) 20㎖을 이용하여 덩어리가 생기지 않게 풀어준 다음 초음파 파쇄기를 이용하여 세포막을 파괴하였다. 세포 찌꺼기와 단백질의 분리를 위해 12,000g에서 4℃, 20분간 원심분리하여 얻은 상층액과 펠렛을 SDS-PAGE를 통해 발현량을 알아보았다.

SDS-PAGE는 Laemmli (1970) 방법에 따라 10.5%과 12.5%의 젤을 만들어 사용하였다. 영동이 끝난 젤은 coomassie brilliant blue R-250을 사용하여 염색하였고, 충분한 탈색을 통해 효소의 순수도를 확인하였다. 이때 사용한 분자량 표준 단백질은 phosphrylase b (97.4 kDa), Bovine serum albumin(BSA) (66 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Carbinic anhydrase (31 kDa), Trypsin inhibitor (21.5 kDa), Lysozyme (14.4 kDa)을 포함하고 있는 BioRad의 Low-range 단백질 사이즈 마커를 사용하였다.

그 결과 N-말단에 존재하는 친화력 태그 시스템은 특이적으로 목적 단백질이 과발현되는 특징이 있었지만, SDS-PAGE 결과 발현된 인체 티로시나제는 인체 유래 유전자로 대장균 내에서 발현될 때 독성물질(toxic)로 인지되어 목적단백질을 식별할 수 없었다. 따라서 조추출물(crude extract)을 이용하여 전체 활성을 통한 발현량을 비교한 결과, pET16-hTyr(TM-) 보다 pMal-hTyr(TM-)이 12.04unit/mg으로 두 배정도 높은 수치를 가짐을 알 수 있었다(표 2). 따라서 정제 및 효소학적 특성은 pMal-hTyr(TM-)을 이용하여 실시하였다.

재조합 단백질을 정제하기 위해, 대량발현된 pMal-hTyr(TM-)/TB1 균체를 20mM 포타슘 포스페이트 완충용액 A (pH 6.8) 20㎖로 두 번 세척한 후에 균체를 다시 20㎖의 완충용액 A로 균일화 시켰다. 그런 후 초음파 파쇄기(Sonics & Materials INC.)를 이용하여 4℃에서 30~40 watts, amplitude 8% 의 조건으로 30분간 균을 파괴하였다. 균을 파쇄 후에 12,000g로 4℃에서 25분간 원심분리하여 단백질과 다른 세포 불순물을 분리하였다. 여기서 얻은 상층액을 300mM NaCl과 1mM EDTA가 포함된 20mM Tris-HCl (pH7.4)(완충용액 B)로 평형시킨 아밀로오스 레진 컬럼 크로마토그래피에 1㎖/min의 속도로 용출시켰다. 불필요한 단백질을 제거하기 위해 완충용액 B로 컬럼 베드 부피(column bed volume)의 10배 이상 세척한 다음, 10mM 말토오스가 포함된 완충용액 B로 1㎖/min의 속도로 용출시켰다. 이때 얻은 분획을 완충용액 A로 4℃에서 8시간씩 3번 다시 투석하였다. 투석한 후에 단백질이 용출된 분획을 12,000g로 4℃에서 20분간 원심분리하여 인체 티로시나제와 불필요한 단백질을 분리하였다. 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE에 통해 확인하였으며, 모든 실험은 효소의 활성을 고려해 4℃에서 진행하였다.

단백질 농도는 BCA assay (Prerce Chemical Co, Rockford IL, USA)에 의해 측정하였다. Bovine serum albumin을 표준 단백질로 사용하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 OD 562nm에서 측정하고, 표준곡선을 작성하여 정량하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 레인 1은 아밀로오스 친화 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제한 것으로 말토오스 결합 단백질(42kDa)을 포함하여 막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제는 55kDa으로, 97kDa에서 단일 밴드로 깨끗하게 정제되었음을 알 수 있었다. 배양액 1L 당 약 3.32㎎의 정제된 효소를 얻을 수 있었으며, 정제 수율은 41% 였다(표 3).

<실험예 1> L-Dopa 옥시다제 활성 측정

효소의 활성도 측정은 Fling et al., (1963)의 방법을 사용하였다. 기질인 L-Dopa가 효소에 의해 갈변 생성물인 도파크롬(dopachrome)으로 변환하는 것을 475nm에서 측정하였다. 도파크롬은 475nm에서 농도에 따른 흡광도 값이 최대로 나타나며 이때의 몰 흡광 계수는 3600(M^-1㎝^-1)이다. 100mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 3mM L-Dopa 그리고 효소액 50㎕를 넣어 1㎖의 반응액을 조제하고 바로 475nm에서 1분 동안 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 효소를 제외한 반응액을 먼저 조제하여 37℃에서 10분간 유지시켰다. 상기 측정방법에서 효소의 활성도 단위는 분당 dopachrome이 1μmol 생성하는 것을 1 unit(μmole/min)으로 정하였다. 또한 비활성도는 1㎎당 1 unit으로 하였다.

막관통 부위가 제거된 pMal-hTyr(TM-)의 비활성도는 34 units/㎎에서 1,470 units/㎎로 증가하여 약 43배의 증가도를 보였다. 이는 막관통 부위가 제거되지 않은 야생형 인체 티로시나제와 비활성도를 비교해 볼 때 비슷한 값을 가지는 것으로 보아 막관통 부위가 제거되어도 대장균 내에서의 인체 티로시나제의 dopa 옥시다제 활성에는 영향을 미치지 않은 것을 알 수 있었다.

<실험예 2> L-Dopa의 기질 농도에 대한 영향

L-Dopa의 최종 농도를 0.1mM에서 1.2mM까지 농도 별로 조제하여, 정제된 효소의 대한 기질 농도의 영향을 조사하는데 사용하였다. 각 농도에 대하여 dopa 옥시다제 활성은 실험예 1의 방법에 따라 측정하였다. 이로부터 얻은 값으로 Michaelis 상수 K _m값과 k _cat 값을 Lineweaver-Burk plot에 의하여 구하였다.

그 결과, 대장균에서 발현시킨 막관통 부위가 제거된 pMal-hTyr(TM-)의 K _m값은 0.30mM, k _cat값은 38S^-1였다. 이 값은 막관통 부위가 제거되지 않은 야생형 인체 티로시나제의 K _m값인 0.40mM과 비교하여 볼 때, 비록 막관통 부위가 제거되어도 인체 티로시나제의 L-Dopa에 대한 기질 결합력은 증가하였음을 시사한다.

<실시예 2> 인체 티로시나제 결손 변이체 제조

막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제의 유전자를 대상으로 엑토도메인의 양방향으로 결손이 있는 세 종류의 결손 변이체, 즉 엑토도메인의 C-말단 부분의 18개 아미노산(서열번호 13; 뉴클레오티드 서열: 서열번호 14)을 제거한 hTyr(C-)(서열번호 15; 뉴클레오티드 서열: 서열번호 16), N-말단의 1-91의 아미노산(서열번호 17; 뉴클레오티드 서열: 서열번호 18)을 제거한 hTyr(N-)(서열번호 19; 뉴클레오티드 서열: 서열번호 20), 양방향으로 각각 제거한 hTyr(N&C-)를 설계하였다(서열번호 21; 뉴클레오티드 서열: 서열번호 22). 이들을 증폭하기 위해 GenBank의 M27160 서열을 기준으로 프라이머 세트를 설계하고, Genotech(대전)에 의뢰하여 합성하였다(표 4). pET16 벡터는 Nde I와 BamH I의 제한효소 부위를 가지고 있도록 설계하였다.

(인체 티로시나제 유전자의 클로닝)

결손이 있는 인체 티로시나제는 상기 프라이머 세트를 이용하고 HeLa cell human 5'-stretch plus cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR을 통해 증폭하였다.

pET16 벡터용 PCR 반응 조성은 10×Picomaxx RXN buffer 5㎕, 100mM dNTP 0.4㎕, DNA 주형 1㎕, N-프라이머 1㎕, C-프라이머 1㎕, picomaxx polymerase 1㎕, DW 40.6㎕를 반응액으로 하여 시행하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 40초, 55℃에서 1분 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 30 사이클 반응시켰다.

반응이 끝난 후 1% 아가로우즈 젤에서 증폭된 DNA를 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, C-말단이 결손된 DNA는 1317bp, N-말단이 결손된 DNA는 1092bp, N&C-말단이 결손된 DNA는 1041bp에서 DNA 밴드를 확인하였다.

확인된 PCR 생성물은 즉시 pGEM-T easy 클로닝 벡터와 4℃에서 12시간 반응시킨 후 supercompetent cell(RBC, USA)에 형질전환 하였다. 생성된 pGEM-hTyr 유전자는 대장균으로부터 분리한 후 제한효소 Nde I 과 BamH I 으로 절단하여 1% 아가로우즈 젤 전기영동으로 확인하였다.

증폭된 인체 티로시나제 유전자를 T7 프로모터를 가진 발현 벡터 pET-16b(+)에 도입하여 재조합 벡터 pET16-hTyr(C-), pET16-hTyr(N-), pET16-hTyr(N&C-)를 제조하는 과정은 실시예 1의 pET16-hTyr(TM-)의 제조과정과 동일하게 실시하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, pET16-hTyr 플라스미드 DNA를 제한효소 Nde I 과 BamH I 으로 절단한 결과, 세 종류의 결손변이체를 확인하였다. 확인이 끝난 pET16-hTyr 유전자의 아미노산 서열을 분석하기 위해 Cosmogenetech(Seoul)사에 의뢰한 결과 주형으로 삼았던 염기서열(M27160)과 동일한 서열임을 확인하였다.

pET16-hTyr/ BL21 star (DE3)의 대량 발현을 위해 50 ㎍/㎖의 앰피실린과 1mM Cu²⁺가 포함된 1L LB 배지에 2~3시간 동안 37℃에서 배양하였다. UV로 OD₆₀₀ 값을 측정하여 0.3~0.4 에 이르면, 발현유도제인 IPTG를 최종농도가 0.4mM 되도록 첨가한 뒤, 12시간 이상을 배양하여 대량 발현을 유도하였다.

대량 발현된 pET16-hTyr 균체를 20mM 포타슘 포스페이트 완충용액(pH 6.8)(완충용액 A) 20㎖로 두 번 세척한 후에 균체를 다시 20㎖의 완충용액 A로 균일화 시켰다. 그런 후 초음파 파쇄기(Sonics & Materials INC.)를 이용하여 4℃에서 30~40 watts, amplitude 8% 의 조건으로 30분간 균을 파괴하였다. 이 때 크로마토그래피에 흡착시킨 후의 여액을 수집하여 500mM NaCl과 5mM 이미다졸이 포함된 20mM Tris-HCl(pH 7.9)(완충용액 B)로 8시간씩 3번 투석하였다. 투석한 후의 용액을 완충용액 B로 평형시킨 His·Bind Resin 컬럼 크로마토그래피(Novagen)에 흡착하였다. 불필요한 단백질을 제거하기 위해 12mM 이미다졸이 포함된 완충용액 B로 컬럼 베드 부피의 10배 이상 세척한 다음, 100mM 이미다졸이 포함된 완충용액 B로 1㎖/min의 속도로 용출시켰다. 이때 얻어진 분획을 완충용액 A로 4℃에서 8시간씩 3번 다시 투석하였다. 투석한 후에 단백질이 용출된 분획을 12,000g로 4℃에서 20분간 원심분리하여 인체 티로시나제와 불필요한 단백질을 분리하였다. 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE에 통해 확인하였으며(도 11), 모든 실험은 효소의 활성을 고려해 4℃에서 진행하였다.

원심분리후의 상층액을 DEAE-Sephacel 음이온 교환 크로마토그래피를 통과시키고, 그 통과 액을 히스티딘 분자가 Ni²⁺ 이온에 흡착되는 His·Bind Resin 크로마토그래피(Michele et al., 1987 & 1988)를 이용하여 정제하였다.

그 결과, 배양액 1L당 pET16-hTyr(C-)는 2.2㎎, pET16-hTyr(N-)는 2㎎, pET16-hTyr(N&C-)는 1.84㎎의 정제된 효소를 얻을 수 있었다(표 5).

<실험예 3> L-Dopa의 기질 농도에 대한 영향

L-Dopa의 최종 농도를 0.1mM에서 1.2mM까지 농도 별로 조제하여, 정제된 효소의 대한 기질 농도의 영향을 조사하는데 사용하였다. 각 농도에 대하여 dopa 옥시다제 활성은 실험예 2의 방법에 따라 측정하였다. 이로부터 얻은 값으로 Michaelis 상수 K _m값과 k _cat 값을 Lineweaver-Burk plot에 의하여 구하였다.

그 결과, pET16-hTyr(C-)의 L-Dopa에 농도에 대한 K _m값은 0.27μM로 막관통 부위가 제거되지 않은 야생형 인체 티로시나제의 K _m값인 0.40μM로 L-Dopa에 대한 기질 결합력이 증가하였다. 부분적으로 더 제거된 pET16-hTyr(N-)과 pET16-hTyr(N&C-)의 K _m값은 각각 0.22μM, 0.18μM로 L-Dopa에 대한 기질 결합력이 점차 증가하는 것을 알 수 있었다(표 6).

상기 결과로부터 엑토도메인의 C-말단의 18 개의 아미노산을 제거한 pET16-hTyr(C-)는 야생형의 인체 티로시나제와 비교하였을 때 K _m값이 감소하였다. 또한 N-말단에 91개의 아미노산을 제거한 pET16-hTyr(N-)와 활성중심부분을 제외하고 모두 제거한 pET16-hTyr(N&C-)는 야생형과 비교하였을 때, K _m값이 점차 감소하는 경향을 보였다. 이는 티로시나제의 엑토도메인에서 추가로 제거되는 N-말단 부분에 단백질의 고차구조의 형성에 영향을 미치는 것으로 예측될 수 있으며, 활성 부위 역시 부분적으로 제거된 도메인의 영향으로 구조를 이루어 기질과의 결합력에는 영향을 주는 것으로 생각된다.

도 1은 인체 티로시나제의 구조를 나타낸 것으로, (a) 야생형 인체 티로시나제(hTyr: wild type), (b) hTyr (TM-: 막관통 부위가 결손됨, 1 내지 456 아미노산), (c) hTyr (C-: 엑토도메인의 C-말단의 18개 아미노산이 제거된 1 내지 438 아미노산), (d) hTyr (N-: 엑토도메인의 N-말단의 1 내지 91의 아미노산이 제거된 92 내지 456 아미노산), (e) hTyr (N&C-: 엑토도메인의 N- 및 C-말단이 제거된 92 내지 438 아미노산)이다.

도 2는 PCR에 의해 증폭된 막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제를 아가로우즈 젤을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로, M1(λDNA/HindIII)은 사이즈 마커, 레인 1 내지 3은 증폭된 막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제이다.

도 3은 본 발명의 재조합 벡터 pET16-hTyr(TM-)의 구축 과정을 도시한 것이다.

도 4는 본 발명의 재조합 벡터 pET16-hTyr(TM-)를 아가로우즈 젤을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로, M1(λDNA/HindIII) 및 M2(φX174/HincII)는 사이즈 마커, 레인 1은 pET16-hTyr(TM-) 플라스미드, 레인 2는 pET16-hTyr(TM-) 플라스미드를 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단한 결과이다.

도 5는 본 발명의 재조합 벡터 pMal-hTyr(TM-) 발현 플라스미드의 구축 과정을 도시한 것이다.

도 6은 본 발명의 재조합 벡터 pMal-hTyr(TM-)를 아가로우즈 젤을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로, M1(λDNA/HindIII) 및 M2(φX174/HincII)는 사이즈 마 커, 레인 1은 pMal-hTyr(TM-) 플라스미드, 레인 2는 pMal-hTyr(TM-) 플라스미드를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 절단한 결과이다.

도 7은 대장균에서 발현된 본 발명의 막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것으로, M은 사이즈 마커, 레인 1은 정제된 pMal-hTyr(TM-)이다.

도 8은 본 발명의 막관통 부위가 제거된 인체 티로시나제의 Lineweaver-Burk plot를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 엑토도메인 일부가 결손된 변이체 제조를 위한 인체 티로시나제의 PCR 증폭 결과를 나타낸 것으로, M1(λDNA/HindIII) 및 M2(φX174/HincII)는 사이즈 마커, 레인 1은 hTyr(C-), 레인 2는 hTyr(N-), 레인 3은 hTyr(N&C-)의 DNA 단편이다.

도 10은 본 발명의 인체 티로시나제의 엑토도메인 일부가 결손된 변이체의 DNA 삽입 여부를 확인한 결과로, M1(λDNA/HindIII) 및 M2(φX174/HincII)는 사이즈 마커, 레인 1과 2는 pET16-hTyr(C-)과 hTyr(C-), 레인 3과 4는 pET16-hTyr(N-)과 hTyr(N-), 레인 5와 6은 pET16-hTyr(N&C-)와 hTyr(N&C-)이다.

도 11은 대장균에서 발현된 본 발명의 인체 티로시나제 결손 변이체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것으로, M은 사이즈 마커, 레인 1과 2는 pET16-hTyr(C-)의 조추출물과 펠렛, 레인 3과 4는 pET16-hTyr(N-)의 조추출물과 펠렛, 레인 5와 6은 pET16-hTyr(N&C-)의 조추출물과 펠렛이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Recombinant human tyrosinase fusion protein and use thereof <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer: pET16-hTyr(TM-) <400> 1 ggaattccat atgcattttc cgagagcctg tgtgtcttct 40 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer: pET16-hTyr(TM-) <400> 2 cgcggatccc gttattagat ccgactcgct tc 32 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer: pMal-hTyr(TM-) <400> 3 ggaattccat ttccctagag cctgtgt 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer: pMal-hTyr(TM-) <400> 4 cccaagcttt taccgactcg cttgttc 27 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer: pET16-hTyr(C-) <400> 5 ggaattccat atgcattttc cgagagcctg tgtgtctt 38 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer: pET16-hTyr(C-) <400> 6 cgcggatcct gggtctgaat cttgtagata gcta 34 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer: pET16-hTyr(N-) <400> 7 ggaattccat atgaactgca cagagagacg act 33 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer: pET16-hTyr(N-) <400> 8 cgcggatccc gttattagat ccgactcgct tc 32 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer: pET16-hTyr(N&C-) <400> 9 ggaattccat atgaactgca cagagagacg act 33 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer: pET16-hTyr(N&C-) <400> 10 cgcggatcct gggtctgaat cttgtagata gcta 34 <210> 11 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu Met Glu Lys Glu 1 5 10 15 Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys Gly Gln Leu Ser 20 25 30 Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro Leu Gly 35 40 45 Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu Ser Trp Pro Ser 50 55 60 Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn Phe Met Gly Phe 65 70 75 80 Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro Asn Cys Thr Glu 85 90 95 Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu Ser Ala Pro Glu 100 105 110 Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys His Thr Ile Ser 115 120 125 Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln Met Lys Asn Gly 130 135 140 Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp Leu Phe Val Trp 145 150 155 160 Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly Gly Ser Glu Ile 165 170 175 Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala Phe Leu Pro Trp 180 185 190 His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu Ile Gln Lys Leu Thr 195 200 205 Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp Arg Asp Ala Glu 210 215 220 Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly Gly Gln His Pro Thr 225 230 235 240 Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser Ser Trp Gln Ile 245 250 255 Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln Ser Leu Cys Asn 260 265 270 Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly Asn His Asp Lys 275 280 285 Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys Leu 290 295 300 Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys Ala Ala Asn Phe 305 310 315 320 Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser Pro Leu Thr Gly Ile 325 330 335 Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu His Ile Tyr Met 340 345 350 Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala Asn Asp Pro Ile Phe 355 360 365 Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp Leu Arg 370 375 380 Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala Asn Ala Pro Ile 385 390 395 400 Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile Pro Leu Tyr Arg 405 410 415 Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Ser 420 425 430 Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp Tyr Ile Lys Ser 435 440 445 Tyr Leu Glu Gln Ala Ser Arg Ile 450 455 <210> 12 <211> 1368 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 catttcccta gagcctgtgt ctcctctaag aacctgatgg agaaggaatg ctgtccaccg 60 tggagcgggg acaggagtcc ctgtggccag ctttcaggca gaggttcctg tcagaatatc 120 cttctgtcca atgcaccact tgggcctcaa tttcccttca caggggtgga tgaccgggag 180 tcgtggcctt ccgtctttta taataggacc tgccagtgct ctggcaactt catgggattc 240 aactgtggaa actgcaagtt tggcttttgg ggaccaaact gcacagagag acgactcttg 300 gtgagaagaa acatcttcga tttgagtgcc ccagagaagg acaaattttt tgcctacctc 360 actttagcaa agcataccat cagctcagac tatgtcatcc ccatagggac ctatggccaa 420 atgaaaaatg gatcaacacc catgtttaac gacatcaata tttatgacct ctttgtctgg 480 atgcattatt atgtgtcaat ggatgcactg cttgggggat ctgaaatctg gagagacatt 540 gattttgccc atgaagcacc agcttttctg ccttggcata gactcttctt gttgcggtgg 600 gaacaagaaa tccagaagct gacaggagat gaaaacttca ctattccata ttgggactgg 660 cgggatgcag aaaagtgtga catttgcaca gatgagtaca tgggaggtca gcaccccaca 720 aatcctaact tactcagccc agcatcattc ttctcctctt ggcagattgt ctgtagccga 780 ttggaggagt acaacagcca tcagtcttta tgcaatggaa cgcccgaggg acctttacgg 840 cgtaatcctg gaaaccatga caaatccaga accccaaggc tcccctcttc agctgatgta 900 gaattttgcc tgagtttgac ccaatatgaa tctggttcca tggataaagc tgccaatttc 960 agctttagaa atacactgga aggatttgct agtccactta ctgggatagc ggatgcctct 1020 caaagcagca tgcacaatgc cttgcacatc tatatgaatg gaacaatgtc ccaggtacag 1080 ggatctgcca acgatcctat cttccttctt caccatgcat ttgttgacag tatttttgag 1140 cagtggctcc gaaggcaccg tcctcttcaa gaagtttatc cagaagccaa tgcacccatt 1200 ggacataacc gggaatccta catggttcct tttataccac tgtacagaaa tggtgatttc 1260 tttatttcat ccaaagatct gggctatgac tatagctatc tacaagattc agacccagac 1320 tcttttcaag actacattaa gtcctatttg gaacaagcga gtcggatc 1368 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Pro Asp Ser Phe Gln Asp Tyr Ile Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Ala Ser 1 5 10 15 Arg Ile <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg gatc 54 <210> 15 <211> 438 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu Met Glu Lys Glu 1 5 10 15 Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys Gly Gln Leu Ser 20 25 30 Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro Leu Gly 35 40 45 Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu Ser Trp Pro Ser 50 55 60 Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn Phe Met Gly Phe 65 70 75 80 Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro Asn Cys Thr Glu 85 90 95 Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu Ser Ala Pro Glu 100 105 110 Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys His Thr Ile Ser 115 120 125 Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln Met Lys Asn Gly 130 135 140 Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp Leu Phe Val Trp 145 150 155 160 Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly Gly Ser Glu Ile 165 170 175 Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala Phe Leu Pro Trp 180 185 190 His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu Ile Gln Lys Leu Thr 195 200 205 Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp Arg Asp Ala Glu 210 215 220 Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly Gly Gln His Pro Thr 225 230 235 240 Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser Ser Trp Gln Ile 245 250 255 Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln Ser Leu Cys Asn 260 265 270 Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly Asn His Asp Lys 275 280 285 Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys Leu 290 295 300 Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys Ala Ala Asn Phe 305 310 315 320 Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser Pro Leu Thr Gly Ile 325 330 335 Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu His Ile Tyr Met 340 345 350 Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala Asn Asp Pro Ile Phe 355 360 365 Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp Leu Arg 370 375 380 Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala Asn Ala Pro Ile 385 390 395 400 Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile Pro Leu Tyr Arg 405 410 415 Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Ser 420 425 430 Tyr Leu Gln Asp Ser Asp 435 <210> 16 <211> 1314 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 catttcccta gagcctgtgt ctcctctaag aacctgatgg agaaggaatg ctgtccaccg 60 tggagcgggg acaggagtcc ctgtggccag ctttcaggca gaggttcctg tcagaatatc 120 cttctgtcca atgcaccact tgggcctcaa tttcccttca caggggtgga tgaccgggag 180 tcgtggcctt ccgtctttta taataggacc tgccagtgct ctggcaactt catgggattc 240 aactgtggaa actgcaagtt tggcttttgg ggaccaaact gcacagagag acgactcttg 300 gtgagaagaa acatcttcga tttgagtgcc ccagagaagg acaaattttt tgcctacctc 360 actttagcaa agcataccat cagctcagac tatgtcatcc ccatagggac ctatggccaa 420 atgaaaaatg gatcaacacc catgtttaac gacatcaata tttatgacct ctttgtctgg 480 atgcattatt atgtgtcaat ggatgcactg cttgggggat ctgaaatctg gagagacatt 540 gattttgccc atgaagcacc agcttttctg ccttggcata gactcttctt gttgcggtgg 600 gaacaagaaa tccagaagct gacaggagat gaaaacttca ctattccata ttgggactgg 660 cgggatgcag aaaagtgtga catttgcaca gatgagtaca tgggaggtca gcaccccaca 720 aatcctaact tactcagccc agcatcattc ttctcctctt ggcagattgt ctgtagccga 780 ttggaggagt acaacagcca tcagtcttta tgcaatggaa cgcccgaggg acctttacgg 840 cgtaatcctg gaaaccatga caaatccaga accccaaggc tcccctcttc agctgatgta 900 gaattttgcc tgagtttgac ccaatatgaa tctggttcca tggataaagc tgccaatttc 960 agctttagaa atacactgga aggatttgct agtccactta ctgggatagc ggatgcctct 1020 caaagcagca tgcacaatgc cttgcacatc tatatgaatg gaacaatgtc ccaggtacag 1080 ggatctgcca acgatcctat cttccttctt caccatgcat ttgttgacag tatttttgag 1140 cagtggctcc gaaggcaccg tcctcttcaa gaagtttatc cagaagccaa tgcacccatt 1200 ggacataacc gggaatccta catggttcct tttataccac tgtacagaaa tggtgatttc 1260 tttatttcat ccaaagatct gggctatgac tatagctatc tacaagattc agac 1314 <210> 17 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu Met Glu Lys Glu 1 5 10 15 Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys Gly Gln Leu Ser 20 25 30 Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro Leu Gly 35 40 45 Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu Ser Trp Pro Ser 50 55 60 Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn Phe Met Gly Phe 65 70 75 80 Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly 85 90 <210> 18 <211> 273 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 catttcccta gagcctgtgt ctcctctaag aacctgatgg agaaggaatg ctgtccaccg 60 tggagcgggg acaggagtcc ctgtggccag ctttcaggca gaggttcctg tcagaatatc 120 cttctgtcca atgcaccact tgggcctcaa tttcccttca caggggtgga tgaccgggag 180 tcgtggcctt ccgtctttta taataggacc tgccagtgct ctggcaactt catgggattc 240 aactgtggaa actgcaagtt tggcttttgg gga 273 <210> 19 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Pro Asn Cys Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp 1 5 10 15 Leu Ser Ala Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala 20 25 30 Lys His Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly 35 40 45 Gln Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr 50 55 60 Asp Leu Phe Val Trp Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu 65 70 75 80 Gly Gly Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro 85 90 95 Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu 100 105 110 Ile Gln Lys Leu Thr Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp 115 120 125 Trp Arg Asp Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly 130 135 140 Gly Gln His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe 145 150 155 160 Ser Ser Trp Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His 165 170 175 Gln Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro 180 185 190 Gly Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp 195 200 205 Val Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp 210 215 220 Lys Ala Ala Asn Phe Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser 225 230 235 240 Pro Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala 245 250 255 Leu His Ile Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala 260 265 270 Asn Asp Pro Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe 275 280 285 Glu Gln Trp Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu 290 295 300 Ala Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe 305 310 315 320 Ile Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu 325 330 335 Gly Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln 340 345 350 Asp Tyr Ile Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Ala Ser Arg Ile 355 360 365 <210> 20 <211> 1095 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ccaaactgca cagagagacg actcttggtg agaagaaaca tcttcgattt gagtgcccca 60 gagaaggaca aattttttgc ctacctcact ttagcaaagc ataccatcag ctcagactat 120 gtcatcccca tagggaccta tggccaaatg aaaaatggat caacacccat gtttaacgac 180 atcaatattt atgacctctt tgtctggatg cattattatg tgtcaatgga tgcactgctt 240 gggggatctg aaatctggag agacattgat tttgcccatg aagcaccagc ttttctgcct 300 tggcatagac tcttcttgtt gcggtgggaa caagaaatcc agaagctgac aggagatgaa 360 aacttcacta ttccatattg ggactggcgg gatgcagaaa agtgtgacat ttgcacagat 420 gagtacatgg gaggtcagca ccccacaaat cctaacttac tcagcccagc atcattcttc 480 tcctcttggc agattgtctg tagccgattg gaggagtaca acagccatca gtctttatgc 540 aatggaacgc ccgagggacc tttacggcgt aatcctggaa accatgacaa atccagaacc 600 ccaaggctcc cctcttcagc tgatgtagaa ttttgcctga gtttgaccca atatgaatct 660 ggttccatgg ataaagctgc caatttcagc tttagaaata cactggaagg atttgctagt 720 ccacttactg ggatagcgga tgcctctcaa agcagcatgc acaatgcctt gcacatctat 780 atgaatggaa caatgtccca ggtacaggga tctgccaacg atcctatctt ccttcttcac 840 catgcatttg ttgacagtat ttttgagcag tggctccgaa ggcaccgtcc tcttcaagaa 900 gtttatccag aagccaatgc acccattgga cataaccggg aatcctacat ggttcctttt 960 ataccactgt acagaaatgg tgatttcttt atttcatcca aagatctggg ctatgactat 1020 agctatctac aagattcaga cccagactct tttcaagact acattaagtc ctatttggaa 1080 caagcgagtc ggatc 1095 <210> 21 <211> 347 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Pro Asn Cys Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp 1 5 10 15 Leu Ser Ala Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala 20 25 30 Lys His Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly 35 40 45 Gln Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr 50 55 60 Asp Leu Phe Val Trp Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu 65 70 75 80 Gly Gly Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro 85 90 95 Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu 100 105 110 Ile Gln Lys Leu Thr Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp 115 120 125 Trp Arg Asp Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly 130 135 140 Gly Gln His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe 145 150 155 160 Ser Ser Trp Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His 165 170 175 Gln Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro 180 185 190 Gly Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp 195 200 205 Val Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp 210 215 220 Lys Ala Ala Asn Phe Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser 225 230 235 240 Pro Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala 245 250 255 Leu His Ile Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala 260 265 270 Asn Asp Pro Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe 275 280 285 Glu Gln Trp Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu 290 295 300 Ala Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe 305 310 315 320 Ile Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu 325 330 335 Gly Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp 340 345 <210> 22 <211> 1041 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ccaaactgca cagagagacg actcttggtg agaagaaaca tcttcgattt gagtgcccca 60 gagaaggaca aattttttgc ctacctcact ttagcaaagc ataccatcag ctcagactat 120 gtcatcccca tagggaccta tggccaaatg aaaaatggat caacacccat gtttaacgac 180 atcaatattt atgacctctt tgtctggatg cattattatg tgtcaatgga tgcactgctt 240 gggggatctg aaatctggag agacattgat tttgcccatg aagcaccagc ttttctgcct 300 tggcatagac tcttcttgtt gcggtgggaa caagaaatcc agaagctgac aggagatgaa 360 aacttcacta ttccatattg ggactggcgg gatgcagaaa agtgtgacat ttgcacagat 420 gagtacatgg gaggtcagca ccccacaaat cctaacttac tcagcccagc atcattcttc 480 tcctcttggc agattgtctg tagccgattg gaggagtaca acagccatca gtctttatgc 540 aatggaacgc ccgagggacc tttacggcgt aatcctggaa accatgacaa atccagaacc 600 ccaaggctcc cctcttcagc tgatgtagaa ttttgcctga gtttgaccca atatgaatct 660 ggttccatgg ataaagctgc caatttcagc tttagaaata cactggaagg atttgctagt 720 ccacttactg ggatagcgga tgcctctcaa agcagcatgc acaatgcctt gcacatctat 780 atgaatggaa caatgtccca ggtacaggga tctgccaacg atcctatctt ccttcttcac 840 catgcatttg ttgacagtat ttttgagcag tggctccgaa ggcaccgtcc tcttcaagaa 900 gtttatccag aagccaatgc acccattgga cataaccggg aatcctacat ggttcctttt 960 ataccactgt acagaaatgg tgatttcttt atttcatcca aagatctggg ctatgactat 1020 agctatctac aagattcaga c 1041

Claims (13)

1. 서열목록 서열번호 15, 19 또는 21에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 인체 티로시나제; 및

   상기 인체 티로시나제의 N-말단에 연결되는 단백질 태그를 포함하는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서,

   단백질 태그는 (His)₆-태그, 말토오스 결합 단백질, 헤마글루티닌 A, 베타-갈락토시다제, 티미딘 키나제, 트랜스페린, myc-태그, VP16, FLAG 및 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질.
3. 제1항 기재의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질을 코딩하는 유전자.
4. 제3항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체.
6. 제5항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질의 제조 방법.
7. 제6항에 있어서,

   융합 단백질은 이온 교환체 컬럼 크로마토그래피, 및 금속 친화력 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 거쳐 분리 정제하는 단계를 더 포함하는 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질의 제조 방법.
8. 제1항의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 티로시나제 저해제 스크리닝용 키트.
9. 제1항의 재조합 인체 티로시나제 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자 를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물.
10. 제9항에 있어서,

    멜라닌 저색소증 질환이 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 또는 점상 백피증인 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물.
11. 제9항에 있어서,

    유효량의 재조합 인체 티로시나제 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물인 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물.
12. 제9항에 있어서,

    유효량의 재조합 인체 티로시나제 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 화장료 조성물인 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물.
13. 제9항에 있어서,

    유효량의 재조합 인체 티로시나제 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 식품 조성물인 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물.

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