KR100472938B1

KR100472938B1 - 세포침투 효율을 향상시킨 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질 및 그 용도

Info

Publication number: KR100472938B1
Application number: KR10-2002-0066981A
Authority: KR
Inventors: 최진희; 최수영; 박진서; 한규형
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2005-03-11
Also published as: US20060165634A1; JP4298659B2; JP2006504770A; AU2003210043A1; US7306944B2; KR20040038108A; WO2004039846A1

Abstract

본 발명은 기능을 가진 단백질 또는 펩타이드를 더 높은 효율로 세포 내로 도입시키는 융합단백질과 그 용도에 관한 것으로 좀더 상세히는 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 목표단백질의 아미노기와 카르복실기에 공유결합된, 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질과 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 단백질의 세포 내 도입능과 효율 및 세포 내 활성을 용이하게 분석하기 위한 녹색형광 단백질(Green fluorescence protein)과 생체 방어메카니즘에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(SOD)를 목표 단백질로 사용하였다.

Description

세포침투 효율을 향상시킨 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질 및 그 용도 {Advanced cell-transducing transport domain-target protein-transport domain fusion protein and thereof uses}

본 발명은 기능을 가진 단백질 또는 펩타이드를 더 높은 효율로 세포 내로 도입시키는 융합단백질과 그 용도에 관한 것으로 좀더 상세히는 6 내지 12개의 아미노산으로 이루어지고, 그 중 3/4 이상이 아르기닌 또는 라이신으로 이루어진 수송도메인이 목표단백질의 아미노기와 카르복실기 말단에 융합된 융합단백질을 제조, 정제함으로써 높은 효율로 세포 내로 투과되어 세포 내에서 활성을 가지는 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명은 단백질의 세포 내 도입능과 효율 및 세포 내 활성을 용이하게 분석하기 위한 녹색형광 단백질(Green fluorescence protein)과 생체 방어메카니즘에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(Cu,Zn-Superoxide dismutase; 이하 본 명세서에서 "Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스", "슈퍼옥사이드 디스뮤테이스", "SOD", "Cu,Zn-SOD"를 혼용하였음, 모두 동일한 의미임)를 목표단백질로 사용하였다.

본 명세서의 "목표단백질(target protein)"은 상기 HIV-1 Tat 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 치료 분자, 예방 분자 및 진단 분자 등을 의미하며, 실제로는 순수한 단백질에만 한정되는 것이 아니라, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당류와 결합된 당단백질, 펩티도글리칸 등을 통칭하는 표현으로 사용한다.

또한, 본 발명에서 "수송도메인"은 펩타이드, 단백질, 올리고펩타이드, 당류와 결합된 당단백질, 펩티도글리칸 또는 폴리펩타이드 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 도메인으로서, 6∼12개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 그 중 3/4 이상이 아르기닌 또는 라이신 잔기로 이루어져 있는 것을 말하며, 대표적인 예를 들자면 HIV-1 Tat(48-57), 올리고라이신, 올리고아르기닌, 올리고(라이신,아르기닌) 등을 말한다. 더욱 바람직하게는 9개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 그 중 3/4 이상이 아르기닌 또는 라이신 잔기로 이루어져 있는 것을 본 발명의 수송 도메인의 예로 들 수 있다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 당단백질, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 등을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

최근에 다양한 질환이 세포 단백질의 비정상적인 활성에 기인한다는 사실이 알려짐에 따라 이들 단백질의 활성을 조절함으로써 치명적인 인체질환을 치료할 수 있는 약제의 개발이 전세계적으로 관심의 대상이 되고 있다.

활성산소종(reactive oxygen species)은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서, 여러 세포 내 대사과정의 부산물로 필연적으로 생성된다. 이러한 활성산소종은 세포 내의 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체고분자에 손상을 입히며. 인체의 여러 질병의 진행과정과 깊게 관련되어 있다. 특히, 발암과정, 뇌졸증, 관절염, 동맥경화, 방사선 손상 및 염증반응에 관여하며 정상적인 노화과정에서도 노화를 촉진시키는 중요한 요인으로 작용한다[Floyd, R.A.(1990) FASEB J. 4, 2587-2597.Anderson, W. F.(1998) Human gene therapy. Nature 392, 25-30. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C.(1999) Free radicals in biology and medicine, Oxford University Press, Oxford].

Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스와 관련된 질병들을 간략히 살펴보면 다음 표 1과 같다.

카테고리	구체적인 예
염증성/면역성 손상	사구체신염, 맥관염, 자기면역성 질환 등
국소빈혈	졸중, 심근경색, 부정맥, 협심증 등
약물과 독성물질 유도 반응	생략
철 과적(overload): 조직 및 혈장	특발성 헤모크로마토시스 등
방사선 관련 손상	핵 피폭, 방사선 치료 등
노화	조로증, 질병관련 노화
적혈구 세포	겸상적혈구증, 말라리아 등
기관지	담배흡연의 결과, 폐기종 등
심장과 심혈관계	심근증 등
신장	자기면역 신증후군 등
위장	베텔넛-관련 구강암 등
뇌/신경체계/신경근육 이상	고압산소증, 알쯔하이머병, 파킨슨병 등
눈	백내장 등
피부	UV조사에 의한 질병 등

* 출처: Free radicals in biology and medicine, Oxford University Press, Oxford pp 618~619.

공지된 활성산소종은 ₁O₂, OH, O₂, H₂O₂등이 있으며 이들은 생체 내에서 각종 효소반응에 의해 생성되며 각종 생리활성 물질의 생합성, 면역기능, 약물의 대사 등에서 매우 중요한 역활을 하지만 외부로부터의 방사선, 자외선, 공해 및 각종 스트레스 등에 의해 과잉생성될 경우 오히려 생체에 손상을 가져올 수 있기 때문에 생체는 방어기능으로 SOD, 카탈라제(Catalase), 퍼옥시다제(Peroxidase)등의 효소를 갖고 있는데 노화가 시작되면 피부의 균형이 깨지게 되고 각종 활성산소류에 대한 피부보호능력이 떨어지게 된다.

따라서 이러한 활성산소류들로부터 세포를 보호해줄 필요성이 대두되는데, 화장품 원료로써의 활성산소제거제로써 SOD, 락토페린, 항산화제 등이 사용 내지 개발되고 있다. 하지만 SOD는 활성산소 제거능에도 불구하고 효소단백질이라는 성질로 인하여 지질에 대해 난용성이며 안정성이 나쁘고, 분자량이 30,000달톤 (Dalton) 이상으로 피부 각질층의 투과가 불가능하다는 문제점이 있어서 화장료 조성물로 유용하게 이용되지 못하였다.

Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스는 자유라디칼의 해독과 산소의 손상으로부터 세포의 손상을 막아주는 세포 내 중요한 방어 효소이다[Fridovich, I.(1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 97-112.]. 모든 생체내 고분자들은 이러한 산소라디칼의 해로운 작용에 항상 노출되어 있기 때문에 여러 질환에서 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스를 치료 목적으로 이용하려는 관심도가 매우 높아지고 있다.

최근 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스를 임상적으로 응용하기 위하여 많은 방법들이 시도되고 있다. 현재까지 개발된 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스의 생체내 운반 방법은 크게 3가지로 구분할 수 있다. 첫째, Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 피콜(Ficoll), 레시틴(lecithin), 알부민(albumin) 등을 접합시키는 방법[Del Zoppo, G.J., Wagner, S. and Tagaya, M. (1997) Drugs 54, 9-38. Muzykantov, V.R., Atochina, E.N., Ischiropoulos, H., Danilov, S.M. and Fisher, A.B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5213-5218.], 둘째, 리포조옴(liposome)을 이용하여 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스를 캡슐화시키는 방법[Perdereau, B., Campana, F., Vilcoq, J.R., de la Rochefordiere, A., Barbaroux, C., Fourquet, A. and Magdelenat, H. (1994) Bull. Cancer 81, 659-669.], 셋째, Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 유전자를 형질도입하여 세포 내에서 효소의 과다 발현을 유도하는 유전자 치료 등이 시도되고 있다[Okumura, K., Nishiguchi, K., Tanigawara, Y., Mori, S., Iwakawa, S. and Komada, F.(1997) Pharm. Res. 14, 1223-1227. Lehmann, T.G., Wheeler, M.D., Schoonhoven, R., Bunzendahl, H., Samulski, R.J. and Thurman, R.G.(2000) Transplantation 69, 1051-1057. Liu, R., Oberley, T.D. and Oberley, L.W.(1997) Hum. Gene Ther. 8, 585-595.].

이중 가장 주목받고 있는 것은 유전자 치료로서 그 동안 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 유전자 치료를 질병에 적용하려는 많은 연구가 이루어져 왔다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 세포 내로의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현율이 낮고, 발현되는 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧으며, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 지니고 있다[ Verma, I.M. and Somia, N.(1997) Nature 389, 239-242].

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는 데 있어서 또 다른 방법으로 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 치료용 약물이나 단백질은 그 크기 또는 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 힘들다. 일반적으로 분자량 600 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근 인간 면역결핍 바이러스(Hunan Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(transactivator of transcription) 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(Protein Transduction Domain)의 특성때문에 나타나며 아직 그 정확한 메카니즘은 알려지지 않은 상태이다[Frankel, A.D. and Pabo, C.O.(1988) Cell 55, 1189-1193. Green, M. and Loewenstein, P.M.(1988) Cell 55, 1179-1188. Ma, M. and Nath, A.(1997) J. Virol. 71, 2495-2499. Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B.(1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017.]. 그러나, Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 Tat 단백질의 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해되고 있다[ Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B.(1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017. Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A.(1996) J. Biol. Chem. 271, 18188-18193.].

최근의 연구에서, 오브알부민(ovalbumin), β-갈락토시다아제 (galactosidase), 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 같은 이형단백질을 HIV-1 Tat 단백질과 융합시켜 투여하였을 때 생체 각 조직 및 배양된 세포 내로 직접 운반된다는 것을 보여 주었다[Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore, C., Chen, L.L., Pepinsky, B. and Barsoum, J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668. Schwartze, S.R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. and Dowdy, S.F.(1999) Science. 285, 1569-1572. Watson, K. and Edward, R.J. (1999) Biochem. Pharmacol. 58, 1521-1528]. 이러한 실험결과는 Tat 단백질이 자신뿐만 아니라 다른 종류의 거대한 단백질도 세포 내로 함께 운반할 수 있는 능력을 갖고 있다는 것을 의미한다.

그러나, 실제 모든 단백질이 Tat 단백질에 의해 운반되는 것은 아니다. 또한, Tat에 의해 세포 내로 운반된 모든 단백질이 생물학적 활성을 나타내는지도 아직 확실히 밝혀지지 않은 상태이다.

또한, 본 발명자는 HIV Tat 49-57 수송도메인 외에도 라이신이 6 내지 12개 결합된 올리고라이신 수송도메인, HIV Tat 48-57 잔기 중 2,3개의 잔기가 결여된 염기성 수송도메인이 아미노기에 공유결합된 융합단백질에 대하여 세포투과실험을 수행한 바 있으며, 이들은 원활한 세포투과능을 나타내었다(공개특허공보 제2002-10446호, 제2002-67108호).

따라서, 본 발명의 목적은 목표단백질을 세포 내로 도입하거나 발현시킴에 있어서 종래 기술의 문제점을 해결하고 고효율로 세포 내로 도입시키고 세포 내에서 활성을 가지도록 하려는 것이다.

또한, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스를 세포 내로 도입하거나 발현시킴에 있어서 종래 기술의 문제점을 해결하고 고효율로 세포 내로 도입시키고 세포 내에서 활성을 가지도록 하려는 것이다.

또한, 본 발명은 수송도메인과 융합된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스를 이용하여 피부 표피, 진피층, 피하지방층까지 침투하여 활성산소종의 제거능이 탁월한 화장료를 제공하려는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 수송도메인과 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스를 융합시켜 이 융합단백질이 효과적으로 세포 내로 투과되는지를 HeLa 세포를 이용한 실험에서 확인하였다. 또한, 수송도메인-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스-수송도메인 융합단백질을 다량 생산하는 방법 및 정제하는 방법을 개발하였다.

본 발명은 기능을 가진 단백질 또는 펩타이드를 보다 효율적으로 세포 내로 운반하고 세포 내에서도 보다 높은 활성을 가지도록 하기 위하여 수송도메인과 융합시킨 융합단백질과 이 융합단백질을 이용한 약제 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 수송도메인-목표 단백질-수송도메인 융합단백질은 유전자 재조합 방법 외에도 일반적인 화학결합 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명은 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 목표단백질의 아미노기와 카르복실기에 공유결합된, 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질에 관한 것이다. 목표단백질의 양 말단에 위치하는 수송도메인은 반드시 동일한 잔기로 이루어져 있어야 하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 수송도메인이 9개의 아미노산 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 수송도메인이 HIV tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 목표단백질이 치료분자, 예방분자, 진단분자로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 목표단백질이 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 또는 그의 기능적 등가물인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 목표단백질이 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 또는 그의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형인 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 필요에 따라 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고 필요에 따라 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.0001~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 크림, 연고, 젤, 로션, 화장수 등으로 제형화되어 사용될 수 있으며, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 로션, 젤, 에센스, 크림, 화장수 등은 각각 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있으며, 기초 화장품 등에 편리하게 첨가하여 사용될 수 있다.

일례로서 크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.당업자들은 본 발명이 서열번호에 명시적으로 기재된 Tat 융합단백질 아미노산 서열 및 Tat 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에만 한정되는 것이 아님을 분명히 알 수 있다. 예컨대, Sambrook 등(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1. pp.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))이 정의한 바와 같이, 본 발명이 Tat 융합단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션할 수 있는 그러한 DNA 또는 RNA 서열도 포함된다는 것을 분명히 이해하고 있을 것이다.따라서, 본 발명에 의해 해석되는 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 발명 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션하는 서열 및 유전암호의 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 아래 개시한 방법에 의해 제조된 Tat 융합단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.본 발명은 Tat 융합단백질 아미노산 서열뿐만 아니라, silent change에 따라 서열내에서 다른 아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. silent change란 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있음을 말한다. 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다.즉, 유전자 서열의 "기능적 등가물"이란 동일한 아미노산 서열로 번역되는 유전자 서열들을 의미하며, 또한, 아미노산 서열의 "기능적 등가물"이란 예컨대, 서열 내의 아미노산들이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산들로 치환되어 동등한 기능을 수행할 수 있는 아미노산 서열들을 의미한다.

이하에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 수송도메인 융합단백질 발현 벡터의 제조>

기능을 가진 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표단백질을 전달할 수 있는 융합단백질 발현벡터를 제조하였다.

본 실시예에서는 수송 도메인이 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 녹색형광 단백질(Green Fluorescence Protein; 본 명세서에서 "GFP"라 약칭함)을 목표단백질로 선택하였다. GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 플라스미드 pEGFP-C2(클론텍)를 이용하여 Pfu DNA 중합효소로 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 GFP의 완전한 서열을 증폭하였다. 정방향 개시체(sense primer)는 5'-CTCGAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'이고, 역방향 개시체(antisense primer)의 서열은 5'-GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCC ATGCCGAG-3'이다. PCR산물은 XhoI-BamHI으로 잘리며, pET15b(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 XhoI-BamHI 자리에 서브클론되어 HIV-1 Tat의 염기성 도메인이 없는 GFP 융합단백질을 발현시키는 pGFP를 제조하였다. 약 0.7kb의 삽입체를 가진 클론은 XhoI-BamHI 제한효소 분석으로 선택되고 서열결정을 통하여 분석되었다.

GFP와 융합된 HIV-1 Tat의 염기성 도메인(아미노산 48-57)을 발현시키는 pTat-GFP는 다음의 방법으로 제조되었다. 첫째, 두개의 올리고뉴클레오타이드가 제조되어 HIV-1 Tat의 염기성 도메인의 아홉 개 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드로 어닐되었다. HIV-1 Tat의 염기성 도메인의 아홉개 아미노산을 코딩하는 서열은 위쪽 사슬(top strand) 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'과 아래쪽 사슬(bottom strand) 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3'이다. 이중사슬 올리고뉴클레오타이드는 직접 pGFP의 NdeI-XhoI으로 소화된 부위에 연결된다. 그리하여 인프레임으로(in frame) 6개의 히스티딘 오픈리딩프레임과 연결된 Tat-GFP 발현 플라스미드인 pTat-GFP가 제조되었다(도 1).

또한, Tat 염기성 도메인이 GFP 양쪽 말단에 융합된 pTat-GFP-Tat 은 pTat-GFP 에 Tat 염기성 도메인 아홉 개 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴틀레오타이드가 어닐되어 카르복실 말단에 삽입되었고, Tat 염기성 말단이 카르복실 말단에 융합된 pGFP-Tat 은 pGFP 에 Tat 염기성 도메인 아홉 개 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드가 어닐되어 카르복실 말단에 삽입되었다(도 1).

플라스미드에 클론된 올리고뉴클레오타이드의 서열은 형광 자동 서열분석기 (fluorescence-based automated sequencer, 모델 373A, Applied Biosystems, Inc.)로 확인하였다.

<실시예 2: Tat-GFP, GFP-Tat 및 Tat-GFP-Tat 융합단백질의 발현 및 정제 (Native, denatured)>

pGFP 및 pTat-GFP, pGFP-Tat과 pTat-GFP-Tat 등으로 형질전환된 E. coli BL21(파마시아)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 배양액은 신선한 LB 배지에서 10배 희석하여 250rpm으로 교반하여 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM 되게 한 다음 4시간을 더 배양하였다.

변성된 수송도메인-GFP 융합단백질을 얻기 위하여 배양된 세포에 6M 우레아와 프로테아제 억제제(20mg/ml 소이빈 트립신 억제제, 2mg/ml 아프로티닌, 5mg/ml 류펩틴, 100mg/ml PMSF)가 포함된 결합완충용액(binding buffer; 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파처리(sonication)하여 수확하고 용균하였다. 완충액 A(buffer A; 6M 우레아, 20mM HEPES, pH 8.0, 100mM NaCl)에 넣고 초음파처리하여 세포를 파쇄시킨 다음 원심분리를 2회(16,500rpm x 30min, 40,000rpm x 30min, 4℃) 연속 수행하여 불용성의 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 그 후 용균액(lysate)을 Ni⁺⁺⁺-IDA 컬럼을 통해 정제하였다. 컬럼은 먼저 6M 우레아가 없는 결합완충용액으로 세척한 후 세척완충용액(80mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척하였다. 단백질은 용출완충액(1mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 용출한 후 PD-10 컬럼 크로마토그래피(Amersham)를 이용하여 단백질에 포함된 염분을 제거하였다(도 2). 정제된 GFP 융합단백질은 약 30 kDa의 크기로 발현, 정제되었으며, Tat-GFP, GFP-Tat 융합단백질은 Tat 수송도메인의 크기(약 1kDa)만큼 더 큰 크기로 발현, 정제 되었으며, Tat-GFP-Tat 융합단백질은 양쪽에 Tat 수송도메인이 융합되어 있으므로, Tat-GFP, GFP-Tat 융합단백질보다 하나의 Tat 수송도메인의 크기만큼 더 큰 분자량으로 발현되었고, 정제되었다.

변성되지 않은 자연상태의 수송 도메인-GFP 융합단백질은 상기 언급된 변성제 없이 동일한 과정으로 얻어졌다. 각 분획의 단백질 농도는 SDS-PAGE로 분리한 후 밀도측정분석방법으로 우태혈청 알부민(BSA)을 스탠다드로 하여 정량하였다. 단백질 농도는 브래드포드 단백질 어세이(Biorad)로 결정하였다. 정제된 융합단백질들은 20% 글리세롤이 포함된 PBS에 용해되었고 -80℃에 저장되었다.

<실시예 3: 세포 배양과 융합단백질의 세포 내 전달 실험>

HeLa 세포는 37℃에서 20mM HEPES/NaOH(pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생제(100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.

9개의 아미노산(49-57)으로 이루어진 HIV-1 Tat 단백질 수송 부분을 아미노산 말단과 카르복실 말단에 결합시킨 변이체 수송 도메인에 대한 화물 분자 세포 투과능을 관찰하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 즉, 수송도메인-GFP, GFP-수송도메인, 수송도메인-GFP-수송도메인 융합단백질들의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고 여러 농도의 GFP 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 37℃에서 1시간동안 배양한 뒤, 세포를 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline;PBS)로 충분히 세척하고, 10분동안 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 수송도메인-GFP 융합단백질의 양을 다음 실시예와 같이 웨스턴블랏 분석으로 측정하였다.

<실시예 4: 웨스턴블랏 분석>

Tat 수송도메인이 아미노산말단에 한 개가 융합되어 있는 단백질과 양쪽에 융합되어 있는 단백질간의 세포 내 이동효율을 분석하기 위하여 웨스턴블랏 실험방법을 수행하였다. 먼저 단백질들은 변성된 상태로 정제되었다. 준비된 HeLa 동물세포에 1M의 변성된 융합단백질을 처리한 다음 1시간 후에 세포들만 모아서 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포를 용균하여 얻어진 세포 용균액을 용균 완충액(125mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% v/v 글리세롤)이 있는 6-웰 플레이트에 넣었다. 전체세포 용균액 각 15㎍씩을 SDS-12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기이동시켰다.

전기이동으로 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 10% 분유(dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 래빗 항-GFP 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Clontech, USA, 1:1,000)로 처리하였다. 그 후 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 고우트 항-래빗 (goat anti-rabbit) IgG 항체(Sigma, 1:10,000 희석)와 반응시켰다. 결합된 항체들은 화학발광으로 확인할 수 있었다(ECL; Amersham). 그 결과 도 3에서 나타내듯이 Tat 수송도메인이 아미노산 말단에만 있는 융합단백질과 Tat 수송도메인이 카복실 말단에 있는 융합단백질은 서로 비슷하게 세포 내로 이동하였다. 그러나 Tat 수송도메인이 양쪽 말단에 융합되어 있는 단백질은 한 개의 Tat 수송도메인이 연결되어 있는 융합단백질보다 더 효과적으로 세포 내로 이동하였다. 이 결과는 Tat 수송도메인이 융합단백질의 아미노산 말단과 카복실 말단 어느 쪽에 융합되어 있던지 그 효과는 비슷하지만, Tat 수송 도메인이 양쪽에 융합되어 있으면 세포 내로의 이동효과가 크게 향상됨을 나타내준다.

<실시예 5: 공초점 형광분석(confocal microscopy)에 의한 세포도입 분석>

목표세포에 융합단백질을 전달하고자 할 때 전달되는 세포의 비율이 얼마나 되는지가 중요하다. 또한 세포 내로 투과된 융합단백질이 그 고유한 활성을 유지해야만 이러한 단백질 전달 기술이 응용될 수 있다. 따라서 본 실험에서 GFP 융합단백질이 전달되는 세포의 비율이나 전달된 융합단백질의 활성 유무를 분석하였다. 변성된 GFP 융합단백질을 처리한 HeLa 세포에서 GFP가 나타내는 형광도를 형광현미경으로 관찰하였다.

커버 슬립 상에서 50-70%의 컨플루언시(confluency)가 되도록 세포를 배양한 다음 양쪽 말단에 수송도메인이 결합되어 있는 GFP-융합단백질을 1M 처리하고 15분동안 배양하였다. HeLa 세포들은 PBS로 두번 세척한 후 트립신 처리되고, 실온에서 5분동안 포름알데히드가 함유된 PBS로 고정되었다. 세포들은 다시 PBS로 세척한 다음 핵만을 염색하기 위해 2g/ml의 프로피디움아이오다이드(propidium iodied, PI)를 15분동안 처리하였다. 세포들은 다시 PBS로 세척한 다음 마운팅 용액(mounting solution; 90% 글리세롤, 0.1% 페닐렌디아민이 포함된 인산완충액 식염수(PBS))을 처리하고 커버 글래스를 덮어 공초점 형광현미경을 이용하여 488nm과 545nm 형광필터로 세포 내 형광 유무를 관찰, 단백질의 세포 내 분포를 분석하였다(Eric et al., 1997). 그 결과(도 4) Tat 수송도메인이 아미노산 말단에 융합되어 있는 단백질과 카복실 말단에 융합되어 있는 단백질은 거의 유사하게 세포질뿐 아니라, 핵까지 도달하였다. 이것은 웨스턴블랏의 결과와 마찬가지로 Tat 수송도메인이 단백질의 어느 부분에 융합되어 있든지 그 효과는 비슷하다는 것을 보여준다. 반면, Tat 수송도메인이 양쪽에 붙은 융합단백질은 한쪽에만 존재하는 융합단백질보다 더욱 밝은 형광을 나타내었다. 그리고 많은 단백질이 핵 내로 이동되었다.

<실시예 6: FACS (flow cytometry)분석에 의한 세포 도입 분석>

9개의 아미노산(49-57)으로 이루어진 HIV-1 Tat 단백질 수송 부분을 아미노산 말단과 카르복실 말단 양쪽에 결합시킨 변이체 수송 도메인에 대한 화물 분자 세포 투과능을 관찰하기 위하여 다음과 같이 실험하였다(도 5). 즉, 수송도메인-GFP-수송도메인 융합단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고 여러 농도의 GFP 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 37℃에서 30분동안 배양한 뒤, 세포를 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline;PBS)로 충분히 세척하고, 10분동안 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하였다. 세포를 모아서 다시 PBS로 2번 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyed)로 1시간동안 고정시킨다. 고정시킨 세포에 대하여 FACS를 이용하여 세포 내 형광을 분석하였다. FACS 분석결과 도 5와 같은 곡선을 얻을 수 있었다. 앞에서의 결과들과 마찬가지로 Tat 수송도메인이 한쪽에만 융합되어 있는 단백질은 비슷한 양으로 세포 내 도입되는 반면 양쪽에 Tat 수송도메인이 있는 융합단백질은 많은 양으로 세포 내로 도입됨을 알 수 있었다. 평균 형광도(Mean Fluorescence intensity)는 수송도메인-GFP 가 23.86, GFP-수송도메인이 17.21, 수송도메인-Tat-수송도메인은 204.52로서 월등하게 Tat-GFP-Tat 융합단백질이 높은 수치를 나타내었다. 그 다음, Tat 수송도메인을 양쪽으로 융합된 단백질의 양에 의해 세포 내 도입되는 메카니즘을 분석하기 위해 다양한 농도로 처리하여 30분간 배양한 후 FACS 분석을 실시하였다 (도 6). Tat 수송도메인을 양쪽으로 가지고 있는 융합단백질도 농도에 평균형광도가 증가하는 결과를 볼 수 있었다.

<실시예 7: FACS(flow cytometry)분석과 웨스턴블랏에 의한 자연상태의 융합단백질과 변성된 융합단백질의 세포도입 비교 분석>

자연상태로 수송도메인-GFP을 정제하여 세포 내로 도입했을 때 변성시켜 정제한 수송도메인-GFP보다 도입되는 효과가 많이 제한된다. 수송도메인이 양쪽 말단에 존재하는 GFP 융합단백질은 변성하여 정제하였을 때 한쪽에만 존재하는 GFP 보다 더 많은 효과를 나타내므로 수송도메인-GFP-수송도메인 융합단백질이 자연상태로 정제되었을 때 세포 내로 도입되는 효과를 알아보고자 실험을 수행하였다. 먼저 변성된 단백질과 자연상태로 정제한 단백질을 웨스턴블랏으로 분석한 결과, 자연상태로 정제된 단백질도 수송도메인이 한개 존재하는 GFP 융합단백질과 같은 수치만큼 세포 내로 도입되는 결과를 나타냈다(도 7). 또한 자연상태로 분리한 수송도메인-GFP-수송도메인 융합단백질의 세포 내 도입효과를 알아보기 위해 FACS 분석법을 실시하였다. 각각 자연상태와 변성된 상태로 정제된 단백질을 각각의 농도로 처리하여 1시간 배양하였다. 그 결과 도 8과 같이 변성된 상태의 수송도메인-GFP-수송도메인 융합단백질은 1M 처리하였을 때 평균 형광도가 117인 반면 자연상태로 정제한 수송도메인-GFP-수송도메인은 54인 수치값을 나타내었다. 이는 변성된 상태의 융합단백질의 세포 내 도입효과보다는 떨어지지만, 도 7과 비교해 볼 때 변성하여 정제한 수송도메인-GFP 융합단백질만큼의 세포 내 도입 능력을 갖고 있음을 알 수 있다. 결과적으로 Tat 수송도메인을 한쪽 말단에 가지고 있는 융합단백질보다 Tat 수송도메인을 양쪽에 가지고 있으며 변성하여(denatured) 정제한 융합단백질이 효과적으로 세포 내 침투를 할 수 있으며, 자연상태(native)로 정제한 수송도메인-GFP-수송도메인 융합단백질 또한 세포 내 침투가 가능함을 결론내릴 수 있다.

<실시예 8: 재조합 SOD 융합단백질들의 발현 벡터 제조>

기능을 가진 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표단백질을 전달할 수 있는 융합단백질 발현벡터를 제조하였고, 수송 도메인이 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 (Cu,Zn-superoxide dismutase; 이하 본 명세서에서 SOD라 약칭함) 단백질을 선택하였다.

재조합 융합단백질을 과대발현시키기 위해서 SOD, HIV-1 Tat의 형질도입부 (Tat 49-57) 및 6개의 히스티딘에 대한 cDNA가 연속적으로 포함되어 있는 Tat-SOD, SOD-Tat, Tat-SOD-Tat 발현벡터를 제조하였다(도 9). 융합단백질에 대한 대조 단백질인 SOD를 과대발현시키기 위해 Tat의 형질도입부위만 포함되지 않고 나머지 부위는 동일한 pET-SOD 발현벡터를 제조하였다.

Tat 기본도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드[상위 쇄 (top strand), 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'와 하위 쇄 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3']를 NdeⅠ-XhoⅠ제한효소로 자른 pET-15b 벡터에 결찰(ligation)하여 삽입한 후, 인간 SOD의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 2종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 XhoⅠ제한부위를 갖고 있으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 BamHⅠ제한부위를 갖고 있다. 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한 뒤, 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝벡터에 결찰하여 형질변환시켜 플라스미드를 분리하였다. 인간 SOD cDNA가 TA 벡터를 XhoⅠ과 BamHⅠ로 절단한 다음 pET-15b 및 pET-15b-Tat 발현벡터에 삽입하였다.

또한, Tat 염기성 도메인이 SOD 양쪽 말단에 융합된 pTat-SOD-Tat 은 pTat-SOD에 Tat 염기성 도메인 아홉 개 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴틀레오타이드가 어닐되어 카르복실 말단에 삽입되었고, Tat 염기성 말단이 카르복실 말단에 융합된 pSOD-Tat은 pSOD에 Tat 염기성 도메인 아홉 개 아미노산을 코딩하는 이중사슬 올리고뉴틀레오타이드가 어닐되어 카르복실 말단에 삽입되었다 (도 9).

<실시예 9: 재조합 SOD 융합단백질들의 발현 및 정제>

본 연구실에서 제조한 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21 (DE3) 세포(pSOD 및 pTat-SOD, pSOD-Tat, pTat-SOD-Tat)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5∼1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM 되게 한 다음 3∼4시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 6M Urea가 첨가된 결합완충용액(binding buffer; 5mM imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9) 5ml를 넣고 초음파분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni-니트릴로트리아세틱 액시드 세파로즈 슈퍼플로우 (Ni-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합완충용액(binding buffer)과 6배 부피의 세척완충용액(washing buffer; 60mM imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출완충용액(elution buffer; 1M imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 융합단백질을 용출하였다. 이어서, 융합단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 융합단백질은 6개의 히스티딘을 포하하고 있기 때문에 금속이온-킬레이트 친화 크로마토그래피 단일 단계로 융합단백질을 순수하게(순도＞90%) 정제되었다 (도 10).

분획의 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브레드포드 (Bradford) 방법으로 측정하였다.

<실시예 10: HeLa 세포배양 및 재조합 융합단백질들의 세포 내 투과>

HeLa 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO₃, 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생제(100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.

9개의 아미노산(49-57)으로 이루어진 HIV-1 Tat 단백질 수송부분을 아미노산 말단과 카르복실 말단에 결합시킨 변이체 수송 도메인에 대한 화물분자 세포투과능을 관찰하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 즉, Tat-SOD, SOD-Tat, Tat-SOD-Tat 융합단백질들의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, 2M SOD 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 1시간 뒤 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 SOD의 양과 활성도를 SOD 활성도 분석과 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.

<실시예 11: 웨스턴 블랏 분석>

Tat 단백질이 아미노산 말단에 한 개가 융합되어 있는 단백질과 양쪽에 융합되어있는 단백질간의 세포 내 이동 효율을 분석하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질들은 변성된 상태로 정제하였다. 준비된 HeLa 세포에 2M의 변성된 융합단백질을 처리한 다음 1시간 후에 세포들만 모아서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 세포를 용균하여 얻어진 세포 용균액을 용균 완충액 (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% v/v 글리세롤)이 있는 6-웰 플레이트에 넣었다. 전체세포 용균액 각 15㎍씩을 SDS-12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기이동시켰다.

전기이동으로 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 탈분유(non-dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 고트 항-SOD 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Santacruze, USA, 1:1,000)로 처리하였다. 그 후 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-고우트 (mouse anti-rabbit) IgG 항체(Sigma, 1:10,000 희석)와 반응시켰다. 결합된 항체들은 화학발광으로 확인할 수 있었다(ECL; Amersham). 그 결과, 도 11a 같이 Tat 단백질이 아미노산 말단에만 있는 융합단백질과 Tat 단백질이 카복실 말단에 있는 융합단백질은 서로 비슷하게 세포 내로 투과되었다. 그러나 Tat 단백질이 양쪽 말단에 융합되어 있는 융합단백질은 한 개의 Tat 단백질이 연결되어 있는 융합단백질보다 더 효과적으로 세포 내로 이동하였다. 이 결과는 Tat 단백질이 융합단백질의 아미노산 말단과 카복실 말단 어느 쪽에 융합되어 있던지 그 효과는 비슷하지만, Tat 단백질이 양쪽에 융합되어 있으면 세포 내 이동 효과가 크게 향상됨을 보여준다 (도 11a).

<실시예 12: SOD 효소활성도 측정>

본 연구에서 SOD의 활성도는 McCord와 Fridovich의 방법(1969)에 따라 크산틴/크산틴 옥시다제(xanthine/xanthine oxidase) 반응에 의한 페리시토크롬(ferricytochrome) c 환원의 억제정도를 분광광도계로 관찰함으로써 측정하였다 [McCord, JM and Fridovich, I. (1969) J. Biol. Chem. 244, 6049-6055].

표준분석방법은 25℃에서 2 ml의 0.1 mM EDTA가 포함된 50 mM 인산칼륨 완충용액 (pH 7.8)에서 수행하였다. 반응혼합액에는 10uM ferricytochrome c, 50uM 크산틴(xanthine) 및 충분한 양의 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase)를 함유하고 있으며 550nm에서 페리시토크롬(ferricytochrome) c의 환원정도를 측정하였다. 상기의 조건하에서 시토크롬(cytochrome) c를 50% 감소시키는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스의 양을 1 unit으로 정의하였다.

세포 내로 투과된 융합단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 단백질 치료에 응용할 수 있다. 따라서, 세포 내로 투과된 융합단백질이 생물학적인 활성을 지니는 것은 매우 중요한 문제이다. 도 11b는 2M의 융합단백질들을 1시간동안 HeLa 세포 배지에 투여했을 때, 세포내의 SOD 효소활성도 변화를 나타낸 결과이다. 융합단백질을 투여하지 않은 세포에서 SOD 활성도는 2.46 ±0.39 U/mg 단백질이었고, Tat-SOD와 SOD-Tat 융합단백질을 투여하였을 때에 SOD 활성도는 12.68 ±1.44 U/mg 단백질로 유의하게 상승하였고, Tat-SOD-Tat 융합단백질을 투여하였을 때에 SOD 활성도는 23.75 ±2.35 U/mg 단백질로 Tat-SOD와 SOD-Tat 융합단백질보다 2배 이상 높은 SOD 활성도를 나타내었다(도 11b). 따라서, Tat-SOD-Tat 융합단백질의 세포 내 투과 및 활성이 Tat-SOD와 SOD-Tat 융합단백질보다 2배 이상 크게 증가되는 것을 보여주었다(도 11).

<실시예 13: 아르기닌9-GFP-아르기닌9 융합단백질의 세포 침투활성 측정>

상기 실시예 1 내지 3의 방법과 유사한 방법으로 9개의 아르기닌 잔기로 구성된 수송도메인이 녹색형광단백질의 아미노기 및 카르복시기에 공유결합된 올리고라이신-GFP-올리고라이신 융합단백질을 제조하였다.

Tat-GFP-Tat 융합단백질과 아르기닌9-GFP-아르기닌9(R9-GFP-R9) 융합단백질의 세포 침투 효율을 비교하기 위하여 각 융합단백질 50, 100, 200nM씩을 HeLa 세포가 들어 있는 24웰 플레이트에 가한 후 한시간이 경과한 다음 세포를 트립신처리하고, PBS로 수차례 세척한 다음 형광을 플루오로미터로 측정하였다. 결과는 도 12와 같다.

<실시예 14: 라이신9-GFP-라이신9 융합단백질의 세포 침투활성 측정>

상기 실시예 1 내지 3의 방법과 유사한 방법으로 9개의 라이신 잔기로 구성된 수송도메인이 녹색형광단백질의 아미노기 및 카르복시기에 공유결합된 올리고라이신-GFP-올리고라이신 융합단백질을 제조하였다.

Tat-GFP 융합단백질, GFP-Tat 융합단백질, 아르기닌9-GFP 융합단백질과 라이신9-GFP-라이신9(K9-GFP-K9) 융합단백질의 세포 침투 효율을 비교하기 위하여 각 융합단백질 200nM씩을 HeLa 세포가 들어 있는 24웰 플레이트에 가한 후 한시간이 경과한 다음 세포를 트립신처리하고, PBS로 수차례 세척한 다음 형광을 형광현미경으로 측정하였다. 결과는 도 13과 같다.

본 발명은 기능을 갖는 단백질을 단백질 수준에서 세포 내로 투과시키는 데에 있어서, 기존의 염기성 수송도메인을 일측에 결합시킨 것보다 더 높은 투과 효율과 세포 내 활성을 갖는 융합단백질을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 융합단백질을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물 및 화장품 등을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(Cu, Zn-SOD)를 단백질 수준에서 세포 내로 직접 투과시키는 것으로, 특히 세포 내로 투여된 -수송도메인-SOD-수송도메인 융합단백질은 SOD 활성도를 회복하여 단백질 치료에 효율적으로 활용될 수 있음을 제시한다.

활성산소종은 세포내의 생체고분자에 손상을 입히며. 보고된 바로는 100 여종의 질병의 진행과정과 깊게 관련되어 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 활성산소종을 제거하는데 있어서 주된 역할을 담당하는 SOD를 세포 내로 투여함으로써 질환을 치료하는 단백질 치료에 본 발명의 수송도메인-SOD-수송도메인 융합단백질이 효과적으로 활용될 수 있다.

본 기술을 바탕으로 항산화효소의 일종인 SOD를 세포내 직접 전달하여 우리 인체에 해로운 활성산소종을 제거할 수 있으므로 여러 질병 이외에도 화장품 및 건강식품산업 등에 본 기술이 광범위하게 활용될 수 있다.

도 1은 Tat-GFP, GFP-Tat, Tat-GFP-Tat, GFP 발현벡터의 개략도이다. 합성된 Tat 수송도메인은 GFP의 아미노 말단이나 카르복실 말단, 또는 양쪽 말단에 융합하여 벡터를 제조하였다. GFP 발현벡터 pGFP는 GFP의 코딩서열을 pET15b에 삽입하여 구성되었다.

도 2는 정제된 수송도메인-GFP 융합단백질을 12% SDS-PAGE로 분리한 후 쿠마시 블루로 염색한 것이다.

레인 M: SDS Marker 레인 GFP: GFP

레인 TG: Tat-GFP 레인 GT: GFP-Tat

레인 TGT: Tat-GFP-Tat

도 3a는 변성된 Tat-GFP, GFP-Tat, Tat-GFP-Tat 융합단백질의 세포 내 도입 분석결과로서, 1M Tat 융합단백질들을 1시간동안 HeLa 세포 내로 도입시켰을 때 세포 내로 도입된 단백질을 웨스턴블랏으로 분석한 것이다.

도 3b는 세포 내로 도입된 단백질을 웨스턴블랏한 결과를 토대로 결과에 나타난 단백질들 선의 세기를 도식화한 것이다.

도 4는 세포 내로 도입된 Tat-GFP, GFP-Tat, Tat-GFP-Tat 융합단백질을 공초점 형광현미경으로 가시화한 것이다. 각 섹션은 각각 다음과 같다.

control: 아무것도 처리하지 않은 세포 GFP: 대조군 GFP 1M

TG : Tat-GFP 1M GT : GFP-Tat 1M

TGT : Tat-GFP-Tat 1M

도 5는 FACS 분석법에 의해 GFP 융합단백질의 세포 내 도입효율을 비교 분석한 것이다. 각 융합단백질들은 2M 농도로 30분간 처리하였다.

TG : Tat-GFP GT : GFP-Tat

TGT : Tat-GFP-Tat

도 6은 Tat-GFP-Tat 융합단백질을 농도별로 처리하여 30분간 배양한 결과를 FACS 분석법에 의해 분석하였다. 대조군 GFP는 최고 농도인 2M로 처리하였다.

도 7a은 Tat-GFP-Tat 융합단백질을 자연상태와 변성된 상태로 정제하여 세포 내 도입효율을 분석하기 위해 웨스턴 블랏을 실시하였다. 각 융합단백질들은 1M로 처리하여 1시간동안 배양하였다.

레인 con : 처리하지 않은 세포

레인 GFP : 대조군 GFP

레인 native : 자연상태로 정제한 Tat-GFP-Tat

레인 denatured : 변성된 상태로 정제한 Tat-GFP-Tat

도 7b는 7a 결과로 나타난 선의 세기를 도표로 모식화한 것이다.

도 8은 FACS 분석법에 의해 자연상태로 정제된 Tat-GFP-Tat과 변성된 상태로 정제된 Tat-GFP-Tat의 세포 내 도입효과를 농도별로 1시간 처리하여 분석한 것이다.

도 8a는 변성된 상태로 정제한 Tat-GFP-Tat를 0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M 처리하여 분석한 결과이다.

도 8b는 자연상태로 정제한 Tat-GFP-Tat를 0.1M, 0.2M, 0.5M, 1M 처리하여 분석한 결과이다.

도 9는 Tat-SOD, SOD-Tat, Tat-SOD-Tat, SOD 발현벡터의 개략도이다. 합성된 Tat 단백질을 SOD의 아미노 말단이나 카르복실 말단, 또는 양쪽 말단에 융합하여 벡터를 제조하였다. SOD 발현벡터인 pSOD는 SOD의 코딩서열을 pET-15b 벡터에 삽입하여 제조하였다.

도 10은 정제된 수송도메인-SOD 융합단백질들을 12% SDS-PAGE로 분리한 후 쿠마시 블루로 염색한 것이다.

레인 M: SDS Marker 레인 SOD: SOD,

레인 TS: Tat-SOD 레인 ST: SOD-Tat

레인 TST: Tat-SOD-Tat

도 11a는 변성된 상태로 정제한 Tat-SOD, SOD-Tat, Tat-SOD-Tat 융합단백질의 세포 내 도입 분석결과로서, 2M Tat 융합단백질들을 1시간동안 HeLa 세포 내로 도입시켰을 때 세포 내의 도입된 단백질을 웨스턴 블랏으로 분석한 것이다.

도 11b는 2M 융합단백질들을 1시간동안 HeLa 세포에 투여했을 때 세포 내 도입된 SOD효소의 활성도 변화를 도시한 그래프이다.

도 12는 Tat-GFP-Tat 융합단백질과 아르기닌9-GFP-아르기닌9(R9-GFP-R9) 융합단백질의 세포 침투 효율을 형광을 측정하여 도식화한 그래프이다.

도 13은 GFP, Tat-GFP 융합단백질, GFP-Tat 융합단백질, 아르기닌9-GFP 융합단백질과 라이신9-GFP-라이신9(K9-GFP-K9) 융합단백질의 세포 침투 효율을 비교하기 위하여 각 융합단백질 200nM씩을 HeLa 세포에 가하여 한시간이 경과한 다음 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

<110> CHOI, JIN HEE <120> Advanced cell-transducing HIV-1 Tat-target protein-Tat fusion pro tein <130> WJTJ-SHK-TPT <160> 10 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 1 ctcgaggtga gcaagggcga ggagctg 27 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 2 ggatccttac ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 3 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctcgaggcga cgaaggccgt gtgcgtg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggatccttat tgggcgatcc caattac 27 <210> 7 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polynucleotide coding HIV-1 Tat-green fiuorescens pro tein-Tat fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(768) <400> 7 agg aag aag cgg aga cag cga cga aga gtg agc aag ggc gag gag ctg 48 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu 1 5 10 15 ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac 96 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 20 25 30 ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac 144 Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr 35 40 45 ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg 192 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 50 55 60 ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc 240 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe 65 70 75 80 agc cgc tac ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc 288 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 85 90 95 atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac gac 336 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp 100 105 110 ggc aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg 384 Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 115 120 125 gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac 432 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 130 135 140 atc ctg ggg cac aag ctg gag tac aac tac aac agc cac aac gtc tat 480 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr 145 150 155 160 atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc aag gtg aac ttc aag atc 528 Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 165 170 175 cgc cac aac atc gag gac ggc agc gtg cag ctc gcc gac cac tac cag 576 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 180 185 190 cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac 624 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 195 200 205 tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag aag cgc 672 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 210 215 220 gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc 720 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu 225 230 235 240 ggc atg gac gag ctg tac aag agg aag aag cgg aga cag cga cga aga 768 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 245 250 255 <210> 8 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu 1 5 10 15 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 20 25 30 Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr 35 40 45 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 50 55 60 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 85 90 95 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp 100 105 110 Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 115 120 125 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 130 135 140 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr 145 150 155 160 Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 165 170 175 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 180 185 190 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 195 200 205 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 210 215 220 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu 225 230 235 240 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 245 250 255 <210> 9 <211> 530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polynucleotide coding HIV-1 Tat-Human superoxide dism utase-Tat fusion protein <400> 9 taggaagaag cggagacagc gacgaagact cgaggcgacg aaggccgtgt gcgtgctgaa 60 gggcgacggc ccagtgcagg gcatcatcaa tttcgagcag aaggaaagta atggaccagt 120 gaaggtgtgg ggaagcatta aaggactgac tgaaggcctg catggattcc atgttcatga 180 gtttggagat aatacggcag gctgtaccag tgcaggtcct cactttaatc ctctatccag 240 aaaacacggt gggccaaagg atgaagagag gcatgttgga gacttgggca atgtgactgc 300 tgacaaagat ggtgtggccg atgtgtctat tgaagattct gtgatctcac tctcaggaga 360 ccattgcatc attggccgca cactggtggt ccatgaaaaa gcagatgact tgggcaaagg 420 tggaaatgaa gaaagtacaa agacaggaaa cgctggaagt cgtttggctt gtggtgtaat 480 tgggatcgcc caataaggat cctaggaaga agcggagaca gcgacgaaga 530 <210> 10 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polypeptide sequence of HIV-1 Tat-Human superoxide dismutase-Tat fusion protein <400> 10 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ala Thr Lys Ala Val Cys 1 5 10 15 Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln 20 25 30 Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu 35 40 45 Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr 50 55 60 Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys 65 70 75 80 His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn 85 90 95 Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser 100 105 110 Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val 115 120 125 Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser 130 135 140 Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly 145 150 155 160 Ile Ala Gln Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 165 170

Claims

목표단백질의 아미노기와 카르복실기에 공유결합되어 목표단백질을 세포 내로 도입하는 수송도메인이 HIV tat 49-57 잔기, 라이신 9머(ninemer), 아르기닌 9머(ninemer) 또는 9머의 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질.
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제1항에 있어서, 목표단백질이 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 또는 그의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합 단백질.
제1항의 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 목표단백질이 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 또는 그의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는, 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형인 것을 특징으로 하는, 세포침투성 수송도메인-목표단백질-수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물.
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