KR100526936B1

KR100526936B1 - 세포침투성 수송도메인-ｐ53 융합단백질 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100526936B1
Application number: KR10-2003-0045671A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 박진서; 최진희
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2005-11-08
Also published as: KR20050005659A

Abstract

본 발명은 강력한 종양억제유전자로 알려진 p53 단백질에 수송도메인을 공유결합시킨 세포침투성 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로 좀더 상세히는 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인을 p53 단백질과 공유결합시킨 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질과 그 용도에 관한 것이다.

Description

세포침투성 수송도메인-ｐ53 융합단백질 및 그의 용도{Cell-transducting transport domain-p53 fusion protein and uses thereof}

본 발명에서 "수송도메인"은 펩타이드, 단백질, 올리고펩타이드, 당류와 결합된 당단백질, 펩티도글리칸 또는 폴리펩타이드 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 도메인으로서, 6∼12개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 그 중 3/4 이상이 아르기닌 또는 라이신 잔기로 이루어져 있는 것을 말하며, 대표적인 예를 들자면 HIV-1 Tat(48-57), 올리고라이신, 올리고아르기닌, 올리고(라이신,아르기닌) 등을 말한다. 더욱 바람직하게는 9개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 그 중 3/4 이상이 아르기닌 또는 라이신 잔기로 이루어져 있는 것을 본 발명의 수송 도메인의 예로 들 수 있다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 당단백질, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 등을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

종양 유전자의 비정상적 활성화와 종양억제유전자와 같은 세포 사이클 규제자의 기능적인 비활성화는 많은 암의 발달에 기여한다. 종양 억제자인 p53은 세포사멸, 세포성장 및 세포손상 복구를 포함하여 많은 생물학적 공정에서 결정적인 역할을 한다. p53의 기능상실은 목표세포들의 통제할 수 없는 급증을 수반하여, 종종 종양 발달을 초래한다[Lane, D,P. (1994) Br.Med. Bull. 50, 582-599, Pellegata, N.S. and Ranzani, G.N. (1996) Eur. J. Histochem. 40, 273-282 ]. 그러므로, p53은 대략 절반정도의 인간 암들을 제거하거나 돌연변이시키는 중요한 종양억제 유전자이다[Bosari, S. and Viale, G. (1995) Virchows Arch. 427, 229-241. Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B. and Harris, C.C. (1991) Science. 253, 49-53.].

p53 활성이 상실된 암세포의 복구는 항암 치료법 중에 하나로 제안될 수 있다. 그러므로, 와일드 타입 p53 활성을 회복하는 유전자, 단백질 및 작은 분자들의 발달은 암치료법을 위한 가치있는 방법임을 의미한다. 현재 p53 치료법은 아데노바이러스(adenovirus), 레트로바이러스(retrovirus)를 갖는 와일드 타입 p53 유전자 및 지질을 기본(lipid-based)으로 한 유전자 전달시스템들을 사용하는 유전자 치료법의 발달에 초점을 맞추고 있다. 암 유전자 치료법에서 유전자 전달, 유전자 발현의 지연을 포함하여 몇몇 제약들[Lowe, S.W., Schmitt, E.M., Smith, S.W., Osborne, B.A. and Jacks, T. (1993) Nature. 362, 847-849, Willis, A.C. and Chen, X. (2002) Curr. Mol. Med. 2, 329-345.] 때문에, p53 단백질 형질도입은 p53이 기능적으로 불활성화되는 암세포 내로 와일드 타입 p53(w.t. p53)의 기능을 보강시키기 위한 대안적 도구이다[Soddu, S. and Sacchi,A. (1998) Cytokines Cell. Mol. Ther. 4,177-185, Wiman, K.G. (1998) Med Oncol. 15, 222-228.]. 그러나, 단백질 치료의 주된 제약 중 하나는 취약한 막 투과성에 기인한 목표단백질들의 효율적인 세포 내 전달에 있어서의 어려움이다.

최근, HIV-1 Tat 염기성 도메인(49-57; RKKRRQRRR)이 10kDa~120kDa의 단백질/펩타이드를 다른 타입의 세포나 조직으로 성공적으로 전달한다고 밝혀지고 있다. 또한, Cu,Zn 슈퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 인간 카탈라제 및 GFP가 HIV-1 Tat 염기성 도메인에 유전학적으로 융합되면 포유류의 세포 내로 효율적으로 형질도입된다고 보고되었다[Jin, L.H., Bahn, J.H., Eum, W.S., Kwon, H.Y., Jang, S.H., Han, K.H., Kang, T.C., Won, M.H., Kang, J.H., Cho, S.W., Park, J. and Choi, SY. (2001) Free Radical Biol. Med. 31, 1509-1519, Park, J., Ryu, J., Kim, K.A., Lee, H.J., Bahn, J.H., Han, K., Choi, E.Y., Lee, K.S., Kwon, H.Y. and Choi, S.Y. (2002) J. Gen. Virol. 83, 1173-1181.]. 그러므로, 목표단백질과 융합되는 HIV-1 Tat의 염기성 도메인의 유용성은 단백질 치료의 합리적인 발달에서 새로운 전략으로 고려될 수 있습니다.

따라서, 본 발명의 목적은 강력한 종양 억제 유전자로 알려진 p53 단백질을 세포 내로 도입시키고 세포 내에서 활성을 가지도록 하는 세포침투성이 우수한 수송도메인이 결합된 p53 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 수송도메인과 융합된 p53 융합단백질을 항암치료효과적인 약제학적 조성물로 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 수송도메인과 p53 단백질을 융합시켜 융합단백질을 만들어 항암치료에 대한 연구를 수행하였다. 또한, 상기 융합단백질의 세포내 도입능, 세포내 활성 및 세포 생존율 등을 확인하기 위해 HeLa 세포에 처리하여 그에 따른 효과를 관찰하였다.

본 발명의 수송도메인-p53 융합단백질은 유전자 재조합 방법 외에도 일반적인 화학결합 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명은 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 p53의 최소한 일측 말단 즉, p53의 C말단, N말단 또는 C말단과 N말단에 공유결합된 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 수송도메인은 9~12개의 아미노산 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 수송도메인과 p53의 말단 사이에 수개의 아미노산이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질에 관한 것이다. 수송도메인-p53 융합단백질을 유전자 재조합 방법으로 제조할 경우에 수송도메인과 p53 사이에 제한효소 부위로서 수개의 아미노산이 존재할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 수송도메인-p53 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 상기 약제학적 조성물은 항암제로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 수송도메인-p53 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

수송도메인-p53 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 세포배양>

인간 자궁암 세포주인 HeLa, 인간 간암 세포주인 HepG2(ATCC 번호 HB-8065), Hep3B(ATCC 번호 HB-8064) 및 인간 전립선암 세포주인 LN-CaP(ATCC 번호 CRL-1740), PC-3(ATCC 번호 CRL-1435) 세포(ATCC로부터 입수)를 표준상태에서 10% 우태혈청(FBS) 및 항생제(100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)를 함유한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)에서 배양시켰다.

<실시예 2: 발현 벡터 제조>

세포침투성 p53 융합단백질을 제조하기 위하여, HIV-1 Tat 염기성 도메인에서 유도된 펩타이드를 가진 융합단백질로 p53을 발현시키기 위하여 발현벡터를 제조하였다. p53과 융합된 HIV-1 Tat의 염기성 도메인(아미노산 48-57)을 발현시키는 pTat-p53은 다음의 방법으로 제조되었다. 플라스미드 pTat-p53으로부터 Pfu DNA 중합효소(Clontech)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜 p53의 완전한 서열을 증폭하였다[Sugrue, M.M., Shin, D.Y., Lee, S.W. and Aaronson, S.A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9648-9653.]. 정방향 개시체(sense primer)는 5'-CTCGAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'이고, 역방향 개시체(antisense primer)의 서열은 5'-GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3'이다. PCR산물은 XhoI-BamHI으로 잘리며, pHisTat(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 XhoI-BamHI 자리에 서브클론되었다. 이 벡터를 pTat-p53으로 명명하였다. 유사하게, XhoI-BamHI으로 잘린 PCR산물은 HIV-1 Tat의 염기성 도메인이 없는 컨트롤(control) p53 단백질을 발현시키는 벡터를 제조하기 위하여 pET15b의 XhoI-BamHI 자리에 서브클론되었다. 플라스미드에 클론된 폴리링커(polylinker)의 서열은 형광자동 서열분석기(fluorescence-based automated sequencer, 모델 373A, Applied Biosystems, Inc.)로 확인하였다.

<실시예 3: Tat-p53 융합단백질의 발현과 정제>

Tat-p53 융합단백질의 발현과 정제는 기존의 방법에 따라 수행하였다[Jin, L.H., Bahn, J.H.and Choi, SY. (2001) Free Radical Biol. Med. 31, 1509-1519., Park, J., Ryu, J., Kim, K.A., Choi, E.Y. and Choi, S.Y. (2002) J. Gen. Virol. 83, 1173-1181.]. 단백질은 p53 또는 Tat-p53 융합단백질을 코딩한 플라스미드로 전환된 BL21 E. coli에 IPTG로 유도하여 발현되었다. 변성된 p53 융합단백질을 제조하기 위하여 유도된 세포는 펠렛화되었고 6M 우레아를 함유하는 결합완충용액에서 용균되었다. Tat-p53, p53 단백질은 Ni²⁺-IDA 컬럼으로 친화 크로마토그래피하여 정제시켰고 PD10 컬럼(Amersham)으로 탈염시켰다. 단백질의 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드 단백질 어세이(Bio-Rad)로 측정하였다. 20% 글리세롤이 함유된 PBS에 용해된 정제된 Tat-p53, p53 단백질은 분획하여 -80℃에 저장하였다.

컨트롤 p53 단백질은 Tat 염기성 도메인이 제거된 것을 제외하고는 Tat-p53과 동일한 구조이다. 1.1kDa 분자량을 갖는 Tat 염기성 도메인의 존재때문에, Tat-p53 융합단백질이 컨트롤 p53단백질보다 분자량이 더 크다는 것이 SDS-PAGE로 정제된 단백질 분석에서 나타났다(도 1b). 정제된 산물은 p53에 마우스 단일클론 항체를 이용한 웨스턴블랏으로 확인되었다(도 1c). 정제된 Tat-p53과 p53은 예상된 크기의 적정한 위치에서(positions compatible) 검출되었다. 서열번호 5는 정제된 Tat-p53의 일실시예이다.

<실시예 4: 암세포로의 융합단백질의 형질도입 키네틱스(kinetics)>

인간 암세포내로 Tat-p53 융합단백질을 형질도입시키기 위하여, 정상 Rb(retinoblastoma)와 p53의 기능이 결핍되고 매우 낮은 수준의 와일드 타입 p53을 함유하는 HPV-양성 자궁암세포주인 HeLa 세포를 6웰 플레이트에 6 X 10⁵세포/웰로 가하였다. 세포가 70% 융합되었을 때, 10% 우태혈청이 함유된 새로운 배양배지로 교체해준 다음 Tat-p53 융합단백질을 1시간동안 0.1~1uM의 농도로 HeLa 세포에 가한 후 PBS로 세척하고 10분동안 EDTA가 없는 트립신으로 트립신화시킨 후 PBS로 세척하여 웨스턴블랏으로 단백질 수준을 측정하였다.

도 2a와 같이, 세포내로 형질도입된 Tat-p53 단백질의 수준은 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수 있는 반면, Tat 염기성 도메인이 없는 p53은 세포에서 검출되지 않았다.

다음으로, Tat-p53 융합단백질의 형질도입 키네틱스(kinetics)를 분석하였다. HeLa 세포의 배양배지에 지정된 시간동안 1uM의 농도의 정제된 p53과 Tat-p53 융합단백질을 가하였고, 형질도입된 단백질의 결과 수준은 웨스턴블랏으로 분석하였다. 도 2b에서 보여주듯이, 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 세포내 수준은 처음 10분 후에 검출되어 2시간 후에 최고조에 달하였다. Tat-p53 융합단백질의 세포내 수준은 배양을 연장함에도 불구하고 변하지 않았다. 세포내로 형질도입된 Tat-p53의 세포내 안정성을 조사하기 위하여, 1시간동안 1uM의 Tat-p53으로 전처리한 HeLa 세포를 24시간동안 배양하였으며, 세포내의 p53의 수준은 웨스턴블랏으로 분석하였다. 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 수준은 12시간동안 지속되었고, 24시간에 걸쳐서 점차로 감소하였다(도 2c). 이 결과는 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 상당한 수준은 24시간동안 세포내에서 지속된다는 것을 증명하였다.

세포가 Tat-p53 융합단백질에 의해 형질도입되는 것을 확인하기 위하여, 공초점 레이저 현미경으로 형질도입된 세포에서 Tat-p53의 서브세포 분포와 서브세포 분획을 관찰하였다. 4시간동안 0.5uM의 Tat-p53 융합단백질로 HeLa 세포를 처리하여 레빗 항-히스티딘 항체를 이용하여 시각화하였고, FITC -컨주게이션 고우트 항-레빗 IgG가 수반되었다. 형질도입된 세포의 이미지 분석은 공초점 레이저 현미경으로 행하였다. PI 이중-색상 탐지로, Tat-p53은 고밀도의 핵과 시토졸에 존재하는 것을 알 수 있는 반면, 컨트롤 p53은 세포 내에서 검출되지 않았다. 항-p53 항체를 이용한 공초점 현미경 분석은 유사한 위치 측정 패턴을 보였다(데이터 없음). 예상대로, 항-p53 항체는 무처리 세포내에서와 컨트롤 p53이 형질도입된 세포에서 형광 신호가 탐지되지 않았다. 세포내에서 형질도입된 단백질의 서브세포에서의 위치측정을 보다 분명히 하기 위하여, 핵과 시토졸 분획은 컨트롤 p53과 Tat-p53이 형질도입된 세포로부터 준비하고, 항-p53과 항-액틴 또는 항-PARP 항체를 사용하여 웨스턴블랏으로 분석하였다. 도 2e에서 보는 것처럼, Tat-p53은 형질도입된 세포의 핵과 시토졸에서 탐지되는 반면, 컨트롤 p53은 탐지되지 않았다. 이 결과는 Tat-p53이 주로 세포의 표면에 고착되는 것이 아니라, 실제로 세포의 세포질과 핵에 모두 전달된다는 것을 증명하였다. p53이 핵에 위치하는 것은 p53의 서열 특이적인 전사 활성화에 중요하다.

웨스턴블랏

본 발명의 실시예에서는 하기의 방법으로 웨스턴블랏이 행하여졌다.

세포 용균액은 4℃에서 30분동안 용균완충용액(125 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% 소디움도데실설페이트(SDS), 10% v/v 글리세롤)으로 배양하여 준비하였다. 40㎍ 단백질을 10% 소디움 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 젤(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)에서 분리한 후 단백질은 PBS에서 10% 분유로 블로킹시킨 니트로셀룰로오즈 멤브레인에서 전기영동시켰다. 상기 멤브레인은 1차 항체로 탐지하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 배양하여 수행하고 결합된 항체는 제조자 지침(ECL; Amersham)에 따라서 화학발광처리하여 시각화하였다.

형질도입된 세포의 서브셀룰라 분획화(Subcellular fractionation)

핵과 세포질 분획은 종래의 방법으로 준비하였다[Park, J., Ryu, J., Kim, K.A., Lee, H.J., Bahn, J.H., Han, K., Choi, E.Y., Lee, K.S., Kwon, H.Y. and Choi, S.Y. (2002) J. Gen. Virol. 83, 1173-1181., Nare, B., Allocco,J.J., Kuningas, R., Galuska, S., Myers, R.W., Bednarek, M.A. and Schmatz, D.M. (1999) Anal Biochem. 267, 390-396.]. 간단히 말해서, 형질도입된 HeLa 세포(5 X 10⁶)를 PBS로 세척하고 37℃에서 10분동안 트립신화시켰다. 차가운 PBS로 세포를 세척한 후 수거하고, 펠렛화한 다음, 과격하지 않은 피펫팅으로 1㎖ NP-40 완충용액(10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 30 mM Sucrose (M. W. 342.3), 0.1 mM PMSF, 0.5% NP-40)에서 재현탁시키고, 얼음물에서 10분동안 배양시켰다. 10분동안 1000 X g에서 수크로즈 쿠션을 통해서 세포를 원심분리하고, 상청액으로부터 시토졸 분획을 수거했다. 시토졸 분획을 완벽하게 제거하기 위하여 NP-40 완충용액으로 펠렛을 세척하였다. 핵은 용균용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02 % sodium azide, 100g/ml PMSF, 1% Triton X-100)으로 용균되었다. 상기 결과의 핵과 시토졸 용균액은 웨스턴블랏으로 분석하였다.

공초점 현미경으로 형질도입된 세포의 분석

공초점 현미경 분석은 기존의 방법에 따라 행하였다[Park, J., Ryu, J., Kim, K.A., Lee, H.J., Bahn, J.H., Han, K., Choi, E.Y., Lee, K.S., Kwon, H.Y. and Choi, S.Y. (2002) J. Gen. Virol. 83, 1173-1181.]. 커버슬릿에서 배양한 HeLa 세포를 1시간동안 0.5uM Tat-p53 융합단백질로 처리하였다. 이 세포는 PBS로 두 번 세척하고 트립신화시킨 후, 상온에서 5분간 3.7% 포름알데히드를 함유한 PBS에서 고정시키고, 차가운 메탄올로 삼투시켰다. 고정된 세포는 PBS로 두 번 세척하고 1시간동안 항히스티딘 태그 폴리클론 항체(nti-His tags polyclonal antibody)로 배양시켰다. 세포들은 FITC와 컨주게이트된 항레빗 항체로 1시간동안 배양시키고, 핵을 현상하기 위하여 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, 2㎍/㎖)로 염색한 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경 시스템(Bio-Rad MRD-1024ES)으로 시각화하였다. PI와 FITC 각각을 여기시키기 위하여 535nm와 395nm이상의 파장을 사용하였다(확대 X 630).

<실시예 5: 트랜스펙션(transfection)>

세포로 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 생물학적 활성의 회복은 생물학적 체계에 단백질 형질도입 기술을 적용하기 위한 필수조건이다. p53은 여러 유전자의 프로모터에서 특이적 DNA 서열을 인식하는 트랜스액티베이터(transactivator)로의 역할을 한다. 활성화에서, p53은 p53-반응 유전자 중 하나인 p21과 같은 유전자의 전사를 증가시킨다. 형질도입된 Tat-p53 융합단백질이 세포내에서 전사적으로 활성화가 되는지를 조사하기 위하여, 본 실시예는 Tat-p53 융합단백질의 형질도입 후 p21 단백질의 수준을 분석하였다.

p21 프로모터-루시페라제(luciferase) 구조체 pWWP-luc는 존 홉킨스 대학의 B. Vogelstein로부터 공급받았고, pCMV-베타-갈락토시다제(galactosidase) 구조체는 클론텍(Clontech, Palo Alto, Calif.)에서 구입하였다. HeLa 세포의 트랜스펙션은 리포페틴아민 플러스(Lipofetineamine Plus, Gibco BRL)로 수행되었다. 트랜스펙션 후 24시간 정도에, 추가적으로 지정한 간격동안 Tat-p53 융합단백질로 처리하였다. 그리고 나서 세포를 수거하고 루시페라제와 베타-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 각 샘플의 루시페라제 활성은 상대적 루시페라제 활성을 계산하기 위하여 베타-갈락토시다제 활성으로 표준화시켰고, 그 결과는 폴드트랜스액티베이션(fold transactivation)으로 표현되었다[Choi, C., Kutsch, O., Park, J., Zhou, T., Seol, D.-W. and Benveniste, E. N. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 724-736.].

Tat-p53은 투여량과 시간에 따라 p21 발현이 일어나는 것을 알았다. 반면, 컨트롤 p21은 그렇지 않았다(도 3a, 3b). p21 단백질은 0.2uM Tat-p53에서 탐지되기 시작하였고, 1uM까지 서서히 증가되었다(도 3a). Tat-p53에 의해 유도된 p21 발현은 노출 후 6시간부터 탐지되었고 24시간에 최고조에 달하여, 36시간까지 지속되었다(도 3b).

p53-반응 유전자의 발현에 대한 Tat-p53의 효과를 평가하기 위하여, p21 프로모터 활성을 측정하였다. p21-루시페라제 구조가 트랜스펙션된 HeLa 세포는 다양한 시간동안 0.5uM의 농도에서 Tat-p53 또는 p53으로 형질도입시키고 루시페라제 활성의 수준을 분석하였다(도 3c). 형질도입 Tat-p53은 시간 의존적 형태로 p21 프로모터 활성을 유도하며, 컨트롤과 비교하여 36시간동안 4배에 걸쳐 루시페라제의 활성을 증가시켰다. 반면에 컨트롤 p53과 Tat-GFP는 최소한의 효과를 나타냈다. 이들 결과는 외인성적으로 부가된 Tat-p53은 형질도입된 세포내에서 전사적으로 활성이 있다는 것을 증명한다.

<실시예 6: 세포생존율 측정>

본 실시예는 형질도입된 Tat-p53이 세포내에서 그것의 생물학적 역할을 할 수 있는지를 측정하기 위하여, 세포 생존율에 대한 형질도입된 Tat-p53의 영향을 분석하였다. 세포 생존율(viability)은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5- dipheyltetrazolium bromide; Sigma Co. Ltd)를 이용한 비색계 어세이로 측정하였다. 24웰 플레이트에 2 X 10⁴세포/웰이 되도록 세포를 심었다. 3일동안 매일 24시간마다 컨트롤 p53과 0.2~1uM Tat-p53으로 처리하였다. 각각의 웰에 1㎖ MTT(1㎎/㎖)를 첨가하고 4시간동안 배양하였다. 침전된 MTT 포르마잔(formazan)을 1㎖ 이소프로판올로 용해시키고, ELISA 판독기를 이용하여 570nm에서 각각 웰의 흡광도를 측정하였다.

Tat-p53은 투여량에 의존하는 형태로 세포 생존율을 유도하였으며, 반면, 컨트롤 p53은 세포 생존율에 대한 최소한의 효과를 나타냈다. 1uM Tat-p53로 처리한 세포 생존율은 컨트롤과 대비해서 3일간 대략 60%까지 감소하였다(도 4).

<실시예 7: 형질도입된 Tat-p53에 의해 유도된 세포사멸의 생화학적 분석>

Tat-p53이 형질도입된 세포에서, 배양 표면에서 광범위한 분리를 관찰할 수 있는 반면, 컨트롤 p53은 분리를 유발하지 않았다. DNA 파쇄와 같은 세포사멸 특징과 분자 연관 세포사멸 변화는 형질도입된 세포에서 분석하였다.

6웰 플레이트에 5 X 10⁵ 세포/웰이 되도록 HeLa 세포를 깔았다. 다음날 p53 또는 Tat-p53 융합단백질을 배양배지에 첨가하고 48시간 후에 세포를 수거하고 30분동안 얼음물에서 용균완충용액(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM EDTA, 1 % Nonidet P-40)으로 용균시켰다. 세포 용균액(lysate)은 얼음물에서 30분동안 1% SDS로 배양시킨 다음 37℃에서 2시간동안 10mg/ml RNase A와 20mg/ml 프로테이나제(proteinase) K에서 배양시켰다. 세포 용균액은 페놀-클로로포름으로 두 번 추출하고 DNA는 에탄올에서 침전시켜 2% 아가로스 젤상에서 전기영동시켰다. 상기 젤은 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색시켜 UV 하에서 사진을 찍었다.

융합단백질로 처리한 세포에서 추출한 DNA 염색체는 아가로스 젤 전기영동을 수행하였고, 파쇄된 DNA의 래더(ladder)는 Tat-p53로 형질도입된 세포에서 관찰되었다(도 5a). 다른 한편으로 탐지되지 않은 파쇄된 DNA는 컨트롤 p53이 형질도입된 세포에서 관찰되었다. 형질도입된 세포에서의 세포사멸 특징은 카스파제 활성화, Bcl-2 발현 및 PARP 분열과 같은 세포사멸 연관 분자의 수준변화의 탐지에 의하여 확인할 수 있다. 48시간동안 Tat-p53(0.2uM~1uM)으로 HeLa 세포의 처리는 활성화된 카스파제-3의 양상에 따라 투여량-의존 형태의 프로카스파제-3 전구체의 수준이 점차로 감소하는 결과를 가져왔다(도 5b). 그러나, 프로-카스파제-3의 수준은 컨트롤 p53으로 형질도입된 세포에서는 감소하지 않았다. Tat-p53은 Tat-p53이 형질도입된 세포내의 PARP 분열에 대해 유사한 효과와 갖는다는 것을 알았다. Tat-p53으로 처리된 세포내에서, Bcl-2 단백질의 수준은 투여량에 의존적으로 감소한다(도 5b). 그러나, 컨트롤 p53으로 형질도입된 세포에서 Bcl-2 단백질 수준은 현저하게 감소하였다. 이들을 함께 보면, 이들의 결과는 형질도입된 Tat-p53은 프로-카스파제-3 활성화, PARP 분열 유도와 Bcl-2 단백질의 수준 감소에 의해서 세포 사멸이 유도된다는 것을 지적하였다.

<실시예 8: 다른 p53 상태를 갖는 인간 암세포주의 세포 생존율에 대한 형질도입된 Tat-p53의 영향>

본 실시예에서는 다른 p53 상태(different p53 status)를 갖는 여러 인간 암세포주의 세포 생존율에 대한 형질도입된 p53의 영향을 분석하기 위하여, Hep3B (null p53), HepG2(wild-type p53)의 두 간암 세포주와 PC-3(null p53), LN-Cap (wild type p53)의 두 개의 전립선 암세포주를 사용하였다. 각각의 세포주는 4일간 매 24시간마다 1uM의 Tat-p53 또는 컨트롤 p53 단백질로 처리되었고, 세포 생존율은 MTT 어세이로 측정하였다.

Tat-p53으로 형질도입된 세포의 생존율은 p53의 상태와는 상관없이 4일간 투여량 의존적으로 상당히 감소한다. 반면, 컨트롤 p53으로 처리된 세포의 생존율은 영향을 받지 않았다. 이들 결과는 형질도입 Tat-p53는 p53의 상태와 상관없이 여러 종류의 암세포에 대해 세포독성 영향을 발휘하기에 충분하다는 것을 알았다(도 6a, b).

<실시예 9: 9개의 라이신-p53-9개의 라이신 융합단백질 제조>

실시예 2, 3의 방법과 유사한 방법으로 p53 양측 말단에 9개의 라이신이 융합된 융합단백질을 제조하였다. 실시예 4와 동일한 방법으로 세포에 형질도입하여 실시예 5 내지 8의 방법으로 세포내 도입과 활성, 세포독성 등을 조사한 결과 Tat-p53 융합단백질과 유사하거나 우수한 활성을 나타내었다. 서열번호 7은 정제된 9개의 라이신-p53-9개의 라이신의 일예이다.

그 외에도 HIV-1 Tat(49~57)의 양 말단으로부터 1~2개의 아미노산을 제거한 다양한 수송도메인을 p53의 N-말단 또는 C-말단에 결합시켜 세포 형질도입 실험을 수행하였고, 10~12 아르기닌으로 이루어진 수송도메인으로 상기 실시예와 동일한 형질도입 실험을 수행하였으며, 유사한 정도의 세포도입율과 활성을 나타내었다.

따라서, 본 발명은 p53 단백질에 수송도메인을 결합시켜 높은 투과효율과 세포내 활성을 갖는 융합단백질을 제공할 수 있다.

또한, 상기와 같이 형질도입된 Tat-p53에 의하여 p53 기능의 회복은 p53의 상태에 관계없이 여러 암세포주에서 세포사멸을 유발시키는 것을 알 수 있다. 그러므로, 세포 침투성 Tat-p53은 여러 암세포의 치료를 위하여 강력한 치료 시약으로써 효과적일 수 있으므로, 본 발명의 융합단백질을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물등을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 융합 단백질의 제조 기법은 향후 유전자 치료법과 함께 새로운 질환 치료법 또는 투약법으로 활용될 수 있다.

도 1은 Tat-p53 융합단백질의 발현과 정제 결과를 도시한 것이다.

도 1a는 Tat-p53의 발현벡터 제조의 개략도이다. Tat-p53, p53 발현 벡터는 각각 pHisTat와 pET-15b 내로 p53 코딩서열을 삽입하여 제작하였다.

도 1b는 정제된 p53과 Tat-p53 융합단백질의 분석결과이다. 니켈 컬럼상에서 친화 크로마토그래피로 정제된 단백질은 10% SDS-PAGE로 분리하였고, 쿠마시 블루로 염색되었다. 레인 M: 분자량 사이즈 마커.

도 1c는 정제된 Tat-p53 융합단백질의 웨스턴블랏 분석 결과이다. 정제된 융합단백질은 10% SDS-PAGE로 분리되었고, 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 옮겨졌다. 이 멤브레인은 1차 항체로는 단일클론 p53 항체와 2차 항체로는 항마우스 IgG로 배양되었고, 블랏은 ECL방법으로 현상되었다.

도 2는 p53 융합단백질의 형질도입 키네틱스(kinetics)의 결과를 도시한 것이다.

도 2a는 배양된 HeLa 세포내로 Tat-p53의 투여량 의존성 형질도입 결과이다. 1시간동안 배양배지에 각각 변성된 p53과 Tat-p53을 부가하고, 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 수준을 측정하기 위한 웨스턴블랏을 위하여 세포 용균액을 준비했다.

도 2b는 배양된 HeLa 세포내로 Tat-p53의 시간 의존성 형질도입 결과이다. 배양 시간동안 변성된 1uM Tat-p53을 부가하였다.

도 2c는 형질도입된 HeLa 세포 내에서 Tat-p53의 안정성 측정결과이다. 1시간동안 배양배지에 각각 변성된 Tat-p53, p53 단백질을 부가하고 무혈청 배지로 세포를 두 번 세척하고 새로운 배지로 교체하였다. 단일클론 항체를 이용하여 세포 용균액을 웨스턴블랏으로 분석하였다.

도 2d는 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 서브세포에서의 위치(subcellular localization)를 공초점 현미경을 이용하여 시각화하였다. 4시간동안 HeLa 세포를 0.5uM p53 또는 Tat-p53로 처리한 후 세포를 고정시키고, FITC-컨쥬게이션 고우트 항 레빗 IgG(왼쪽 패널)를 동반하는 항-히스티딘 항체로 융합단백질을 시각화하였다. 핵은 PI로 염색되었다(가운데 패널). (a) 무처리 세포, (b) p53 단백질, (c) Tat-p53 융합단백질.

도 2e는 p53 단백질로 형질도입된 세포의 서브세포 분획의 분석결과이다. 핵과 시토졸 추출물은 형질도입된 HeLa 세포에서 준비되었고, 항-p53 모노클론 항체로 웨스턴블랏하여 분석하였다. 멤브레인을 제거하고, 항액틴(시토졸 마커) 또는 항-PARP(핵 마커) 항체로 재프로브하였다.

도 3은 Tat-p53에 의한 p21 발현의 활성화를 측정한 결과이다.

도 3a는 Tat-p53에 의한 p21 단백질 발현의 투여량 의존성 결과이다. 36시간동안 지정된 농도의 p53 또는 Tat-p53 융합단백질로 HeLa 세포를 처리하였다. p53 단백질의 트랜스엑티베이션(transactivation) 활성은 단일클론 p21 항체를 이용하여 p21 단백질의 수준 측정으로 분석하였다.

도 3b는 Tat-p53에 의한 p21 단백질 발현의 시간 의존성 결과이다. 지정된 기간동안 1uM p53 또는 Tat-p53 융합단백질로 HeLa를 처리하였다. 세포 용균액을 준비하고 p21 단백질의 수준은 단일클론 p21 항체를 이용하여 웨스턴블랏 분석으로 탐지하였다.

도 3c는 Tat-p53 융합단백질의 p21 프로모터의 전사적 활성화의 그래프이다. RLA(related luciferase activities).

도 4는 Tat-p53으로 형질도입된 HeLa 세포의 세포 생존율을 분석한 그래프이다. HeLa 세포는 24웰에 2 X 10⁴ 세포/웰로 심었고 3일동안 24시간마다 컨트롤 p53과 Tat-p53 융합단백질을 다양한 농도로 처리하였다. 생존세포의 백분율은 3일간 MTT로 측정하였다. 결과는 세 번의 실험치 평균으로 정하였고 표준편차를 도시하였다.

도 5는 Tat-p53으로 형질도입에 의한 세포사멸의 생화학적 분석 결과이다.

도 5a는 Tat-p53으로 형질도입된 HeLa 세포에서 DNA 파편 분석결과이다. 48시간동안 0.2~1uM 농도의 p53을 HeLa 세포에 형질도입시켰다. p53이 형질도입된 세포에서 DNA를 추출하여, 2% 아가로스 젤 상에서 분석하였다. 레인 M: DNA 래더(ladder) 마커.

도 5b는 Tat-p53 형질도입된 HeLa 세포에서 분자 관련 세포사멸 분석 결과이다. 48시간동안 0.2~1uM 농도의 p53 단백질을 HeLa 세포에 형질도입시켰다. 세포 단백질을 추출하고, SDS-PAGE로 분리한 후 카스파제-3, PARP, Bcl-2 또는 액틴(actin)으로 인식되는 항체들로 이뮤노블랏 분석을 수행하였다. 레인 con: 무처리 세포.

도 6은 다른 상태의 p53을 갖는 암세포에 형질도입된 Tat-p53 융합단백질의 세포사멸 효과를 분석한 결과이다. 생존세포의 백분율은 3번의 실험치 평균으로 정하였고 표준편차를 그래프에 도시하였다.

도 6a는 간암세포주인 HepG2(w.t. p53)와 Hep 3B(null p53)의 세포 생존율을 측정한 결과이다. 간암세포주인 HepG2(w.t. p53)와 Hep 3B(null p53)를 24웰 플레이트에 2 X 10⁴ 세포/웰로 가하고 1uM p53 또는 Tat-p53 융합단백질을 4일간 24시간마다 처리하였다. 생존 세포의 퍼센트는 Tat-p53 단백질의 형질도입 후 4일간 MTT로 측정하였다.

도 6b는 전립선 암세포주인 LN-Cap(w.t. p53)과 PC-3(null p53)의 세포 생존율을 측정한 결과이다. 전립선 암세포주인 LN-Cap(w.t. p53)과 PC-3(null p53)을 24웰 플레이트에 2 X 10⁴ 세포/웰로 가하고 1uM p53 또는 Tat-p53 융합단백질을 4일간 24시간마다 처리하였다.

<110> Hallym University <120> Cell-transducing transport domain-p53 fusion protein and uses thereof <130> WJTJ-SHK-TP53 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 2 ctcgaggtga gcaagggcga ggagctg 27 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 3 ggatccttac ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 4 <211> 1272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence which comprises HIV-1 Tat coding sequence and p53 DNA sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1269) <400> 4 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat agg aag aag cgg aga cag cga cga aga ctc gag gag 96 Arg Gly Ser His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Glu 20 25 30 gag ccg cag tca gat cct agc gtc gag ccc cct ctg agt cag gaa aca 144 Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr 35 40 45 ttt tca gac cta tgg aaa cta ctt cct gaa aac aac gtt ctg tcc ccc 192 Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro 50 55 60 ttg ccg tcc caa gca atg gat gat ttg atg ctg tcc ccg gac gat att 240 Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile 65 70 75 80 gaa caa tgg ttc act gaa gac cca ggt cca gat gaa gct ccc aga atg 288 Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met 85 90 95 cca gag gct gct ccc ccc gtg gcc cct gca cca gcg act cct aca ccg 336 Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Thr Pro 100 105 110 gcg gcc cct gca cca gcc ccc tcc tgg ccc ctg tca tct tct gtc cct 384 Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro 115 120 125 tcc cag aaa acc tac cag ggc agc tac ggt ttc cgt ctg ggc ttc ttg 432 Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu 130 135 140 cat tct ggg aca gcc aag tct gtg act tgc acg tac tcc cct gcc ctc 480 His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu 145 150 155 160 aac aag atg ttt tgc caa ctg gcc aag acc tgc cct gtg cag ctg tgg 528 Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp 165 170 175 gtt gat tcc aca ccc ccg ccc ggc acc cgc gtc cgc gcc atg gcc atc 576 Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile 180 185 190 tac aag cag tca cag cac atg acg gag gtt gtg agg cgc tgc ccc cac 624 Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His 195 200 205 cat gag cgc tgc tca gat agc gat ggt ctg gcc cct cct cag cat ctt 672 His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu 210 215 220 atc cga gtg gaa gga aat ttg cgt gtg gag tat ttg gat gac aga aac 720 Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn 225 230 235 240 act ttt cga cat agt gtg gtg gtg ccc tat gag ccg cct gag gtt ggc 768 Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly 245 250 255 tct gac tgt acc acc atc cac tac aac tac atg tgt aac agt tcc tgc 816 Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys 260 265 270 atg ggc ggc atg aac cgg agg ccc atc ctc acc atc atc aca ctg gaa 864 Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu 275 280 285 gac tcc agt ggt aat cta ctg gga cgg aac agc ttt gag gtg cgt gtt 912 Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val 290 295 300 tgt gcc tgt cct ggg aga gac cgg cgc aca gag gaa gag aat ctc cgc 960 Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg 305 310 315 320 aag aaa ggg gag cct cac cac gag ctg ccc cca ggg agc act aag cga 1008 Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg 325 330 335 gca ctg ccc aac aac acc agc tcc tct ccc cag cca aag aag aaa cca 1056 Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro 340 345 350 ctg gat gga gaa tat ttc acc ctt cag atc cgt ggg cgt gag cgc ttc 1104 Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe 355 360 365 gag atg ttc cga gag ctg aat gag gcc ttg gaa ctc aag gat gcc cag 1152 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln 370 375 380 gct ggg aag gag cca ggg ggg agc agg gct cac tcc agc cac ctg aag 1200 Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys 385 390 395 400 tcc aaa aag ggt cag tct acc tcc cgc cat aaa aaa ctc atg ttc aag 1248 Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys 405 410 415 aca gaa ggg cct gac tca gac t ga 1272 Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 420 <210> 5 <211> 423 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Glu 20 25 30 Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr 35 40 45 Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro 50 55 60 Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile 65 70 75 80 Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met 85 90 95 Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Thr Pro 100 105 110 Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro 115 120 125 Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu 130 135 140 His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu 145 150 155 160 Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp 165 170 175 Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile 180 185 190 Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His 195 200 205 His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu 210 215 220 Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn 225 230 235 240 Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly 245 250 255 Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys 260 265 270 Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu 275 280 285 Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val 290 295 300 Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg 305 310 315 320 Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg 325 330 335 Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro 340 345 350 Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe 355 360 365 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln 370 375 380 Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys 385 390 395 400 Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys 405 410 415 Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 420 <210> 6 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence which comprises nine lysines coding sequence and p53 DNA sequence and nine lysines coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <400> 6 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat aag aag aaa aag aaa aag aaa aag aag ctc gag gag 96 Arg Gly Ser His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu Glu 20 25 30 gag ccg cag tca gat cct agc gtc gag ccc cct ctg agt cag gaa aca 144 Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr 35 40 45 ttt tca gac cta tgg aaa cta ctt cct gaa aac aac gtt ctg tcc ccc 192 Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro 50 55 60 ttg ccg tcc caa gca atg gat gat ttg atg ctg tcc ccg gac gat att 240 Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile 65 70 75 80 gaa caa tgg ttc act gaa gac cca ggt cca gat gaa gct ccc aga atg 288 Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met 85 90 95 cca gag gct gct ccc ccc gtg gcc cct gca cca gcg act cct aca ccg 336 Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Thr Pro 100 105 110 gcg gcc cct gca cca gcc ccc tcc tgg ccc ctg tca tct tct gtc cct 384 Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro 115 120 125 tcc cag aaa acc tac cag ggc agc tac ggt ttc cgt ctg ggc ttc ttg 432 Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu 130 135 140 cat tct ggg aca gcc aag tct gtg act tgc acg tac tcc cct gcc ctc 480 His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu 145 150 155 160 aac aag atg ttt tgc caa ctg gcc aag acc tgc cct gtg cag ctg tgg 528 Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp 165 170 175 gtt gat tcc aca ccc ccg ccc ggc acc cgc gtc cgc gcc atg gcc atc 576 Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile 180 185 190 tac aag cag tca cag cac atg acg gag gtt gtg agg cgc tgc ccc cac 624 Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His 195 200 205 cat gag cgc tgc tca gat agc gat ggt ctg gcc cct cct cag cat ctt 672 His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu 210 215 220 atc cga gtg gaa gga aat ttg cgt gtg gag tat ttg gat gac aga aac 720 Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn 225 230 235 240 act ttt cga cat agt gtg gtg gtg ccc tat gag ccg cct gag gtt ggc 768 Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly 245 250 255 tct gac tgt acc acc atc cac tac aac tac atg tgt aac agt tcc tgc 816 Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys 260 265 270 atg ggc ggc atg aac cgg agg ccc atc ctc acc atc atc aca ctg gaa 864 Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu 275 280 285 gac tcc agt ggt aat cta ctg gga cgg aac agc ttt gag gtg cgt gtt 912 Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val 290 295 300 tgt gcc tgt cct ggg aga gac cgg cgc aca gag gaa gag aat ctc cgc 960 Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg 305 310 315 320 aag aaa ggg gag cct cac cac gag ctg ccc cca ggg agc act aag cga 1008 Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg 325 330 335 gca ctg ccc aac aac acc agc tcc tct ccc cag cca aag aag aaa cca 1056 Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro 340 345 350 ctg gat gga gaa tat ttc acc ctt cag atc cgt ggg cgt gag cgc ttc 1104 Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe 355 360 365 gag atg ttc cga gag ctg aat gag gcc ttg gaa ctc aag gat gcc cag 1152 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln 370 375 380 gct ggg aag gag cca ggg ggg agc agg gct cac tcc agc cac ctg aag 1200 Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys 385 390 395 400 tcc aaa aag ggt cag tct acc tcc cgc cat aaa aaa ctc atg ttc aag 1248 Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys 405 410 415 aca gaa ggg cct gac tca gac gga tcc aag aag aaa aag aaa aag aaa 1296 Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 420 425 430 aag aag ctc gag gct gct aac aaa gcc cga aag gaa gct gag ttg gct 1344 Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu Ala 435 440 445 gct gcc acc gct gag caa taa 1365 Ala Ala Thr Ala Glu Gln 450 <210> 7 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu Glu 20 25 30 Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr 35 40 45 Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro 50 55 60 Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile 65 70 75 80 Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met 85 90 95 Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Thr Pro 100 105 110 Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro 115 120 125 Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu 130 135 140 His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu 145 150 155 160 Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp 165 170 175 Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile 180 185 190 Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His 195 200 205 His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu 210 215 220 Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn 225 230 235 240 Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly 245 250 255 Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys 260 265 270 Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu 275 280 285 Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val 290 295 300 Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg 305 310 315 320 Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg 325 330 335 Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro 340 345 350 Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe 355 360 365 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln 370 375 380 Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys 385 390 395 400 Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys 405 410 415 Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 420 425 430 Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu Ala 435 440 445 Ala Ala Thr Ala Glu Gln 450

Claims

6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 p53의 최소한 일측 말단에 공유결합된 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 수송도메인은 9~12개의 아미노산 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질.
제1항에 있어서, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 세포침투성 수송도메인-p53 융합단백질.
삭제
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 수송도메인-p53 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 항암제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.