KR101131512B1 - 퇴행성신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 NIa(nuclear inclusion a) 프로테아제 또는 NIa 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성신경질환(neurodegenrative disorders) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 포티바이러스의 NIa 프로테아제를 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 NIa 프로테아제는 아밀로이드 β(Aβ)를 효과적으로 분해할 수 있으며, 아밀로이드 β에 의해 유발되는 세포 사멸을 억제할 수 있다. 본 발명의 NIa 프로테아제는 종래의 아밀로이드 β 분해 효소(예: NEP 및 IDE; 세포막 또는 세포 소기관 속에 존재)와는 달리 세포질에 존재하기 때문에, 알쯔하이머병을 치료하기 위한 새로운 방법을 제시한다.

NIa 프로테아제, 아밀로이드 β, 알쯔하이머병, 세포 사멸

Description

퇴행성신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating a Neurodegenerative Disorder}

본 발명은 퇴행성신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

치매는 이성적 사고와 사회적 활동을 할 수 있는 능력의 점진적인 소실이 한 개인의 일상 생활의 장애를 가져올 정도로 충분히 심각함을 의미한다. 치매는 크게 알쯔하이머병, 파킨슨 병, 헌틴톤 병 등으로 인한 치매, 혈관이 막히거나 좁아진 것이 원인이 되어 발생하는 혈관성 치매로 나눌 수 있으며, 이들 중 알쯔하이머병으로 인한 치매가 가장 많다.

2006년 세계보건기구 조사에 따르면 전세계적으로 알쯔하이머병을 앓고 있는 사람의 수가 천팔백만 명 정도로 집계 되었다. 미국의 경우, 65세 이후 전 미국인의 10.3%가 알쯔하이머병을 앓고 있으며, 연간 알쯔하이머병 치료, 간호 등에 950억 달러 이상이란 막대한 비용을 지불하고 있다. 우리 나라의 경우도 알쯔하 이머병이 10년간 증가 폭이 가장 큰 사망의 원인이 되었으며, 가속화 되는 고령화의 영향으로 알쯔하이머 환자의 수와 그 비용이 크게 증가할 것으로 예상된다. 현재 알쯔하이머 치료에 사용되는 약물들을 크게 항산화제, 항소염제, 여성 호르몬제와 아세틸콜린 분해 억제제로 분류할 수 있다. 하지만 이들 대부분이 심각한 부작용들을 동반하고 있으며, 또한 알쯔하이머병의 근본 원인을 치료할 수 있는 약물이 아닌 증상들을 완화시키기 위한 약물이란 한계점이 있다. 그러므로 알쯔하이머병의 근본적인 치료를 위한 치료제 개발이 절실한 상황이다.

알쯔하이머병은 해부학적으로 뇌 세포의 외부에 생기는 아밀로이드 플락(amyloid plaques)과 세포 안에 생기는 신경섬유다발(NFTs, neurofibrillary tangles)을 특징으로 한다. 아밀로이드 플락은 아밀로이드 β(Aβ)라는 작은 펩타이드로 구성되는데 알미로이드 β는 알쯔하이머병의 주요한 요인으로 알려져 있다. 아밀로이드 β는 아밀로이드 전구 단백질(APP, amyloid β precursor protein)이 β-세크레타제 및 γ-세크레타제에 의해 분해될 때 형성된다. 반면 아밀로이드 전구 단백질이 β-세크레타제 대신 β-세크레타제와 경쟁 관계에 있는 α-세크레타제에 의해 분해될 때 아밀로이드 β의 형성은 저해된다 [1]. 현재 아밀로이드 β의 형성을 억제하기 위한 방법으로 β-세크레타제 및 γ-세크레타제 억제제 개발, 그리고 α-세크레타제를 활성화할 수 있는 물질에 관한 연구들이 진행 중이며, 다른 방향으로 이미 형성된 아밀로이드 β를 제거하기 위한 새로운 아밀로이드 β 분해효소 발견에 많은 연구들이 진행 중에 있다. 최근 밝혀진 아밀로이드 β 분해 효소로 NEP(neprilysin) 및 IDE(insulin degrading enzyme)이 있으며, 그 중 NEP를 바이러스 벡터를 이용, 유전자 치료를 시행하였을 때 알쯔하이머병이 유도되도록 만들어진 형질 전환 생쥐에서 아밀로이드 플락의 크기와 알쯔하이머병들의 여러 특징들이 완화되는 것이 보고되었다 [2,3]. 하지만 NEP의 경우 아밀로이드 β뿐만 아니라 뇌 속에 존재하는 다른 펩타이드들을 분해 할 수 있다는 단점이 있다 [4].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 퇴행성신경질환(neurodegenrative disorders)을 예방 또는 치료하기 위한 치료제의 새로운 타겟을 발굴하고자 노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식물 바이러스인 순무 모자이크바이러스(Turnip mosaic virus, TuMV)의 NIa(nuclear inclusion a) 프로테아제가 아밀로이드 β(Aβ)를 효과적으로 분해하는 활성을 지니며, NIa 프로테아제의 발현이 세포 내의 아밀로이드 β로부터 유도되는 세포 사멸뿐 아니라 세포 외부의 아밀로이드 β로부터 유도되는 세포 사멸도 억제시킨다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 퇴행성신경질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NIa(nuclear inclusion a) 프로테아제 또는 NIa 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성신경질환(neurodegenrative disorders) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 퇴행성신경질환을 예방 또는 치료하기 위한 치료제의 새로운 타겟을 발굴하고자 노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식물 바이러스인 순무 모자이크바이러스의 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해하는 활성을 지니며, NIa 프로테아제의 발현이 세포 내의 아밀로이드 β로부터 유도되는 세포 사멸뿐 아니라 세포 외부의 아밀로이드 β로부터 유도되는 세포 사멸도 억제시킨다는 것을 발견하였다.

식물 바이러스인 순무 모자이크 바이러스(TuMV)는 십자화과 식물에서 병을 유발하는 포티비리대속 패밀리에 속하는 포티바이러스이다. 이 바이러스는 40-50종의 진딧물을 통해 감염되며, 감염된 식물은 국부적인 백화 병변(chlorotic local lesions), 모자이크, 얼룩(mottling) 또는 주름(puckering or rugosity) 같은 증후를 나타낸다. TuMV는 외피가 없고 나선형의 캡시드로 구성된 파지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스로 720 nm의 평균 길이를 가진다. TuMV의 게놈은 약 10 kb 정도로 이루어진 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)로 구성되어 있고 그 형태는 선형 모노파티트(linear monopartite)이다.

포티바이러스의 NIa 프로테아제는 바이러스의 복제에 중요한 역할을 하며 다음과 같은 두 개의 기능성 도메인으로 구성되어 있다: (a) N-말단의 VPg 도메인(25 kDa) 및 (b) C-말단의 프로테아제 도메인(27 kDa). 포티바이러스의 NIa 프로테아제는 서열 분석을 통해 키모트립신-유사 세린 프로테아제와 관련된 것으로 보고되어져 왔다. 한편, 다른 연구에 따르면, 담배 에치 바이러스(TEV)의 NIa 프로테아 제의 활성이 TPCK 및 시스테인 프로테아제 억제제에 의해 억제된다고 알려졌다. 이러한 결과는 NIa 프로테아제가 세린 프로테아제와 유사한 활성 부위를 가지는 시스테인 프로테아제라는 것을 의미한다.

식물 바이러스인 TuMV의 NIa 프로테아제는 Val-Xaa-His-Gln↓라는 강한 기질적 특이성을 가지는데, 본 발명자들은 TuMV NIa의 기질적 특이성에 부합하는 아미노산 서열이 아밀로이드 β 위에 존재한다는 것을 처음으로 발견하였다.

본 발명에 따르면, TuMV의 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해하며, NIa 프로테아제에 의한 아밀로이드 β의 분해로 인해 아밀로이드 β에 의해 유도되는 세포사멸이 감소한다.

아밀로이드 β는 알쯔하이머병 환자의 뇌에서 아밀로이드 플락을 형성하는 주요한 성분으로 39-43 아미노산으로 구성된 펩타이드로 루이소체 치매, 봉입체 근염 또는 근육병 환자에서도 관찰된다. 또한, 아밀로이드 β는 소뇌아밀로이드혈관병변(cerebral amyloid angiopathy) 환자에서 뇌 혈관을 코팅하는 응집체를 형성한다. 이러한 아밀로이드 플락은 다른 펩타이드(예: 프라이온)에 의해 공유되는 단백질 폴드로서 아밀로이드 섬유(amyloid fibers)로 불리는 잘 정돈된 소섬유(fibrillar) 응집체 다발로 구성된다. 아밀로이드 β 전구체 단백질(amyloid β precursor protein, APP)로부터 절단(cleavage)되어 형성되는 아밀로이드 β 펩타이드의 수용성 부위는 알쯔하이머병의 진행에 결정적인 요인으로서 작용한다. 이러한 아밀로이드 β의 형성은 β-세크레타제 및 γ-세크레타제에 의한 APP의 분해 과정을 통해 이루어진다. 또한, 종래에 알려진 NEP(neprilysin)나 IDE(insulin degrading enzyme)와 같은 아밀로이드 β 분해 효소에 의한 세포 외부에 존재하는 아밀로이드 β의 분해가 알쯔하이머병의 치료를 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서 이용되는 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해할 수 있는 활성을 지니는 것은 알쯔하이머병의 치료를 위한 신규한 전략을 제공한다(참조: 인 비트로 실험 및 세포 실험).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 NIa 프로테아제는 아밀로이드 β를 분해하는 활성을 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 퇴행성신경질환은 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 경도 인지기능장애(MCI: mild cognitive impairment), 경도 혹은 중등도 인지기능장애(mild-to-moderate cognitive impairment), 혈관성 치매(Vascular dementia), 소뇌아밀로이드혈관병변(cerebral amyloid angiopathy), 선천성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage), 노인성 치매(senile dementia), 다운 증후군, 봉입체 근염(inclusion body myositis), 노인성 황반변성(age-related macular degeneration) 또는 알쯔하이머병과 관련된 상태(conditions associated with Alzheimer's disease)이며, 보다 바람직하게는 알쯔하이머병이다.

본 발명에서, 알쯔하이머병은 산발성(후천성) 또는 가족성(선천성) 알쯔하이머병을 포함한다. 또한, 알쯔하이머병은 아밀로이도시스(amyloidosis)로 정의되는 퇴행성신경질환이기 때문에, 본 발명의 조성물은 다른 아밀로이도시스를 포함하는 상태, 예를 들어 비신경병증성 유전성 아밀로이드증(nonneuropathic hereditary amyloid), 매크로글로불린혈증(macroglobulinemia), 이차 가족성 지중해열, 머클- 웰즈 증후군, 다발성 골수종, 췌장- 및 심장-관련 아밀로이도시스, 만성 혈액투석 관절증(chronic hemodialysis arthropathy) 또는 핀니쉬 및 아이오와 아밀로이도시스(Finnish and Iowa amyloidosis)의 치료에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서, 용어 “아밀로이도시스(amyloidosis)”는 아밀로이드 단백질이 기관 및/또는 조직에서 비정상적으로 축적(deposit)되는 다양한 질병, 질환 또는 상태를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 알쯔하이머병과 관련된 상태는 갑상선 저하, 뇌혈관 질환, 심혈관 질환, 기억 상실, 불안, 행동 장애(behavioral dysfunction), 신경학적 상태 또는 심리학적 상태를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 행동 장애는 무관심, 초조/공격성(agitation/aggression), 우울, 과민/불안정, 불안 또는 정신이상을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 신경학적 상태는 헌팅톤병, 근위축성 측삭경화증, 후천성 면역결핍증, 파킨슨병, 실어증, 실행증, 실인증, 픽병, 루이소체 치매(DLB), 근육긴장 이상증(altered muscle tone), 발작, 감각 소실, 시야 결손(visual field deficits), 협응 장애(incoordination), 보행 장애, 일과성 허혈성 발작 또는 뇌졸증, 일과성 기민성, 주의력 결핍, 잦은 낙상(frequent falls), 실신, 신경안정제에 대한 감수성, 정상 뇌압 수두증(NPH), 경막하혈증, 뇌종양, 외상후 뇌손상 또는 저산소증후 손상(posthypoxic damage)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 심리학적 상태는 우울, 망상, 착각, 환각, 성기능 장애, 체중 감소, 정신병, 수면 장애, 불면증, 행동 탈억제(behavioral disinhibition), 시력 감퇴, 자살 충동(suicidal ideation), 우울증, 과민, 안헤도니아(anhedonia), 은둔형 외톨이 또는 과도한 죄책감(excessive guilt)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 NIa 프로테아제 단백질을 유효성분으로써 이용하기 위해 NIa 프로테아제가 효과적으로 세포 내로 침투할 수 있어야 한다.

NIa 프로테아제를 유효성분으로 이용하는 경우, 단백질 운반 도메인(PTD: protein transduction domain)을 NIa 프로테아제에 부착시키는 것이 바람직하다. 즉, 유효성분으로서 본 발명의 NIa 프로테아제를 세포 내로 도입(permeable peptide transduction)하기 위하여 단백질 운반 도메인(PTD: protein transduction domain)을 상기 단백질과 융합하여 융합 단백질을 만든다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 바람직하게는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 homeodomain, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

NIa 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달 체를 유효성분으로 이용하는 경우, NIa 프로테아제-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

상기 발현 컨스트럭트에서, NIa 프로테아제 유전자는 프로머터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, NIa 프로테아제 유전자에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 에서 작동하여 NIa 프로테아제 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM- CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CMV 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 NIa 프로테아제-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 “프로모터-NIa 프로테아제 인코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리 아데닐화 서열”의 구조를 갖는다.

본 발명은 상술한 NIa 프로테아제 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NIa 프로테아제 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

NIa 프로테아제의 활성을 갖도록 하는 변이를 갖는다면, 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체는 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열(제1서열, GenBank 접근번호: AAK82884) 또는 뉴클레오타이드 서열(제2서열, GenBank 접근번호: AF394602)에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 NIa 프로테아제 변이체 자체에 변화를 가져올 수도 있다. NIa 프로테아제 변이체의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 NIa 프로테아제 변이체 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여 되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보 다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체 단백질 또는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992); 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

NIa 프로테아제 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 NIa 프로테아제-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 플라스미드

플라스미드는 매우 간편하고 용이하게 다룰 수 있는 유전자 전달 시스템으로서 당업계에서 널리 이용되고 있다. 본 발명에 있어서, NIa 프로테아제 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 에서 작동하여 NIa 프로테아제 변이체를 발현할 수 있는 것으로서, 당업계에 잘 알려진 발현 벡터들을 포함하며, 예를 들어 pcDNA3, pcDNA3.1 시리즈(예: pcDNA3.1D/V5-His-TOPO, pcDNA3.1/mycHisC(-)), pcDNAI, pTracer-SV40, pCDM8, pCEP4, pRc/CMV, pREP9, pCDM8, pCR2.1, pCR3.1, pCRIII, pSG5, pCMV4, pCMV/Nu/Myc, pGW1, pEGFP-C2, pC1-S65T, YIp5, YCpl9, pMSG, pAV009/A⁺, pMAMneo-5, pSecTag2B 또는 yT&A 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, pcDNA3 벡터이다.

ⅱ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서 본 발명의 NIa 프로테아제 변이체 유전자는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템은 “프로모터-NIa 프로테아제 변이체 유전자-폴리 A 서열”이 연결된 구조를 갖으며, 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서 아데노바이러스에 삽입되는 NIa 프로테아제 변이체 유전자는 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 NIa 프로테아제 변이체 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅲ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, NIa 프로테아제 변이체 유전자는 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하 지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). NIa 프로테아제 변이체 유전자, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅳ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(NIa 프로테아제 변이체 유전자)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.

ⅴ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러 스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, NIa 프로테아제 변이체 유전자를 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅵ. 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. NIa 프로테아제 변이체 유전자를 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 NIa 프로테아제 변이체 유전자를 운반한다.

한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 NIa 프로테아제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 NIa 프로테아제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 NIa 프로테아제는 상술한 본 발명의 플라스미드와 동일한 것이므로, 플라스미드에 대한 상세한 설명은 본 발명의 약제학적 조성물에도 그대로 적용된다. 따라서 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형 태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 정제된 NIa 프로테아제가 아밀로이드 β를 효과적으로 분해하였을 뿐만 아니라 세포 내외부의 아밀로이드 β에 의한 세포 사멸의 정도가 세포질에서 발현된 NIa 프로테아제에 의해 억제되었다(참조: 도 4 및 도 5). 이것은 NIa 프로테아제에 의해 아밀로이드 β 독성이 효과적으로 제거된다는 것을 의미하므로, 본 발명의 조성물을 알쯔하이머 환자에게 투여함으로써 알쯔하이머병의 발병과 진행에 결정적인 역할을 하는 인자인 아밀로이드 β를 분해할 수 있다. 따라서 본 발명의 NIa 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알쯔하이머병 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 포티바이러스의 NIa(nuclear inclusion a) 프로테아제를 제공한다.

(b) 본 발명에 따르면, 본 발명의 NIa 프로테아제는 아밀로이드 β를 효과적으로 분해할 수 있다.

(c) 또한, 본 발명의 NIa 프로테아제는 아밀로이드 β에 의해 유발되는 세포 사멸을 억제할 수 있다.

(d) 본 발명의 NIa 프로테아제는 종래의 아밀로이드 β 분해 효소(예: NEP 및 IDE; 세포막과 세포 소기관 속에 존재)와는 달리 세포질에 존재하기 때문에, 알쯔하이머병을 치료하기 위한 새로운 방법을 제시한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

1.1 NIa 발현 유전자 재조합 방법

NIa 단백질을 대장균에서 정제하기 위하여, pTYB12 벡터(New England BioLabs, USA)에 NIa 유전자를 삽입하여 재조합 유전자를 만들었다. 유전자 증폭 기기를 이용하여 NIa에서 촉매성 트리아드(catalytic triad)로 작용하는 81번째 아미노산인 아스파라긴산을 알라닌으로 변형시켜 NIa 단백질의 기능이 완전히 소실된 NIa 돌연변이 유전자를 만들었다. 야생형 NIa 및 NIa 돌연변이 유전자를 세포 안에서 발현시키기 위해 위의 두 유전자를 N-말단에 HA tag을 갖고 있는 pcDNA-HA 벡터(Invitrogen, USA)에 삽입하여 pcDNA-HA-NIa 및 pcDNA-HA-mutant NIa 벡터를 재 조합하였다. 세포질에서 아밀로이드 β_1-42를 발현시킬 수 있는 벡터(pGFPUb-Aβ_1-42)는 유영준 박사님(GIST)으로부터 제공 받았다[15].

1.2 NIa 단백질 정제

위에서 재조합된 pTYB12-NIa 벡터를 대장균의 한 종인 BL21(DE3) 안에 삽입 한 후, 그 형질 전환체를 LB 배양액에서 37℃로 배양하였다. 대장균의 증식에 의한 배양액의 탁도가 OD₆₀₀에서 그 값이 0.5에 이르면 500 μM IPTG를 배양액에 첨가한 후 20℃에서 18시간 더 배양하였다. 배양된 형질 전환 대장균을 원심분리 방법으로 배양액으로부터 분리하였다. 분리 후 덩어리를 형성한 형질 변환체를 컬럼 완충액 [20 mM HEPES (pH 7.9), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA; Sigma, USA]로 다시 녹인 후 초음파 분해기기를 이용하여 대장균을 용해시켰다. 용해된 대장균을 원심분리기를 이용하여 분리한 후, 위의 상층액 만을 키틴 비드(chitin bead, New England BioLabs, USA)와 결합시켰다. 여러 번의 세척 단계를 거쳐 순수한 NIa 단백질을 50 mM DTT를 함유한 컬럼 완충액을 이용하여 키틴 비드로부터 분리하였다. 과량의 DTT가 함유되어 있는 NIa 단백질 용액으로부터 DTT를 제거하기 위해 투석을 시행하였다. 12% SDS(Sigma, USA)와 BCA(bicinchonic acid; Sigma, USA) 방법을 이용하여 정제된 NIa 단백질의 순도와 양을 측정하였다.

1.3 아밀로이드 β 펩타이드 준비와 그 처리 방법

정제된 NIa 단백질과 반응시키기 위해 합성된 아밀로이드 β 펩타이드(Aβ_1-42 peptide; Sigma, USA 및 Anygen, Korea)를 DMSO(dimethyl sulfoxide; Gibco BRL, USA)에 농도가 5 mM이 되도록 녹인 후, 사용 시까지 -70℃에서 보관하였다. 냉동고에 저장되어 있던 아밀로이드 β 펩타이드를 사용하기 직전에 농도가 25 μM이 되도록 멸균수를 이용하여 희석하였다. 배양된 세포에 대한 아밀로이드 β 펩타이드의 독성을 연구하기 위해 아밀로이드 β 펩타이드를 PBS(phosphate buffered saline)에 500 μM 농도가 되도록 녹인 후, 4℃에서 일주일간 보관하였다. 펩타이드의 최종 농도가 5 μM이 되도록 세포에 처리하였다.

1.4 NIa 단백질에 의한 아밀로이드 분해 효과 측정

반응 완충액[HEPES (pH 7.4), 20 mM KCl, 20 mM MgCl₂; Sigma, USA]에 위와 같은 방법으로 전처리 과정이 끝난 2.5 μM 농도의 아밀로이드 β 펩타이드와 정제된 NIa 단백질 6 ㎍을 섞어준 후, 25℃에서 0시간, 3시간, 15시간 동안 반응시켰다. 대조군 실험을 위해 정제된 NIa 단백질을 시스테인 단백질 분해 효소 억제제인 NEM(N-ethylmaleimide; Sigma, USA)와 4℃에서 10분간 미리 반응시킨 후, 상술한 것과 동일한 방법으로 아밀로이드 β 펩타이드와 반응시켰다. 아밀로이드 β 항체를 이용한 웨스턴 블롯(PeptiGels; ELPiS, Korea) 및 질량 분석(mass spectrometry) 방법을 이용하여 NIa 단백질에 의한 아밀로이드 β 펩타이드의 분해 정도와 그 절단 위치를 확인하였다.

1.5 세포 배양, 트랜스펙션 및 세포 사멸 측정 방법

백서의 신경아세포종인 B103 세포주(서울대학교 정용근 교수님 실험실, 17)는 10% 우태혈청이 포함된 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 배양된 세포는 리포펙타민(Invitrogen)을 이용하여 트랜스펙션 하였다. 세포 사멸 측정은 형광 현미경(DMRBE; Leica, Germany)을 이용하여 GFP 신호를 나타내는 세포의 형태 변화를 관찰하여 실시되었다.

1.6 면역 형광 염색법 및 공초점 현미경 분석법

B103 세포주를 1 mM KCl 및 1 mM MgCl₂이 포함된 PBS 용액으로 세척한 후, 세포 고정화를 위해서 3.5% 포름알데하이드 용액(Sigma, USA)에 10분간 방치한다. 0.2% triton X-100 용액(Sigma, USA)에 10분간 방치함으로 세포 투과화를 유도한 후, 상온에서 5% BSA(Sigma, USA)로 1시간 방치함으로 블롯킹 시켰다. 아밀로이드 β 항체인 6E10 (Signet, USA) 혹은 HA 항체(Abcam, USA)와 상온에서 1시간 반응시킨 후, TRITC(tetramethyl-rhodamine isothiocyanate; Sigma, USA)가 결합되어 있는 2차 항체, TRITC-antimouse IgG(Jackson Immunoresearch, West Point, PA)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 6E10 혹은 HA 항체와 반응시킨다. 올림프스 형광 현미경 BX41, JENOPTIK/JENA에서 판매된 ProgRes C10^plus카메라와 IMT i-solution INC.에서 판매된 IMT i-solution 소프트웨어를 이용하여 TRITC로부터 발생되는 형 광 파장을 관찰하고 분석하였다. 공초점 현미경 분석법은 zeiss에서 판매된 공초점 현미경(LSM510, Germany)을 이용하여 분석되었다.

1.7 세포 소기관 분리 방법

B103 세포에 트랜스펙션 방법을 이용하여 인위적으로 발현시킨 NIa 단백질의 세포 내 발현 위치를 관찰하기 위하여 NIa가 인위적으로 발현되고 있는 B103 세포를 균질화 완충액(200 mM sucrose, 20 mM Tris [pH7.4], 1 mM EGTA, 1mM EDTA, 1 X complete protease inhibitor cocktail; Sigma, USA)을 이용하여 세포 배양 용기로부터 수득하였다. 모아진 세포는 26 크기의 바늘을 있는 주사기를 여러 번 위아래로 이동시키면서 용해시켰다. BECKMAN에서 구입한 초고속 원심 분리기(Optima^TMTL Ultracentrifuge)를 이용하여 70,000 g에서 30분간 원심분리하였다. 상층액은 분리하여 따로 모으고 가라앉은 부분은 0.5% triton X-100이 포함된 균질화 완충액으로 풀어준 후 SONICS & MATERIALS. INC.에서 구입한 초음파 분해기(Ultrasonic processor vcx-400 & conv)를 이용하여 다시 용해시킨다. 상층액 부분과 가라앉은 부분, 각각으로부터 50 ㎍의 단백질을 취한 후, 12% SDS-PAGE를 이용하여 그 결과를 분석하였다.

실험결과

2.1 NIa에 의한 아밀로이드 β 분해

NIa 단백질 분해 효소는 Val-Xaa-His-Gln↓라는 강한 기질적 특이성을 갖는다. 본 연구실에서는 TuMV NIa의 기질적 특이성에 부합하는 아미노산 서열이 아밀로이드 β 위의 α-세크레타제에 의해 절단되는 부위에 존재(Val-His-His-Gln)하고 있음을 발견하였다(도 1).

이러한 발견으로부터 본 실험실에서는 NIa 단백질 분해 효소가 α-세크레타제와 같은 부위에서 아밀로이드 β를 분해할 수 있을 것으로 가정하고 실험을 진행하였다. 먼저 NIa 단백질 분해 효소를 대장균을 이용하여 발현시킨 후, 키틴 비드를 이용하여 분리 및 정제하였다(도 2A). 정제된 NIa 단백질 분해 효소와 합성된 아밀로이드 β 펩타이드를 3시간 내지 15시간 동안 반응시킨 후, 그 결과를 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 분석하였다. NIa 단백질 분해 효소가 제거된 반응에서는 반응 시간의 경과에 따른 모노머 상태의 아밀로이드 β 펩타이드의 변화가 관찰되지 않은 반면, NIa 단백질 분해 효소가 첨가된 반응에서는 반응 시간의 증가에 따라 빠르게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 시스테인 계열의 단백질 분해 효소 억제제인 NEM으로 NIa의 활성을 억제시킨 반응에서도 NIa 활성에 의한 아밀로이드 β의 감소가 확연히 줄어드는 것을 확인하였다(도 2B). 하지만 억제제 첨가 반응에서 NIa에 의한 아밀로이드 β 분해를 완전히 억제할 수 없었다. 이 결과는 이전 논문의 결과인 NIa 단백질 분해 효소의 활성을 촉매성 트리아드에 존재하는 시스테인의 변이만으로 완전히 억제할 수 없다는 보고와 일치함을 알 수 있다[5].

NIa 단백질 분해 효소에 의한 아밀로이드 β 위의 분절 위치를 확인하기 위하여 질량분석법을 이용하여 분석하였다. NIa 단백질 분해 효소와 반응시킨 샘플 에서는 동량의 아밀로이드 β 펩타이드 만을 포함하고 NIa 단백질 분해 효소가 배제되어 있는 샘플에서와 달리 1,826 Da과 2,704 Da에 새로운 피크를 발견하였다(결과를 보이지 않음). 이 피크들의 분자량은 각각 아밀로이드 β의 1-15번까지의 분자량 및 16에서 42번까지의 아미노산들의 분자량과 일치하는 것을 확인하였다. 이 결과로부터 NIa 단백질 분해 효소가 아밀로이드 β의 15번과 16번 아미노산 사이를 단절함을 확인할 수 있었다(도 3).

2.2 NIa의 아밀로이드 β에 의해 유도된 세포 사멸 억제 효과

세포 안에서의 NIa 효과를 확인하기 위해서 먼저 아밀로이드 β를 세포질 내에서 발현시킬 수 있는 벡터 시스템, pGFPUb-Aβ_1-42[GFP, 유비퀴틴(Ub) 및 Aβ의 융합단백질 벡터]를 이용하여 실험하였다. pGFPUb-Aβ_1-42 벡터는 N 말단으로부터 GFP-Ub-Aβ_1-42가 연결되어 있는 단백질을 세포질 안에서 발현시키며, 그 발현된 단백질은 세포질 속에 존재하는 탈유비퀴틴화(deubiquitinating) 효소에 의해 동량의 비율로 GFP-Ub 부분과 아밀로이드 β 부분으로 분리된다. 세포질에 존재하는 GFP 신호에 비해 아밀로이드 β와 반응하는 신호의 감소는 세포질에 존재하는 아밀로이드 β의 분해를 의미한다. GFPUb-Aβ_1-42 및 NIa를 세포질 안에서 동시에 발현시킨 다음 48시간 후, 아밀로이드 β에 대한 항체, 6E10을 이용하여 면역 형광 염색법을 시행하였다. GFP 신호에 비해 아밀로이드 β에 대한 신호를 나타내는 세포의 수(Aβ-양성 세포)가 GFPUb-Aβ_1-42 및 NIa를 세포질 안에서 동시에 발현 실험군(pGFPUb-Aβ_1-42 및 pcDNA-HA-NIa; 14 ± 4%)에서 아밀로이드 β만을 발현시킨 실험군(pGFPUb-Aβ_1-42 및 공벡터; 56 ± 8%) 및 아밀로이드 β와 NIa 돌연변이체를 동시에 발현시킨 실험군(pGFPUb-Aβ_1-42 및 pcDNA-HA-mNIa; 42 ± 10%)에 비해 현저히 감소된 것을 확인하였다. 이 실험 결과를 통해 GFPUb-Aβ_1-42 벡터로부터 세포질 안에 발현되는 아밀로이드 β가 NIa 단백질 분해 효소에 의해 분해된다는 것을 확인하였다(도 4).

위와 동일한 실험 조건에서 세포질에 존재하는 아밀로이드 β에 의한 세포 사멸 정도를 측정하였다. 위의 실험 결과와 일맥상통하게 세포 사멸 정도가 GFPUb-Aβ_1-42 및 NIa를 세포질 안에서 동시에 발현시킨 실험군(pGFPUb-Aβ_1-42 및 pcDNA-HA-NIa; 막(Mock) 처리와 유사 수준)에서 아밀로이드 β만을 발현시킨 실험군(pGFPUb-Aβ_1-42 및 공벡터; 62 ± 13%) 및 아밀로이드 β와 NIa 돌연변이체를 동시에 발현시킨 실험군(pGFPUb-Aβ_1-42 및 pcDNA-HA-mNIa; 57 ± 3%)에 비해 현저히 감소된 것을 확인하였다(도 5A).

이전 여러 연구의 결과로부터 세포막과 세포 내에서 형성된 아밀로이드 β는 세포 밖으로 분비되며 세포막에 존재하는 여러 수용체에 의해 세포 속으로 다시 유입됨이 보고되었다[1]. 최근 두 논문으로부터 세포 속으로 유입된 아밀로이드 β 가 미토콘드리아나 리소좀에 존재하는 것이 확인되었으며, 유입된 아밀로이드 β가 마이토콘드리아나 리소좀의 역할을 저해시킴으로써 세포의 사멸을 유도한다는 연구가 보고되었다[6,7]. 이전의 연구들을 바탕으로 본 실험에서 B103 세포주의 배양액에 5 μM의 아밀로이드 β를 처리하였을 경우 40 ± 5%의 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 하지만 B103 세포주에 NIa가 발현되고 있을 경우 아밀로이드 β로 의한 세포 사멸 정도가 반정도 감소하는 것을 확인할 수 있었다. NIa 돌연변이체가 발현되는 B103 세포주의 경우 아밀로이드에 의한 세포 사멸이 감소하지 않았다. 이로부터 세포 안에서 발현되는 NIa에 의해 세포 밖에서부터 유도된 아밀로이드 β에 의한 세포 사멸이 의미 있게 감소한다는 결론을 얻었다(도 5B).

2.3 NIa의 세포 속 발현 위치

N 말단에 HA tag으로 표지된 NIa 유전자를 B103 세포주 안에서 발현시킨 후, 그 세포 속 위치를 HA에 의한 항체를 이용하여 면역 형광 염색법을 시행하였다. 염색된 B103 세포를 공초점 형광 현미경을 이용하여 NIa 단백질의 세포 속 위치를 확인하였다. 세포핵이 아닌 세포핵 밖으로 그 신호가 강하게 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 6A). 다른 방법으로 N 말단에 HA tag으로 표지된 NIa 단백질을 발현하는 B103 세포의 소기관들을 세포 소기관 분리 방법을 이용하여 파티큘레이트(particulate) 분획과 수용성(soluble) 분획으로 분리하였다. 이후 각 세포 소기관들의 표지 단백질 항체들, Oct1(핵 마커; Abcam, USA), VDAC2(미토콘드리아 마커; Abcam, USA), 카뎁신 D(리소좀 마커; Abcam, USA), α-튜블린(세포질 마커; Abcam, USA)을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 시행하였다. NIa의 발현을 나타내는 HA 항체의 밴드가 세포질 표지 단백질인 α-튜블린의 신호와 같이 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 6B). 이로부터 NIa 단백질이 세포질 안에 존재하는 것을 확인하였다.

결 론

아밀로이드 β의 축적은 알쯔하이머병 발병과 진행에 핵심적인 역할을 한다. 그러므로 아밀로이드 β의 분해와 제거는 알쯔하이머병을 치료하기 위한 중요한 전략으로 여겨지고 있다. 아밀로이드 β는 세포 외부와 내부 모두에서 발견되고 있으며 최근 여러 실험 기술의 발달로 세포 안에 존재하는 아밀로이드 β의 역할에 많은 관심이 집중이 되고 있는 추세다. 여러 논문들에서 알쯔하이머 실험 생쥐 모델과 알쯔하이머 환자에서 세포 밖의 아밀로이드 플락 형성보다 세포 속 아밀로이드 β의 축적이 시기적으로 앞선다는 연구 결과가 보고되었다[8,9]. 또한 알쯔하이머병을 쉽게 일으키도록 돌연변이된 유전자를 가지고 있는 아밀로이드 전구 단백질(APP, amyloid beta precursor protein)의 아밀로이드 β 형성과정이 정상적인 아밀로이드 전구 단백질의 아밀로이드 β 형성 과정과 다르다는 연구 결과가 보고되었다[10]. 이 논문에 따르면, 정상적인 아밀로이드 전구 단백질로부터 형성된 아밀로이드 β는 빠르게 세포 밖으로 분비되는 반면 알쯔하이머병 유발 인자를 가지고 있는 아밀로이드 전구 단백질로부터 형성된 아밀로이드 β의 경우 세포 밖보다 오히려 세포 안에 더 많이 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 프레제닐린 1(presenilin 1)이 돌연변이된 늙은 쥐에서, 아밀로이드 β의 응집이 세포외액이 아닌 신경세포 안에서 검출되었다[16]. 이러한 연구들로부터 세포 안에 존재하는 아밀로이드 β를 효과적으로 제거하는 것이 알쯔하이머병을 치료하는데 유용한 방법일 것으로 사료된다.

인 비트로 및 인 비보 실험에서 세포질 속에 존재하는 프로테아좀 기능의 억제가 아밀로이드 β의 농도를 높인다는 보고가 있었다[11,12]. 또한 아밀로이드 β의 과잉 생산은 프로테아좀 기능에 과부하를 유도하고 심지어 아밀로이드 β에 의해 직접적으로 프로테아좀의 기능이 억제되는 것이 이전 논문들에서 보고되었다[13]. 알쯔하이머병 환자에서도 프로테아좀의 기능 장애가 확인되었다[14]. 이러한 여러 연구 결과로부터 세포질 속에 존재하는 아밀로이드 β와 그 분해가 알쯔하이머병의 주요 병인일 것으로 유추된다.

본 실험에서는 식물 바이러스에 존재하는 NIa 단백질 분해 효소를 이용하여 알쯔하이머병의 유발인자인 아밀로이드 β의 제거를 시도하였다. 본 실험 결과, 정제된 NIa 단백질이 효과적으로 아밀로이드 β를 분해하였을 뿐만 아니라 백서의 신경아세포종인 B103 세포주에서도 세포 내외부의 아밀로이드 β에 의한 세포 사멸의 정도가 세포질에서 발현된 NIa 단백질 분해 효소에 억제되었음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 세포질이 아밀로이드 β의 독성을 제거하는데 중요한 위치임을 확인할 수 있었다. NIa 단백질 분해 효소를 이용하기 위해서는 동물 모델에서 효과와 그 독성 연구가 선행되어야 하지만, 이전의 알려진 아밀로이드 β 분해 효소의 대부분이 세포막과 세포 소기관 속에 존재하는 것과는 달리 세포질에 존재하는 NIa 단백질 분해 효소가 알쯔하이머병을 치료하기 위한 새로운 방법을 제시해 줄 수 있을 것으로 기대된다.

참조문헌

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3. Iwata N, Mizukami H, Shirotani K, Takaki Y, Muramatsu S, Lu B, et al. Presynaptic localization of neprilysin contributes to efficient clearance of amyloid-beta peptide in mouse brain. J Neurosci, 24(4): 991-8(2004).

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13. Gregori L, Fuchs C, Figueiredo-Pereira ME, Van Nostrand WE, Goldgaber D. Amyloid beta-protein inhibits ubiquitin-dependent protein degradation in vitro. J Biol Chem, 270(34): 19702-8(1995).

14. Keller JN, Hanni KB, Markesbery WR. Impaired proteasome function in Alzheimer's disease. J Neurochem, 75(1): 436-9(2000).

15. Lee EK, Park YW, Shin DY, Mook-Jung I, Yoo YJ. Cytosolic amyloid-beta peptide 42 escaping from degradation induces cell death. Biochem Biophys Res Commun, 344(2): 471-7(2006).

16. Chui DH, Tanahashi H, Ozawa K, Ikeda S, Checler F, Ueda O, et al. Transgenic mice with Alzheimer presenilin 1 mutations show accelerated neurodegeneration without amyloid plaque formation. Nat Med, 5(5): 560-4(1999).

17. Song SM, Lee H, Kam TI, Tai ML, Lee JY, Noh JY, Shim SM, Seo SJ, Kong YY, Nakagawa T, Chung CW, Choi DY, Oubrahim H, Jung YK. E2-25K/Hip-2 regulates caspase-12 in ER stress-mediated Aβ neurotoxicity. J. Cell Biol, 182(4): 675-684(2009).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 아밀로이드 β 염기 서열 및 이 서열 내에 α-세크라타제의 분절 위치(Val-Xaa-His-Gln↓)가 존재함을 보여준다.

도 2A는 E. coli에서 발현 정제된 NIa 프로테아제를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 레인 1, 사이즈 마커(size marker); 레인 2, NIa(10 ㎍).

도 2B는 NIa 프로테아제에 의한 아밀로이드 β 분해를 나타내는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. NEM의 존재 또는 부존재 하에서 Aβ(2.5 μM)를 정제된 NIa 프로테아제(6 ㎍)와 25℃에서 1, 3 및 15시간 동안 반응하였다. 반응 혼합물을 SDS-PAGE에서 분리하여 블롯팅한 후에 항-Aβ 항체(6E10)로 검출하였다.

도 3은 아밀로이드 β의 1-15과 16-42 아미노산 서열에 따른 예상 분자량을 보여준다.

도 4는 NIa 프로테아제에 의한 세포 내 아밀로이드 β의 분해를 관찰한 결과이다. B103 세포주에 pGFPUb-Aβ_1-42(Aβ₄₂)와 공벡터(Mock), pcDNA-HA-NIa(NIa) 또는 pcDNA-HA-mNIa(mNIa)를 각각 함께 트랜스펙션시켰다. 48시간 후에, 세포를 6E10 항체로 면역염색하였다(형광 사진 결과). Aβ-양성 세포(빨간색) 및 GFP-발현 세포(녹색)의 수를 현미경 하에서 카운팅하여 그들의 비율을 측정하였다(막대 그래프 결과).

도 5A는 GFP-발현 세포 중에서 발견되는 죽은 세포들은 현미경 하에서 카운팅한 결과이다. 도 5B는 B103 세포에 공벡터(Mock), pcDNA-HA-NIa(NIa) 또는 pcDNA-HA-mNIa(mNIa)를 트랜스펙션한 후, Aβ(5 μM)를 48시간 동안 처리하여 죽은 세포를 현미경 하에서 카운팅한 결과이다.

도 6A는 pcDNA-HA-NIa로 트랜스펙션된 B103 세포주를 HA 항체로 면역염색하여 공초점 형광 현미경 하에서 관찰한 결과를 나타낸다. 도 6B는 pcDNA-HA-NIa로 트랜스펙션된 B103 세포주를 분별 원심분리를 이용하여 파티큘레이트(particulate) 분획(P)과 수용성 분획(S)으로 분리하였다. 웨스턴 블롯팅을 이용하여 두 분획을 분석하였다. VDAC2, 미토콘드리아 마커; Oct1, 핵 마커;, 카뎁신 D, 리소좀 마커; α-튜블린, 세포질 마커.

<110> GIST <120> Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating a Neurodegenerative Disorder <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Turnip mosaic virus <400> 1 Ser Asn Ser Met Phe Arg Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Asn 1 5 10 15 Asn Ile Cys His Leu Thr Asn Val Ser Asp Gly Ala Ser Asn Ser Leu 20 25 30 Tyr Gly Val Gly Phe Gly Pro Leu Ile Leu Thr Asn Arg His Leu Phe 35 40 45 Glu Arg Asn Asn Gly Glu Leu Val Ile Lys Ser Arg His Gly Glu Phe 50 55 60 Val Ile Lys Asn Thr Thr Gln Leu His Leu Leu Pro Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 Asp Leu Leu Leu Ile Arg Leu Pro Lys Asp Ile Pro Pro Phe Pro Gln 85 90 95 Lys Leu Gly Phe Arg Gln Pro Glu Lys Gly Glu Arg Ile Cys Met Val 100 105 110 Gly Ser Asn Phe Gln Thr Lys Ser Ile Thr Ser Val Val Ser Glu Thr 115 120 125 Ser Thr Ile Met Pro Val Glu Asn Ser Gln Phe Trp Lys His Trp Ile 130 135 140 Ser Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Met Val Ser Thr Lys Asp 145 150 155 160 Gly Lys Ile Leu Gly Leu His Ser Leu Ala Asn Phe Gln Asn Ser Ile 165 170 175 Asn Tyr Phe Ala Ala Phe Pro Asp Asp Phe Ala Glu Lys Tyr Leu His 180 185 190 Thr Ile Glu Ala His Glu Trp Val Lys His Trp Lys Tyr Asn Thr Ser 195 200 205 Ala Ile Ser Trp Gly Ser Leu Asn Ile Gln Ala Ser Gln Pro Ser Gly 210 215 220 Leu Phe Lys Val Ser Lys Leu Ile Ser Asp Leu Asp Ser Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Ala Gln <210> 2 <211> 732 <212> DNA <213> Turnip mosaic virus <400> 2 gagagtaact ccatgttcag agggttgcgt gattacaacc caatatcaaa caacatttgt 60 catctcacaa atgtttcaga tggagcatca aactcgttat atggagtcgg tttcggacca 120 ctcatattaa cgaaccgaca cctctttgag cggaataacg gtgaactcgt aataaaatca 180 cgacatggtg agttcgtgat taaaaacaca actcagctac atttgctacc gattccagac 240 agagatctcc tgctaatccg gttaccaaag gacatcccac cctttccaca gaaattgggt 300 ttcaggcaac ctgagaaggg tgagcgaatc tgcatggtgg ggtccaactt ccaaactaag 360 agcataacga gtgtagtctc tgagactagc acaataatgc cagtggaaaa cagtcagttt 420 tggaaacact ggattagcac gaaagacggc caatgcggaa gtccaatggt gagcacgaaa 480 gacgggaaaa tacttggact acacagccta gcaaacttcc agaattccat taattacttt 540 gctgctttcc cagatgattt tgccgagaag tatctccata ccattgaagc acacgagtgg 600 gtcaagcatt ggaaatataa tactagtgcc atcagctggg gctctttgaa tatacaagca 660 tcgcaaccgt caggtttgtt caaagtaagc aaactaatct cagacctcga cagcacggca 720 gtctacgcac aa 732

Claims (11)

1. NIa(nuclear inclusion a) 프로테아제 또는 NIa 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 또는 노인성 치매(senile dementia) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 NIa 프로테아제는 세포내 또는 세포외 아밀로이드 β를 분해하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 NIa 프로테아제는 세포질에 있는 아밀로이드 β를 분해하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 NIa 프로테아제는 아밀로이드 β에 의한 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 알쯔하이머병은 산발성(후천성) 또는 가족성(선천성) 알쯔하이머병인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

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