KR20090111894A - 세포 투과성 크레아틴 키나아제 융합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 크레아틴 키나아제 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 크레아틴 키나아제 단백질의 일측 또는 양측 말단에 단백질 수송 도메인을 공유결합시킨 융합 단백질을 제조하여 세포 또는 핵 내로 도입시키는 방법 및 융합 단백질을 이용한 약제학적 조성물, 건강기능성 식품에 관한 것이다.
크레아틴 키나아제(creatine kinase), 간질, 세포투과, 단백질 치료, 융합 단백질

Description

세포 투과성 크레아틴 키나아제 융합 단백질{Cell-transducing creatine kinase fusion protein}
본 발명은 크레아틴 키나아제 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 크레아틴 키나아제 단백질의 일측 또는 양측 말단에 단백질 수송 도메인을 공유결합시킨 융합 단백질에 관한 것이다.
간질은 비정상적인 신경 방전에 의한 것으로 알려져 있으나, 그 상세한 병리학적 메카니즘은 알려져 있지 않다.
크레아틴 키나아제(Creatine kinase; 이하 "CK"와 혼용함; EC 2.7.3.2)는 매우 잘 보존된 포스파겐 키나아제 효소 패밀리의 일종으로서, MgATP γ­인산기(phosphoryl group)를 크레아틴으로 전이시키는 가역적 전이 촉매작용을 수행하여 인산크레아틴(phosphocreatine; "PCr")과 MgADP를 생성시킨다. 크레아틴 키나아제는 뉴런, 근육섬유(muscle fibers) 및 정자와 같이 다양하고 높은 APTase 활성이 있는 세포 내에서 에너지 대사에 중요한 역할을 수행한다. 크레아틴 키나아제는 골격근, 심근, 평활근 및 뇌 등에 분포한다 또한, 크레아틴 키나아제는 근질환 또는 심질환 등에서 조직으로부터 혈액 중으로 방출된다. 그리고, 비척추동물과 척추동 물 모두에 널리 분포한다(1-3). 최근 포유동물 조직에는 네 종류의 크레아틴 키나아제 아이소자임이 있는 것으로 밝혀졌다. 두 종류의 세포질 크레아틴 키나아제 서브유니트 즉, 뇌에는 뇌 크레아틴 키나아제(B-CK), 그리고 근육에는 근육 크레아틴 키나아제(M-CK), 이들은 결합하여 근육 및 뇌 아이소자임을 형성한다. 미토콘드리아 내막에 위치하는 두 종류의 효소(사코미어 Mi-CK와 유비쿼터스 Mi-CK)가 있다. 또한, 이들 인간 근육, 뇌 및 미토콘드리아 CK cDNA들은 모두 높은 유사성을 나타내며, 약 40kDa의 단백질을 코딩한다.
크레아틴 키나아제가 몇몇 신경질환의 상태를 나타내는 중요한 임상 마커라는 것은 잘 알려져 있다. 뇌 기능의 개발과 조절을 유지하기 위해서는 에너지가 필수적이므로, Ck 활성 변화는 뇌에서 신경 손실을 일으키는 신경퇴화의 중요한 단계를 나타낸다. 몇몇 연구결과는 신경퇴화 질환에서 CK 활성이 현저히 감소하였음을 보여주었다. 뿐만 아니라, CK 기능의 산화적 변형 및 손상은 신경 퇴화 질환의 CK 활성 손실에 기여하는 것으로 보인다.
간질은 비정상적 신경방전에 의한 만성 질환이다. 흥분성 전달(excitatory transmission)과 억제성 전달(inhibitory transmission) 간의 불균형이 간질의 가장 일반적인 원인으로 생각된다.
생체 내 고분자들을 치료목적으로 이용하려는 관심이 매우 높아지고 있다. 현재 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료법이다. 그러나 유전자 치료법은 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 인위적으로 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위 적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 나타낸다.
치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시킴에 있어 세포막을 거쳐 목표 단백질을 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
최근에, 사람 면역결핍 바이러스 (Hunan Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(transactivator of transcription) 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(Protein Transduction Domain)의 특성 때문에 나타나며 아직 그 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다. 그러나 Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해하고 있다. 이것은 Tat 단백질이 세포막을 통과하여 모든 종류의 세포 내로 투과할 수 있음을 의미한다.
그러나, 모든 단백질이 Tat 단백질 수송 도메인과 융합 단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 세포 내로 투과된 Tat 융합 단백질들이 세포 내에서 활성을 나타내지 않는다는 사례들이 종종 논문으로 발표된 바 있다.
본 발명의 목적은 간질 등의 신경질환, 근질환 및 심장질환 치료 및 예방에 유용한 크레아틴 키나아제 단백질을 세포 내로 효율적으로 도입할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 간질 등 신경질환, 근질환 및 심장질환 예방 또는 치료제로서 사용가능한 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 세포 투과성 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 주요성분으로 포함하는 신경질환, 근질환 및 심장질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하려는 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 상기 세포 투과성 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 신경질환, 근질환 및 심장질환 예방 및 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하려는 것이다.
본 발명자들은 최근 프로테오믹스 분석을 통하여 간질 동물모델에서 크레아틴 키나아제 단백질 발현과 효소 활성이 현저히 감소하는 것을 발견하였다. 그리하여 본 발명자들은 인간 크레아틴 키나아제 유전자를 HIV-Tat 펩타이드 유전자와 융합하여 Tat-크레아틴 키나아제(이하 "Tat-CK"와 혼용함) 융합 단백질을 제조하였다. 정제된 Tat-CK 융합 단백질은 배양배지에 가했을 때 시간- 및 투여량- 의존적으로 PC12 세포에 효과적으로 도입되었다. 또한, 일단 세포 내로 도입된 Tat-CK 융 합 단백질은 세포 내 크레아틴 키나아제 활성을 현저히 증가시켰다. 이러한 결과는 Tat-CK 융합 단백질이 간질을 비롯한 크레아틴 키나아제 관련 질환 즉, 신경질환, 근질환 및 심장질환치료목적으로 이용할 수 있음을 제시한다.
본 발명은 인간 크레아틴 키나아제를 효과적인 방법으로 단백질 수준에서 세포 내로 직접 투과시키는 실험적 보고이다.
간질, 알쯔하이머, 파킨슨병 등의 신경질환, 근질환 및 심장질환을 회복하는데 있어서 주된 역할을 담당하는 크레아틴 키나아제를 세포 내 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 단백질 치료에 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질이 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)의 Tat 단백질이 이형 단백질을 세포 내로 이동시키는데 운반체로써 이용될 수 있다는 것이 여러 연구자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 이러한 Tat 단백질이 파킨슨병, 간질, 알쯔하이머 등의 신경질환 및 근질환, 심장질환에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 크레아틴 키나아제을 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질이 세포 내에서 단백질의 기능을 나타내는지를 알아보고자 수행하였다.
본 발명자들은 먼저 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-크레아틴 키나아제 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 크레아틴 키나아제, Tat 형질도입 부위의 9개 아미노산(Tat 49-57), 그 리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다(도 1).
이 발현벡터를 이용하여 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다(도 4). 세포 내로 투과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질은 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되었다(데이터 표시하지 않음).
이러한 결과는 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 크레아틴 키나아제의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 크레아틴 키나아제 융합 단백질은 알쯔하이머, 간질 및 신경질환의 예방 및 치료에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.
Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 포함하여 수송도메인 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.01㎍~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머, 간질, 파킨슨병을 비롯한 다양한 신경질환, 근질환, 심장질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하는 신경질환, 근질환, 심장질환의 예방과 개선에 유용한 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.
본 발명은 또한 크레아틴 키나아제 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 크레아틴 키나아제 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 aa 49-57의 아홉 개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 1과 같은 아미노산 서열로 이루어진 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 1의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질, 이 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합 단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 건강 기능성 식품 등에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 크레아틴 키나아제를 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 크레아틴 키나아제을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-크레아틴 키나아제", "크레아틴 키나아제 융합 단백질" 또는 "Tat-CK"와 혼용하였다.
"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 크레아틴 키나아제 단백질을 의미한다.
"융합 단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의 미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 "수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 크레아틴 키나아제의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명에서 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질의 그 아미노산 서열이 서열번호 7과 같은 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 크레아틴 키나아제 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 6과 같은 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 크레아틴 키나아제 융합 단백질 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 간질, 알쯔하이머 등 신경질환의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하며, 간질, 알쯔하이머 등 신경질환의 예방 및 개선 효과가 있는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 9~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 크레아틴 키나아제 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) 크레아틴 키나아제 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.
예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 크레아틴 키나아제 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.
이하, 본 발명의 구성을 아래의 실시예의 기재를 통하여 좀더 상세히 알아본다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명하다.
재료 및 방법
< 실시예 1: 재료>
제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머라아제는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드(plasmid)는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로아세트산 세파로즈 수퍼플로우는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 크레아틴 키나아제 cDNA는 PCR 방법으로 사람 뇌 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 토끼 항-히스티딘 폴리클론 항체는 Santa Cruz Biotechnology company(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.
< 실시예 2: Tat -크레아틴 키나아제 융합 단백질 발현벡터의 제조 및 형질변환>
Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 생산하기 위하여 우선, HIV-1 Tat의 염기성 도메인(아미노산 49-57)이 포함된 pET-Tat 발현벡터를 만들었다. Tat 염기성 도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(상위 쇄, 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'; 하위 쇄, 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3')를 NdeI - XhoI 제한효소로 자른 pET15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 크레아틴 키나아제의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'-CTCGAGATGCCCTTCTCCAACAGC-3'로 Xho I 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머(reverse primer)의 서열은 5'-GGATCCTCATTTCTGGGCAGGC-3'로 BamH I 제한부위가 있다.
중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환반응기(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였으며, 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 튜브(siliconized reaction tube)에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 그리고 74℃에서 1분 30초간, 72℃에서 5분간 최종 연장(final extension)을 30회 반복 유도하였다. PCR 수행 후 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결하였다. 이어 이 벡터를 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다. 인간 크레아틴 키나아제 cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho Ⅰ과 BamH Ⅰ로 절단한 다음 HIV-1 Tat 발현 벡터에 삽입하였다. Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질로 형질변환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 Tat-크레아틴 키나아제의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 Tat-크레아틴 키나아제는 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.
< 실시예 3: 재조합 Tat -크레아틴 키나아제 융합 단백질의 정제>
형질전환된 E. coli BL21을 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 250rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM되게 한 다음 3 시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5㎖ 결합 완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)에 6M 우레아를 첨가하여 초음파 파쇄하였다.
원심분리하여 상청액을 즉시 2.5㎖ Ni2 +-니트릴로아세트산 세파로즈 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(0.5M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD10 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.
< 실시예 4: 세포배양 및 재조합 Tat -크레아틴 키나아제 융합 단백질의 세포 내 투과>
PC12 세포는 ATCC에서 구입하였고, 37℃에서 95% 공기와 5% CO2를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH(pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% 열변성 말 혈청, 5% 열변성 우태혈청(fetal bovine serum; "FBS") 및 항생제(100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)이 포함된 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
Tat-크레아틴 키나아제의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, 세포를 6-웰 플레이트에서 충분히 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하 고 여러 농도의 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 1시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏 분석으로 비교 측정하였다.
< 실시예 5: 웨스턴 블랏 분석>
Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 세포 내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏팅 방법을 수행하였다. 준비된 세포에 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 농도 및 시간별로 처리한 다음, 세포들만 모아서 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 탈지분유가 들어 있는 TBS(Tris buffered saline)로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Santa Cruze, USA, 1:500)로 1시간 실온에서 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 염소 항-래빗 IgG 항체(Sigma, 1:10,000 희석)와 한 시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL 시스템(ECL; Amersham)을 이용하여 크레아틴 키나아제 단백질 띠를 확인하였다.
< 실시예 6: 크레아틴 키나아제 효소 활성 측정>
크레아틴 키나아제 효소 활성은 크레아틴 키나아제 키트(Diagnostica Merck)를 이용하여 제조자의 지시서에 따라 측정하였다(Choi, H., Park, C. S., Kim, B. G., Cho, J. W., Park, J. B., Bae, Y. S. and Bae, D. S. (2001) Creatine kinase B is a target molecule of reactive oxygen species in cervical cancer. Mol . Cells 12, 412-417, Alterio, J., Courtois, Y., Robelin, J., Bechet, D. and Martelly, I. (1990) Acidic and basic fibroblast growth factor mRNAs are expressed by skeletal muscle satellite cells. Biochem . Biophysic . Res . Commun . 166, 1205-1212).
< 실시예 7: 형광 현미경 관찰>
형광물질 표지된 단백질을 직접 탐지하기 위하여 EZ-표지 FITA(Fluorescein isothiocyanate) 단백질 표지 키트(PIERCE, Rockford, USA)로 제조자의 지시서에 따라 정제 Tat-CK 융합 단백질을 표지하였다. PC12 세포는 글라스 커버슬립 상에서 배양하여 3μM Tat-CK 융합 단백질로 한 시간 동안 37℃에서 처리하였고, PBS 처리한 트립신-EDTA로 세척하였다. 형광 분포는 Zeiss Axiophot 형광형미경으로 관찰하였다.
결과 1) Tat -크레아틴 키나아제 융합 단백질의 과대발현 및 정제
Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 과대 발현시키기 위하여 크레아틴 키나아제, Tat의 형질 도입부위(Tat 49-57) 및 6개의 히스티딘에 대한 cDNA가 연속적 으로 포함되어 있는 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질 발현 벡터를 개발하였다(도 1). 융합 단백질에 대한 대조 단백질인 크레아틴 키나아제을 과대 발현시키기 위하여 Tat의 형질 도입부위(Tat 49-57)만 포함되지 않고 나머지 부위는 동일한 크레아틴 키나아제 발현 벡터를 개발하였다.
IPTG로 융합 단백질의 과대 발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파로 파쇄한 다음, 원심분리하여 상청액의 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분리하였다. 융합 단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합 단백질을 순수하게(순도 〉95%) 정제하였다(도 2A). 정제된 융합 단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한 번 확인하였다(도 2B).
정제된 CK 융합 단백질은 146.2units/㎎의 특이활성을 나타내었다. Towler et al.은 정제된 재조합 CK 단백질이 140.6units/㎎의 특이활성을 나타내는 것을 발표한 사실이 있다(Towler, E. M., Wilson, L. K., Zhou, Y. C., Ma, T. S. and Fisher, R. J. (2000) A complete system for identifying inhibitors of creatine kinase B. Anal . Biochem . 279, 96-99). 나아가, 상기 재조합 CK 단백질은 정제된 인간 뇌 조직보다 50% 높은 특이 활성을 나타내었다. 본 발명의 결과는 정제된 Tat-CK 융합 단백질이 동일한 효소 활성을 나타냄을 말해준다.
결과 2) Tat -크레아틴 키나아제 융합 단백질의 PC12 세포 투과
Tat-CK 융합단백질의 PC12 세포로의 투과는 직접형광법으로 확인하였다. 포름알데하이드에 의한 세포고정이 Tat-CK 세포 도입에 영향을 미칠 가능성을 배제하기 위하여 FITC-표지된 Tat-CK 융합단백질을 포정하지 않은 PC12 세포로 도입하였다. 도 3과 같이, 토끼 항-히스티딘 폴리클론 항체를 이용한 면역형광염색으로 Tat-CK 융합 단백질이 세포 내로 투과되었음을 나타내었고, 반면 Tat-CK 융합 단백질을 처리하지 않은 세포는 형광 신호가 없었다. 또한, 세포고정시킨 세포의 형광 신호는 고정시키지 않은 세포의 형광 신호와 유사하였다(데이터 기재하지 않음). 이러한 결과들은 세포 고정이 Tat-CK 융합 단백질의 세포 투과에 필수적이지 않음을 나타낸다.
결과 3) Tat - CK 융합 단백질의 시간별, 농도별 세포 투과 및 활성
정제한 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 신경 세포 내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 4A, 4B에 나타낸 것처럼 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 신경 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 4A는 농도별(1~3μM) 및 시간별(15~60분)로 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 PC12 세포 배양액 내에 처리하였을 때의 결과이다. Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 세포 내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 투여 15분 이내에 투과된 융합 단백질을 확인할 수 있었고, 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투 과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 양이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로부터 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 일어남을 알 수 있었다.
세포 내로 투과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질은 상당 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 세포 내로 투과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소하였으나, 최소 48시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다(데이터 나타내지 않음).
또한, 농도 및 시간 의존적으로 세포 내로 투과된 Tat-CK 융합 단백질은 도 4A 및 도 4B의 하단 그래프와 같이 농도 및 시간 의존적으로 활성이 증가하였다. 이러한 결과는 Tat-CK 융합 단백질이 PC12 세포 내로 효과적으로 투과되어 CK 활성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 따라서 세포 내로 투과된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질은 최소 48시간은 안정성을 유지하고 충분한 활성을 나타내고 있기 때문에 간질이나 알쯔하이머, 파킨슨병 등 신경질환, 근질환, 심장질환의 예방 및 치료에 응용할 수 있다.
도 1은 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질 발현 벡터의 개략도. Tat-크레아틴 키나아제 발현 벡터의 구조는 pET-15b 벡터를 기본으로 하였다. 합성 HIV Tat(aa 49-57) 올리고머가 pET-15b의 NdeⅠ, XhoⅠ 제한부위 내로 클론되고, 사람 크레아틴 키나아제 cDNA가 pET-15b의 XhoⅠ, BamHⅠ 제한부위 내로 클론되었다. 얻어진 벡터는 "pTat-CK"로 명명하였다. 발현은 IPTG를 가하여 유도되었다.
도 2는 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 발현과 이콜라이 세포의 단백질 추출물에서의 정제를 나타내는 사진. 정제된 융합 단백질은 12% 젤 상에서 SDS-PAGE로 분석하였고(A), 웨스턴 블랏팅하였다(B).
도 3은 PC12 세포 내로 FITC-표지된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 세포 도입한 사진(B) 및 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 처리하지 않은 사진(A).
도 4는 PC12 세포로 도입된 Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 안정성을 실험한 결과이다. 1~3μM Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 배양 배지에 60분 동안 가하였다(A). 3μM Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질을 각각 15~60분 동안 배양 배지에 가하였다. Tat-크레아틴 키나아제 융합 단백질의 세포 도입은 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.
<110> Industry Academic Foundation Corporation, Hallym University <120> CELL-TRANSDUCING CREATINE KINASE FUSION PROTEIN <130> hallymU-tatCK <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagatgc ccttctccaa cagc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatcctcat ttctgggcag gc 22 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding sequence which consists of HIV Tat coding sequence and human creatine kinase cDNA sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1176) <400> 6 agg aag aag cgg aga cag cga cga aga ctc gag atg ccc ttc tcc 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Claims (8)

  1. 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 크레아틴 키나아제의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 크레아틴 키나아제 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 크레아틴 키나아제 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 7과 같은 것을 특징으로 하는 크레아틴 키나아제 융합 단백질.
  4. 크레아틴 키나아제 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 6과 같은 것을 특징으로 하는, 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  6. 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 제4항 또는 제5항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 크레아틴 키나아제 융합 단백질 발현벡터.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 신경질환, 근질환 또는 심장질환의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 크레아틴 키나아제 융합 단백질을 유효성분으로 하며, 신경질환, 근질환 또는 심장질환의 예방 및 개선 효과가 있는 건강 기능성 식품 조성물.
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