KR100472939B1 - 세포침투성 티에이티-피리독살 카이네이즈 융합단백질 및그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 방어메카니즘에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 피리독살 카이네이즈(PK)를 세포 내로 운반하고 세포 내에서 활성을 가지도록 하기 위하여 HIV-1 Tat 단백질과 융합시킨 융합단백질 Tat-PK, 이 융합단백질 Tat-PK를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이 융합단백질을 제조하는 벡터 및 이 융합단백질을 세포 내로 도입시키는 방법 및 그 용도에 관한 것으로서, Tat-PK 융합단백질은 의약 조성물 등의 용도로 유용하다.

Description

세포침투성 티에이티-피리독살 카이네이즈 융합단백질 및 그 용도{Cell-transducing HIV-1 Tat-pyridoxal kinase fusion protein and use of the fusion protein}

본 발명은 세포침투성 피리독살 카이네이즈(pyridoxal kinase; 이하 본 명세서에서 "PK"와 혼용하였음, 동일한 의미임)의 융합단백질, 이 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드, 이 융합단백질의 발현벡터 및 티에이티-피리독살 카이네이즈 융합단백질을 세포 내로 도입하는 방법 및 그 용도에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 재조합 벡터를 이용하여 피리독살 카이네이즈의 N말단측에 6개의 히스티딘 잔기와 9개의 HIV-1 Tat 단백질이 결합된 융합단백질을 제조, 정제함으로써 높은 효율로 세포 내로 투과되어 세포 내에서 활성을 가지는 피리독살 카이네이즈에 관한 것이다.

뇌 조직에서 피리독살-5' 포스페이트(pyridoxal-5'phosphate; PLP)는 비타민 B6인 피리독신을 전구체로 하여 피리독신-5'포스페이트 옥시데이즈와 피리독살 카이네이즈(pyridoxal(PL) kinase)의 효소 촉매 작용에 의하여 합성되는 중요한 물질이다.

피리독살-5' 포스페이트는 생체조직에서 아미노산, 탄수화물, 단백질, 지방 그리고 핵산의 메타볼리즘에 관여하는 효소 반응의 조효소로 관여할 뿐만 아니라 만일 비타민 B6가 부족되면 대사에 이상이 생기거나 의학적인 문제가 발생한다. 예를 들면, 아미노산 대사에서 본다면 피리독살-5' 포스페이트는 아민전이(transamination), 즉 아스파테이트 트랜스아미네이즈(aspartate transaminase), GABA 트랜스아미네이즈 등에 의한 아민 전이, 글루타메이트 디카복실레이즈, 도파 디카복실레이즈 등에 의한 디카복실레이션, 디설퓨레이션(desulfuration), 트랜스설퓨레이션(transsulfuration) 그리고 아민 산화반응(amine oxidation reactions) 등의 조효소로서 역할을 한다.

특히 뇌기능에서 피리독살-5' 포스페이트의 중요성은 도파민, 세로토닌, 에피네프린, 트립타민, 티라민, 히스타민, GABA 그리고 타우린 등과 같은 신경전달물질(neurotransmitter)로 알려진 모든 화합물의 합성이나 이화작용(catabolism)에 관여한다는 사실이다. 그러므로 비타민 B6 결핍증의 병리현상의 경우 성장이 지연되고 원형 탈모증(alopecia), 빈혈(anemia) 등을 유발시킨다.

또한, 중추신경계에서 이러한 신경전달물질 합성효소들의 생리적 항상성의 유지가 매우 중요하기 때문에 중추신경계에서 비타민 B6 결핍은 발작(seizures)과 경련(convulsions) 등의 이상을 보이기도 하고, PLP 의존적 효소들의 이상은 직·간접적으로 간질병(Epilepsy), 파킨슨병(Parkinsonism), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 우울증(Depression) 등의 신경이상증세를 야기시킨다.

비타민 B6 즉 피리독신으로부터 PLP를 생성하는 과정은 다음에서 보듯이 2단계 반응에 의하여 일어나는데 위에서 언급된 PLP의 중요성에 의하여 PNP 옥시데이즈와 피리독살 카이네이즈에 대한 연구는 신경생화학적이나 신경생리학적으로 매우 중요한 일이다.

PNP 옥시데이즈

(a) PNP + O₂ ------------------> PLP + H₂O₂

피리독살 카이네이즈

(b) 피리독살 + ATP ----------------------> PLP + ADP

Zn⁺⁺

피리독살 카이네이즈(Pyridoxal kinase)는 ATP, 피리독살(pyridoxal), 그리고 2가 양이온(Zn⁺⁺)으로부터 PLP로의 생성을 촉매시켜 주는 매우 중요한 효소로서 소, 양들의 뇌조직들부터 정제되어 왔다. 피리독살 카이네이즈의 촉매 활성은 뇌조직 슬라이스(brain slices)에 세포외 비타민 B6 농도가 축적되는 메카니즘과 밀접한 관계가 있으며, 또다른 비타민 B6 메타볼리즘의 피리독살 카이네이즈 억제제를 실험동물에 투여하면 경련같은 신경증적 이상증세를 일으킨다는 보고도 있다.

또한 최근에는 다운 증후군 환자의 혀의 경우 피리독살 카이네이즈의 활성도가 증가한다는 보고도 있다.

피리독살 포스페이트 등의 단백질을 인체 세포 내로 도입시키는 것에 대한 연구가 많은 연구자들에 의해 활발히 진행되고 있다.

이중 가장 주목받고 있는 것은 유전자 치료분야이다. 그러나 유전자 치료는 유전자를 세포 내로 운반하는 방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현율이 낮고, 발현되는 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧으며, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 지니고 있다[Verma, I.M. and Somia, N.(1997) Nature 389, 239-242].

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어서 또 다른 방법으로 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 치료용 약물이나 단백질은 그 크기 또는 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 힘들다. 일반적으로 분자량 600 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근 인간 면역결핍 바이러스(Hunan Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(transactivator of transcription) 단백질은 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(Protein Transduction Domain)의 특성때문에 나타나며 아직 그 정확한 메카니즘은 알려지지 않은 상태이다[Frankel, A.D. and Pabo, C.O.(1988) Cell 55, 1189-1193. Green, M. and Loewenstein, P.M.(1988) Cell 55, 1179-1188. Ma, M. and Nath, A.(1997) J. Virol. 71, 2495-2499. Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B.(1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017.]. 그러나, Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 Tat 단백질의 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해되고 있다[ Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B.(1997) J. Biol. Chem. 272, 16010-16017. Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A.(1996) J. Biol. Chem. 271, 18188-18193.].

최근의 연구에서, 오브알부민(ovalbumin), β-갈락토시다아제 (galactosidase), 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 같은 이형단백질을 HIV-1 Tat 단백질과 융합시켜 투여하였을 때 생체 각 조직 및 배양된 세포 내로 직접 운반된다는 것을 보여 주었다[Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore, C., Chen, L.L., Pepinsky, B. and Barsoum, J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668. Schwartze, S.R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. and Dowdy, S.F.(1999) Science. 285, 1569-1572. Watson, K. and Edward, R.J. (1999) Biochem. Pharmacol. 58, 1521-1528]. 이러한 실험결과는 Tat 단백질이 자신뿐만 아니라 다른 종류의 거대한 단백질도 세포 내로 함께 운반할 수 있는 능력을 갖고 있다는 것을 의미한다.

그러나, 실제 모든 단백질이 Tat 단백질에 의해 운반되는 것은 아니다. 또한, Tat에 의해 세포 내로 운반된 모든 단백질이 생물학적 활성을 나타내는지도 아직 확실히 밝혀지지 않은 상태이다.

본 발명은 피리독살 카이네이즈를 세포 내로 도입하거나 발현시킴에 있어서 종래 기술의 문제점을 해결하고 고효율로 세포 내로 도입시키고 세포 내에서 활성을 가지도록 하려는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 Tat 단백질의 단백질 형질도입 부위와 피리독살 카이네이즈를 융합시켜 이 융합단백질이 효과적으로 세포 내로 투과되는지를 PC12 세포를 이용한 실험에서 확인하였다. 또한, Tat-피리독살 카이네이즈 융합단백질을 다량 생산하는 방법 및 정제하는 방법을 개발하였다.

본 발명은 생체 방어메카니즘에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 피리독살 카이네이즈(PK)를 세포 내로 운반하고 세포 내에서 활성을 가지도록 하기 위하여 HIV-1 Tat 단백질과 융합시킨 융합단백질 Tat-PK, 이 융합단백질 Tat-PK를 제조하는 벡터, 이 벡터를 이용하여 융합단백질을 생산하는 방법 및 정제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 융합단백질 Tat-PK를 이용한 약제 조성물을 제공한다.

이를 위하여 Tat-PK 융합단백질을 과다 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-PK 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터 (pET-Tat-PK)는 사람 피리독살 카이네이즈, Tat 형질도입부위의 9개 아미노산 (Tat 49-57) 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘(histidine) 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.

이 발현벡터를 이용하여 Tat-PK 융합단백질을 대장균에서 과다 발현시켰으며 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피(metal-chelating affinity chromatography)법으로 쉽고 편리하게 정제하였다.

본 발명의 Tat-PK 융합단백질은 유전자 재조합 방법 외에도 일반적인 화학결합 방법으로 제조할 수 있다.

Tat-PK 융합단백질은 배양된 HeLa 세포에 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 확인하였다.

Tat-PK 융합단백질을 처리한 세포에서 PK 효소의 활성은 세포 내로 운반된 단백질의 양에 비례하여 증가하였다. 이러한 결과는 Tat이 PK를 세포 내로 이동시켜 세포 내 PK의 활성도를 인위적으로 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명은 피리독살 카이네이즈의 아미노 말단에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57)가 공유결합된 세포침투성 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피리독살 카이네이즈 cDNA의 5'측에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57) 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항의 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6 또는 그의 등가물 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포침투성 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질을 발현시키며, 예컨대 도 1b의 제한지도와 같이 구성되는 벡터에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 상기 Tat-피리독살 카이네이즈 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 성장 지연, 원형 탈모증(alopecia), 빈혈(anemia), 발작(seizures), 경련(convulsions), 간질병(Epilepsy), 파킨슨병(Parkinsonism), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 우울증(Depression)과 같은 PK 의존성 질환 중 1종의 치료제로서 사용되는 것을 특징으로 하며, Tat-피리독살 카이네이즈 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.당업자들은 본 발명이 서열번호 7의 Tat 피리독살 카이네이즈 융합단백질 아미노산 서열 및 서열번호 6의 Tat 피리독살 카이네이즈 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에만 한정되는 것이 아님을 분명히 알 수 있다. 예컨대, Sambrook 등(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1. pp.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))이 정의한 바와 같이, 본 발명이 Tat 피리독살 카이네이즈 융합단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션할 수 있는 그러한 DNA 또는 RNA 서열도 포함된다는 것을 분명히 이해하고 있을 것이다.따라서, 본 발명에 의해 해석되는 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 발명 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션하는 서열 및 유전암호의 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 상기 개시한 방법에 의해 제조된 Tat 피리독살 카이네이즈 융합단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.본 발명은 Tat 피리독살 카이네이즈 융합단백질 아미노산 서열(서열번호 7)뿐만 아니라, silent change에 따라 서열내에서 다른 아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. silent change란 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있음을 말한다. 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다.즉, 유전자 서열의 "기능적 등가물"이란 동일한 아미노산 서열로 번역되는 유전자 서열들을 의미하며, 또한, 아미노산 서열의 "기능적 등가물"이란 예컨대, 서열 내의 아미노산들이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산들로 치환되어 동등한 기능을 수행할 수 있는 아미노산 서열들을 의미한다.

본 명세서에서는 피리독살 카이네이즈 단백질을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

Tat-PK 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001~100 ㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료

DNA 서브클로닝(subcolning)에 사용한 택 폴리머라아제(Tag polymerase), T4 리가아제(ligase), 제한효소(restriction enzyme) 등은 Takara에서 구입하였고, Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. 재조합 단백질 정제를 위한 히스티딘 결합 금속 킬레이팅 수지와 컬럼은 Novagen에서 구입하였다. 그리고 니켈 설페이트(nikel sulfate)와 이미다졸 등은 Sigma사에서 구입하였다.

박테리아 형질전환에 이용한 대장균 균주는 본 실험실에서 보유하고 있던 것이며, 단백질 발현을 위해 대장균 JM109(DE3) 균주를 사용하였으며 미생물 배지의 박토트립톤(Bacto tryptone), 효모추출물(yeast extract), 한천 등은 Difco 제품을 사용하였다. 세포 배양에 필요한 배지는 Gibco 제품을 사용하였고 인간 피리독살 카이네이즈 DNA는 PCR 방법으로 인간 뇌조직 PK cDNA에서 증폭시켰다. 그리고 이밖의 모든 시약은 특급 제품을 사용하였다.

PK 효소활성도 측정

피리독살 5' 포스페이트(PLP)의 생성속도는 PLP의 최대흡광파장인 388nm에서 흡광도의 변화를 측정함으로서 얻어진다(388 = 4900 cm^-1M^-1 at pH7). 표준 어세이 혼합액(Standard assay mixture)은 피리독살(0.1 mM), ATP(0.1 mM), ZnCl₂(0.05 mM) 을 포함한 0.07mM 인산칼륨(pH 6.5) 완충액에 피리독살 카이네이즈를 가함으로서 initial rate를 측정한다.

웨스턴 블랏 분석

본 발명의 실시예에서 웨스턴 블랏 분석은 피리독살 카이네이즈에 대한 단일클론항체 mAbs PK67, PK86, PK91, PK144, PK252, PK275를 이용하여 행하였다.

세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기이동법으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 TBS(Tris-bufferes saline) 5 % 탈지분유 용액으로 처리하고, 트윈(Tween) 20이 함유된 TBS로 세번 세척하였다. 그 후 멤브레인은 정제된 항PK 단일클론 항체로 1시간 상온에서 처리하였다. 세척후 멤브레인을 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 결합된 고우트 안티-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG) 항체(Sigma, 1:5,000 희석)와 1시간동안 반응시켰다. 최종적으로 알칼린 포스파타아제 연결된 기질 킷트(alkaline phosphatase conjugate substrate kit)(Bio-Rad, USA)를 처리하여 단일클론항체에 반응하는 단백질 밴드를 확인하였다.

<실시예 1> Tat-PK의 발현과 정제

Tat-PK 융합단백질을 과다 발현시키기 위하여 피리독살 카이네이즈(pyridoxal kinase; PK), HIV-1 Tat의 형질 도입부위(Tat49-57) 및 6개의 히스티딘에 대한 cDNA가 연속적으로 포함되어 있는 pET-Tat-PK 발현 벡터를 제조하였다 (Fig. 1A). 융합단백질에 대한 대조 단백질인 PK를 과다 발현시키기 위하여 Tat의 형질 도입부위 (Tat49-57)만 포함되지 않고 나머지 부위는 동일한 pET-PK 발현 벡터를 제조하였다.

먼저, Tat-PK 융합단백질을 생산하기 위하여 HIV-1 Tat의 기본 도메인(basic domain, 즉 아미노산 49-57)이 포함된 pET-Tat 발현벡터를 만들었다.

Tat 기본 도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(상위 쇄(top strand), 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'; 하위 쇄(bottom strand), 5'-TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3')를 NdeI-XhoI 제한효소로 자른 pET15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어 인간 Cu,Zn-SOD의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 2종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'-CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG-3' 로 Xho I 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머(reverse primer)의 서열은 5'-GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTAC-3' 로 BamH I 제한부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 thermal cycler(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였으며, 반응 혼합액을 50 ㎕ 실리콘 튜브(siliconized reaction tube)에 넣고 94℃에서 5 분간 가열하였다. PCR 반응은 94℃에서 50초간 연장(extension), 68℃에서 1분간 변성(denaturation), 72℃에서 1분간 어닐링(annealing)을 30회 반복하였고, 그리고 72℃에서 10분, 37℃에서 3분간 최종 연장(final extension)을 유도하였다. PCR 수행후 아가로즈 젤 전기이동(agarose gel electrophoresis)으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 결찰하였다. 이어 이 벡터를 형질변환용 세포(competent cell)에 형질변환(transformation)시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균 방법(alkaline lysis method)으로 분리하였다[Sambrook, J., Fritsch, F.E. and Maniatis, T (1989) Molecular cloning, Cold spring harbor laboratory press, Cold spring harbor]. 사람 PK cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho I 과 BamH I로 절단한 다음 pET-15b 및 pET-15b-Tat 발현 벡터에 삽입하였다(도 1b). 벡터의 발현은 T7 프로모터와 lacO-오퍼레이터의 조절 하에 있다.

pPK와 pET-Tat-PK로 형질변환된 E. coli BL21(DE3), JM109(Pharmacia)를 선택한 다음, 콜로니(colony)를 100ml 앰피실린이 함유된 LB 배지에 접종하고 IPTG (1.0 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 PK와 Tat-PK의 과다 발현을 유도하였다. 발현된 융합단백질 Tat-PK와 대조단백질로 사용한 PK의 모식도는 도 1a에 나타내었다.

IPTG로 융합단백질의 과다 발현을 유도한 대장균 세포를 5∼6M 우레아가 함유된 결합 완충액 내에서 프렌치 프레스(french press), 초음파 처리로 파쇄, 용균한 다음, 융합단백질 Tat-PK가 들어 있는 Ni²⁺-NTA 세파로즈 컬럼에 로딩하여 10배의 결합 완충액과 6배의 세척 완충액으로 세척한 후 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 융합 단백질이 용출되었다. 융합단백질은 PD10컬럼(Amersham)을 이용하여 염을 제거하였다. 분획 내의 단백질 농도는 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 BSA를 스탠다드로 하여 덴시토미터 분석으로 정량하였다. 단백질 농도는 브래드포드 어세이(Braford, 1976; Biorad)로 정량하였다. 정제된 PK 융합단백질은 25% 글리세롤이 함유된 PBS에 용해시켜 -70℃에 보관하였다.

과다 발현된 PK와 Tat-PK는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기이동(도 2a)과 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

도 3a,b,c는 대장균(BL21 DE3, JM109)에서의 Tat-PK의 발현과 정제에 관한 것이다. 도 3a는 6시간동안 1mM IPTG에 의하여 유도되었다. 각 레인은 다음과 같다.

레인 1,3: JM109, 레인 2,4: BL21

레인 3,4: 발현된 pPK의 용출액, 레인 1,2: 발현된 pTat-PK 용출액

도 3b는 니켈-세파로즈 컬럼으로 정제한 pTat-PK(레인 1)와 pPK(레인 2)를 15% SDS-PAGE로 분석한 것이다.

도 3c는 상기 도 3b에서 얻은 밴드를 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: pTat-PK, 레인 2: pPK.

<실시예 2> PC12 세포배양 및 재조합 Tat-PK의 세포 내 투과, 농도별 시간별 활성도의 변화

PC12 세포는 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% 말혈청(horse serum), 열변성된 5% 우태혈청(FBS) 및 항생제(100㎎/ml 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)가 포함된 RPMI1640 배지에서 37℃로 배양하였다.

Tat-PK의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여 PC12 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간동안 배양한 뒤 FBS가 포함되지 않은 1∼1.5ml의 신선한 RPMI1640 또는 DMEM 배양액으로 교체하고 여러 농도의 재조합 Tat-PK를 배양액 내에 처리하였다. 37℃에서 2∼4시간 배양한 후 세포는 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 2∼3회 세척하고, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 37℃에서 10∼12분 처리하였다. 세포를 거두어 세포 추출물을 제조한 후 효소 어세이와 웨스턴 블랏 분석에 사용하였다.

도 4a는 6웰 플레이트에 위치한 포유동물 세포(PC12)에 pTat-PK, pPK를 2ｕM , 4시간 처리한 결과이다. 레인 1: PC12 세포 추출물, 레인 2, 3: pTat-PK 융합단백질, 레인 4, 5: pPK 융합단백질.

도 4b는 배양된 PC12 세포 내로 Tat-PK를 농도(dose) 별로 투과시킨 결과이다. 도 4c는 상기 도 4b를 분광기로 분석하여 활성도를 그래프화한 것이다.

도 5a, b는 배양된 PC12 세포 내로 Tat-PK를 시간별로 투과시킨 결과를 이다.

도 6a는 배양된 PC12 세포 내로 투과된 Tat-PK 융합단백질의 시간 경과에 따른 활성도 변화를 웨스턴 블랏 분석한 것이다. Tat-PK 융합단백질은 4ｕM 선처리한 것이다. 도 6b는 상기 도 6a의 결과를 분광기로 효소 분석(enzyme assay)한 것이다.

<실시예 3> 비타민 B6(피리독살)로 처리한 PC12세포의 효소 활성도에 대한 융합 단백질 세포 도입의 효과

1∼2ｕM 피리독살로 선처리한 세포를 세시간동안 배양한 후 5ｕM Tat-PK 융합 단백질을 가하여 세시간동안 배양하였다. 각 레인은 다음과 같다.

레인 1: PC12세포 추출물, 레인 2: 1mM 피리독살,

레인 3: pTat-PK(5ｕM ), 레인 4: pTat-PK(5ｕM )+1mM 피리독살,

레인 5: pTat-PK(5ｕM )+2mM 피리독살.

결과는 도 7에 나타내었다.

<실시예 4> 비타민 B6족(피리독살, 피리독사민, 피리독신)을 처리한 PC12 (HeLa) 세포에서의 효소 활성에 있어서 융합단백질 세포 내 도입의 효과

Tat-PK의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여 PC12 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 배양한 뒤 FBS가 포함되지 않은 1∼1.5ml의 신선한 RPMI1640 또는 DMEM 배양액으로 교체하고 여러 농도의 재조합 Tat-PK를 배양액 내에 처리하였다. 37℃에서 2∼4시간 배양한 후 세포는 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 2∼3회 세척하고, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 37℃에서 10∼12분 처리하였다. 세포를 거두어 세포 추출물을 제조한 후 효소 어세이와 웨스턴 블랏 분석에 사용하였다.

도 8에 결과를 나타내었다. 도면 중의 약자 PL, PN, PM은 각각 피리독살, 피리독신, 피리독사민을 나타낸다. 세포를 1ｕM씩의 PL, PN, PM으로 3시간 선처리한 후 5ｕM Tat-PK 융합 단백질을 가하여 세시간 배양하고, 세포 내로 도입된 단백질의 양을 분석하였다(참고로, 도면의 하얀 기둥은 비타민 B6처리를 하지 않은 것을 말한다).

본 발명은 사람 피리독살 카이네이즈(PK)를 단백질 수준에서 세포 내로 직접 투과시키는 최초의 실험적 보고이다.

특히, 세포 내로 투여된 Tat-PK는 농도 및 시간 의존적으로 세포 내에서 활성을 나타내었다.

또한, 본 발명은 도 7의 결과로부터 실제로 융합단백질 Tat-PK가 포유류의 세포 내에서 피리독살의 생체 내 작용에 관여함을 제시하고, 단백질 치료에 Tat-PK가 효율적으로 활용될 수 있음을 제시한다.

본 발명은 신경계에서 중요한 역할을 담당하는 PK를 세포 내로 투여함으로써 질환을 치료하는 단백질 치료에 Tat-PK가 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1a는 융합단백질 Tat-PK와 대조군 PK의 모식도이다.

도 1b는 pET15b 벡터를 이용한 Tat-PK 발현벡터(pTat-PK)의 제조방법을 개시한 제한지도이다.

도 2a는 대장균에서 PK를 발현시킨 후 쿠마시 블루로 염색한 것이다.

M: 사이즈 마아커, pPK: pPK 벡터가 들어 있는 세포의 파쇄액

도 2b는 PK를 발현시킨 후 사람 뇌 PK에 대한 여러 가지 단일클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석한 것이다.

레인 1: 단일클론항체 PK67, 레인 2: 단일클론항체 PK86,

레인 3: 단일클론항체 PK91, 레인 4: 단일클론항체 PK144,

레인 5: 단일클론항체 PK252, 레인 6: 단일클론항체 PK275.

도 3a,b,c는 대장균(BL21 DE3, JM109)에서의 Tat-PK의 발현과 정제에 관한 것이다.

도 3a는 6시간동안 1mM IPTG에 의하여 유도되었다.

레인 1,3: JM109, 레인 2,4: BL21

레인 3,4: 발현된 pPK의 용출액, 레인 1,2: 발현된 pTat-PK 용출액

도 3b는 니켈-세파로즈 컬럼으로 정제한 pTat-PK(레인 1)와 pPK(레인 2)를 15% SDS-PAGE로 분석한 것이다.

도 3c는 상기 도 3b에서 얻은 밴드를 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: pTat-PK, 레인 2: pPK

도 4a는 6웰 플레이트에 위치한 포유동물 세포(PC12)에 pTat-PK, pPK를 2ｕM , 4시간 처리한 결과이다.

레인 1: PC12 세포 추출물, 레인 2, 3: pTat-PK 융합단백질,

레인 4, 5: pPK 융합단백질.

도 4b는 배양된 PC12 세포 내로 Tat-PK를 농도(dose) 별로 투과시킨 결과이다.

도 4c는 상기 도 4b를 분광기로 분석하여 활성도를 그래프화한 것이다.

도 5a는 배양된 PC12 세포 내로 Tat-PK를 시간별로 투과시킨 결과이다.

도 5b는 상기 도 5a를 분광기로 분석하여 활성도를 그래프화한 것이다.

도 6a는 배양된 PC12 세포 내로 투과된 Tat-PK 융합단백질의 시간 경과에 따른 활성도 변화를 웨스턴 블랏 분석한 것이다. Tat-PK 융합단백질은 4ｕM 선처리한 것이다.

도 6b는 상기 도 6a의 결과를 분광기로 효소 분석(enzyme assay)한 것이다.

도 7은 비타민 B6(피리독살)로 처리한 PC12세포의 효소 활성도에 대한 융합 단백질 세포 도입의 효과를 나타낸 것이다. 1∼2ｕM 피리독살로 선처리한 세포를 세시간동안 배양한 후 5ｕM Tat-PK 융합 단백질을 가하여 세시간동안 배양하였다.

레인 1: PC12세포 추출물, 레인 2: 1mM 피리독살,

레인 3: pTat-PK(5ｕM ), 레인 4: pTat-PK(5ｕM )+1mM 피리독살,

레인 5: pTat-PK(5ｕM )+2mM 피리독살.

도 8은 비타민 B6 패밀리(피리독살, 피리독사민, 피리독신)로 처리하였을 때 PC12세포의 효소활성에 융합단백질 도입이 미치는 영향을 나타낸 것이다.

PL: 피리독살, PN: 피리독신, PM: 피리독사민.

세포를 1ｕM의 PL, PN, PM으로 3시간 선처리한 후 5ｕM Tat-PK 융합 단백질을 가하여 세시간 배양하였다.

도 9는 Tat-PK의 뉴클레오타이드 서열 및 제한효소 반응부위를 나타낸 것이다.

<110> CHOI, SOO YOUNG PARK, JIN-SEU KANG, JUNG-HOON KWON, Oh-Shin BAEK, Nam-In CHO, Sung-Woo LEE, Kil Soo <120> Cell-transducing HIV-1 Tat-pyridoxal kinase fusion protein and use of the fusion protein <130> WJTJ-TATPK <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctcgaggcga cgaaggccgt gtgcgtg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggatccttat tgggcgatcc caattac 27 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 979 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence which consists of HIV Tat coding sequence and human pyridoxal kinase cDNA sequence <220> <221> CDS <222> (2)..(970) <400> 6 t agg aag aag cgg aga cag cga cga aga ctc gag atg gag gag 43 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Glu Glu 1 5 10 gag tgc cgg gtg ctc tcc ata cag agc cac gtc atc cgc ggc tac gtg 91 Glu Cys Arg Val Leu Ser Ile Gln Ser His Val Ile Arg Gly Tyr Val 15 20 25 30 ggc aac cgg gcg gcc acg ttc ccg ctg cag gtt ttg gga ttt gag att 139 Gly Asn Arg Ala Ala Thr Phe Pro Leu Gln Val Leu Gly Phe Glu Ile 35 40 45 gac gcg gtg aac tct gtc cag ttt tca aac cac aca ggc tat gcc cac 187 Asp Ala Val Asn Ser Val Gln Phe Ser Asn His Thr Gly Tyr Ala His 50 55 60 tgg aag ggc caa gtg ctg aat tca gat gag ctc cag gag ttg tac gaa 235 Trp Lys Gly Gln Val Leu Asn Ser Asp Glu Leu Gln Glu Leu Tyr Glu 65 70 75 ggc ctg agg ctg aac aac atg aat aaa tat gac tac gtg ctc aca ggt 283 Gly Leu Arg Leu Asn Asn Met Asn Lys Tyr Asp Tyr Val Leu Thr Gly 80 85 90 tat acg agg gac aag tcg ttc ctg gcc atg gtg gtg gac att gtg cag 331 Tyr Thr Arg Asp Lys Ser Phe Leu Ala Met Val Val Asp Ile Val Gln 95 100 105 110 gag ctg aag cag cag aac ccc agg ctg gtg tac gtg 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Glu Glu Glu Cys 1 5 10 15 Arg Val Leu Ser Ile Gln Ser His Val Ile Arg Gly Tyr Val Gly Asn 20 25 30 Arg Ala Ala Thr Phe Pro Leu Gln Val Leu Gly Phe Glu Ile Asp Ala 35 40 45 Val Asn Ser Val Gln Phe Ser Asn His Thr Gly Tyr Ala His Trp Lys 50 55 60 Gly Gln Val Leu Asn Ser Asp Glu Leu Gln Glu Leu Tyr Glu Gly Leu 65 70 75 80 Arg Leu Asn Asn Met Asn Lys Tyr Asp Tyr Val Leu Thr Gly Tyr Thr 85 90 95 Arg Asp Lys Ser Phe Leu Ala Met Val Val Asp Ile Val Gln Glu Leu 100 105 110 Lys Gln Gln Asn Pro Arg Leu Val Tyr Val Cys Asp Pro Val Leu Gly 115 120 125 Asp Lys Trp Asp Gly Glu Gly Ser Met Tyr Val Pro Glu Asp Leu Leu 130 135 140 Pro Val Tyr Lys Glu Lys Val Val Pro Leu Ala Asp Ile Ile Thr Pro 145 150 155 160 Asn Gln Phe Glu Ala Glu Leu Leu Ser Gly Arg Lys Ile His Ser Gln 165 170 175 Glu Glu Ala Leu Arg Val Met Asp Met Leu His Ser Met Gly Pro Asp 180 185 190 Thr Val Val Ile Thr Ser Ser Asp Leu Pro Ser Pro Gln Gly Ser Asn 195 200 205 Tyr Leu Ile Val Leu Gly Ser Gln Arg Arg Arg Asn Pro Ala Gly Ser 210 215 220 Val Val Met Glu Arg Ile Arg Met Asp Ile Arg Lys Val Asp Ala Val 225 230 235 240 Phe Val Gly Thr Gly Asp Leu Phe Ala Ala Met Leu Leu Ala Trp Thr 245 250 255 His Lys His Pro Asn Asn Leu Lys Val Ala Cys Glu Lys Thr Val Ser 260 265 270 Thr Leu His His Val Leu Gln Arg Thr Ile Gln Cys Ala Lys Ala Gln 275 280 285 Ala Gly Glu Gly Val Arg Pro Ser Pro Met Gln Leu Glu Leu Arg Met 290 295 300 Val Gln Ser Lys Arg Asp Ile Glu Asp Pro Glu Ile Val Val Gln Ala 305 310 315 320 Thr Val Leu

Claims (6)

1. 피리독살 카이네이즈의 아미노 말단에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57)가 공유결합된 서열번호 7의 세포침투성 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질.
2. 피리독살 카이네이즈 cDNA의 5'측에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57) 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항의 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6 또는 그의 기능적 등가물 재조합 폴리뉴클레오타이드.
3. 상기 제1항의 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 제2항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포침투성 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질을 발현시키는 벡터.
4. 제3항에 있어서, 발현벡터는 도 1b의 제한지도와 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 세포침투성 Tat-피리독살 카이네이즈 융합 단백질을 발현시키는 벡터.
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