KR20120035566A - 세포 투과성 ｒｐＳ3 융합 단백질을 포함하는 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 rpS3와 단백질 수송도메인이 공유결합된 rpS3 융합 단백질을 형성함으로써 세포에 적용시킬 때 용이하게 신경세포 내로 투과 가능한 rpS3 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군과 비교할 때 원활히 세포 내로 침투하며, 세포 내에서 48시간 이상 지속되었고, 신경세포 사멸을 억제하고, 신경세포를 회복시키는 효과를 거두었다.

Description

세포 투과성 ｒｐＳ3 융합 단백질을 포함하는 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물{A pharmaceutical composition containing cell-transducing rpS3 fusion protein for preventing and treating neurological disorders}

본 발명은 세포 투과성 ｒｐｓ3 융합 단백질을 포함하는 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병 (Parkinson's diseases; PD)은 대뇌의 흑질 (substantia nigra)에 존재하는 도파민성 신경세포 (dopaminergic neuron)가 소실되는 퇴행성 신경질환으로 점진적인 도파민의 결핍으로 인하여 운동기능에 장애를 나타나게 되며 대표적으로 떨림 (tremor), 경직 (rigidity), 체위 (postuer), 그리고 서행 (bradykinesia) 등의 증상을 특징으로 한다. 파킨슨병은 인류복지 향상과 함께 인구의 노령화가 가속화되면서 알쯔하이머병(Alzheimer's disease; AD) 및 근위축성 측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis; ALS)과 더불어 대표적인 퇴행성 신경질환으로 발병빈도가 점진적으로 높아지고 있는 실정이다.

rpS3(Ribosomal proteinS3)는 리보솜의 구성성분으로 40S 서브유닛의 외부 표면에 위치하며 개시인자(initiation factor) eIF2와 eIF3에 교차연결(cross-link)되어 있다. rpS3는 N-말단 부위에 핵 위치화 신호(nuclear localization signal)를 가지고 있는데, 이것은 rpS3의 세포질에서의 기능과 핵에서의 회복(repair) 기능을 가지고 있다는 것을 의미한다. 또한, 많은 리보솜 단백질들은 복제, 전사, RNA 프로세싱, DNA 회복(repair), 악성 형질전환(malignant transformation) 등의 두 번째 기능을 가지고 있다. 그러나, 지금까지 rpS3와 파킨슨병과의 연관관계에 대한 연구가 활발히 진행되고 왔지만 도파민 결핍의 정확한 원인에 대해서는 아직 확실하게 밝혀지지 않은 상태이다.

파킨슨병의 치료 및 예방 가능성이 NAC(N-acethyl-cystein), DTT(dithiothreitol), GSH, 비타민 C 및 비타민 E와 같은 항산화제의 투여 및 처리에 의해 억제된다는 것이 알려짐으로써 항산화제가 파킨슨병의 치료 및 예방용 약학 조성물로서 사용될 가능성이 제시되었다. 이러한 항산화제들은 인비트로(in vitro) 상에서는 신경세포의 손상을 보호하는 효과가 보고되었지만, 세포 내 투과가 어렵기 때문에 실제로 파킨슨병의 치료 및 예방 물질로 효과적이지 않은 것으로 보인다.

현재 질병 치료 분야에서 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 가지 문제점이 있다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600 달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 PEP-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. PEP-1 펩타이드는 21개의 아미노산 (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 3개의 도메인 (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain)을 갖고 있다. 지금까지, PEP-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 PEP-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 종류의 단백질이 PEP-1에 의해 세포 내로 운반되는지는 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다.

따라서, 본 발명은 상기 파킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성 측삭경화증 등 신경세포 사멸로 인한 신경질환의 효과적인 예방제 또는 치료제를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 사람 rpS3 단백질에 융합시켰고, 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 융합 단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 세포 내로 운반되는 것을 배양된 신경 세포 및 조직 실험을 통하여 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 신경 세포 내로 운반되며 생물학적인 활성 즉, 활성산소종 및 파킨슨병 유발물질에 의한 세포사멸을 효과적으로 보호함을 밝혀냈다.

좀더 구체적으로 설명하면, 본 발명자들은 먼저 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 rpS3 융합 단백질 발현벡터를 제조하였다. 이 발현벡터는 인간 rpS3 cDNA, PEP-1 펩타이드 (21 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni^{2 +}-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. 과대발현 및 정제된 rpS3 융합 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 정제된 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 배양된 신경세포에 원활하게 운반되는 것을 형광염색으로 확인하였고, 세포 내로 투과된 rpS3 융합 단백질은 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다. 또한 세포 내로 투과된 rpS3 융합 단백질은 H₂O₂ 및 MPP⁺에 의한 세포사멸을 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다.

이러한 결과는 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 rpS3 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성rpS3 융합 단백질은 산화 스트레스 및 파킨슨병과 관련하여 신경세포의 보호 등 퇴행성 신경질환 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.

세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태, 경구투여 형태 등으로 제형화할 수 있다. 예컨대, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 피하 투여, 근육 투여 또는 경구투여, 정맥 투여 등으로 투여할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명자들은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 신경세포에 침투실험한 결과, 세포에 원활하게 침투하고, 신경세포 사멸을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 약제 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 rpS3 단백질을 신경세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 rpS3 단백질 분자의 세포내 전달은 rpS3에 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 PEP-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, PEP-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일?유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경질환 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

" 세포 투과성 rpS3 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 rpS3 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 rpS3를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-rpS3", "rpS3 융합 단백질" , "세포 투과성 rpS3 융합 단백질" 또는 "PEP-rpS3"와 혼용하였다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 구체적으로 본 발명에서는 신경세포를 의미한다.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 PEP-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.

본 명세서의 "목표 단백질"은 PEP-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미하며, 구체적으로는 rpS3를 의미한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 rpS3 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) rpS3 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인이 rpS3 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 rpS3 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포 투과성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 PEP-1 단백질 수송 도메인과 융합한 rpS3 융합 단백질은 신경 세포 내로 원활히 운반되며, 세포 내에서 최소 48시간 이상 그 활성을 유지하며, 활성산소종 및 파킨슨병 유발물질에 의한 신경세포의 사멸을 효과적으로 보호함을 확인하였다.

도 1은 PEP-1-rpS3 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 발현된 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 정제 및 웨스턴 블랏팅한 결과이다. 세포에서 추출한 단백질 추출물 및 정제한 단백질을 12% SDS-PAGE로 전개하여 쿠마시 브릴리언트 블루로 단백질 염색하였고(A), 항-래빗 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏팅하였다(B). A와 B에서 각 레인은 다음과 같다. 레인 1: 유도되지 않은 pPEP-1-rpS3, 레인 2: 유도된 pPEP-1-rpS3, 레인 3: 정제된 pPEP-1-rpS3.
도 3은 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 세포 도입 . (A)는 2μM의 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 60분간 배양 배지에 가한 것이고, (B)는 1~60시간 2μM의 PEP-1-rpS3 융합 단백질로 미리 처리한 세포를 형광 현미경과 웨스턴 블랏으로 분석한 것이다.
도 4는 H₂O₂ 또는 MPP⁺에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포사멸에 대한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 효과를 나타내는 그래프이다. SH-SY5Y 세포 생존율은 MTT 어세이로 측정하였다.
도 5는 신경세포 사멸에 관한 세포 내로 도입된 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 효과를 나타내는 사진이다. 사진은 각각 흑질(substantia nigra; SN) 대조군과 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) 처리한 마우스의 흑질 및 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 도입한 마우스의 흑질을 TH-면역염색한 것이다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 세포 투과성 rpS3 융합 단백질로서 "PEP-1-rhEGF" 융합 단백질을 위주로 실시예 및 그 결과를 기재하였으나, rpS3 단백질의 C-말단에 PEP-1이 공유결합된 rpS3-PEP-1 융합 단백질(서열번호 9) 및 rpS3의 N-말단과 C-말단에 PEP-1이 공유결합된 PEP-1-rpS3-PEP-1 융합 단백질(서열번호 11)도 "rpS3 융합 단백질" 범주에 속하며, 각 실시예에서 "PEP-1-rpS3" 융합 단백질과 거의 유사한 정도(85~100%)의 결과를 나타내었다.

<재료>

제한 효소와 T4 DNA 연결효소(ligase)는 Promega (USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머레이즈는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로삼아세트산 세파로즈 슈퍼플로우(Ni-nitrilo- triactic acid sepharose superflow)는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 rpS3(ribosomal protein S3) cDNA는 중합효소 연쇄반응 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

< 실시예 1: PEP -1- rpS3 융합 단백질 발현벡터 제조 및 형질변환>

세포 내로 목표 단백질인 인간 rpS3 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였다.

먼저, PEP-1-rpS3 융합 단백질을 생산하기 위해 PEP-1 펩타이드 (KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV; 21 아미노산)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. PEP-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드 (위쪽 사슬, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'; 아래쪽 사슬, 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3')를 Nde-Xho 제한효소로 자른 pET-15b에 연결(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 rpS3 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'-CTCGAGATGGCAGTGCAAATATCCAAGAAG-3'로 Xho I 제한부위를 포함하고 있으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 5'-GGATCCTTATGCTGTGGGGACTGGCTGGGG-3'로 BamHI 제한부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환기(thermal cycler, Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 반응튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결한 다음, 세포(competent cell)를 형질변환시키고, 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다. 사람 rpS3 cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho과 BamH로 절단한 다음 PEP 발현 벡터에 삽입하였다. PEP-1-rpS3로 형질변환된 E. coli BL21 (DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

"rpS3-PEP-1" 융합 단백질 및 "PEP-1-rpS3-PEP-1" 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터(서열번호 8 및 서열번호 10)도 위와 유사한 방법으로 제조하였다.

<실시예 2: PEP -1- rpS3 융합 단백질 발현 및 정제>

본 연구실에서 제조한 인간 rpS3 cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21 (DE3) 세포 (PEP-1-rpS3)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200 rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5와 1 mM 되게 한 다음 30℃에서 12 시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5㎖ 결합 완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni^{2 +}-니트릴로삼아세트산 세파로즈 슈퍼플로우 (Ni^{2 +}-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.

< 실시예 3: 신경세포 배양 및 PEP -1- rpS3 융합 단백질의 세포 투과>

신경세포(SH-SY5Y, 인간 신경아세포종(human neuroblastoma))는 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO₃, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제 (100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.

PEP-1-rpS3 융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, PEP-1-rpS3 융합 단백질(2μM)를 배양액 내에 처리하였다. 1 시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA (Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수 (phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하였다. 세포 내로 투과된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 형광염색을 통하여 확인하였다.

< 실시예 4: 웨스턴 블랏 >

PEP-1-rpS3의 세포내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질은 자연상태로 정제하였다. 준비된 세포에 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 처리한 다음 1시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 나이트로셀룰로스 막을 5% 탈분유(non-dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 막은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체 (Santacruze, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗 IgG 항체 (1:10,000 희석)와 1 시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit (ECL; Amersham) 을 이용하여 사람 rpS3 단항체에 반응하는 단백질 밴드를 확인하였다.

< 실시예 5: 신경세포로 투과된 PEP -1- rpS3 융합 단백질의 안정성>

세포 내로 투과된 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 세포 내 안정성을 측정하기 위하여, 신경세포를 6-웰 플레이트에서 4~6 시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 1 시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서 시간별 (1~60 시간)로 세포를 모아 세포 내에 남아 있는 융합 단백질의 양과 활성을 웨스턴 블랏과 활성도 분석으로 측정하였다.

< 실시예 6: 세포사멸 억제 분석 ( MTT assay )>

신경세포에 PEP-1-rpS3 융합 단백질(2μM)을 1시간 처리한 후 위와 같은 방법으로 세척하였다. 그런 다음 H₂O₂ (450 uM)을 6 시간 처리, 배양하여 세포사멸 억제 효능을 MTT 분석으로 측정하였다. 또한 같은 방법으로 MPP⁺ (4.5 mM)를 17 시간 처리한 후 MTT 분석으로 세포사멸에 대한 보호기능을 확인하였다.

< 실시예 7: 면역조직염색( Immunohistochemistry )>

PEP-1-rpS3 융합 단백질이 파킨슨병(PD) 동물모델에서 효능을 확인하기 위해 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, 20mg/kg)를 2 시간 간격으로 4번 주사하여 파킨슨병 동물모델을 제조하였다. 또한 PEP-1-rpS3 융합 단백질 (2mg/kg)을 MTPT를 처리하기 하루 전에 주사하였다. 그런 다음 1 주일 뒤 면역조직염색으로 보호효능을 확인하였다.

결과 1) PEP -1- rpS3 융합 단백질의 과대발현 및 정제

PEP-1-rpS3 융합 단백질을 과대발현시키기 위해 사람 rpS3 cDNA, PEP 펩타이드 (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV; 21 아미노산) 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 PEP-1-rpS3 발현 벡터를 제조하였다(도 1).

IPTG로 융합 단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 PEP-1-rpS3의 과대발현과 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 단백질 밴드(도 2A)와 웨스턴 블랏으로 확인한 밴드(도 2B)이다. 도 2A의 레인 2는 0.5 mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합 단백질을 나타내고 있으며, 대조군인 레인 1 (pET-15b 벡터)과 비교하여 매우 높은 농도의 융합 단백질이 과대발현되었음을 잘 보여주고 있다.

PEP-1-rpS3 융합 단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피 (immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합 단백질을 자연상태로 순수하게 (순도 >95%) 정제할 수 있었다(도 2A). 레인 3은 정제된 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 쿠마시 브릴리언트 ㅂ브블루로 염색하여 확인한 결과이다.

과대발현 및 정제된 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한 번 확인하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 rpS3 또는 6x 히스티딘 항체에 반응하는 PEP-1-rpS3 밴드는 도 2A의 단백질 밴드와 동일한 위치에서 관찰되었다.

결과 2) PEP -1- rpS3 융합 단백질 신경세포로 투과

자연 상태에서 정제한 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 신경 세포 내 투과를 형광염색으로 확인하였다. 도 3A에 나타낸 것처럼 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 세포 내로 투과됨을 확인하였다. 또한 세포 내로 투과된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 3B에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소하였으나, 최소 48 시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 최소 48 시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질 치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.

결과 3) PEP -1- rpS3 융합 단백질의 생물학적 기능

신경 세포 내로 투과된 융합 단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료(protein therapy)에 응용할 수 있다. 따라서, 세포 내로 투과된 융합 단백질이 어느 정도 생물학적인 활성을 지니는지는 매우 중요한 문제이다. 그리하여 정제된 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 생물학적 기능을 알아보기 위해 H₂O₂ 및 MPP⁺에 의해 유발되는 세포사멸을 MTT 어세이를 이용하여 확인하였다. 정제한 PEP-1-rpS3 융합 단백질을 신경 세포에 다양한 농도 (0.5~2μM)로 60분 동안 37℃에서 처리한 후 H₂O₂ (450 uM)을 6 시간, MPP⁺ (4.5 mM)을 17 시간 처리한 후 MTT 어세이로 세포사멸에 대한 보호기능을 확인하였다(도 4). MTT 어세이를 수행한 결과 도 4에서 보여주듯이 H₂O₂ 및 MPP⁺에 의한 세포사멸을 PEP-1-rpS3 융합 단백질이 보호하고 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD) 동물모델에서 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 효능을 확인하기 위해 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 처리하여 PD 동물모델을 제조하여 PEP-1-rpS3 융합 단백질의 효능을 조직염색을 통하여 확인하였다. 도 5에서 보여주듯이, PEP-1-rpS3 융합 단백질은 MPTP에 의한 신경세포사멸을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 PEP-1-rpS3 융합 단백질이 세포 및 동물모델에서 H₂O₂ 및 MPP⁺에 의한 세포사멸을 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 PEP-1-rpS3 융합 단백질은 파킨슨 질환을 비롯한 신경 질환에 대한 새로운 질환치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> A pharmaceutical composition containing cell-transducing rpS3 fusion protein for preventing and treating neurological disorders <130> inipat-hallym-rps3 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 1 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 3 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of human ribosomal protein S3 <400> 4 ctcgagatgg cagtgcaaat atccaagaag 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of human ribosomal protein S3 <400> 5 ggatccttat gctgtgggga ctggctgggg 30 <210> 6 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polynucleotide coding PEP-1-rpS3 fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(798) <400> 6 atg aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg acc gaa tct cag ccg aaa 48 Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 aaa aaa cgt aaa gtg ctc gag atg gca gtg caa ata tcc aag aag agg 96 Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Met Ala Val Gln Ile Ser Lys Lys Arg 20 25 30 aag ttt gtc gct gat ggc atc ttc aaa gct gaa ctg aat gag ttt ctt 144 Lys Phe Val Ala Asp Gly Ile Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu 35 40 45 act cgg gag ctg gct gaa gat ggc tac tct gga gtt gag gtg cga gtt 192 Thr Arg Glu Leu Ala Glu Asp Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val 50 55 60 aca cca acc agg aca gaa atc att atc tta gcc acc aga aca cag aat 240 Thr Pro Thr Arg Thr Glu Ile Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn 65 70 75 80 gtt ctt ggt gag aag ggc cgg cgg att cgg gaa ctg act gct gta gtt 288 Val Leu Gly Glu Lys Gly Arg Arg Ile Arg Glu Leu Thr Ala Val Val 85 90 95 cag aag agg ttt ggc ttt cca gag ggc agt gta gag ctt tat gct gaa 336 Gln Lys Arg Phe Gly Phe Pro Glu Gly Ser Val Glu Leu Tyr Ala Glu 100 105 110 aag gtg gcc act aga ggt ctg tgt gcc att gcc cag gca gag tct ctg 384 Lys Val Ala Thr Arg Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu 115 120 125 cgt tac aaa ctc cta gga ggg ctt gct gtg cgg agg gcc tgc tat ggt 432 Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Gly Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly 130 135 140 gtg ctg cgg ttc atc atg gag agt ggg gcc aaa ggc tgc gag gtt gtg 480 Val Leu Arg Phe Ile Met Glu Ser Gly Ala Lys Gly Cys Glu Val Val 145 150 155 160 gtg tct ggg aaa ctc cga gga cag agg gct aaa tcc atg aag ttt gtg 528 Val Ser Gly Lys Leu Arg Gly Gln Arg Ala Lys Ser Met Lys Phe Val 165 170 175 gat ggc ctg atg atc cac agc gga gac cct gtt aac tac tac gtt gac 576 Asp Gly Leu Met Ile His Ser Gly Asp Pro Val Asn Tyr Tyr Val Asp 180 185 190 act gct gtg cgc cac gtg ttg ctc aga cag ggt gtg ctg ggc atc aag 624 Thr Ala Val Arg His Val Leu Leu Arg Gln Gly Val Leu Gly Ile Lys 195 200 205 gtg aag atc atg ctg ccc tgg gac cca act ggt aag att ggc cct aag 672 Val Lys Ile Met Leu Pro Trp Asp Pro Thr Gly Lys Ile Gly Pro Lys 210 215 220 aag ccc ctg cct gac cac gtg agc att gtg gaa ccc aaa gat gag ata 720 Lys Pro Leu Pro Asp His Val Ser Ile Val Glu Pro Lys Asp Glu Ile 225 230 235 240 ctg ccc acc acc ccc atc tca gaa cag aag ggt ggg aag cca gag ccg 768 Leu Pro Thr Thr Pro Ile Ser Glu Gln Lys Gly Gly Lys Pro Glu Pro 245 250 255 cct gcc atg ccc cag cca gtc ccc aca gca ta a 801 Pro Ala Met Pro Gln Pro Val Pro Thr Ala 260 265 <210> 7 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Met Ala Val Gln Ile Ser Lys Lys Arg 20 25 30 Lys Phe Val Ala Asp Gly Ile Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu 35 40 45 Thr Arg Glu Leu Ala Glu Asp Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val 50 55 60 Thr Pro Thr Arg Thr Glu Ile Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn 65 70 75 80 Val Leu Gly Glu Lys Gly Arg Arg Ile Arg Glu Leu Thr Ala Val Val 85 90 95 Gln Lys Arg Phe Gly Phe Pro Glu Gly Ser Val Glu Leu Tyr Ala Glu 100 105 110 Lys Val Ala Thr Arg Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu 115 120 125 Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Gly Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly 130 135 140 Val Leu Arg Phe Ile Met Glu Ser Gly Ala Lys Gly Cys Glu Val Val 145 150 155 160 Val Ser Gly Lys Leu Arg Gly Gln Arg Ala Lys Ser Met Lys Phe Val 165 170 175 Asp Gly Leu Met Ile His Ser Gly Asp Pro Val Asn Tyr Tyr Val Asp 180 185 190 Thr Ala Val Arg His Val Leu Leu Arg Gln Gly Val Leu Gly Ile Lys 195 200 205 Val Lys Ile Met Leu Pro Trp Asp Pro Thr Gly Lys Ile Gly Pro Lys 210 215 220 Lys Pro Leu Pro Asp His Val Ser Ile Val Glu Pro Lys Asp Glu Ile 225 230 235 240 Leu Pro Thr Thr Pro Ile Ser Glu Gln Lys Gly Gly Lys Pro Glu Pro 245 250 255 Pro Ala Met Pro Gln Pro Val Pro Thr Ala 260 265 <210> 8 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding rpS3-Pep-1 fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(789) <400> 8 atg gca gtg caa ata tcc aag aag agg aag ttt gtc gct gat ggc atc 48 Met Ala Val Gln Ile Ser Lys Lys Arg Lys Phe Val Ala Asp Gly Ile 1 5 10 15 ttc aaa gct gaa ctg aat gag ttt ctt act cgg gag ctg gct gaa gat 96 Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Thr Arg Glu Leu Ala Glu Asp 20 25 30 ggc tac tct gga gtt gag gtg cga gtt aca cca acc agg aca gaa atc 144 Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val Thr Pro Thr Arg Thr Glu Ile 35 40 45 att atc tta gcc acc aga aca cag aat gtt ctt ggt gag aag ggc cgg 192 Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn Val Leu Gly Glu Lys Gly Arg 50 55 60 cgg att cgg gaa ctg act gct gta gtt cag aag agg ttt ggc ttt cca 240 Arg Ile Arg Glu Leu Thr Ala Val Val Gln Lys Arg Phe Gly Phe Pro 65 70 75 80 gag ggc agt gta gag ctt tat gct gaa aag gtg gcc act aga ggt ctg 288 Glu Gly Ser Val Glu Leu Tyr Ala Glu Lys Val Ala Thr Arg Gly Leu 85 90 95 tgt gcc att gcc cag gca gag tct ctg cgt tac aaa ctc cta gga ggg 336 Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Gly 100 105 110 ctt gct gtg cgg agg gcc tgc tat ggt gtg ctg cgg ttc atc atg gag 384 Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly Val Leu Arg Phe Ile Met Glu 115 120 125 agt ggg gcc aaa ggc tgc gag gtt gtg gtg tct ggg aaa ctc cga gga 432 Ser Gly Ala Lys Gly Cys Glu Val Val Val Ser Gly Lys Leu Arg Gly 130 135 140 cag agg gct aaa tcc atg aag ttt gtg gat ggc ctg atg atc cac agc 480 Gln Arg Ala Lys Ser Met Lys Phe Val Asp Gly Leu Met Ile His Ser 145 150 155 160 gga gac cct gtt aac tac tac gtt gac act gct gtg cgc cac gtg ttg 528 Gly Asp Pro Val Asn Tyr Tyr Val Asp Thr Ala Val Arg His Val Leu 165 170 175 ctc aga cag ggt gtg ctg ggc atc aag gtg aag atc atg ctg ccc tgg 576 Leu Arg Gln Gly Val Leu Gly Ile Lys Val Lys Ile Met Leu Pro Trp 180 185 190 gac cca act ggt aag att ggc cct aag aag ccc ctg cct gac cac gtg 624 Asp Pro Thr Gly Lys Ile Gly Pro Lys Lys Pro Leu Pro Asp His Val 195 200 205 agc att gtg gaa ccc aaa gat gag ata ctg ccc acc acc ccc atc tca 672 Ser Ile Val Glu Pro Lys Asp Glu Ile Leu Pro Thr Thr Pro Ile Ser 210 215 220 gaa cag aag ggt ggg aag cca gag ccg cct gcc atg ccc cag cca gtc 720 Glu Gln Lys Gly Gly Lys Pro Glu Pro Pro Ala Met Pro Gln Pro Val 225 230 235 240 ccc aca gca aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg acc gaa tct cag 768 Pro Thr Ala Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Ser Gln 245 250 255 ccg aaa aaa aaa cgt aaa gtg 789 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 260 <210> 9 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 9 Met Ala Val Gln Ile Ser Lys Lys Arg Lys Phe Val Ala Asp Gly Ile 1 5 10 15 Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Thr Arg Glu Leu Ala Glu Asp 20 25 30 Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val Thr Pro Thr Arg Thr Glu Ile 35 40 45 Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn Val Leu Gly Glu Lys Gly Arg 50 55 60 Arg Ile Arg Glu Leu Thr Ala Val Val Gln Lys Arg Phe Gly Phe Pro 65 70 75 80 Glu Gly Ser Val Glu Leu Tyr Ala Glu Lys Val Ala Thr Arg Gly Leu 85 90 95 Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Gly 100 105 110 Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly Val Leu Arg Phe Ile Met Glu 115 120 125 Ser Gly Ala Lys Gly Cys Glu Val Val Val Ser Gly Lys Leu Arg Gly 130 135 140 Gln Arg Ala Lys Ser Met Lys Phe Val Asp Gly Leu Met Ile His Ser 145 150 155 160 Gly Asp Pro Val Asn Tyr Tyr Val Asp Thr Ala Val Arg His Val Leu 165 170 175 Leu Arg Gln Gly Val Leu Gly Ile Lys Val Lys Ile Met Leu Pro Trp 180 185 190 Asp Pro Thr Gly Lys Ile Gly Pro Lys Lys Pro Leu Pro Asp His Val 195 200 205 Ser Ile Val Glu Pro Lys Asp Glu Ile Leu Pro Thr Thr Pro Ile Ser 210 215 220 Glu Gln Lys Gly Gly Lys Pro Glu Pro Pro Ala Met Pro Gln Pro Val 225 230 235 240 Pro Thr Ala Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Ser Gln 245 250 255 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 260 <210> 10 <211> 852 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding Pep-1-rpS3-Pep-1 fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(852) <400> 10 atg aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg acc gaa tct cag ccg aaa 48 Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 aaa aaa cgt aaa gtg atg gca gtg caa ata tcc aag aag agg aag ttt 96 Lys Lys Arg Lys Val Met Ala Val Gln Ile Ser Lys Lys Arg Lys Phe 20 25 30 gtc gct gat ggc atc ttc aaa gct gaa ctg aat gag ttt ctt act cgg 144 Val Ala Asp Gly Ile Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Thr Arg 35 40 45 gag ctg gct gaa gat ggc tac tct gga gtt gag gtg cga gtt aca cca 192 Glu Leu Ala Glu Asp Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val Thr Pro 50 55 60 acc agg aca gaa atc att atc tta gcc acc aga aca cag aat gtt ctt 240 Thr Arg Thr Glu Ile Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn Val Leu 65 70 75 80 ggt gag aag ggc cgg cgg att cgg gaa ctg act gct gta gtt cag aag 288 Gly Glu Lys Gly Arg Arg Ile Arg Glu Leu Thr Ala Val Val Gln Lys 85 90 95 agg ttt ggc ttt cca gag ggc agt gta gag ctt tat gct gaa aag gtg 336 Arg Phe Gly Phe Pro Glu Gly Ser Val Glu Leu Tyr Ala Glu Lys Val 100 105 110 gcc act aga ggt ctg tgt gcc att gcc cag gca gag tct ctg cgt tac 384 Ala Thr Arg Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu Arg Tyr 115 120 125 aaa ctc cta gga ggg ctt gct gtg cgg agg gcc tgc tat ggt gtg ctg 432 Lys Leu Leu Gly Gly Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly Val Leu 130 135 140 cgg ttc atc atg gag agt ggg gcc aaa ggc tgc gag gtt gtg gtg tct 480 Arg Phe Ile Met Glu Ser Gly Ala Lys Gly Cys Glu Val Val Val Ser 145 150 155 160 ggg aaa ctc cga gga cag agg gct aaa tcc atg aag ttt gtg gat ggc 528 Gly Lys Leu Arg Gly Gln Arg Ala Lys Ser Met Lys Phe Val Asp Gly 165 170 175 ctg atg atc cac agc gga gac cct gtt aac tac tac gtt gac act gct 576 Leu Met Ile His Ser Gly Asp Pro Val Asn Tyr Tyr Val Asp Thr Ala 180 185 190 gtg cgc cac gtg ttg ctc aga cag ggt gtg ctg ggc atc aag gtg aag 624 Val Arg His Val Leu Leu Arg Gln Gly Val Leu Gly Ile Lys Val Lys 195 200 205 atc atg ctg ccc tgg gac cca act ggt aag att ggc cct aag aag ccc 672 Ile Met Leu Pro Trp Asp Pro Thr Gly Lys Ile Gly Pro Lys Lys Pro 210 215 220 ctg cct gac cac gtg agc att gtg gaa ccc aaa gat gag ata ctg ccc 720 Leu Pro Asp His Val Ser Ile Val Glu Pro Lys Asp Glu Ile Leu Pro 225 230 235 240 acc acc ccc atc tca gaa cag aag ggt ggg aag cca gag ccg cct gcc 768 Thr Thr Pro Ile Ser Glu Gln Lys Gly Gly Lys Pro Glu Pro Pro Ala 245 250 255 atg ccc cag cca gtc ccc aca gca aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg 816 Met Pro Gln Pro Val Pro Thr Ala Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp 260 265 270 tgg acc gaa tct cag ccg aaa aaa aaa cgt aaa gtg 852 Trp Thr Glu Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 275 280 <210> 11 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Met Ala Val Gln Ile Ser Lys Lys Arg Lys Phe 20 25 30 Val Ala Asp Gly Ile Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Thr Arg 35 40 45 Glu Leu Ala Glu Asp Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val Thr Pro 50 55 60 Thr Arg Thr Glu Ile Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn Val 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Claims (3)

15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 4개 이상 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 rpS3 단백질의 N-말단 및 C-말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) rpS3 융합 단백질을 주요성분으로 함유하는 신경질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.

청구항 1에 있어서,
상기 세포 투과성 rpS3 융합 단백질은 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.

청구항 1에 있어서,
상기 신경질환은 파킨슨병, 알쯔하이머병 또는 근위축성 측삭경화증임을 특징으로 하는 조성물.

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