KR100802480B1 - 성장 수용체 인자 접합 단백질의 융합 단백질 - Google Patents

성장 수용체 인자 접합 단백질의 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 단백질과 단백질 수송도메인이 공유결합된 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질을 형성함으로써 피부 표면에 적용시킬 때 용이하게 진피 내로 또는 세포 내로 침투(penetration) 가능한 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군과 비교할 때 원활히 세포 내로 농도 의존적, 시간 의존적으로 침투하며, 세포 내에서 48시간 이상 지속되었다.
융합 단백질, 성장 수용체 인자 접합 단백질 7, 세포 도입

Description

성장 수용체 인자 접합 단백질의 융합 단백질{Growth receptor factor bound protein 7 fusion protein}
도 1은 정상인과 아토피 피부염 환자에서 호산구(eosinophil) 프로테옴(proteome) 프로파일을 나타내는 이차원(2D) 젤 사진이다.
도 2는 정상인과 아토피 피부염 환자에서 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 단백질을 분석한 사진이다.(추가 설명 필요함)
도 3은 PEP-1-성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질의 발현 벡터를 나타낸 개략도이다. (A) 벡터 pET-15b를 바탕으로 하는 PEP-1-성장 수용체 인자 접합 단백질 7 발현벡터의 구조. 합성 PEP-1 올리고머는 NdeⅠ, XhoⅠ제한부위 내로 클론되었고, 사람 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 cDNA는 pET-15b의 XhoⅠ, BamHⅠ 제한부위 내로 클론되었다. 발현은 IPTG를 가하여 유도되었다.
도 4는 이 콜리(E. coli)에서 PEP-1-성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질의 발현, 정제를 나타낸 것이다. 세포의 단백질 추출물과 정제된 융합 단백질은 15% SDS-PAGE로 분석되었고(A), 항래빗 폴리히스티딘 항체(anti-rabbit polyhistidine antibody)로 웨스턴 블랏 분석되었다(B). 1, 2, 3 레인은 각각 다음과 같다:
레인 1, 유도되지 않은 (non-induced) pPEP-1-Grb7;
레인 2, 유도된(induced) pPEP-1-Grb7;
레인 3, 정제된 pPEP-1-Grb7.
도 5는 배양된 포유류 세포 내로 융합 단백질의 농도별, 시간별 세포 도입을 나타내는 사진이다. 사람 피부세포(Human fibroblast cells)를 6-웰 플레이트에 깔고 PEP-1-Grb7 융합 단백질로 다양한 농도로 한 시간 처리하였다. 세포 도입된 단백질은 웨스턴 블랏으로 분석되었다. 3μM의 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 각각 10~50분간 배양 배지에 가해졌고(A), 0.5~5μM의 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 한 시간 동안 배양 배지에 가해졌다(B).
도 6은 피부 세포에 도입된 PEP-1-Grb7 융합 단백질의 안정성을 나타내는 사진이다. 피부 세포는 3μM의 PEP-1-Grb7 융합 단백질로 처리되어 시간별로 배양되었고, 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
도 7은 피부 세포에 도입된 PEP-1-Grb7 융합 단백질의 세포 생존율에 대한 영향을 나타내는 그래프이다. 피부 세포를 PEP-1-Grb7 융합 단백질로 한 시간 처리한 이후 LPS에 노출된 피부 세포의 세포 생존율을 MTT 어세이로 확인하였다.
도 8은 세포 도입된 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 LPS-유도 COX-2 발현을 억제함을 나타내는 사진이다. 피부 세포는 3μM의 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 있는 상태와 없는 상태로 LPS에 노출되었다.
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아토피 피부염은 유전적 소인을 가진 만성 재발성 습진성 질환으로 아토피 가족력을 가진 아이들에게서 가장 흔하게 발병되는 질병이며, 산업국가에서 점차 증가되고 있는 추세이다. 아토피 피부염의 발병률은 세계적으로 급증하고 있는데 일부에서는 유소아의 20% 이상을 차지한다는 보고도 있으며 특히 아시아계 인구에서 더 빈번하게 발생하는 것으로 알려져 있어서 44%의 발병률을 보였다는 보고도 있다.
아토피 질환은 유전적 요인과 환경적 요소의 복합적 작용에서 비롯된다. 그러나 아토피 피부염이라는 질환에 대한 정의는 아직 명확하게 정립되어 있지 않으며 최근에 이르러 임상적 특징에 의거하여 순수 아토피 피부염(pure atopic dermatitis;AD) 즉, 다른 알러지성 호흡기 질환이 수반되지 않은 아토피 피부염과 혼합 아토피 피부염(mixed AD) 즉, ㅊ알러지성 호흡기 질환이 수반된 아토피 피부염으로 분류되며 순수 아토피 피부염은 다시 혈청 IgE 수치가 높은 외인성 아토피 피부염과 혈청 IgE 수치가 정상 범위에 있는 내인성 아토피 피부염으로 분류된다.
성장 수용체 인자 접합 단백질 7(Growth receptor factor bound protein 7; 이하 본 발명의 상세한 설명, 도면, 청구범위 등에서 "Grb7"과 혼용함)은 다세포 표면 수용체에서 여러 가지 세포 신호전달에 관여하는 접합 단백질이다. 현재 이 성장 수용체 인자 접합 단백질 7은 FAK와 EphB1 감각 수용체로부터 신호전달 체계의 중간물이며, 이것은 종양증식과 관련된 세포 이동에 관여한다고 알려져 있다. 최근 우리는 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 단백질이 아토피 환자들에게서 특이적으로 단백질 발현율이 낮다는 것을 프로테옴(proteome) 연구를 통해 확인하였다.
생체 내 고분자들을 이용한 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 인위적으로 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 나타낸다.
치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어서 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 PEP-1(이하 발명의 상세한 설명, 특허청구범위 등에서 pep-1, Pep-1, PEP 등과 혼용함) 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형단백질을 세포 내로 운반되는 것이 밝혀졌다. PEP-1 펩타이드는 21개의 아미노산(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 세 개의 도메인(소수성 도메인, 스페이서, 친수성 도메인)을 갖고 있다. 지금까지 PEP-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 PEP-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것만 밝혀졌다. 또한, PEP 펩타이드는 Tat 단백질에 비해 단백질 치료제로서의 여러 가지 장점 즉, 효율적으로 단백질을 세포 내로 투과시키고, 생리학적인 완충액에서 안정하며, 혈청에 대한 민감성이 결여되어 있다는 점이 알려져 있다. 그러나, PEP 펩타이드는 외부 단백질 즉, 녹색형광 단백질(Green fluorescent protein) 베타갈락토시다아제(β-galactosidase, β-Gal)와 일정한 비율로 맞추어 투여해야만 세포 내에 효과적으로 단백질이 운반하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 단백질이 PEP-1에 의해 세포 내로 운반되는지는 아직까지 확실하지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 성장 수용체 인자 접합 단백질 7의 세포침투성(cell penatration ability)을 높인 융합 단백질을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 PEP-1을 포함하여 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인을 성장 수용체 인자 접합 단백질 7의 적어도 일측 말단과 공유결합시킴으로써 세포 침투성을 극대화하려는 것이다.
본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 외부단백질인 사람 성장 수용체 인자 접합 단백질 7에 융합시켰고, 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속-킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 세포 내로 운반되는 것을 배양된 피부 세포 및 조직실험을 통하여 확인하였다. 그리고, PEP-1-Grb7 융합 단백질이 피부 세포 내로 운반되며 피부 세포사를 효과적으로 보호함을 밝혀냈다.
본 발명자들은 먼저, PEP-1-Grb7 융합 단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 PEP-1-Grb7 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 Grb7 cDNA, PEP 펩타이드 그리고 여섯 개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni2 +-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. PEP-1-Grb7의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 웨스턴 블랏으로 배양된 피부세포에 정제된 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 확인하였다. 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7는 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되었으며 PEP-1-Grb7 융합 단백질은 배양된 세포뿐 아니라, 마우스의 피부 조직에도 효율적으로 투과되었다. 또한 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7는 면역 반응에 의한 세포사를 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 Grb7 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 PEP-1-Grb7 융합 단백질은 아토피 피부염 등 피부 질환 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.
PEP-1-Grb7 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주 사형태 또는 도포제로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화될 수 있다.
본 발명자들은 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 마우스의 피부에 침투실험한 결과 진피층까지 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, PEP-1-Grb7 융합 단백질을 약제 조성물 및/또는 도포제(본 명세서에서 "피부외용제"와 동일한 의미로 사용함) 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.
본 발명은 Grb7를 세포 내 또는 피부 내부로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 Grb7 단백질 분자의 세포 내 전달은 Grb7에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 PEP-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, PEP-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백 질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 PEP-1-Grb7 융합 단백질, 이 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 융합 단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 피부 외용제 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"PEP-1-Grb7 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인(protein transducing domain; "PTD")과 Grb7를 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 Grb7를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-Grb7", "Grb7 융합 단백질" 또는 "PEP-Grb7"와 혼용하였다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 PEP-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.
본 명세서의 "목표 단백질"은 PEP-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 Grb7 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) Grb7 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 세포 도입성 Grb7 융합 단백질이 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인이 Grb7 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 도입성(cell-transducing) Grb7 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 도입성 Grb7 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Grb7 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포도입성 융합 단 백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.
아래에서는 본 발명의 구성을 구체적인 실시예를 들어 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 재료>
제한 효소와 T4 DNA 리가아제는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머라아제는 stratagene(USA)에서 구입하였다. PEP-1 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로 트리아세틱 애시드 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen(Germany)에서 구입하였다. 사람 성장 수용체 인자 접합 단백질 7("Grb7") cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.
< 실시예 1: PEP -1- Grb7 융합 단백질 발현벡터 제조 및 형질변환>
기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였고, PEP-1 펩타이드가 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 사람 Grb7 단백질을 선택하였다.
먼저, PEP-1-Grb7 융합 단백질을 생산하기 위해 PEP-1 펩타이드(KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. PEP-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(상위 쇄, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'; 하위 쇄, 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3')를 NdeⅠ-XhoⅠ 제한효소로 자른 pET-15b에 라이게이션(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 Grb7의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머는 5’-CTCGAGATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTC-3'로 Xho Ⅰ 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머는 5’-GGATCCTTATC GAGTTGTCCACAGTGAGC-3'로 BamH Ⅰ 제한부위를 가진다.
중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환반응기(thermal cycler)(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 라이게이션한 다음, 형질변환용 세포(competent cell)에 형질변환 시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다. 사람 Grb7 cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho Ⅰ과 BamH Ⅰ로 절단한 다음 PEP 발현 벡터에 삽입하였다. PEP-1-Grb7로 형질변환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음 콜로니를 100ml LB 배지에 접종하고 IPTG(0.5mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 PEP-1-Grb73의 과대발현을 유도하였다. 과대 발현된 PEP-1-Grb7는 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.
< 실시예 2: PEP -1- Grb7 융합 단백질의 발현 및 정제>
본 연구실에서 상기 실시예 1과 같이 제조한 사람 Grb7 cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21(DE3) 세포(PEP-1-Grb7)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 0.5～1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5와 1mM 되게 한 다음 30℃에서 12시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리 하여 모은 뒤 5ml 결합 완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)을 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni2 +-니트릴로 트리아세틱 애시드 세파로즈 슈퍼 플로우(Ni2 +-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.
정제된 단백질 농도는 우태혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.
< 실시예 3: MALDI - TOP MS( matrix assisted laser desorption / ionization - time of flight mass spectrometry) 분석>
MALDI-TOP MS는 기질로서 0.1% v/v TFA(Trifluoroacetic acid)/50%v/v ACN이 포함한 포화된 CHCA 용액과 Applied Biosystems Voyager DETM MALDI-TOP(Canada)와 ETTAN MALDI-TOP Pro 질량 흡광분석기(Amersham Biosystems)를 이용하여 수행하였다. 단백질을 규명하기 위해 MS-FIT(http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/ msfit.htm) 프로그램을 이용하여 Swiss-Prot database에 대한 조사를 하여 pI를 얻었다.
< 실시예 4: 2D-젤>
1) 샘플준비
정제한 호산구(eosinophil)를 2mM 소듐 오르쏘바나데이트(sodium orthovanadate: Na3VO4), 1mM 소듐 피로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1mM β-글리세로포스페이트(ppi), 1mM 소듐 플루오라이드(sodium fluoride)를 포함한 1ml RIPA 완충액(PBS,pH 7.4, 1% w/v NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 1.0% w/v SDS, 1mM EDTA, 1mM EGTA)으로 파쇄하고 37℃에서 30분 반응시킨 다음 같은 양의 아세트산을 첨가하여 -20℃에서 한 시간 반응시켰다. 파쇄된 세포는 원심분리(12,000g×30min, 4℃) 후 상층액은 제거하고 침전물은 건조시켰다. 건조된 침전물은 재수화 완충액 (rehydration buffer; 7M urea, 4% w/v CHAPS, 0.5% w/v IPG 완충액,pH 3. 10 NL 2% w/v DTT 및 약간의 브로모페놀블루)으로 용해시켜 단백질을 정량한 후 사용하였다.
2) 이차원 젤
IEF는 프리캐스트(precast) 18cm pH 3.10 nonlinear IPG gel strips(Amersham Biosciences)을 이용하여 lPGphor unit(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)로 수행되었다. 단백질과 재수화 완충액을 같은 양으로 처리하여 총 350㎕가 되게 한 후 전류는 50uA로 제한하면서 500V와 1000V에서 한 시간, 8000V에서 다섯 시간 수행하였다. IEF 분리 후 바로 평형화 용액으로 평형화시키고 Protean II xi 2-D cell (Bio-Rad)을 이용하여 전기영동을 실시하였다.
얻어진 이차원 젤에 대한 실버 스테이닝은 젤을 50% v/v 메탄올/5% v/v ㅇ아아세트산/0.5% v/v 포름알데히드 용액으로 30분 동안 고정시킨 후 50% v/v 메탄올과 증류수로 수차례 세척하고, 0.2% w/v 소듐 티오설페이트(sodium thiosulfate)에 30분간 넣어 격렬하게 흔들어준 후 증류수로 수차례 세척하였다. 30분간 0.2% w/v 질산은(silver nitrate)으로 처리한 후 증류수로 세척하였다.
젤은 10분간 0.5% v/v 포름알데히드/6% w/v 소듐 카보네이트로 처리한 후 50% v/v 메탄올/12% v/v 아세트산으로 반응을 멈추었다. 결과로 얻어진 실버 스테이닝된 2-DE 젤은 ImageScanner(Amersham Biosciences)로 스캔되었다.
< 실시예 5: 피부 세포 배양 및 PEP -1- Grb7 융합 단백질의 세포 내 투과>
피부 세포(Human primary fibroblast cell- 가톨릭대 의대 피부과로부터 입수)는 37℃에서 95% 공기와 5% CO2를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH(pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% 우태혈청(FBS) 및 항생제(100㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.
PEP-1-Grb7 융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, 재조합 PEP-1-Grb7를 배양액 내에 처리하였다. 한 시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 Grb7의 양을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.
상기 피부 세포 외에 ATCC로부터 입수한 HaCaT 세포(Human Keratocyte cell)와 ATCC에서 입수한 B16 세포(Mouse Melanoma cell)로부터도 위와 같은 실험을 수행하여 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 세포 내로 투과함을 확인하였다.
< 실시예 6: 웨스턴 블랏 분석>
PEP-1-Grb7 융합 단백질의 세포 내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질은 자연상태로 정제하였다. 준비된 피부 세포에 PEP-1-Grb7(5μM)의 융합 단백질을 처리한 다음 한 시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아미드 젤로 분리 한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 탈지분유(non-dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Santacruze, USA, 1:1,000)로 한 시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗(mouse anti-rabbit) IgG 항체(1:10,000 희석)와 한 시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit(ECL; Amersham)를 이용하여 사람 Grb7 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.
< 실시예 7: 피부 세포로 투과된 PEP -1- Grb7 융합 단백질의 안정성>
세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7 융합 단백질의 세포 내 안정성을 측정하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 한 시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별(1~60시간)로 세포를 모아 세포 내에 남아 있는 융합 단백질의 양과 활성을 웨스턴 블랏과 활성도 분석으로 측정하였다.
< 실시예 8: 면역반응 억제 효과>
LPS로 유도한 면역억제 효과를 측정하기 위해 피부 세포를 6-웰 플레이트에 서 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 배양액 내에 처리하고 한 시간 뒤 LPS를 투여하였다. 투여 후 COX-2의 발현과 세포사를 웨스턴 블랏과 MTT 어세이를 통하여 확인하였다.
< 실시예 9: 세포 생존 어세이 >
24시간 전 1 X 105 개의 세포를 24-웰 플레이트에 배양한 후 Grb7 융합단백질을 농도별(1-5uM)로 한 시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 100ug/ml LPS를 12시간 처리하고 세포의 생존율을 MTT를 이용하여 측정하였다. 간단히 MTT 어세이는 같은 양의 MTT 용액을 각 플레이트에 넣고 4시간 배양하고 570nm에서 흡광도를 ELISA 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다.
위 각 실시예에 의하여 얻어진 결과는 다음과 같다.
결과 1: PEP -1- Grb7 융합단백질의 과대발현 및 정제
아토피 피부염 환자에서 표지 물질을 찾기 위해 아토피 피부염 환자의 혈액세포중 호산구(eosinophil)를 분리하여 프로테옴군을 2D(이차원)-젤 방법을 이용하여 단백질군을 분석하였고(도 1), 정상인 사람 호산구의 2D-젤에서만 발현되고 아토피 피부염 환자의 호산구에서는 발현되지 않는 한 개의 점(spot)을 선정하여 MALDI-TOF를 사용한 펩타이드 매스 핑거프린팅(petide mass fingerprinting) 방법과 포스포-티로신 항체를 이용한 이뮤노블랏팅 방법으로 확인한 결과 Grb7 단백질 임을 확인하였다(도 2).
PEP-1-Grb7 융합 단백질을 과대발현시키기 위해 사람 Grb7 cDNA, PEP-1 펩타이드(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV) 및 여섯 개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 PEP-1-Grb7 발현 벡터를 개발하였다(도 3).
IPTG로 융합 단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 4는 PEP-1-Grb7 융합 단백질의 과대발현과 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 단백질 띠(도 4A)와 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다(도 4B). 도 4A는 0.5mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합 단백질을 나타내고 있으며, 대조군과 비교하여 매우 높은 농도의 융합 단백질이 과대발현되었음을 잘 보여주고 있다.
PEP-1-Grb7 융합 단백질은 N-말단에 여섯 개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합단백질을 자연상태로 순수하게(순도 〉95%) 정제하였다.
정제된 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한번 확인하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이 6x 히스티딘 항체에 반응하는 PEP-1-Grb7 띠는 도 4A의 단백질 띠와 동일한 위치에서 관찰되었다.
결과 2: PEP -1- Grb7 융합 단백질의 피부 세포 투과
자연상태에서 정제한 PEP-1-Grb7 융합 단백질의 피부 세포 내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 자연상태의 PEP-1-Grb7는 시간 및 농도 의존적으로 피부 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 5는 3μM PEP-1-Grb7 융합 단백질을 10~60분 동안 또는 0.5~5μM PEP-1-Grb7를 한 시간 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때의 결과이다. PEP-1-Grb7의 세포 내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때, 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7 양이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 투여 10분 이내에 투과된 융합 단백질을 확인할 수 있었고, 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7의 양이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 일어남을 나타낸다.
피부 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7 융합 단백질은 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 6에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소되었으나, 최소 48시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7 융합 단백질은 최소 48시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질 치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.
결과 3: PEP -1- Grb7 융합 단백질의 생물학적 활성
피부 세포 내로 투과된 융합 단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료(protein therapy)에 응용할 수 있다. 따라서, 세포 내로 투과된 융합단 백질이 어느 정도 생물학적인 활성을 지니는지는 매우 중요한 문제이다. 따라서 정제된 PEP-1-Grb7 단백질들의 생물학적 기능을 알아보기 위해 LPS에 의해 유발되는 COX-2 발현과 세포사를 MTT 어세이를 이용하여 확인하였다. 정제한 PEP-1-Grb7 재조합 단백질을 시간과 농도별로 LPS에 의한 세포사 및 COX-2 발현을 억제함을 확인하였다. 세포 내로 투과된 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 효과적으로 작용하고 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 사람 Grb7 단백질을 효과적인 방법으로 단백질 수준에서 세포 내로 직접 투과시키는 기술을 제공한다.
본 발명에 의하면 아토피 피부염에 대한 피부 및 염증을 회복하는데 있어서 Grb7를 자연상태로 세포 내 투여함으로써 피부질환을 치료하는 단백질 치료에 PEP-1-Grb7 융합 단백질이 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 발명을 바탕으로 PEP-1-Grb7 융합 단백질을 세포 내로 직접 전달하여 아토피 피부염으로부터 피부 세포 및 조직을 보호할 수 있기 때문에 질병 이외에도 기능성 화장품 산업 등에 본 발명이 광범위하게 활용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 3의 pep-1 단백질 수송 도메인이 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 도입성(cell-transducing) 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 서열번호 3의 pep-1 단백질 수송도메인이 공유결합된 것을 특징으로 하는 세포 도입성 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질.
  4. 제1항의 세포 도입성 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
  5. 제1항의 세포 도입성 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방, 치료 및 경감용 약제학적 조성물.
  6. 성장 수용체 인자 접합 단백질 7 cDNA에 단백질 수송 도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항의 세포 도입성 성장 수용체 인자 접합 단백질 융합 단백질을 코딩하는, 서열번호 6의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  7. 삭제
  8. 삭제
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