KR20120034927A - 피부투과성 인간 상피세포 성장인자 및 그 생산방법 - Google Patents
피부투과성 인간 상피세포 성장인자 및 그 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재조합 인간 상피세포성장인자(recombinant human Epidermal Growth Factor ; rhEGF)를 효율적으로 피부에 전달하기 위하여 피부투과 펩타이드와 융합된 재조합 인간 상피성장인자(Pep-1 펩타이드 - recombinant human Epidermal Growth Factor ; Pep-1-rhEGF)에 생산 및 효과에 관한 것으로 보다 구체적으로는 재조합 발현 벡터와 대장균을 이용하여 피부 투과 펩타이드와 융합된 재조합 인간 상피성장인자를 발현 및 정제하는 동시에 효율적으로 피부 경피를 투과 시킬수 있는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단백질의 경피 투과에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 재조합 인간 상피세포 성장인자(recombinant human Epidermal Growth Factor ; rhEGF)에 피부침투 수송 도메인인 Pep-1 펩타이드가 공유결합된 상태의 융합 단백질에 관한 것이다.
일반적으로 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 구성되어 있고, 기능으로는 보호기능, 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 역할을 담당하고 있는 아주 중요한 기관이다[Proksch E, Brandner JM, Jensen JM. (2008).The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol . 17(12):1063-72]. 이중 보호기능은 외부 자극 및 물질에 대해 신체를 보호하게 되며 이러한 보호기능 때문에 약물 전달에 어려움이 따르게 된다. 결과적으로 기존에 상피세포 성장인자만을 이용한 제제들은 피부의 보호기능 때문에 효율적으로 피부에 작용하지 못하는 단점이 있다. 이러한 재조합 상피세포 성장인자의 전달에 따른 문제점을 해결하기 위한 다양한 전달방법이 개발되었으나 피부 침투에 한계가 있다.
상피세포 성장인자는 상피세포의 세포분열을 촉진하는 호르몬으로 53개의 아미노산 잔기를 가진 펩타이드이며, 분자량은 6,200달톤이다. 상피세포 성장 인자는 생리적인 작용에 있어서 필수적인 역할을 하는 세 개의 황 결합(disulfide bonds : Cys6-Cys20, Cys14-Cys31, Cys33-Cys42)을 가진 폴리펩타이드 단백질이다. 상피세포 성장인자는 체내에서 상피세포의 증식 그리고 상처가 생겼을 때 이를 치유하는 작용을 가지는 인자로 알려져 있다[HERBST RS. (2004) Int J Radiat Oncol Biol Phys . 59(2 Suppl):21-6]. 상피세포 성장인자는 상피세포와 간엽(messenchymal) 세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다[Assoka Hiratoni., US Patent 140,998; Carpenter, Experimenta I Cell Research 164 1-10(1986)].
최근에는 거대분자를 세포 안으로 운반시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 펩타이드가 개발됨으로써 이를 이용하여 세포 내로 약물전달을 시도하고 있다. 이중 Pep-1 펩타이드는 이러한 세포투과성 펩타이드의 일종으로 인간 후천성 면역결핍 바이러스-1의 역전사 효소로부터 유래된 아미노산 서열(KETWWETWWTEW)과 시미안 바이러스(Simian virus-40, SV-40) 라지 T 항원의 핵치환 서열(nuclear localization sequence; KKKRKV)을 스페이서 서열(spacer sequence, SQP)로 연결시킨 펩타이드로 알려져 있다[Morris, M.C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F. and Divita, G. (2001) Nat. Biotech. 19, 1173-1176].
이 밖에도 Tat 펩타이드가 단백질 수송 도메인(protein transducing domain)으로 알려져 있지만, Tat 펩타이드는 수송하고자 하는 단백질을 자연 상태(native form)가 아닌 변형되어 3차원 구조가 풀린 상태(denatured form)로 세포 내로 이동시킨다고 알려져 있다[임세진, 이상규 (2006) Biowave vol. 8 No.14 2006]. 이렇게 3차원 구조가 풀린 상태의 단백질은 자연 상태의 단백질에 비해 활성에 문제가 있을 것으로 예측된다.
한편 대장균은 여러 유용한 단백질을 대량으로 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포이며 이에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다[Hodgson, Bio/Technology, 11:887, 1993; Lee, Trends Biotechnol ., 14:98, 1996] 그러나 숙주세포를 대장균으로 이용할 경우 대부분의 단백질은 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 활성이 없는 응집체(inclusion body)를 형성하는 경우가 있다.
상피세포 성장인자는 피부의 보호기능으로 인하여 경피를 투과하기 어렵기 때문에 치료 효과를 위해서 상피세포 성장인자를 과량으로 사용하게 되며, 과량 사용은 여러 가지 부작용을 일으키게 된다. 따라서, 인간 상피세포 성장인자를 피부 및/또는 세포에 좀 더 효율적으로 투과시키려는 시도들이 계속되어 왔다.
본 발명의 목적은 상기 종래의 문제점들을 해결하고 재조합 인간 상피세포 성장인자(recombinant human Epidermal Growth Factor ; rhEGF)의 피투 침투성을 높인 융합 단백질을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 종래 재조합 기법으로 제조하기 어려운 자연 상태의(native form) 인간 상피세포 성장인자를 세포 내로 투과시키는 방법을 제공하려는 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 자연 상태의 피부투과 인간 상피세포 성장인자 융합단백질을 이용한 피부외용제를 제공하려는 것이다.
그리하여, 본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 Pep-1 펩타이드를 외부 단백질인 재조합 인간 상피세포 성장인자(recombinant human Epidermal Growth Factor ; rhEGF)와 융합시켰고, 이것을 박테리아에서 대량 생산 후, 만들어진 단백질 응집체를 리폴딩하여 자연 상태의 단백질로 만들었다. 만들어진 단백질은 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 그리고, 본 발명자들은 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질이 피부 세포 재생 활성이 있고, 피부 조직 내로 운반됨을 밝혀냈다. 또한 Tat 펩타이드와 융합시킨 rhEGF와 그 활성을 비교함으로써 3차 구조가 풀린 상태보다는 자연 상태(native form)의 융합단백질을 이용하였을 때 피부 내로 전달이 더 잘 되고 활성도 높음을 확인하였다.
본 발명자들은 먼저 Pep-1-rhEGF 융합 단백질, rhEGF-Pep-1 융합 단백질 및 Pep-1-rhEGF-Pep-1을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 EGF cDNA, Pep-1 펩타이드(21 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 rhEGF 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni2 +-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. rhEGF 융합 단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 배양된 섬유아세포에 정제된 rhEGF 융합 단백질이 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 rhEGF 융합 단백질은 EGF 수용체와 원활히 결합하며, 활발하게 세포를 증식시키는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는 rhEGF 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 EGF 활성을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 rhEGF 융합 단백질은 피부노화, 아토피, 피부염, 각막질환 및 위궤양 치료, 예방 등에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.
rhEGF 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태 또는 도포제로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.01ng~1㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 Pep-1-rhEGF 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화될 수 있다.
본 발명자들은 rhEGF 융합 단백질을 마우스의 피부에 침투실험한 결과 진피층까지 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, rhEGF 융합 단백질을 약제 조성물 및/또는 도포제(본 명세서에서 "피부외용제"와 동일한 의미로 사용함) 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.
본 발명은 hEGF를 피부 세포를 비롯한 세포 내부로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 hEGF 단백질 분자의 세포 내 전달은 hEGF에 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 Pep-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 Pep-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Pep-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Pep-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일?유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 Pep-1-rhEGF 융합 단백질, rhEGF-Pep-1 융합 단백질 및 Pep-1-rhEGF-Pep-1 융합 단백질이 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 융합 단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 피부 외용제 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"rhEGF 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 rhEGF을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 rhEGF을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "hEGF 융합 단백질", "rhEGF 융합 단백질", "EGF 융합 단백질" 또는 "인간 상피세포 성장인자 융합 단백질"과 혼용하였다. 또한, 본 발명에서는 rhEGF 융합 단백질로서 "Pep-1-rhEGF" 융합 단백질을 위주로 실시예 및 그 결과를 기재하였으나, rhEGF의 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 rhEGF-Pep-1 융합 단백질 및 rhEGF의 N-말단과 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 Pep-1-rhEGF-Pep-1 융합 단백질도 "rhEGF 융합 단백질" 에 속하며, 각 실시예에서 "Pep-1-rhEGF" 융합 단백질과 거의 유사한 정도의 결과를 나타내었다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 Pep-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.
본 명세서의 "목표 단백질"은 Pep-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명은 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 4개 이상 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 재조합 인간 상피세포 성장인자(recombinant human Epidermal Growth Factor ; rhEGF)의 말단에 공유결합된 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 제공한다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질이 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화, 아토피, 피부염, 각막질환, 위궤양 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 상피세포 성장인자 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드임을 특징으로 한다. 본 발명의 범위는 서열번호 8, 10 또는 12번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.
또한, 본 발명은 인간 상피세포 성장인자 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 발현시키는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 박테리아에서 대량 발현시켜 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 응집체를 얻는 단계;
상기 응집체를 세포질로부터 분리하는 단계;
상기 분리된 응집체를 용해시키는 단계;
상기 용해된 응집체에 포함된 융합 단백질을 리폴딩하는 단계; 및
상기 리폴딩된 융합 단백질을 투석하여 자연 상태의 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 얻는 단계;를 포함하는 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 제조방법을 제공한다.
본 발명은 인간 상피세포 성장인자(human Epidermal Growth Factor; rhEGF) 융합 단백질을 자연 상태로 생산해내고, 단백질 수준에서 피부 경피를 투과시키는 기술을 제공한다.
본 발명을 바탕으로 인간 상피세포 성장인자를 피부로 직접 전달하여 피부세포 및 조직을 재생할 수 있기 때문에 본 발명은 인간 표피세포 성장인자를 이용한 산업에 다양하게 이용 가능할 것이다.
도 1은 Pep-1-rhEGF 단백질의 발현 벡터의 개략도이다. 융합 단백질 발현 벡터는 pET15b를 바탕으로 하여 구성되었다. XhoI과 BamHI을 이용하여 rhEGF cDNA를 결합시켰다. Pep-1 올리고머는 NdeI과 XhoI 제한효소 부위 사이에 삽입되었다. IPTG를 가하여 발현을 유도한다.
도 2는 Pep-1-rhEGF 단백질의 정제 사진이다. 최종 정제된 단백질을 SDS-PAGE 기법과 항-토끼 상피세포 성장인자 다클론항체를 이용한 웨스턴 블랏법으로 분석하였다.
SDS-PAGE 분석
레인 1 : 표준 단백질
레인 2 : 10ug Pep-1-rhEGF
웨스턴 블랏 분석
레인 1 : 항-토끼 상피세포 성장인자 다클론항체를 이용한 Pep-1-rhEGF 단백질 확인
도 3은 Pep-1-rhEGF 단백질의 EGF 수용체 결합 활성을 확인한 것이다. Pep-1-rhEGF 단백질과 상업적으로 구매한 EGF 단백질의 수용체 결합 능력을 EGF 수용체 인산화 항체를 이용하여 웨스턴 블랏법으로 분석하였다.
레인 1 : 대조군(비처리)
레인 2 : 100ng/㎖ 상업적 구매 EGF 단백질 처리군
레인 3 : 1ug/㎖ 상업적 구매 EGF 단백질 처리군
레인 4 : 100ng/㎖ Pep-1-rhEGF 단백질 처리군
레인 5 : 1ug/㎖ Pep-1-rhEGF 단백질 처리군
도 4는 Pep-1-rhEGF 단백질의 활성도를 측정한 그래프이다. Pep-1-rhEGF 단백질을 이용하여 인간 상피세포 증식 정도를 측정하였다.
1: 0pg/ml Pep-1-rhEGF 대조군의 세포성장률
2: 1pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
3: 10pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
4: 100pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
5: 1ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
6: 10ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
7: 100ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
8: 1ug/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
도 5는 Pep-1-rhEGF 융합 단백질을 동물 피부조직으로 침투시킨 사진이다. 100ug의 Pep-1-rhEGF 융합 단백질을 마우스 등 피부에 도포하고 60분 간격으로 처리하였다. 피부 조직의 동결 절편을 토끼 항 상피세포 성장인자 항체로 염색한 후 형광물질이 결합된 염소 항 토끼 IgG로 염색하였다. 절편을 공초점 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.
a: 대조군 - 상업적 판매 EGF 단백질 처리 후 조직 염색 사진
b: 실험군 - 100ug Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 조직 염색 사진
도 6은 Pep-1-rhEGF 단백질을 여러 조건과 시간으로 보관 후 안정성을 테스트한 그래프이다. 단백질은 4℃, 15℃, 25℃에서 보관하여 1주, 2주, 5주, 10주 후의 인간 상피세포의 성장 정도를 측정하였다.
1: 1, 2, 5, 10주 보관한 0pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
2: 1, 2, 5, 10주 보관한 1pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
3: 1, 2, 5, 10주 보관한 10pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
4: 1, 2, 5, 10주 보관한 100pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
5: 1, 2, 5, 10주 보관한 1ng/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
6: 1, 2, 5, 10주 보관한 10ng/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
7: 1, 2, 5, 10주 보관한 100ng/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
8: 1, 2, 5, 10주 보관한 1ug/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
도 7은 Pep-1-rhEGF 단백질과 1M 우레아 완충액으로 처리한 Tat-rhEGF 단백질의 활성도를 측정한 그래프이다. 자연 상태의 Pep-1-rhEGF와 풀린 상태의(denatured) Tat-rhEGF를 비교하여 WST-1을 이용하여 인간 상피세포의 증식 정도를 측정하였다.
그룹 1
블록 1: 0pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 2: 0pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 2
블록 3: 1pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 4: 1pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 3
블록 5: 10pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 6: 10pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 4
블록 7: 100pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 8: 100pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 5
블록 9: 1ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 10: 1ng/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 6
블록 11: 10ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 12: 10ng/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 7
블록 13: 100ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 14: 100ng/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 8
블록 15: 1ug/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 16: 1ug/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
도 8은 Pep-1-rhEGF를 1M 우레아 완충액과 1% 다이티오트레이톨로 처리한 후 단백질의 활성도를 측정한 그래프이다. 자연상태의 단백질이 아닌 변성된 rhEGF에 의한 인간 상피세포의 증식 정도를 WST-1 세포증식 어세이 키트를 이용하여 측정하였다.
블록 1: 0pg/ml Pep-1-rhEGF 대조 군의 세포성장률
블록 2: 1pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 3: 10pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 4: 100pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 5: 1ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 6: 10ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 7: 100ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 8: 1ug/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
도 9는 Pep-1-rhEGF 융합단백질과 Tat-rhEGF 융합 단백질을 모두 자연상태의 단백질로 리폴딩한 후 동물 피부조직에 침투시키고 항-래빗 상피세포 성장인자 항체를 이용하여 웨스턴 블랏법으로 분석한 결과이다.
레인 1 : 대조군(비처리)
레인 2 : 상업적 구매 EGF 단백질 처리군
레인 3 : Tat-rhEGF 융합단백질 처리군
레인 4 : Pep-1-rhEGF 융합단백질 처리군
도 10은 마우스 경피에서 Pep-1-rhEGF 융합단백질과 1M 우레아 버퍼 및 1% 다이티오트레이톨로 녹인 Tat-rhEGF 단백질의 활성도를 EGF 수용체 인산화 항체를 이용하여 비교한 것이다.
레인 1 : 대조군(비처리군)
레인 2 : Tat-rhEGF 처리군
레인 3 : Pep-1-rhEGF 처리군
도 2는 Pep-1-rhEGF 단백질의 정제 사진이다. 최종 정제된 단백질을 SDS-PAGE 기법과 항-토끼 상피세포 성장인자 다클론항체를 이용한 웨스턴 블랏법으로 분석하였다.
SDS-PAGE 분석
레인 1 : 표준 단백질
레인 2 : 10ug Pep-1-rhEGF
웨스턴 블랏 분석
레인 1 : 항-토끼 상피세포 성장인자 다클론항체를 이용한 Pep-1-rhEGF 단백질 확인
도 3은 Pep-1-rhEGF 단백질의 EGF 수용체 결합 활성을 확인한 것이다. Pep-1-rhEGF 단백질과 상업적으로 구매한 EGF 단백질의 수용체 결합 능력을 EGF 수용체 인산화 항체를 이용하여 웨스턴 블랏법으로 분석하였다.
레인 1 : 대조군(비처리)
레인 2 : 100ng/㎖ 상업적 구매 EGF 단백질 처리군
레인 3 : 1ug/㎖ 상업적 구매 EGF 단백질 처리군
레인 4 : 100ng/㎖ Pep-1-rhEGF 단백질 처리군
레인 5 : 1ug/㎖ Pep-1-rhEGF 단백질 처리군
도 4는 Pep-1-rhEGF 단백질의 활성도를 측정한 그래프이다. Pep-1-rhEGF 단백질을 이용하여 인간 상피세포 증식 정도를 측정하였다.
1: 0pg/ml Pep-1-rhEGF 대조군의 세포성장률
2: 1pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
3: 10pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
4: 100pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
5: 1ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
6: 10ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
7: 100ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
8: 1ug/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
도 5는 Pep-1-rhEGF 융합 단백질을 동물 피부조직으로 침투시킨 사진이다. 100ug의 Pep-1-rhEGF 융합 단백질을 마우스 등 피부에 도포하고 60분 간격으로 처리하였다. 피부 조직의 동결 절편을 토끼 항 상피세포 성장인자 항체로 염색한 후 형광물질이 결합된 염소 항 토끼 IgG로 염색하였다. 절편을 공초점 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.
a: 대조군 - 상업적 판매 EGF 단백질 처리 후 조직 염색 사진
b: 실험군 - 100ug Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 조직 염색 사진
도 6은 Pep-1-rhEGF 단백질을 여러 조건과 시간으로 보관 후 안정성을 테스트한 그래프이다. 단백질은 4℃, 15℃, 25℃에서 보관하여 1주, 2주, 5주, 10주 후의 인간 상피세포의 성장 정도를 측정하였다.
1: 1, 2, 5, 10주 보관한 0pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
2: 1, 2, 5, 10주 보관한 1pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
3: 1, 2, 5, 10주 보관한 10pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
4: 1, 2, 5, 10주 보관한 100pg/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
5: 1, 2, 5, 10주 보관한 1ng/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
6: 1, 2, 5, 10주 보관한 10ng/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
7: 1, 2, 5, 10주 보관한 100ng/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
8: 1, 2, 5, 10주 보관한 1ug/ml Pep-1-rhEGF 처리 후 세포성장률
도 7은 Pep-1-rhEGF 단백질과 1M 우레아 완충액으로 처리한 Tat-rhEGF 단백질의 활성도를 측정한 그래프이다. 자연 상태의 Pep-1-rhEGF와 풀린 상태의(denatured) Tat-rhEGF를 비교하여 WST-1을 이용하여 인간 상피세포의 증식 정도를 측정하였다.
그룹 1
블록 1: 0pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 2: 0pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 2
블록 3: 1pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 4: 1pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 3
블록 5: 10pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 6: 10pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 4
블록 7: 100pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 8: 100pg/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 5
블록 9: 1ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 10: 1ng/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 6
블록 11: 10ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 12: 10ng/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 7
블록 13: 100ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 14: 100ng/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
그룹 8
블록 15: 1ug/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 16: 1ug/ml Tat-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
도 8은 Pep-1-rhEGF를 1M 우레아 완충액과 1% 다이티오트레이톨로 처리한 후 단백질의 활성도를 측정한 그래프이다. 자연상태의 단백질이 아닌 변성된 rhEGF에 의한 인간 상피세포의 증식 정도를 WST-1 세포증식 어세이 키트를 이용하여 측정하였다.
블록 1: 0pg/ml Pep-1-rhEGF 대조 군의 세포성장률
블록 2: 1pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 3: 10pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 4: 100pg/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 5: 1ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 6: 10ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 7: 100ng/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
블록 8: 1ug/ml Pep-1-rhEGF 단백질 처리 후 세포성장률
도 9는 Pep-1-rhEGF 융합단백질과 Tat-rhEGF 융합 단백질을 모두 자연상태의 단백질로 리폴딩한 후 동물 피부조직에 침투시키고 항-래빗 상피세포 성장인자 항체를 이용하여 웨스턴 블랏법으로 분석한 결과이다.
레인 1 : 대조군(비처리)
레인 2 : 상업적 구매 EGF 단백질 처리군
레인 3 : Tat-rhEGF 융합단백질 처리군
레인 4 : Pep-1-rhEGF 융합단백질 처리군
도 10은 마우스 경피에서 Pep-1-rhEGF 융합단백질과 1M 우레아 버퍼 및 1% 다이티오트레이톨로 녹인 Tat-rhEGF 단백질의 활성도를 EGF 수용체 인산화 항체를 이용하여 비교한 것이다.
레인 1 : 대조군(비처리군)
레인 2 : Tat-rhEGF 처리군
레인 3 : Pep-1-rhEGF 처리군
아래에서는 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재 범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 rhEGF 융합 단백질로서 "Pep-1-rhEGF" 융합 단백질을 위주로 실시예 및 그 결과를 기재하였으나, rhEGF의 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 rhEGF-Pep-1 융합 단백질 및 rhEGF의 N-말단과 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 Pep-1-rhEGF-Pep-1 융합 단백질도 "rhEGF 융합 단백질" 범주에 속하며, 각 실시예에서 "Pep-1-rhEGF" 융합 단백질과 거의 유사한 정도(85~100%)의 결과를 나타내었다.
<
실시예
1: 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 제조>
피부 투과성 인간 상피세포 성장인자(human Epidermal Growth Factor ; rhEGF) 를 제조하기 위하여 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 발현 벡터를 제조하였다.
인간 상피세포 성장인자와 Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) 펩타이드의 융합 단백질 발현을 위한 단백질 발현벡터가 제조되었다. 인간 상피세포 성장인자는 cDNA 서열에 기초하여 두 개의 개시체가 합성되었다. 센스 개시체 5'-ACACTCGAGAATAGTGACTCTGAATGTC-3'는 Xho Ⅰ 제한효소 절단부위를 함유하고, 안티센스 개시체 5'-TGTGGATCCTTAGCGCAGTTCC-3'는 BamH Ⅰ제한효소 절단부위를 가진다. 중합효소 체인반응(PCR)이 수행되고 중합효소 체인반응 생성물을 TA-클로닝 벡터에 연결하였다. 그 후 Xho Ⅰ과 BamH Ⅰ으로 절단하고, 절단된 올리고뉴클레오타이드를 용출시켰다(Invitek, Berlin,German). T4 DNA 리가아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 이용하여 상기 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 pET15b 벡터에 연결하고, E.coli DH5 세포에 형질전환시켰다. 형질 전환된 박테리아로부터 벡터를 정제하였다.
위쪽 사슬 5'-GGGGAATTCCATATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGCCTCGAGTATAT-3'과 아래쪽 사슬 (bottom strand) 5'-ATATACTCGAG GCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGAGACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCATATGGAATTCCCC-3'을 합성하고 이를 어닐하여 Pep-1 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 올리고뉴클레오타이드를 만들었다. 이중사슬 올리고뉴클레오타이드와 pET15b-rhEGF 벡터는 제한효소 NdeI/BamHI으로 잘라 일루션하고 이 둘을 직접 연결하였다. 도 1은 이를 모식화한 것이다.
"rhEGF-Pep-1" 융합 단백질 및 "Pep-1-rhEGF-Pep-1" 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터도 위와 유사한 방법으로 제조하였다.
<
실시예
2: 융합 단백질 발현 및 정제>
인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 생산하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 플라스미드 벡터를 E. coli Rosetta-gami™ 2(DE3)세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아 세포는 37℃에서 100ml의 암피실린 포함 LB배지에서 OD 600 값이 0.6이 될 때까지 배양하였고, 18℃에서 0.2mM IPTG를 도입하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 하베스트한 세포를 초음파기를 이용하여 파괴하여 이것을 원심분리하여 응집체(inclusion body)와 세포질로 분리하였다. 분리된 응집체는 1% SDS, 50mM 소듐 카보네이트(pH 9.8)를 사용해서 용해시켰다. 그리고 하루 동안 냉장 보관하여 SDS를 침전시켰다. 이것을 4℃에서 원심분리하여 침전된 SDS와 용해된 응집체를 분리하였다. 용해된 응집체 중의 SDS는 IRA-420 수지를 이용하여 제거하였다. 용해된 응집체는 5mM L-시스테인을 1시간 처리한 후 5mM DL-시스틴을 24시간 상온에서 교반하여 단백질을 리폴딩(refolding) 시켰다. 리폴딩된 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질은 1X PBS를 이용하여 투석하였고 자연 상태의 융합 단백질은 Ni2 +-니트릴로아세트산 세파로즈 친화컬럼(nitrilotriacetic acid Sepharose affinity column)(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 정제하였다. 융합 단백질은 1X PBS 완충액을 이용하여 투석하였고 완충액의 염분기를 제거하였다.
"rhEGF-Pep-1" 융합 단백질 및 "Pep-1-rhEGF-Pep-1" 융합 단백질도 위와 유사한 방법으로 발현 및 정제하였다.
도 2는 최종 획득한 상피세포 성장인자 융합 단백질의 SDS-PAGE와 상피세포 성장인자 다항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과이다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 스탠다드로 하여 브래드포드법(Bradford procedure)으로 예측하였다.
<
실시예
3: 상피세포 성장인자 융합 단백질의
내독성
측정>
실시예 2에서 얻어진 상피세포 성장인자 융합 단백질의 내독성을 알아보기 위하여 Limulus. Amebocyte Lysate(Lonza, Swiss) 테스트를 통하여 내독성을 측정하였다. 측정 방법은 제품 사용설명에 의거하여 실행하였다. 최종 상피세포 성장인자 융합 단백질 1mg당 1EU 이하의 단백질을 확인하였다.
<
실시예
4 : 상피세포 성장인자 융합 단백질의 수용체 결합활성 측정>
실시예 2에서 얻어진 상피세포 성장인자 융합 단백질의 수용체 결합활성도를 알아보기 위하여 인간 섬유아세포에 농도별로 처리하여 세포의 수용체 활성도를 측정하였다. 인간 섬유아세포는 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하였고, 실시예 2에서 얻어진 상피세포 성장인자 융합 단백질과 비교를 위하여 상업적으로 판매되고 있는 상피세포 성장인자 단백질(Sigma, USA)을 동시에 처리하여 이를 상피세포 성장인자 수용체 인산화 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 상피세포 성장인자 융합 단백질이 수용체에 자연상태로 결합하는 것과, 상업적으로 판매되고 있는 상피세포 성장인자 단백질 또한 같은 효능을 보이는 것을 확인했다. 도 3은 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
<
실시예
5 : 상피세포 성장인자 융합 단백질의 활성도 측정>
Pep-1-rhEGF 단백질의 활성도를 알아보기 위하여 인간 섬유아세포에 농도별로 처리하여 세포의 성장률을 측정하였다. 인간 섬유아세포는 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하고 Pep-1-rhEGF 단백질을 농도별로 처리한 후 24시간을 배양하였다. 최종 측정 방법은 WST 어세이(Takara, Otsu, Shiga, Japan) 제품을 이용하였고 그 방법은 제품 사용설명서에 의거하여 수행하였다. 최종 상피세포 성장인자 융합 단백질은 1ng/ml 농도 이상부터 세포의 성장에 확연한 영향을 주었다. 도 4는 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
<
실시예
6: 상피세포 성장인자 융합 단백질의 마우스
피부경피
투과 능력 측정>
실시예 2에서 제조된 상피세포 성장인자 융합 단백질이 마우스 피부를 투과하는지를 시험하기 위하여 웅성(male) 누드 마우스(체중 약 30g)을 이용하였다. 이 실험에 사용된 동물은 실험동물 관리준칙(Principles of Laboratory Animal Care)(NIH publication No. 86-23)에 따라 처리되었다. 동물은 3% 이소플루란스(isoflurance)가 함유된 질소와 산소로 마취시키고, 50g의 대조군으로서 상업적으로 판매 중인 상피세포 성장인자 단백질 (a)와 실시예 2에서 제조된 상피세포 성장인자 융합 단백질 (b)를 다양한 시간 간격으로 동물 피부의 면도한 부위에 적용하였다. 그리고 나서, 얼린 조직 조각이 제조되고 4% 파라포름알데하이드로 10분 동안 고정시켰다. 비특이적 면역반응을 제거하기 위하여 free-floating sections는 0.3% 트리톤(Triton) X-100과 10% 일반 염소 혈청 함유 PBS로 한 시간 동안 실온에서 배양하였다.그리고 나서 래빗 항히스티딘 IgG (1:500)로 24시간 동안 실온에서 배양하였다. PBS로 10분간 세 번 세척한 후 절편들은 한 시간 동안 알렉사 488이 결합된 염소 항토끼 IgG(dilution 1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 배양하였다. 이후 액시오스코프 현미경(Axioscope microscope)(Carl Zeiss, Gottingen,Germany) 하에서 관찰하였다. 도 5는 이의 결과이다.
<
실시예
7: 안정성 테스트>
실시예 2에서 제조한 상피세포 성장인자 융합 단백질의 안정성을 시험하기 위하여 1ng/ml의 융합 단백질을 각 4℃, 15℃, 25℃에서 보관하여 1주, 2주, 5주, 10주에 각각의 샘플을 통해 세포 성장효과(Cell Growth Effect)를 측정하였다. 실험방법은 실시예 5와 같은 방법으로 실행하였고, 이 실험을 근거로 결과를 얻었다. 도 6은 이를 그래프로 나타낸 것이다.
<
실시예
8:
Pep
-1-
rhEGF
융합 단백질과
Tat
-
rhEGF
융합 단백질의 세포 증식 효능 비교실험>
실시예 2에서 제조된 상피세포 성장인자 융합 단백질과 Tat-rhEGF 융합 단백질의 효능 비교실험을 하였다. 실험은 Tat-rhEGF 융합 단백질을 Tat 펩타이드가 단백질을 효율적으로 전달할 수 있는 변성(denatured) 상태로 만들기 위하여 1M 우레아 버퍼에 녹여 사용하였다. 실험은 실시예 5의 방법으로 실행하였으며, 그 결과는 도 7에 그래프로 나타내었다.
<실시예 9: 변성된 상태의 Pep-1-rhEGF 융합 단백질의 세포 증식 효능실험>
EGF가 활성을 가지려면 3개의 황결합과 3차구조를 가져야지만 한다. 그렇지 않다면 EGF의 활성도는 없을 것이다. 풀어진 상태로 만들기 위하여 1M 우레아 버퍼와 베타 1% 디티티를 넣어 황결합과 3차구조를 파괴하여 사용하였다. 실험방법은 실시예 5에 방법으로 실행하였으며 그 결과는 도 8에 그래프로 나타내었다.
최종적으로 EGF 단백질을 3차 구조와 황 결합이 그 활성에 중요한 부분을 차지한다는 것을 알 수가 있다.
<실시예 10 : Pep-1과 Tat 펩타이드의 효능 비교 실험>
Pep-1 펩타이드와 Tat 펩타이드 모두 세포벽을 투과 가능한 펩타이드로 알려져있다.
이 두 펩타이드 모두 세포벽을 투과하는 것에는 문제가 없지만 EGF 단백질을 피부투과를 목적으로 한다면 Tat 펩타이드보다는 Pep-1 펩타이드가 더욱 효능이 있다.
실험은 Pep-1-rhEGF 와 Tat-rhEGF 모두 자연상태의 단백질로 리폴딩후 동물 피부조직에 침투시켰으며, 실험방법은 실시예 6에 방법으로 실행하였으며 그 결과는 웨스턴 블랏방법으로 하였으며, 그 결과는 도 9 이다.
<실시예 11 : Pep-1-rhEGF 단백질과 Tat-rhEGF 단백질의 마우스 피부경피 투과후 활성도 측정>
단백질 처리방법은 실시예 6과 동일하며, 실험군은 대조군, Pep-1-rhEGF 단백질 처리군, Tat-rhEGF 단백질 처리군으로 하였다. 단백질을 처리하고 나서 30분뒤 마우스 피부 경피를 절단하여 조직을 조직 단백질 추출 용액(T-per)(Pierce, USA)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 이렇게 추출된 단백질을 EGF Receptor 인산화 항체를 이용하여 웨스턴 블랏법으로 분석하였다. 도 10은 이에 대한 결과이다.
<110> BioCeltran, Inc.
<120> Cell-transducing Human Epidermal Growth Factor and a producing
method thereof
<130> inipat-jangsh-pepegf
<160> 13
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> top strand oligonucleotide coding PEP-1
<400> 1
tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60
taaagtgc 68
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1
<400> 2
tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60
gtttctttcc 70
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protein transducing domain called PEP-1
<400> 3
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 4
acactcgaga atagtgactc tgaatgtc 28
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 5
tgtggatcct tagcgcagtt cc 22
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant polynucleotide
<400> 6
ggggaattcc atatgaaaga aacctggtgg gaaacctggt ggaccgaatg gtctcagccg 60
aaaaaaaaac gtaaagtgcc tcgagtatat 90
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant polynucleotide
<400> 7
atatactcga ggcactttac gttttttttt cggctgagac cattcggtcc accaggtttc 60
ccaccaggtt tctttcatat ggaattcccc 90
<210> 8
<211> 234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant polynucleotide coding Pep-1rhEGF fusion protein
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(231)
<400> 8
atg aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg acc gaa tgg tct cag ccg 48
Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro
1 5 10 15
aaa aaa aaa cgt aaa gtg ctc gag aat agt gac tct gaa tgt ccc ctg 96
Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu
20 25 30
tcc cac gat ggg tac tgc ctc cat gat ggt gtg tgc atg tat att gaa 144
Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu
35 40 45
gca ttg gac aag tat gca tgc aac tgt gtt gtt ggc tac atc ggg gag 192
Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu
50 55 60
cga tgt cag tac cga gac ctg aag tgg tgg gaa ctg cgc tga 234
Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
65 70 75
<210> 9
<211> 77
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu
20 25 30
Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu
35 40 45
Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu
50 55 60
Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
65 70 75
<210> 10
<211> 234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding rhEGF-PEP-1 fusion protein
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(231)
<400> 10
atg aat agt gac tct gaa tgt ccc ctg tcc cac gat ggg tac tgc ctc 48
Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu
1 5 10 15
cat gat ggt gtg tgc atg tat att gaa gca ttg gac aag tat gca tgc 96
His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys
20 25 30
aac tgt gtt gtt ggc tac atc ggg gag cga tgt cag tac cga gac ctg 144
Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu
35 40 45
aag tgg tgg gaa ctg cgc gga tcc aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg 192
Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp
50 55 60
tgg acc gaa tgg tct cag ccg aaa aaa aaa cgt aaa gtg tga 234
Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
65 70 75
<210> 11
<211> 77
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu
1 5 10 15
His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys
20 25 30
Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu
35 40 45
Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp
50 55 60
Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
65 70 75
<210> 12
<211> 303
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding PEP-1-rhEGF-PEP-1 fusion protein
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(300)
<400> 12
atg aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg acc gaa tgg tct cag ccg 48
Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro
1 5 10 15
aaa aaa aaa cgt aaa gtg ctc gag aat agt gac tct gaa tgt ccc ctg 96
Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu
20 25 30
tcc cac gat ggg tac tgc ctc cat gat ggt gtg tgc atg tat att gaa 144
Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu
35 40 45
gca ttg gac aag tat gca tgc aac tgt gtt gtt ggc tac atc ggg gag 192
Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu
50 55 60
cga tgt cag tac cga gac ctg aag tgg tgg gaa ctg cgc gga tcc aaa 240
Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser Lys
65 70 75 80
gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg acc gaa tgg tct cag ccg aaa aaa 288
Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys
85 90 95
aaa cgt aaa gtg tga 303
Lys Arg Lys Val
100
<210> 13
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu
20 25 30
Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu
35 40 45
Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu
50 55 60
Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser Lys
65 70 75 80
Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys
85 90 95
Lys Arg Lys Val
100
Claims (7)
15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 4개 이상 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 재조합 인간 상피세포 성장인자(recombinant human Epidermal Growth Factor ; rhEGF)의 말단에 공유결합된 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질.
제1항에 있어서, 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질은 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질.
제1항 또는 제2항의 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화, 아토피, 피부염, 각막질환 또는 위궤양 치료 및 예방용 조성물.
제1항 또는 제2항의 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
인간 상피세포 성장인자 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항 또는 제2항의 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
인간 상피세포 성장인자 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합된 상기 청구항 5의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 발현시키는 벡터.
상기 청구항 6의 벡터를 박테리아에서 대량 발현시켜 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 응집체를 얻는 단계;
상기 응집체를 세포질로부터 분리하는 단계;
상기 분리된 응집체를 용해시키는 단계;
상기 용해된 응집체에 포함된 융합 단백질을 리폴딩하는 단계; 및
상기 리폴딩된 융합 단백질을 투석하여 자연 상태의 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 얻는 단계;를 포함하는 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 제조방법.
상기 응집체를 세포질로부터 분리하는 단계;
상기 분리된 응집체를 용해시키는 단계;
상기 용해된 응집체에 포함된 융합 단백질을 리폴딩하는 단계; 및
상기 리폴딩된 융합 단백질을 투석하여 자연 상태의 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질을 얻는 단계;를 포함하는 피부 투과성 인간 상피세포 성장인자 융합 단백질 제조방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020100096321A KR20120034927A (ko) | 2010-10-04 | 2010-10-04 | 피부투과성 인간 상피세포 성장인자 및 그 생산방법 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020100096321A KR20120034927A (ko) | 2010-10-04 | 2010-10-04 | 피부투과성 인간 상피세포 성장인자 및 그 생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20120034927A (ko) |
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