KR101626758B1 - 피부 투과성을 갖는 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 개발, 생산 및 화장품 조성물 - Google Patents
피부 투과성을 갖는 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 개발, 생산 및 화장품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 융합 단백질은 FGF2 단백질을 세포 및 피부 내로 탁월하게 투과시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 우수한 주름 개선 효과 및 발모 촉진 효과를 발휘한다.
Description
본 발명은 피부 투과성이 우수한 융합 단백질, 그 제조방법 및 피부 투과성이 증대된 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 구성되어 있다. 피부는 보호기능, 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 역할을 담당하고 있는 매우 중요한 기관이다 [Proksch E, Brandner JM, Jensen JM. (2008).The skin:an indispensable barrier. Exp Dermatol . 17(12):1063-72].
이중 보호기능은 외부 자극 및 물질에 대해 신체를 보호하게 되며 이러한 보호기능 때문에 약물 전달에 어려움이 따르게 된다. 결과적으로 기존에 상피세포 성장 인자만을 이용한 제제들은 피부의 보호기능 때문에 효율적으로 피부에 작용하지 못하는 단점이 있다. 이러한 재조합 상피세포 성장인자의 전달에 따른 문제점을 해결하기 위한 다양한 전달방법이 개발되었으나 효과적인 피부 침투에는 한계가 있다.
치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목적 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
최근에는 거대분자를 세포 안으로 운반시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 펩타이드가 개발됨으로써 이를 이용하여 세포 내로 약물전달을 시도하고 있다. 이중 Pep-1 펩타이드는 이러한 세포투과성 펩타이드의 일종으로 인간 후천성 면역결핍 바이러스-1의 역전사 효소로부터 유래된 아미노산 서열 (KETWWETWWTEW)과 시미안 바이러스(Simian virus-40, SV-40) 라지 T 항원의 핵치환 서열(nuclear localization sequence; KKKRKV)을 스페이서 서열(spacer sequence, SQP)로 연결시킨 펩타이드로 알려져 있다 [Morris, M.C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F. and Divita, G. (2001) Nat. Biotech. 19, 1173-1176].
이 밖에도 Tat 펩타이드가 단백질 수송 도메인(protein transducing domain)으로 알려져 있지만, Tat 펩타이드는 수송하고자 하는 단백질을 자연 상태(native form)가 아닌 3차원 구조가 풀린 변형 상태(denatured form)로 세포 내로 이동시킨다고 알려져 있다. 이렇게 3차원 구조가 풀린 상태의 단백질은 자연 상태의 단백질에 비해 활성에 문제가 있을 수 있다.
한편, 모든 단백질이 단백질 수송도메인과 융합 단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 2001년, 2004년 그리고 2007년에, Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는다는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다 [Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등]. 즉, 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 단백질 수송도메인을 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타낸다고 단정할 수는 없는 것이다.
본 발명은 섬유아세포 성장인자 FGF2와 PEP-1 펩타이드를 결합하여 FGF2를 세포 및 피부 내로 탁월하게 투과시킬 수 있는 융합 단백질 및 이의 제조방법을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 섬유아세포 성장인자 FGF2와 PEP-1 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질을 제공한다.
상기 피부 투과성 융합 단백질에 있어서, 상기 FGF2는 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이 좋다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 FGF2 전체 서열 중 일부 서열을 제외한 나머지 서열로서, 주요 활성 발현 부위이다.
상기 피부 투과성 융합 단백질은, 티오레독신(thioredoxin, Trx)이 더 결합될 수 있다. 티오레독신은 목적 단백질의 용해도 및 안정도를 향상시킬 수 있기 때문이다. 티오레독신의 구조, 아미노산 서열 및 핵산 서열은 널리 공지되어 있어, 이에 대한 기재는 생략하기로 한다.
한편, 염기성 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast growth factor) FGF2는 여러 섬유아세포 성장인자 중 하나이며, 최적의 몸 상태를 유지하는데 필수적인 요소로 널리 알려져 있고, 그 구조로서 아미노산 서열 및 핵산 서열 또한 공지되어 있다.
FGF2는 인체 내의 혈관, 근육, 뼈나 신경세포 등의 여러 가지 세포에 작용해 세포의 증식이나 분화를 촉진하는 성질을 가지며, 강력한 혈관신생작용 및 신경세포 보호 작용을 가지고 있다. 또한, 생체 내에서 손상이 일어날 경우 그 치유를 위해서는 반드시 필요한 물질로 화상, 욕창 및 피부 상처 등에 뛰어난 효과를 나타내는 것이 대표적이다. 피부 생리 활성 부분에서는 피부 세포의 노화로 감소한 활성 증대, 시술 및 상처 후 재생, 콜라겐 합성 촉진에 효과적이고 모발 부분에서는 모낭세포의 수와 성장에 도움을 주어 모발의 형성과 재생, 건강한 검은 모발 유지에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 다만, FGF2 자체로는 피부 세포로의 전달에 대한 한계가 있다.
이에, 본 발명은 상기 문제점을 해결하고자, FGF2에 PEP-1 단백질을 융합하여 FGF2를 세포 및 피부 내로 탁월하게 침투시킬 수 있는 융합 단백질을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
하기 본 발명의 실험예에 의하면, SP1-FGF2는 FGF2와 동일한 생리활성, 세포증식 정도를 가지면서, 세포 및 피부 침투 능력은 FGF2 보다 매우 탁월함을 확인할 수 있었다. 이로부터, 본 발명의 SP1-FGF2는 FGF2의 주름 개선능 및 모발 성장 촉징능을 우수하게 발휘할 것으로 판단되었다.
한편, 본 발명은 PEP-1 펩타이드 및 FGF2가 융합된 융합 단백질을 생산하기 위해, 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2를 암호화하는 유전자 및 PEP-1 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계 (A); 및 상기 재조합 벡터로 호스트를 형질전환시킨 후, 배양하여 PEP-1 펩타이드 및 FGF2가 융합된 융합 단백질을 생산하는 단계 (B);를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 본 발명의 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 FGF2는 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이 좋다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 FGF2 전체 서열 중 일부 서열을 제외한 나머지 서열로서, 주요 활성 발현 부위이다.
상기 본 발명의 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 티오레독신(thioredoxin, Trx)을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 티오레독신은 목적 단백질의 용해도 및 안정도를 향상시킬 수 있다. 다만, 티오레독신을 사용할 경우, 추가적으로 단백질분해효소를 처리하여 티오레독신을 제거해 줘야 하는 번거로움이 있기는 하다.
상기 본 발명의 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 배양은, 35~39℃, pH 7.0~8.0, 200~700 rpm, 0.5~1.5 vvm, 20<DO<100%의 조건으로 수행하는 것이 좋다. 이때, 상기 배양은 회분식 배양 또는 유가식 배양일 수 있다. 본 발명의 실험에 의할 경우, 이와 같은 조건으로 발효기를 운전하여 회분 배양할 경우, 플라스크를 이용하여 회분 배양을 하는 경우보다 균체 생산량이 현저히 높아짐을 확인할 수 있었기 때문이다.
상기 본 발명의 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 벡터는, pET21 벡터인 것이 좋다. 다른 벡터를 사용하는 것에 비해 SP1-FGF2의 생산 수율이 높게 나타났기 때문이다. pET21 벡터는 상용벡터로서, 당업자가 용이하게 입수할 수 있으므로, 이에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
한편, 본 발명은 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 피부 투과성 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 주름 개선용 또는 발모 촉진용일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 FGF2는 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이 좋다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 FGF2 전체 서열 중 일부 서열을 제외한 나머지 서열로서, 주요 활성 발현 부위이다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 일 예로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"융합 단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목적 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목적 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
본 발명에서의 "단백질 수송도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 펩타이드, 단백질 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
"목적 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는, 수송 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목적 단백질 복합체의 목적 단백질 부분을 의미한다. 목적 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 'FGF2'를 의미한다.
본 발명의 "PEP1-FGF2 융합 단백질"이란 PEP-1과 FGF2를 포함하며, PEP-1과 목적 단백질(즉, 본 발명에서는 FGF2를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 이 융합 단백질에 대해 "PEP1-FGF2", "SP1-FGF2 (정제된 PEP1-FGF2)"와 혼용하였다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하여 기재하였다.
본 발명에 의할 경우, 섬유아세포 성장인자 FGF2와 PEP-1 펩타이드를 결합하여 FGF2가 세포 및 피부 내로 탁월하게 투과시킬 수 있는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 함유하여 주름 개선 효과 및 발모 촉진 효과를 발휘하는 화장료 조성물을 제공할 수도 있다.
도 1은 제작된 pMal-TEV 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스이다.
도 2는 제작된 pET32-(PEP1-FGF2) 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스(서열)이다.
도 3은 제작된 pET21-(PEP1-FGF2) 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스이다.
도 4는 제작된 일반 형태 (Normal) FGF2 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스이다.
도 5는 재조합된 4개 발현 유전자의 목적 단백질로의 발현 유무를 SDS-PAGE 전기 영동 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 재조합된 4개 발현 유전자 {pET32-(PEP1-FGF2), pET21-(PEP1-FGF2), pET15-FGF2, pMAL-TEV}의 목적 단백질로의 발현 유무를 His Tag probe 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 재조합된 3개 발현 유전자 {(pET32-(PEP1-FGF2), pET21-(PEP1-FGF2), Nomal FGF2}의 목적 단백질로의 발현 유무를 FGF2 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 8은 Trx-PEP1-FGF2(pET32)의 Ni2+-NTA 친화 컬럼 정제 결과이다 (A ; Liquid chromathography curve, B ; Fraction SDS-PAGE).
도 9는 Trx-PEP1-FGF2의 TEV 처리 조건 및 결과이다.
도 10은 TEV 처리된 Trx-PEP1-FGF2(pET32)의 헤파린(Heparin) 친화 컬럼 정제 결과이다 (A ; Liquid chromathography curve, B ; Fraction SDS-PAGE).
도 11은 발현된 PEP1-FGF2(pET32) 단백질의 정제 단계를 나타낸 과정도이다.
도 12는 발현된 PEP1-FGF2(pET21)의 Ni2 +-NTA 친화 컬럼 정제 결과이다 (A ; Liquid chromathography curve, B ; Fraction SDS-PAGE).
도 13은 발현된 PEP1-FGF2(pET21), Nomal FGF2, TEV 단백질의 정제 단계를 나타낸 과정도이다.
도 14는 최종 정제된 SP1-FGF2(pET32)의 순도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 15는 최종 정제된 SP1-FGF2(pET21)의 순도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 16은 최종 정제된 SP1-FGF2(pET32), SP1-FGF2(pET21)의 내독성 정량 시험 결과이다.
도 17은 SP1-FGF2의 생리활성 측정결과이다.
도 18은 SP1-FGF2의 Erk 활성 및 Bax 세포 사멸 억제 효과 측정결과이다.
도 19는 SP1-FGF2의 세포증식 능력을 정량적으로 측정한 결과이다.
도 20은 SP1-FGF2의 세포증식 능력을 정성적으로 측정한 결과이다.
도 21은 SP1-FGF2의 세포 내 침투 능력을 형광현미경 관찰을 통해 확인할 결과이다.
도 22는 SP1-FGF2의 세포 내 침투 능력 정도를 확인한 결과이다.
도 23은 돼지 피부에서 SP-FGF2의 피부 조직 침투 효능을 확인한 결과이다.
도 24는 피부 투과율(Skin permeability) 분석 킷트 이용한 SP1-FGF2의 피부침투 효율을 확인한 결과이다.
도 25는 SP1-FGF2의 보관 온도별 장기보관 안정성 시험 결과이다.
도 26은 회분식 배양 과정에서의 발효조 내의 용존산소(DO) 및 RPM 변화를 확인한 결과이다.
도 27은 회분식 배양 과정에서의 세포 성장 패턴(cell growth pattern) 그래프이다.
도 28은 대량 생산된 SP1-FGF2 정제 산물(10batch)의 순도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 29는 대량 생산된 SP1-FGF2 정제 산물(10batch)의 활성도를 검사한 결과이다.
도 2는 제작된 pET32-(PEP1-FGF2) 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스(서열)이다.
도 3은 제작된 pET21-(PEP1-FGF2) 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스이다.
도 4는 제작된 일반 형태 (Normal) FGF2 발현 플라스미드의 유전자 구조 및 시퀀스이다.
도 5는 재조합된 4개 발현 유전자의 목적 단백질로의 발현 유무를 SDS-PAGE 전기 영동 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 재조합된 4개 발현 유전자 {pET32-(PEP1-FGF2), pET21-(PEP1-FGF2), pET15-FGF2, pMAL-TEV}의 목적 단백질로의 발현 유무를 His Tag probe 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 재조합된 3개 발현 유전자 {(pET32-(PEP1-FGF2), pET21-(PEP1-FGF2), Nomal FGF2}의 목적 단백질로의 발현 유무를 FGF2 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 8은 Trx-PEP1-FGF2(pET32)의 Ni2+-NTA 친화 컬럼 정제 결과이다 (A ; Liquid chromathography curve, B ; Fraction SDS-PAGE).
도 9는 Trx-PEP1-FGF2의 TEV 처리 조건 및 결과이다.
도 10은 TEV 처리된 Trx-PEP1-FGF2(pET32)의 헤파린(Heparin) 친화 컬럼 정제 결과이다 (A ; Liquid chromathography curve, B ; Fraction SDS-PAGE).
도 11은 발현된 PEP1-FGF2(pET32) 단백질의 정제 단계를 나타낸 과정도이다.
도 12는 발현된 PEP1-FGF2(pET21)의 Ni2 +-NTA 친화 컬럼 정제 결과이다 (A ; Liquid chromathography curve, B ; Fraction SDS-PAGE).
도 13은 발현된 PEP1-FGF2(pET21), Nomal FGF2, TEV 단백질의 정제 단계를 나타낸 과정도이다.
도 14는 최종 정제된 SP1-FGF2(pET32)의 순도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 15는 최종 정제된 SP1-FGF2(pET21)의 순도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 16은 최종 정제된 SP1-FGF2(pET32), SP1-FGF2(pET21)의 내독성 정량 시험 결과이다.
도 17은 SP1-FGF2의 생리활성 측정결과이다.
도 18은 SP1-FGF2의 Erk 활성 및 Bax 세포 사멸 억제 효과 측정결과이다.
도 19는 SP1-FGF2의 세포증식 능력을 정량적으로 측정한 결과이다.
도 20은 SP1-FGF2의 세포증식 능력을 정성적으로 측정한 결과이다.
도 21은 SP1-FGF2의 세포 내 침투 능력을 형광현미경 관찰을 통해 확인할 결과이다.
도 22는 SP1-FGF2의 세포 내 침투 능력 정도를 확인한 결과이다.
도 23은 돼지 피부에서 SP-FGF2의 피부 조직 침투 효능을 확인한 결과이다.
도 24는 피부 투과율(Skin permeability) 분석 킷트 이용한 SP1-FGF2의 피부침투 효율을 확인한 결과이다.
도 25는 SP1-FGF2의 보관 온도별 장기보관 안정성 시험 결과이다.
도 26은 회분식 배양 과정에서의 발효조 내의 용존산소(DO) 및 RPM 변화를 확인한 결과이다.
도 27은 회분식 배양 과정에서의 세포 성장 패턴(cell growth pattern) 그래프이다.
도 28은 대량 생산된 SP1-FGF2 정제 산물(10batch)의 순도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 29는 대량 생산된 SP1-FGF2 정제 산물(10batch)의 활성도를 검사한 결과이다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
제조예
1:
TEV
프로테아제(
protease
)의 유전자 함유
pMal
-
TEV
벡터 제작]
본 발명에서 TEV 프로테아제는 융합 단백질에 결합되어 있는 티오레독신의 절단을 위해 사용된다. TEV 프로테아제(protease)의 발현을 위한 발현 벡터는 TEV의 cDNA 서열에 기초하여 발현 벡터인 pMal 벡터에 TEV 유전자를 결합시킴으로써 제조하였다.
센스 개시체 5'-CGAGGGAAGGCTCGAGGGAGAAAATCTTTATTTTCA-3'는 Xho 제한효소 절단부위를 함유하고, 안티센스 개시체 5'-TCTAGAGG ATCCTTATTAGCGACGGCGAC-3'는 BamH 제한효소 절단부위를 가진다. PCR이 수행되고 PCR 생성물을 TA-클로닝 벡터에 연결하였다. 그 후 Xho I과 BamH으로 절단하고, 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 용출시켰다. T4 DNA 리가아제를 이용하여 상기 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 pMal 벡터에 연결하고, E. coli DH5 alpha 세포에 형질전환시켰으며, 형질전환된 박테리아로부터 pMal-TEV 발현 플라스미드 수득하였다 (도 1).
[
실시예
1:
pET32
-(
PEP1
-
FGF2
)
벡터 제작]
섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 (서열번호 1) 및 PEP-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV, 서열번호 2) 펩타이드의 융합 단백질 (PEP1-FGF2) 생산을 위한 발현 벡터는 FGF2의 cDNA 서열에 기초하여 두 개의 개시체를 합성함으로써 제작될 수 있었다.
서열번호 1은 FGF2 전체 서열 중 일부 서열을 제외한 나머지 아미노산 서열로서, 주요 활성 발현 부위인데, 본 발명에서는 이 서열번호 1로 기재된 FGF2 서열을 사용하였다. 이하, 하기 실시예들 및 비교예에서도 동일한 서열번호 1의 FGF2 서열을 사용하였다.
발현 벡터는 pET32 벡터를 모벡터로 하는데 발현 벡터 내에 Trx가 태깅되어 있다. 센스 개시체 5'-GAGGTCTCCTCGAGCCCGCCTTGCCCGAGGAT-3'는 Xho 제한효소 절단부위를 함유하고, 안티센스 개시체 5'-GGAGGTCTCGGATCCTCAGCTCTTAGCAGACAT-3'는 BamH 제한효소 절단부위를 가진다. PCR이 수행되고 PCR 생성물을 TA-클로닝 벡터에 연결하였다. 그 후 Xho I과 BamH으로 절단하고, 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 용출시켰다. 그 후, T4 DNA 리가아제를 이용하여 상기 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 pET32b 벡터에 연결하고, E.coli DH5 alpha 세포에 형질전환시켰으며, 형질전환된 박테리아로부터 재조합 벡터를 정제하여 얻었다.
그 후, PEP-1 펩타이드와의 융합을 위하여 TCS(TEV protease cleavage site) 및 제한 효소 부위 Bgl II/Xho I이 포함된 5'-GAAGGTCTCAGATCTGGAGAA TCTTTATTTTCAGGGCGTCGACAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGGAGCTCCCTCGAGTATAT-3'을 합성하여 PEP-1 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 올리고 뉴클레오타이드를 제조하였다. 이중사슬 올리고 뉴클레오타이드 (PEP-1)와 pET32b-FGF2 벡터는 제한효소 Bgl II/Xho I으로 잘라 각각 용출한 후 이 둘을 직접 연결하여 pET32-(PEP1-FGF2) 발현 플라스미드를 제조하였다 (도 2).
[
실시예
2:
pET21
-(
PEP1
-
FGF2
) 벡터 제작]
섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 및 PEP-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) 펩타이드의 융합 단백질 (PEP1-FGF2) 발현을 위한 단백질 발현 벡터는 FGF2의 cDNA 서열에 기초하여 두 개의 개시체를 합성함으로써 제조하였다.
이때, 발현 벡터는 pET21 벡터를 모벡터로 하며, 센스 개시체 5'-GAGGTCTCGGATC CCCCGCCTTGCCCGAGGAT-3'는 BamH 제한효소 절단부위를 함유하고, 안티센스 개시체 5'-GGAGGTCTCCTCGAGTCAGCTC TTA GCAGACAT-3'는 Xho제한효소 절단부위를 가진다. PCR이 수행되고 PCR 생성물을 TA-클로닝 벡터에 연결하였다. 그 후 BamH과 Xho으로 절단하고, 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 용출시켰다. T4 DNA 리가아제를 이용하여 상기 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 pET21b 벡터에 연결하고, E.coli DH5 alpha 세포에 형질전환시켰으며, 형질전환된 박테리아로부터 결합된 벡터를 정제하여 얻었다.
그 후, PEP-1 펩타이드와의 융합을 위하여 제한 효소 부위 Nde I/ BamH이 포함된 5'-GGAGGTCTCCATATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGGGATCCCCTCGAGTATAT-3'을 합성하여 PEP-1 펩타이드를 코딩하는 이중사슬 올리고 뉴클레오타이드를 제조하였다. 이중사슬 올리고 뉴클레오타이드 (PEP-1)와 pET21b-FGF2 벡터는 제한효소 Nde I/BamH으로 잘라 각각 용출한 후 이 둘을 직접 연결하여 pET21-(PEP1-FGF2) 발현 플라스미드를 제조하였다 (도 3).
[비교예 1: 비 피부 투과성 유전자(Normal
FGF2)의 재조합]
비 피부투과성 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(Normal Human Basic Fibroblast Growth Factor1; Normal FGF2)는 피부 투과성 인간 섬유아세포 성장인자 (PEP1-FGF2)와의 효능 및 효과 비교를 목적으로 재조합 단백질 발현 벡터에 이 유전자를 클로닝하여 제작하였다.
Normal FGF2 펩타이드의 재조합 단백질 발현을 위한 단백질 발현벡터는 FGF2의 cDNA 서열에 기초하여 발현 벡터인 pET15b 벡터에 결합시킴으로써 제조하였다.
센스 개시체 5'-GAGGTCTCCTCGAGCCCGCCTTGCCCGAGGAT-3'는 Xho 제한효소 절단부위를 함유하고, 안티센스 개시체 5'-GGAGGTCTCGGATCCTCAGCTCTTAGCAGACAT-3'는 BamH 제한효소 절단부위를 가진다. 중합효소 체인반응(PCR)이 수행되고 중합효소 체인반응 생성물을 TA-클로닝 벡터에 연결하였다. 그 후 Xho I과 BamH으로 절단하고, 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 용출시켰다 (Invitek, Berlin, German). T4 DNA 리가아제 (Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 이용하여 상기 절단된 올리고 뉴클레오타이드를 pET15b 벡터에 연결하고, E.coli DH5 alpha 세포에 형질전환시켰으며 형질전환된 박테리아로부터 결합된 벡터를 정제하여 비 피부 투과성 FGF2 발현 플라스미드를 제조하였다 (도 4).
[실험예 1: 재조합된 유전자의 단백질 발현]
본 실험예에서는 상기 제조예 1, 실시예 1, 2 및 비교예 1에서 제조된 재조합 벡터로부터 해당 단백질을 발현하고자 하였다.
재조합된 4개의 발현 벡터들을 각각 E. coli Rosetta-gami 2 (DE3) 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아 세포는 37℃에서 1,000 ㎖의 암피실린 포함 LB배지에서 OD600 값이 0.6이 될 때까지 배양하였고, 22℃에서 0.5mM IPTG를 도입하여 24시간 동안 추가 배양하였다.
각각의 목적 단백질 발현 유무 확인은 IPTG에 첨가에 의한 목적 단백질의 유도 발현 전과 후의 배양 세포들을 샘플링하여 SDS-PAGE 전기 영동 분석 및 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 분석을 통해 확인하였다.
실험결과, 도 5 내지 7에서 확인되는 바와 같이, pET32-(PEP1-FGF2)는 37 kDa, pET21-(PEP1-FGF2)는 21 kDa, Normal FGF2는 19 kDa, TEV는 25 kDa의 크기를 가지는 단백질이 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 5 내지 7).
[실험예 2: 유도 발현된 단백질의 정제]
본 실험예에서는 상기 실험예 1에서 각각 발현된 단백질에 대하여 세포 파쇄 및 내독소(endotoxin) 제거 공정 실시 후, His tag 및 헤파린(Heparin) 친화 컬럼을 이용하여 목적 단백질만을 순수 분리 정제하고자 하였다.
(1)
pET32
-(
PEP1
-
FGF2
)로부터 목적 단백질
PEP1
-
FGF2
정제
pET32-(PEP1-FGF2) 함유 세포를 1X Native 완충액 (50mM NaPO4, 0.5M NaCl)에서 초음파기를 이용하여 파괴한 후, 이것을 원심분리하여 응집체(inclusion body)와 세포질 (상청액)로 분리하였다. 분리된 세포질은 내독성(Endotoxin)을 제거하기 위하여 Triton X-114를 최종(Final) 2%가 되도록 첨가한 후 원심분리하여 내독성(Endotoxin)이 제거된 세포질만을 얻었다.
그 후, 목적 단백질의 His6 tagging 특성을 이용하여 Ni2+-NTA 친화 컬럼 (Nitrilotriacetic acid Sepharose affinity column, GE Healthcare, USA)으로 정제하였다 (도 8). 1차 정제하여 얻어진 분획(fraction)은 Trx-His6-PEP1-FGF2로서 Trx를 제거하기 위하여 정제된 TEV 프로테아제(protease)를 처리한 후 (도 9), 목적 단백질의 헤파린 결합(heparin binding) 특성을 이용하여 헤파린(Heparin) 친화컬럼 (Heparin Sepharose affinity column, GE Healthcare, USA)으로 순수 PEP1-FGF2만을 2차 정제하였다. 그 후, 안정화 버퍼 (50mM NaPO4, 0.1M NaCl, 10% Glycerol, pH 7.5)를 이용하여 투석을 실시하였다 (도 10). 여기서 얻어진 최종 산물(product)을 SP1-FGF2(pET32)라 명명하였다 (도 11 참조).
(2)
pET21
-(
PEP1
-
FGF2
)로부터 목적 단백질 PEP1-FGF2 정제
pET21-(PEP1-FGF2) 함유 세포를 1X Native 완충액 (50mM NaPO4, 0.5M NaCl)에서 초음파기를 이용하여 파괴한 후, 이것을 원심분리하여 응집체(inclusion body)와 세포질 (상청액)로 분리하였다. 분리된 세포질은 내독성(Endotoxin)을 제거하기 위하여 Triton X-114를 최종(Final) 2%가 되도록 첨가한 후, 원심분리하여 내독성(Endotoxin)이 제거된 세포질만을 얻었다.
그 후, 목적 단백질의 His6 tagging 특성을 이용하여 Ni2+-NTA 친화 컬럼 (Nitrilotriacetic acid Sepharose affinity column, GE Healthcare, USA)으로 순수 PEP1-FGF2만을 정제하였다 (도 12). 그 후, 안정화 버퍼 (50mM NaPO4, 0.4M NaCl, 2mM EDTA, 10% Glycerol, pH 7.5)를 이용하여 투석을 실시하였다. 여기서 얻어진 최종 산물(product)을 SP1-FGF2(pET21)라 명명하였다 (도 13 참조).
(3) Normal FGF2, TEV 프로테아제의 정제
상기 pET21-(PEP1-FGF2) 단백질의 정제 방법과 동일한 방법을 이용하여 Normal FGF2, TEV 프로테아제를 정제하였다.
[실험예 3: 순도 분석]
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 정제된 SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21)의 순도를 분석하고자 액체크로마토그래피(HPLC)를 실시하였다.
순도를 알고자 하는 샘플, 이동상에 해당하는 용매로는 극성용매로 물과 아세토나이트릴(ACN), 컬럼으로는 역상친수성 컬럼인 C18을 사용하였고, HPLC 조건은 하기 표 1과 같았다. 용매는 물과 아세토나이트릴(ACN)에 산안정성을 위해 트리플루오르아세트산(Trifluoroacetic acid)을 각 0.1%씩 첨가하여 준비하고 기포 제거 후 사용하고, 샘플은 필터 후 바이알에 각각 주입하여 준비하였다. 기기는 분리과정 전에 안정화를 시켜주기 위해 100% 아세토나이트릴로 펌프를 2~3회 세척(washing)하고 C18 컬럼을 장착시킨 후, 압력과 온도가 안정화 될 때까지 아세토나이트릴을 흘려주었다. 압력이 안정화되면 프로그램을 설정하고 UV/VIS 디텍터(detector)에서 검출하기 위한 파장(280 nm)을 결정하여 시간대별 반응의 크기를 측정함으로 단백질의 순도를 파악하였다.
| Column | Protein C18 (Waters, 4.6×250 mm) | ||
| Column Temperature | Room temperature | ||
| Eluent A | 0.1% TFA in water | ||
| Eluent B | 0.1% TFA in Acetonitrile | ||
| Gradient | Time (min) | %A | %B |
| 0 | 95 | 5 | |
| 30 | 0 | 100 | |
| 33 | 0 | 100 | |
| 35 | 95 | 5 | |
| 45 | 95 | 5 | |
| Flow Rate | 1 ㎖/min | ||
| Detection | 280 nm | ||
| Injection volume | 20 ㎕ | ||
실험결과, SP1-FGF2(pET32)는 99.3% (도 14), SP1-FGF2(pET21)는 95.2% (도 15)의 고순도를 가짐을 확인할 수 있었다. 이는 현재 화장품 원료 시장에 유통되는 동일한 성장인자 원료들의 순도보다 동등하거나 높은 순도라고 판단되었다.
[실험예 4: 내독성 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 정제된 SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21)의 내독성을 측정하기 위하여 생물학적내독소시험(Limulus Amebocyte Lysate (Lonza, Swiss))를 수행하였다. 측정 방법은 제품 사용 설명서에 기재된 프로토콜을 이용하였다.
한편, 연구용으로 판매되는 성장 인자(growth factor)의 평균 내독성 레벨(Endotoxin level)은 1 EU/㎍ (1,000 EU/mg)이다 (회사명 : Sigma, Genscript, Cell signaling).
실험결과, SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21) 두 산물 모두 1 ㎍당 1EU 이하의 내독성이 측정됨을 확인할 수 있었다 (도 16).
상기와 같은 결과로부터, SP1-FGF2는 피부 독성 가능성이 적어 화장품 원료에 사용하기 적합할 것으로 판단되었다.
[실험예 5: 생리활성 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 정제된 SP1-FGF2(pET21)의 생리활성을 측정하고자 섬유아세포의 수용체 결합 정도를 정성적으로 확인하였다.
섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor)인 FGF2는 세포 내로 들어가게 되면 Erk와 같은 수용체와 결합하여 인산화반응(phosphorylation)이 일어나는데, 이러한 생리 활성 특성을 이용 SP1-FGF2의 수용체 결합 활성도를 알아보고자 하였다.
마우스 섬유아세포 (Balb/c3T3 Clone A31 Cell)에 각 단백질을 농도별 (1, 10, 100 ng/㎖)로 처리하여 세포의 수용체 활성도를 측정하였다. 인간 섬유아세포는 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하였고, 얻어진 섬유아세포 성장인자 융합 단백질과 비교를 위하여 Normal FGF2를 동시에 처리하였고, FGF2 수용체 기질 인산화 항체(P-p44/42 MAPK(Erk1/2)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
또한, 추가적으로 미토콘드리아에서 세포 사멸 시 진행되는 Bax의 발현 정도가 SP1-FGF2 첨가에 의해 어느 정도 억제되는지를 Normal FGF2와 비교하였다.
그 결과, 제조된 SP1-FGF2(pET21)는 Normal FGF2와 비교하여 인산화 정도가 동등한 형태로 나타남을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과로부터, 개발된 SP1-FGF2가 Normal FGF2와 같은 동일한 생리 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다 (도 17).
또한, p-Erk 및 Bax에 대한 웨스턴 블랏 분석의 밴드 강도(band intensity)를 비교 분석한 결과, Normal FGF2에 비해서 SP1-FGF2(pET21)의 p-Erk의 활성이 더 높고 Bax의 발현 정도가 낮음을 확인함으로써 SP1-FGF2(pET21)가 Normal FGF2에 비해 세포 증식 증대 및 세포 사멸 억제에 효과가 더 뛰어남을 확인 할 수 있었다 (도 18).
[실험예 6: 세포 증식 능력 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 정제된 SP1-FGF2(pET32), SP1-FGF2(pET21)의 세포 증식 능력을 측정하고자 하였다.
(1) 정량적 활성도 측정 -
Cell
proliferation
activity
test
SP1-FGF2에 의한 세포 증식 효과를 측정하기 위하여 마우스 섬유아세포 (NIH3T3 cell)에 대해 각각의 정제된 단백질을 농도별로 처리하여 세포의 성장률을 측정하였다.
마우스 섬유아세포는 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하고, 각각의 재조합 단백질을 농도별로 처리한 후, 24시간을 배양하는 방법으로 진행하였으며, 자세한 방법으로는 10% FBS 무혈청 배지(media)가 100 ㎕씩 담겨져 있는 96 웰 플레이트(well plate)에 NIH3T3 세포(cell)를 106개/well로 넣고 24시간 배양한 후, 0% FBS 무혈청 배지(media)로 옮겨 20시간 정도 스타베이션(Starvation)을 주었다.
그 후 Normal-FGF2, SP1-FGF2(pET21), SP1-FGF2(pET32) 단백질을 최대 60 ng/㎖ 농도부터 3배씩 희석하여 준비하여 각 웰(well)에 넣어서 24시간 처리하였다. 최종 측정을 위해 WST assay (Takara, Otsu, Shiga, Japan) 제품을 이용하였고, 그 방법은 제품 사용설명서에 의거하여 수행하였으며, ED50 농도를 보이는 흡광도의 단백질 처리 농도를 1 unit으로 정하여 정량하였다.
실험 결과, 정제된 Normal FGF2, SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21)에 대하여 1 × 106 Unit/mg 이상의 비슷한 세포 증식 활성도를 보임을 확인할 수 있었다 (도 19).
(2)
정성적 활성도 측정 - Cell proliferation 현미경 관찰
SP1-FGF2에 의한 세포 증식 효과를 정성적으로 확인하기 위하여 Balb/c3T3 Clone A21 cell에 대해 각각의 정제된 단백질을 농도별로 처리하여 세포의 성장 상태를 현미경으로 관찰하였다.
자세한 방법으로는 10% FBS 무혈청 배지(media)가 2 ㎖씩 담겨져 있는 6 웰 플레이트(well plate)에 Balb/c3T3 Clone A21 cell을 105개/well로 넣고 24시간 배양 후, 0% FBS 무혈청 배지(media)로 옮겨 20시간 정도 스타베이션(Starvation)을 주었다.
그 후, Normal-FGF2, SP1-FGF2(21b), SP1-FGF2(32b) 단백질을 최대 0, 1, 10, 100 ng/㎖ 농도로 각 웰(well)에 첨가한 후, 24시간 추가 배양 뒤에 각 웰(well)을 현미경으로 관찰하여 세포 증식 정도를 확인하였다.
실험 결과, 정제된 Normal FGF2, SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21)가 동일한 세포 성장을 보임을 확인할 수 있었다 (도 20).
[
실험예
7: 세포 침투 능력 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 정제된 SP1-FGF2(pET21)의 세포 침투 능력을 측정하고자 NIH3T3 세포 및 형광 항체를 반응시켜 현미경 관찰을 하였다.
SP1-FGF2(pET21) 융합 단백질의 세포 내 침투 여부를 확인하고자, 5M 농도로 단백질을 피브로블라스트 세포주 (fibroblast cell line)인 NIH3T3 세포에 2시간 동안 처리하였다. 상기와 같이 처리된 세포들을 고정액에 고정하였으며, 고정된 세포는 3% BSA로 블락킹(blocking)을 하였고, 1차 항체는 Anti-His probe를, 2차 항체로는 Gota anti rabbit IgG-Alexa 488을 이용하여 면역반응을 완료하였다. 반응이 완료되어 제작된 시료는 현미경 관찰을 위하여 세포의 핵(대비 염색제 : 청색)과 FGF2 단백질(히스티딘 : 녹색)을 염색한 후, 형광 현미경으로 관찰하였다.
실험결과, 도 21에서 확인되는 바와 같이, 대조군(Control) 및 Normal FGF2 [Alexa(A, B) or Merged(A, B)]는 세포 내 침투가 이루어지지 않은 반면 SP1-FGF2(pET21) [Alexa(C), merged(C)]은 세포 내 투과가 효과적으로 일어났음을 확인할 수 있었다 (도 21).
또한, 상기 현미경 관찰 후, 형광 사진으로부터 녹색 형광 강도를 정량화한 결과, SP1-FGF2(pET21) 융합 단백질이 Normal FGF2 보다 더 효율적으로 세포 내로 투과되는 것을 확인할 수 있었다 (도 22).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 SP1-FGF2 융합 단백질은 세포 침투성 펩타이드에 의해 세포 내 침투가 원활함을 알 수 있었다.
[실험예 8: 피부 침투 능력 측정]
본 실험예에서는 SP1-FGF2 융합 단백질의 피부 침투 능력을 측정하고자 하였다.
(1) 돼지 피부를 이용한 면역형광 염색법
조직 염색을 통한 SP1-FGF2의 피부 투과성 분석을 위해서, 돼지 피부(Porcine skin)를 이용한 프란츠 셀(Franz cell)에 동일한 양 (500 ㎍)의 Normal FGF2와 SP1-FGF2(pET21)를 처리하였다.
24시간 뒤에 프란츠 셀(Franz cell) 사이에 있는 돼지피부를 꺼내어 증류수에 세척한 뒤 조직염색 과정을 진행하였다. 도너 세포(Donor cell)에 노출된 돼지피부 부위를 절단한 뒤에 10% 버퍼드 포르말린(buffered formalin)에서 고정시킨 뒤 파라핀 블록(paraffin block)을 제조하였으며, 마이크로톰(Microtome)을 이용하여 7 m로 조직을 구분(section)하였다.
그 후, 슬라이드 위에 조직을 마운팅(mounting)한 다음 파라핀을 제거하고, 수화과정을 거친 후 조직 구분(section)을 30분간 블락킹(blocking)하였다. 블락킹(Blocking)이 끝난 조직에 anti-FGF2 antibody (Cell signaling, green) 처리하여 4℃에서 18시간 반응시켰다.
다음날, PBST로 씻어준 다음 Alexa Fluor 488 2차 항체를 상온에서 2시간 처리하고, PBST로 다시 한번 씻어주었다. 이후, 대조 염색을 위해 Hoechst 33342 (blue)로 상온에서 10분간 반응한 후, 형광 배지(fluorescence medium)로 봉입하고 형광 현미경으로 관찰하였다.
실험결과, Normal FGF2는 돼지 피부 조직 내로 전혀 전달되지 않음에 반해, 본 발명의 SP1-FGF2(pET21)는 돼지 피부 조직의 피부 내로 효율적으로 전달이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 23).
(2) Skin-PAMPA를 이용한 침투 효율 측정
피부 투과 분석을 위한 동물실험대체법으로 각질층의 주 성분인 지질 매트릭스 멤브레인(Lipid matrix membrane)이 부착된 인공피부를 이용한 피부 투과성 검사 킷트(Skin PAMPA, Pion)를 이용하였다.
스킨 팜파 플레이트(Skin PAMPA plate)는 사용 전 멤브레인(membrane)을 하이드레이션(hydration) 시킨 후, 바텀 플레이트(bottom plate, donor plate)에 동일한 양 (100 ㎍)의 Normal FGF2와 SP1-FGF2(pET21)를 각각 처리하였다.
12시간 및 24시간 뒤에 도너 플레이트(donor plate)에서 어셉터 플레이트(acceptor plate)로 투과된 단백질을 UV 스펙트로미터(UV spectrometer)를 이용하여 측정하였다. 기타 시험 방법은 키트의 시험법을 참조하여 시험하였다.
실험결과, Nomal FGF2의 피부조직 투과 능력이 0.12%임에 반해, SP1-FGF2(pET21)의 피부조직 투과 능력은 5.4%로, SP1-FGF2(pET21)의 탁월한 피부 투과 능력을 확인할 수 있었다 (도 24).
[실험예 9: 장기 보관 안정성 시험]
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 정제된 SP1-FGF2(pET21)의 장기 보관 안정성 시험을 실시하고자 하였다.
SP1-FGF2(pET21)이 담겨져 있는 0.1 mg/vial의 동결건조(Lyophilized) 제형과 100 ppm(100 ㎍/㎖)의 농도로 2 ㎖/vial의 용액(solution) 제형을 무균 상태로 각각의 바이알(vial)에 완전 밀봉 제조하였다. 이후, 냉동(-20℃), 냉장(4℃), 상온(25℃) 및 37℃에 12주간 보관한 후, 시간 및 온도에 따른 장기보관안정성을 세포 증식 테스트(Cell proliferation test)에 의해 측정하였다.
실험결과, 동결건조 제형(Lyophilized product)의 경우, 시험기간 12주 동안 모든 온도에서 QC PASS 기준인 1 × 106 Unit/mg 이상의 활성을 유지하는 것을 확인하였으며, 용액 제형(Solution product)의 경우, 37℃ 보관을 제외하고는 모든 온도에서 QC PASS 기준을 넘어선 활성을 유지함을 확인할 수 있었다 (도 25).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 SP1-FGF2는 화장품 원료로서 적합함을 확인할 수 있었다.
[실험예 10: 대량 생산 공정 개발]
본 실험예에서는 본 발명의 SP1-FGF2를 대량 생산하고자 대량 생산 공정을 개발하였다.
(1) 대량 배양 및 발현 조건 확립
pET21-(PEP1-FGF2)/Rosetta 발현 균주를 대량으로 생산하기 위하여 기초적인 회분식 플라스크 배양 방법이 아닌 발효조를 이용한 회분(Batch fermentation) 배양 방법으로 스케일 업(scale-up)을 시도하였다.
발효조에서의 회분 배양은 10 L 발효조(fermenter)를 사용하여 초기 5 L 작업량(working volume)으로 수행하였다. LB 배지 250 ㎖가 들어있는 멸균된 1L 플라스크(flask)에 종균 배양액 5%가 되도록 접종하여 37℃, 200rpm, 진탕배양기에서 4시간 정도 배양한 후, 하기 표 2와 같이 조성된 배지가 들어있는 멸균된 발효조에 접종하여 37℃, pH 7.0, 200~700rpm, 1.0 vvm, DO>20%의 조건으로 배양을 시작하였다. pH는 4N NH4OH 용액을 이용하여 조절하였고, 거품억제제(antifoam)로 배양 중간에 발생되는 거품의 생성을 억제하였다.
초기 배양 시작 4시간 후, OD600이 6~7이 되는 시점에 배양 온도를 22℃로 서서히 낮춘 후, SP1-FGF2의 단백질을 유도 발현하기 위하여 IPTG를 최종 0.5mM 농도가 되도록 발효조에 첨가하였다. 이후 탄소원인 글루코스(glucose)의 고갈 시점까지 9~10시간의 추가 배양을 실시하였다. 그 후, 최종 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다.
| 화합물 | 농도 | 화합물 | 농도 |
| Fermentation Base Media(FBM) | |||
| Yeast extract | 20 g/L | Pepton | 10 g/L |
| (NH4)2SO4 | 8 g/L | KH2PO4 | 3 g/L |
| Na2HPO4 | 2.78 g/L | NaCl | 0.5 g/L |
| 10% MgCl2.6H2O | 10 ㎖/L | Glucose | 50 g/L |
| TMS | 1 ㎖/L | 100 mg/㎖ Ampicillin | 1 ㎖/L |
| Trace-Element Solution(TMS) | |||
| CaCl2.2H2O | 13.2 g/L | FeSO4.7H2O | 8.4 |
| CuSO4.5H2O | 0.48 g/L | CoCl2.6H2O | 0.48 g/L |
| Na2MoO4.2H2O | 0.24 g/L | H3BO4 | 0.5 g/L |
| 1M HCl | 1L | ||
| # Glucose Fed-Batch Method * 유가식 회분 배양의 FBM에는 모두 동일하게 첨가되나 glucose만 10g/L 첨가 됨 * 배양 과정에서의 부족한 탄소원은 50% glucose, 1L를 멸균한 후 배양 과정에서 pH-shift에 의한 자동 공급 방식으로 공급함. |
|||
실험 결과, 균체 생산량은 배양 배지 1L 당 wet cell weight 80 g (생산 수율 : wcw 80 g/배지 1L)을 얻을 수 있었으며, 이는 플라스크 배양의 생산수율 7 g/L 보다 약 11배 높은 것이며, 유가식 회분 배양의 생산 수율의 경우, 160 g/L로서 플라스크 배양의 약 23배 높은 생산 수율을 나타냈다.
또한, 회분식 배양 과정에서 발효조 내의 용존산소(DO) 및 RPM 변화는 도 26에 나타냈고, 균체 성장 패턴(cell growth pattern)은 도 27에 나타냈다.
(2) 대량 배양시 생산 수율 확인
대량 배양 및 발현에 의해 회수된 균체로부터 목적하는 SP1-FGF2를 순수 분리 정제하고자, 스몰 스케일(small scale) 정제 컬럼 (정제 레진 부피 약 30~100 ㎖)에서 스케일 업(scale up)을 위한 정제 컬럼 (정제 레진 부피 800 ㎖)으로 변경하여 대량 순수 분리 정제를 실시하였다.
SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21)의 정제 방법은 유도 발현된 단백질의 정제의 방법과 동일하게 실시하였으며, 최종 투석 후 최종적으로 얻어지는 wcw g당 생산되는 목적 단백질의 생산 수율을 비교하였다.
실험결과, SP1-FGF2(pET32)는 0.1 mg/g wcw, SP1-FGF2(pET21)는 0.45 mg/g wcw의 생산 수율을 나타냄을 확인할 수 있었는데, SP1-FGF2(pET21)는 SP1-FGF2(pET32)에 비해 4.5배 높게 나타났다. 정제 공정에 있어서도 2단계 정제 공정(His tag affinity purification >> Heparin affinity purification)을 거쳐야 하는 SP1-FGF2(pET32)의 경우 낮은 생산 수율에 더해, 추가 정제 공정 단계가 발생하여 정제 비용 및 시간의 소요가 1단계 정제 공정만 거치는 SP1-FGF2(pET21)보다 높아 비효율적이다. 따라서, 효율적 생산 공정 및 높은 생산 수율을 고려하였을 때 SP1-FGF2(pET21)의 생산이 사업화에 보다 적합한 것으로 판단할 수 있었다.
[실험예 11: 대량 생산된 산물의 순도 분석]
본 실험예에서는 상기 실험예 10에서 순수 분리 정제된 산물의 순도를 분석하고자 하였다.
10 L 발효조를 이용하여 대량 배양 및 회수된 균체를 총 10회에 걸쳐 SP1-FGF2만을 순수 분리 정제하여 10개의 정제 산물을 얻었다. 상기에서 얻어진 10 배치(batch)의 SP1-FGF2에 대한 HPLC 순도 분석을 실시하였으며, 실시 방법은 상기 실험예 3의 SP1-FGF2(pET32) 및 SP1-FGF2(pET21)의 순도 분석의 방법과 동일하였다.
실험결과, 10 배치(batch)의 SP1-FGF2에 대해 모두 95% 이상의 높은 순도를 보여 줌으로 안정적으로 고순도의 SP1-FGF2의 생산 가능함을 확인할 수 있었다 (도 28).
[실험예 12: 대량 생산된 산물의 활성도 검사]
본 실험예에서는 순수 분리 정제된 산물의 활성도 검사를 실시하고자 하였다.
상기 순수 분리 정제하여 얻어진 10 배치(batch)의 SP1-FGF2에 대하여 세포증식을 통한 활성도 검사를 실시하였으며, 실시 방법은 상기 실험예 5의 세포증식 능력 측정 방법과 동일하였다.
실험결과, 10 배치(batch)의 SP1-FGF2에 대해 모두 1×106 Unit/mg(자사 자체 QC Pass 기준) 이상의 높은 활성도를 나타내어, 안정적으로 활성도가 높은 SP1-FGF2의 생산 가능함을 확인할 수 있었다 (도 29).
[실험예 13: 대량 생산된 산물의 내독성 검사]
본 실험예에서는 순수 분리 정제된 산물의 내독성 검사를 실시하고자 하였다.
총 10회에 걸쳐 SP1-FGF2 만을 순수 분리 정제하여 얻어진 10 배치(batch)의 SP1-FGF2에 대하여 Limulus. Amebocyte Lysate (Lonza, Swiss) 테스트를 통한 내독성 검사를 실시하였으며, 실시 방법은 상기 실험예 4의 내독성(endotoxin) 측정 방법과 동일하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
| Sample No. (Conc.10 ㎍/㎖) |
Calc. EU/㎖ |
Calc. EU/㎖ |
| Batch #01 | 8.2 | 0.82 |
| Batch #02 | 5.4 | 0.54 |
| Batch #03 | 7.1 | 0.71 |
| Batch #04 | 3.4 | 0.34 |
| Batch #05 | 9.1 | 0.91 |
| Batch #06 | 7.6 | 0.76 |
| Batch #07 | 4.2 | 0.42 |
| Batch #08 | 6.8 | 0.68 |
| Batch #09 | 8.5 | 0.85 |
| Batch #10 | 7.1 | 0.71 |
실험결과, 10 배치(batch)의 SP1-FGF2에 대해 모두 1 ㎍당 1EU(1EU/㎍) 이하의 내독성(자사 자체 QC Pass 기준)을 나타내어, 안정적으로 피부 독성 가능성이 적은 SP1-FGF2의 생산 가능함을 확인할 수 있었다.
<110> BioCeltran
<120> Fusion protein for improvement of skin permeation, method thereof
and cosmetic composition with the fusion protein
<130> AP-2014-0224
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 146
<212> PRT
<213> Homo sapiens sapiens
<400> 1
Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His
1 5 10 15
Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu
20 25 30
Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp
35 40 45
Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser
50 55 60
Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu
85 90 95
Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr
100 105 110
Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser
115 120 125
Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala
130 135 140
Lys Ser
145
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell permeation peptide
<400> 2
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
Claims (13)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드가 결합되어, FGF2의 세포 및 피부 침투 능력이 증대된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 피부 투과성 융합 단백질은,
티오레독신(thioredoxin, Trx)이 더 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질.
- PEP-1 펩타이드 및 FGF2가 융합된 융합단백질을 생산하기 위해, 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2를 암호화하는 유전자 및 PEP-1 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계 (A); 및
상기 재조합 벡터로 호스트를 형질전환시킨 후, 배양하여 PEP-1 펩타이드 및 FGF2가 융합된 융합 단백질을 생산하는 단계 (B);를 포함하고,
상기 융합 단백질은 FGF2의 세포 및 피부 침투 능력이 증대되며,
상기 FGF2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 PEP-1 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법.
- 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 재조합 벡터는,
티오레독신(thioredoxin, Trx)을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법.
- 제4항에 있어서,
상기 배양은,
35~39℃, pH 7.0~8.0, 200~700 rpm, 0.5~1.5 vvm, 20<DO<100%의 조건으로 수행하는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법.
- 제7항에 있어서,
상기 배양은,
회분식 배양 또는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법.
- 제4항에 있어서,
상기 벡터는,
pET21 벡터인 것을 특징으로 하는 피부 투과성 융합 단백질의 생산방법.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor) FGF2 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드가 결합된 피부 투과성 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고,
상기 피부 투과성 융합 단백질은 FGF2의 세포 및 피부 침투 능력이 증대된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102089754B1 (ko) * | 2018-11-09 | 2020-03-17 | 주식회사 바이오셀트란 | 피부투과성이 개선된 탈모 억제 또는 발모 촉진용 조성물 |
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