KR20240004161A - 신경세포 투과 촉진 활성의 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신경세포 투과성이 향상된 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 신경세포 투과 촉진 펩타이드, 상기 펩타이드에 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 및 상기 융합 펩타이드를 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합 펩타이드는 신경전달물질 방출 조절 능력이 있는 펩타이드에 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 결합되어, 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 펩타이드의 능력이 유지 또는 향상되면서도, 동시에 신경세포 투과성을 현저하게 향상시키므로, 피부개선용 화장료 조성물, 기능성 화장품 등의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신경세포 투과 촉진 활성의 펩타이드 {Peptide for accelerating delivery to nerve cells}
본 발명은 피부 개선용 펩타이드, 또는 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상기 펩타이드 또는 화장료 조성물을 포함하는 피부 개선용 기능성 화장품 및 피부 외용제용 약학 조성물에 관한 것이다.
신경전달물질의 방출은, 신경전달물질을 함유하는 신경말단에 위치하는 시냅스 소포(synaptic vesicle)와 시냅스 전막(presynaptic membrane)이 융합된 후 두 경계 간의 통로가 형성됨에 의해 발생된다. 소포 단백질 VAMP(synaptobrevin)와 원형질막 결합단백질인 신택신(Syntaxin) 1a, SNAP-25로 이루어진 3종의 단백질 복합체인 SNARE 단백질이 시냅스 소포와 시냅스 전막의 융합에 근원적인 힘을 제공한다. 여기서 시냅스 소포와 시냅스 전막 간의 막 융합에 의해 신경전달물질 방출 통로가 열리는 것은, 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는 신택신 1a 단백질과 SNAP-25 단백질 2종의 복합체인 t-SNARE 및 소포(vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE의 작용에 따른 결과이다. 상기 막 융합 시에는 지질 이중층(lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내므로, 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들 간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이러한 힘을 제공하는 것이 SNARE 단백질인 것으로 알려졌다. 이와 같이 SNARE 복합체의 형성은 신경전달물질의 방출을 포함하는 세포외 방출작용(exocytosis)의 핵심 현상이다.
최근 들어 비마비성 방식으로 독소의 부작용 없이 근육의 수축을 감소시키는, 보톡스(botox)와 유사한 역할을 갖는 펩타이드에 대한 개발이 이루어지고 있다. 이러한 펩타이드는 근육 세포의 수축을 담당하는 아세틸콜린 등과 같은 신경전달물질의 분비를 한시적으로 차단하여 주름 발생을 완화시키는 역할을 한다.
그러나, 상기 보톡스와 유사한 역할을 하는 펩타이드의 개발에도 불구하고, 크림 등의 제형으로 피부에 도포 시 그 효과가 미비하여 본래의 효능을 그대로 발휘하지 못하는 문제가 있었다.
한편, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)로서의 효과가 확인된 다른 예로는 HSV-1(herpes simplex virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드(Elliott, G. et al., Cell, 88:223, 1997), HSV-2의 UL-56 단백질의 84번째부터 92번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드(GeneBank code:D1047[gi:221784]) 및 드로소필라 속(Drosophila sp.)의 안테나페디아(antennapedia, ANTP) 단백질의 339번째부터 355번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 (Schwarze, S.R. et al., Trends. Pharmacol . Sci., 21:45, 2000) 등이 있으며, 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩타이드의 경우도 그 효과가 확인되었다(Laus, R. et al., Nature. Biotechnol., 18:1269, 2000).
종래 CPP를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시켜 제조된 융합 단백질이 효율적으로 세포 내로 수송할 수 있다는 것이 밝혀진 이후, CPP를 이용한 다양한 응용이 시도되었으나(대한민국 특허등록 제10-0568457호), 투과기능성 펩타이드가 바이러스에서 유래하기 때문에 안전성 측면에서 문제점을 가지고 있었다.
이에, 본 발명자들은 신경전달물질의 방출을 조절하는 물질의 효능 개선을 위해서는 신경세포 투과도 향상이 필요하다는 것을 확인하게 되었다.
신경세포 투과성이 우수한 물질을 개발하고자, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 하기 Nev 1 또는 Nev 4 가운데 하나의 아미노산 서열을 포함하는 신규 신경세포 투과 촉진 펩타이드를 발굴하였다. 또한, 상기 발굴된 신경세포 투과 촉진 펩타이드를 신경전달 물질 방출을 조절하는 펩타이드와 결합하였고, 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드가 기존 단백질에 비해 신경세포 투과성 및 근 수축 억제 효과가 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 Nev 1 또는 Nev 4 가운데 하나의 아미노산 서열로 이루어진 신경세포 투과 촉진 펩타이드 또는 이의 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 Nev 1 또는 Nev 4 가운데 하나의 아미노산 서열을 포함하는 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 결합된 융합 펩타이드 또는 이의 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 기능성 화장품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하고, 본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 하기 Nev 1 또는 Nev 4의 아미노산 서열로 이루어진 신경세포 투과 촉진 펩타이드 또는 이의 유도체를 제공한다. 또 다른 실시예로 하기 Nev 1 또는 Nev 4의 아미노산 서열과 융합되어, 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 신경세포 투과를 촉진하는 융합 펩타이드 또는 이의 유도체를 제공한다.
아미노산 서열
Nev 1 : ALKEVGA (서열번호 1)
Nev 4 : VPMKVAA (서열번호 2)
본 발명에 있어서, "신경세포 투과성 펩타이드"란, 분자의 크기나 성질에 관계없이 신경을 투과할 수 있으며, 신경세포 잔류성이 우수한 펩타이드를 의미한다. 또한 상기 펩타이드 자체가 신경세포를 투과할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 펩타이드의 신경세포 투과를 향상시키는 펩타이드를 의미한다. 신경세포 투과성 펩타이드는 다른 펩타이드의 신경세포 투과를 촉진할 수 있는 펩타이드를 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "신경세포 투과성"이란, 펩타이드가 신경세포를 투과하여 신경세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 신경세포 투과 촉진 펩타이드는 그 자체가 다른 펩타이드에 비하여 우수한 신경세포 투과성을 가질 뿐만 아니라, 다른 펩타이드의 신경세포 투과 촉진 효과를 나타낸다.
본 발명의 신경세포 투과 촉진 펩타이드(Nev 1 및/또는 Nev 4)는 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한 파지 디스플레이 방법을 수행하여 발굴된, 신경세포 투과성이 우수한 펩타이드를 포함할 수 있고, 구체적으로는 Nev 1 및/또는 Nev 4 가운데 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 파지 디스플레이 방법을 통해 신경세포 투과 촉진 펩타이드로서 Nev 1과 Nev 4 아미노산 서열을 각각 포함하는 펩타이드를 제조하였다. 이후 신경전달물질 방출 조절 펩타이드(Argireline™)와 신경세포 투과성을 비교한 결과, 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 신경세포 투과성이 약 35배~100배 증가함을 확인하였다(표 1).
본 발명에 있어서, "신경전달물질"은 뇌를 비롯하여 체내의 신경 세포에서 방출되어 인접해 있는 신경 세포 등에 정보를 전달하는 일련의 물질로서, 하나의 뉴런에서 또 다른 '표적' 뉴런으로 시냅스를 가로질러 신호를 전달하는 내인성 화학물질이다. 신경전달물질은 시냅스의 시냅스 전 부분에서 축삭 말단의 막 아래에 군집화된 시냅스 소낭으로 패키징된 후, 시냅스 간극 내에 방출되어 시냅스 간극을 가로질러 발산되는데, 이때 신경전달물질은 시냅스의 시냅스 후 부분에서 막의 특이적 수용체에 결합된다. 본 발명의 신경전달물질은 도파민, 세로토닌, 히스타민, 아세틸콜린, 아드레날린, 노르아드레날린, 감마아미노뷰티릭산(GABA), L-글루탐산, 글라이신 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "신경전달물질 방출 조절 펩타이드"는 신경전달물질이 신경전달물질의 수용체로 전달되는 것을 차단하여 근 수축 효과를 억제할 수 있으며, 주름 개선 효과를 나타낼 수 있는 펩타이드를 의미한다. 구체적으로, 근육을 움직이기 위해서는 신경전달물질이 신경세포에서 근육세포로 시냅스를 통해 전달되어야 하는데, 시냅스에서 신경전달물질인 아세틸콜린이 분비되기 위해서는 신경세포 말단에서 스네어 복합체(SNARE Complex)가 형성되어 시냅스로 방출되는 과정이 필요하다. 일반적으로 알려진 보톡스는 스네어 복합체를 형성하는 성분(SNAP-25)을 파괴하여 아세틸콜린이 시냅스로 방출되지 못하게 한다. 반면, 보톡스 유사 펩타이드는 스네어 복합체의 구성 성분(SNAP-25) 일부와 유사한 구조를 갖고 있어, SNAP-25 대신 복합체의 구성 과정에 관여하여 아세틸콜린이 방출되는 과정을 막는 역할을 한다.
본 명세서에서 사용된 펩타이드는 펩타이드 뿐만 아니라 이의 유도체를 포함할 수 있다. 상기 유도체는 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드 또는 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 N-말단, C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 또는 아미노산이 추가/치환/결실되어 변형된 펩타이드를 포함할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 업계에서 널리 알려진 것이 사용될 수 있으며, 펩타이드 종류에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 천연 펩타이드 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 펩타이드도 포함할 수 있으며, 주름개선 효과를 갖는 것으로 알려진 펩타이드의 펩타이드 유도체도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 서열번호 5 (EEMQRR), 서열번호 6 (DDMQRR) 및 서열번호 7 (YPWTQRF)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 5 (EEMQRR) 의 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 실시예에서 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 아세틸(Acetyl)-EEMQRR, 팔미틸(Palmityl)-DDMQRR 및 팔미틸(Palmityl)-YPWTQRF로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드, 이의 이성질체, 라세미 화합물, 이의 화장학적 또는 약학적으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
R1-AA-R2
상기 화학식 1에서 AA는 Nev 1 또는 Nev 4의 아미노산 서열일 수 있고, 또는 3 내지 40개의 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열일 수 있다. R1은 H 또는 C3 내지 C24의 알킬, 아릴, 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 상기 R2는 알리파틱(aliphatic) 또는 사이클릭(cyclic)기로 치환되거나 치환되지 않은, 아미노기, 하이드록실기 및 티올기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
구체적으로, 상기 AA는 MAEDADMRNELEEMQRRADQL(서열번호 8), ADESLESTRRMLQLVEESKDAGI(서열번호 9), ELEEMQRRADQLA(서열번호 10), ELEEMQRRADQL(서열번호 11), ELEEMQRRADQ(서열번호 12), ELEEMQRRAD(서열번호 13), ELEEMQRRA(서열번호 14), ELEEMQRR(서열번호 15), LEEMQRRADQL(서열번호 16), LEEMQRRADQ(서열번호 17), LEEMQRRAD(서열번호 18), LEEMQRRA(서열번호 19), LEEMQRR(서열번호 20), EEMQRRADQL(서열번호 21), EEMQRRADQ(서열번호 22), EEMQRRAD(서열번호 23), EEMQRRA(서열번호 24), LESTRRMLQLVEE(서열번호 25), NKDMKEAEKNLT(서열번호 26), KNLTDL(서열번호 27), IMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG(서열번호 28), SNKTRIDEANQRATKMLGSG(서열번호 29), TRIDEANQRATKMLGSG(서열번호 30), DEANQRATKMLGSG(서열번호 31), NQRATKMLGSG(서열번호 32) 및 QRATKMLGSG(서열번호 33)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 AA는 SNAP-25 단백질의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "융합 펩타이드" 란 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 펩타이드로서, 구체적으로 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드 및 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드는 Nev 1(서열번호 1) 또는 Nev 4(서열번호 2) 가운데 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 서열번호 5 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드, 구체적으로는 서열번호 5의 펩타이드이거나, 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드, 이의 이성질체, 라세미 화합물, 이의 화장학적 또는 약학적으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다. 보다 더 구체적으로 상기 융합 펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 융합 펩타이드일 수 있다.
상기 융합 펩타이드는 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 융합 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 구성하는 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 단백질 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 펩타이드를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 융합 펩타이드는 17 내지 40개의 아미노산으로 구성되는 짧은 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 융합 펩타이드는 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드 및 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 융합 펩타이드는 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커(Linker)를 통해 융합 연결될 수도 있다.
상기 링커는 구체적으로 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 구체적으로 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등의 아미노산을 여러 개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 보다 더 구체적으로 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드의 C-말단과 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 N-말단을 2개의 펩타이드(GG)로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합 펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드로서 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(Argireline™, Acetyl-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg(Acetyl-EEMQRR))에 Nev 1(서열번호 1) 또는 Nev 4(서열번호 2) 아미노산 서열을 포함하는 신경세포 투과 촉진 펩타이드를 결합하여 융합 펩타이드(ALKEVGAEEMQRR 또는 VPMKVAAEEMQRR)를 제조하였으며, 상기 제조된 융합 펩타이드의 효과를 종래의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드와 비교한 결과, 신경세포 투과성이 현저히 향상되고 근 수축 억제 효과 또한 우수함을 확인하였다(표 2 및 도 1 내지 2).
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "주름 개선"이란 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명의 융합 펩타이드는 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 융합 펩타이드의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50 중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 기능성 화장품을 제공한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 기능성 화장품을 제공할 수 있다. 상기 화장료 조성물 및 주름 개선은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서, "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.
본 발명의 기능성 화장품은 상기 화장료 조성물에 일반 피부용 화장품의 제조 시에 사용되는 적절한 담체를 가하여 제조할 수 있다. 이때, 사용되는 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 기능성 화장품은 주름 개선 효과를 나타내고, 그의 제형은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림, 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있고, 구체적으로는 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼 또는 오일젤의 제형으로 제조될 수 있는데, 이때, 사용되는 담체는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 파우더 또는 스프레이 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더, 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 용액 또는 유탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 현탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 화장비누 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 피부외용연고는 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 바셀린 50 내지 97 중량% 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5 중량%를 함유하도록 제조될 수 있고; 유연화장수는 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 프로필렌글리콜 또는 글리세린과 같은 다가알콜류 1 내지 10 중량% 및 폴리에틸렌올레일에테르 또는 폴리옥시에틸렌 경화피마자유와 같은 계면활성제 0.05 내지 2 중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 스쿠알란, 바셀린 또는 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5 내지 20 중량% 및 세탄올, 스테아릴알콜 또는 밀납과 같은 왁스성분 3 내지 15 중량%을 함유하도록 제조될 수 있고; 에센스는 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 글리세린 또는 프로필렌글리콜과 같은 다가알콜류 5 내지 30 중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 마사지크림은 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 유동파라핀, 바셀린 또는 이소노닐이소노나노에이트와 같은 오일류를 30 내지 70 중량% 함유하도록 제조될 수 있고; 팩은 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 폴리비닐알콜을 5 내지 20 중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩으로 제조되거나 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연 또는 이산화티탄과 같은 안료가 5 내지 30 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 융합 펩타이드는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 융합 펩타이드는 신경전달물질 방출을 조절할 수 있는데, 구체적으로 신경전달물질이 신경전달물질의 수용체로 전달되는 것을 차단하여 근 수축 효과를 억제할 수 있으며, 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에서 제공하는 융합 펩타이드는 피부 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 능력이 유지 또는 향상되면서도, 신경세포 투과성을 현저하게 향상시키므로, 상기 근 수축 억제 또는 주름 개선 효과를 나타내는 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "피부외용제"란, 유지류, 바셀린, 라놀린, 글리세롤 등의 다양한 기제에 약품을 혼합하여 쉽게 피부에 바를 수 있도록 한 고형, 반고형 또는 액상의 외용약을 의미한다. 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.
본 발명의 목적상 상기 피부외용제는 본 발명의 융합 펩타이드를 포함하고, 적절한 피부외용제용 담체인 기제를 포함하는 제제로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 신경세포 투과 촉진 펩타이드는 신경세포 투과성이 향상된 펩타이드로서, 상기 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 신경전달물질 방출 조절 능력이 있는 펩타이드에 결합된 융합 펩타이드는 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 펩타이드의 능력이 유지 또는 향상되면서도, 동시에 신경세포 투과성을 현저하게 향상시키므로, 피부개선용 화장료 조성물, 기능성 화장품 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 Argireline™과 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 ALKEVGAEEMQRR(서열번호 3, 융합펩타이드 1) 및 VPMKVAAEEMQRR (서열번호 4, 융합펩타이드 4)의 공초점 현미경을 통하여 얻은 세포 투과 이미지이다. 신경세포 투과성을 보여준다.
도 2는 Argireline™과 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 ALKEVGAEEMQRR(서열번호 3, 융합펩타이드 1) 및 VPMKVAAEEMQRR (서열번호 4, 융합펩타이드 4)의 근수축 감소 비율을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신경세포 투과 촉진 펩타이드의 선별
신경세포 투과 촉진 펩타이드를 선별하기 위해서 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하였다.
먼저, 세포 배양약에 Ph.D-12 phage library kit(New England Biolab)로부터 유래된 109개의 파지를 가하였다.
신경아세포 및 각질세포(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast) 각각을 플레이트에 10% (v/v) 태아 송아지 혈청과 1% (v/v) 항생물질이 들어간 DMEM 배지에서 배양하였다. 파지 라이브러리를 세포 배지에 희석하여 각질세포에 처리한 후 각질세포에 투과하지 않은 파지를 모아서 다시 섬유아세포에 처리하여 같은 과정을 반복하였다. 이렇게 각질세포와 섬유아세포에 투과하는 파지는 제외한 후, 남아있는 파지를 신경세포에 처리하여 일정시간 배양한 후, 세포 밖에 묻어있는 파지는 워싱한 다음 신경세포를 용해(lysis)하여 내부에 들어간 파지를 선별하였다.
상기 증폭은 숙주세포로서 E. coli ER2738(New England Biolab)를 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 25mL의 LB 배지에서 진탕 배양된 대장균 ER2738 균주에 상기 파지용액 5mL를 가하고 4시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 8,000G로 원심 분리하여 파지분획이 포함된 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 6mL의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 반응시켜서 파지를 침전시키고, 상기 반응액을 8,000G로 원심 분리하여 파지를 침전시켰으며, 상기 침전물을 TBS용액에 현탁시켜서, 증폭된 파지용액을 수득하였다.
이처럼, 신경세포에 파지를 가하여 신경세포를 투과한 파지를 수득하고, 이를 증폭시키는 과정을 1회 진행하는 것을 1 Round라고 정의하였으며, 1 Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2 Round를 진행하여 신경세포 투과력을 경쟁하는 방식으로 신경세포 투과력이 좋은 파지를 선별하였고 총 3 Round를 수행하였다.
상기 3 Round 수행 결과 최종적으로 얻어진 파지에 포함된 펩타이드의 서열을 확인하기 위하여, 상기 파지를 포함하는 TBS용액을 대장균 ER2738 균주에 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액에 TOP agar를 가하여 혼합한 다음, 상기 혼합물을 LB/X-gal/IPTG 평판배지의 상단에 가하여 고형화시켰다. 그런 다음, 고형화된 배지를 16시간 동안 배양한 후, 청색의 콜로니(colony)를 선별하였다. 상기 선별된 콜로니로부터 유래된 균주를 6시간 동안 배양하고, 이로부터 DNA를 수득한 다음, 파지로부터 유래된 염기서열을 분석함으로써, 신경세포를 투과하는 특성을 나타내는 펩타이드의 상기 Nev 1 및 Nev 4 아미노산 서열을 선별하였다.
실시예 2: 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 신경세포 투과 촉진 펩타이드 가 결합된 융합 펩타이드의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 신경세포 투과 촉진 펩타이드와 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 각각 결합된 융합 펩타이드를 합성하고 분리 및 정제하여 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 제조하였다(이하 융합펩타이드 1, 융합펩타이드 4로 명명).
실시예 2-1: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 합성
상기 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드는 각각 펩타이드 자동합성기(Applied Biosystems Model 431A)를 이용하여 고체상(solid phase) 펩타이드 합성법으로 합성하였다.
구체적으로, 0.25 mmol의 파라히드록시 메틸페닐옥시메칠 폴리스티렌(HMP) 레진을 표준 반응용기(38mL)에 넣고, 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단의 Fmoc-아미노산을 넣고 합성을 시작하였다. 1 mmol의 Fmoc-아미노산이 들어있는 카트리지를 카르복실 말단 아미노산에서부터 아미노산 말단의 아미노산까지 배열 순서대로 가이드웨이에 배열한다. 이때 카트리지의 금속 뚜껑을 제거하고 맨 처음과 맨 끝에는 아미노산이 들어있지 않은 빈 카트리지를 놓았다.
펩타이드 합성은 ABI사에서 개발한 표준 스케일 Fmoc 커플링 프로토콜(protocol)에 따라 시행 전에 파라메타를 편집하고 자동합성 메뉴에 따라 시행하였다(ABI User's Manual. Jan, 1992 참조). 표준 스케일 Fmoc을 사용할 때는 디프로텍션(deprotection)을 N-메틸피롤리딘(NMP)으로 희석한 20% 피페리딘을 사용하여 21분 동안 수행하였으며, NMP로 9분 동안 세척하고 커플링을 71분 동안 실시하였다. 커플링에는 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT)을 사용하였고 NMP로 7분간 세척하는 시스템을 이용하였다.
실시예 2- 2: 융합 펩타이드의 분리 및 정제
상기 실시예 2-1에서 합성된 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 2종을 하기와 같은 과정을 통해 분리 및 정제하였다.
먼저, 실시예 2-1에서 합성된 융합 펩타이드를 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 고체 지지체(solid support)로부터 분리하고, ABI사의 매뉴얼 (Introduction to Cleavage Techniques, P6-19(1990))을 참고로 하여 상기 융합 펩타이드를 분리하였다. 구체적으로, 실시예 2-1에서 합성된 융합 펩타이드가 붙은 레진을 둥근 플라스크에 넣고 냉각시킨 후, 결정 페놀 0.75g, 1,2-에탄디티올(EDT) 0.25mL, 티오아니솔 0.5mL, 증류수 0.5mL, 및 TFA 10mL를 넣고 뚜껑을 닫은 다음 실온에서 1~2 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 레진과 반응액을 규화(sintered) 유리 깔때기를 통해 저진공으로 여과하여 레진과 융합 펩타이드 용액을 분리하였다. 플라스크와 유리 깔때기를 5~10mL 디클로로메탄(DCM)으로 씻어 디클로로메탄이 융합 펩타이드 용액과 섞이게 하였으며, 50mL 이상의 차가운 디에틸에티르를 첨가하여 펩타이드의 침전물을 얻었다. 이 침전물을 저진공으로 깔때기로 여과하여 깔때기 위에 모아진 침전물을 건조시킨 후, 30% 초산에 녹여 냉동 건조시켰다. 이렇게 하여 얻어진 융합 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였다. 이때 칼럼은 C18 analytical column(Pharmacia)을 사용하였으며, 완충용액 A는 10% 아세토니트닐 + 0.05% TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 80% 아세토니트닐 + 0.05% TFA를 사용하여 융합 펩타이드를 용출하였다. 그 결과 고순도로 정제된 융합 펩타이드 2종을 얻었으며 합성 수율은 모두 30 ± 5 % 정도였다.
실험예 : 선별된 신경세포 투과 촉진 펩타이드 및 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 효과검증
상기 실시예 1과 2에서 선별 및 제조한 신경세포 투과 촉진 펩타이드 및 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 개선 용도를 확인하기 위하여 하기와 같이 신경세포 투과성, 근 수축 억제 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.
실험예 1: 신경세포 투과 촉진 펩타이드의 신경세포 선택적 투과성 검증
파지 라이브러리에서 선별한 펩타이드 2종 (N1 (서열번호 1), N4 (서열번호 2))의 말단에 형광물질인 fluorescein isothiocyanate(FITC)를 결합한 펩타이드를 합성하였다. 대조군으로는 Argireline™과 TAT- argifeline(TAT-argi)에 각각 FITC를 결합한 펩타이드를 사용하였다. Argireline™은 신경세포에서 작용하는 물질의 하나로써 사용되었고, Argireline™과 결합한 TAT는 trans-activating transcriptional activator 즉, 상기 CPP의 일종으로 세포의 물질 흡수를 촉진시켜주는 것으로 알려져 있다. 이렇게 4종의 펩타이드를 피부 각질층을 구성하고 있는 keratinocyte와 신경세포에서 일정시간 흡수시켜 보았을 때 형광세기를 측정하였으며, 하기 표 1에 Argireline™ 대비 펩타이드의 형광 세기 비율(배)을 나타내었다.
신경세포 투과성 펩타이드의 keratinocyte와 신경세포에서의 투과 정도
(Argireline™대비 비율(배))
상기 표 1에 나타난 바와 같이, N1, N4, TAT-argi를 keratinocyte에 처리할 경우, 그 투과 정도는 Argireline™ 에 비해 26~31배 정도로 높게 나왔고, 그 정도가 TAT-argi와 신경세포 투과성 펩타이드가 비슷하였다. 하지만 이를 신경세포에 처리하였을 때에는 신경세포 투과성 펩타이드가 TAT-argi보다 그 정도가 우수하였고, 이를 보았을 때, 신경세포 투과성 펩타이드 2종은 신경세포 선택적 투과성이 우수하다고 할 수 있었다.
실험예 2: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 신경세포 투과성
상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 2종의 신경세포 투과성을 신경아세포를 이용하여 확인하였다. 먼저, 신경아세포를 플레이트에 10% (v/v) 태아 송아지 혈청과 1% (v/v) 항생물질이 들어간 DMEM배지에서 배양하였다. 그런 다음 C-말단에 플루오레세인 이소티오시안산염 (fluorescein isothiocyanate, fitc)이 결합된 Argireline™과 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 각각 가하고, 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 워싱하였다. 이후 공초점 현미경을 통하여 세포 투과 이미지를 획득하였다(도 1). 이를 통해 기존의 Argireline™보다 신경세포 투과성 펩타이드와 결합한 융합 펩타이드의 신경세포 투과성이 현저히 향상됨을 알 수 있었다.
실험예 3: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 근 수축 억제 효과
상기 실시예 2에서 제조한 융합 펩타이드 2종의 근 수축 억제 효과를 확인하기 위해, 먼저 C2C12세포를 플레이트에 10% (v/v) 태아 송아지 혈청과 1% (v/v) 항생물질이 들어간 DMEM배지에서 배양한 후, 신경아세포를 같은 플레이트에 추가적으로 공동 배양하였다. 그런 다음, C2C12세포의 세포 수축이 시작할 때 30초간 C2C12 세포의 수축횟수를 측정하고, 배지를 모두 제거한 후 PBS로 3회 세정한 후 송아지 혈청이 들어있지 않은 배지에 대조군 펩타이드와 융합 펩타이드가 각 농도별로 포함된 배지를 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 이후 C2C12 세포의 수축횟수를 다시 30초간 측정하여 근 수축 억제 정도를 확인할 수 있었으며, 이 결과와 50%의 활성을 억제하는 농도의 결과를 하기 도 2와 표 2에 나타내었다.
신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 근 수축 억제 활성
처리 펩타이드 근수축 50% 억제 농도(ppm)
Argireline™ 3±1.7
융합 펩타이드 1 0.32±0.05
융합 펩타이드 4 0.4±0.07
상기 표 2에 나타난 바와 같이, Argireline™과 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드가 신경세포로부터 신경전달물질의 방출을 억제하여 C2C12 세포의 수축 횟수를 감소시킴을 확인하였다. 또한, 신경세포 투과 촉진 펩타이드가 결합된 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드는 Argireline™과 비교하여 근 수축억제 정도가 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 사용하면, 신경전달물질 방출 조절 펩타이드보다 낮은 농도에서 근 수축 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.
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Claims (5)

  1. 서열번호 1의 아미노산 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 신경세포 투과 촉진 펩타이드와 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 융합된 융합펩타이드의 유도체를 포함하는 신경세포 투과 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합 펩타이드의 유도체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 유도체인 신경세포 투과 촉진용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 융합 펩타이드의 유도체는 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4의 융합 펩타이드를 이루는 아미노산 잔기의 Ala와 Ser간에, Val와 Ile간에, Asp와 Glu간에, Thr와 Ser간에, Ala와 Gly간에, Ala와 Thr간에, Ser와 Asn간에, Ala와 Val간에, Ser와 Gly간에, Thy와 Phe간에, Ala와 Pro간에, Lys와 Arg간에, Asp와 Asn간에, Leu와 Ile간에, Leu와 Val간에, Ala와 Glu간에, 또는 Asp와 Gly 간에 아미노산의 교환이 일어난 것을 특징으로 하는 신경세포 투과 촉진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신경전달물질은 도파민, 세로토닌, 히스타민, 아세틸콜린, 아드레날린, 노르아드레날린, 감마아미노뷰티릭산, L-글루탐산, 및 글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 신경세포 투과 촉진용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 조성물을 포함하는 주름 개선용 화장품.
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