KR101813560B1

KR101813560B1 - 세포투과형 성장인자들의 피부 생리활성 피부외용제 조성물

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Publication number: KR101813560B1
Application number: KR1020160079654A
Authority: KR
Inventors: 정대현; 김수정; 김형건; 박진우
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨; 목포대학교산학협력단
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2018-01-31

Abstract

본 발명에 따른 세포투과형 성장인자는 세포투과형 펩타이드가 EGF, IGF-I, PDGF와 같은 성장인자와 융합된 재조합 성장인자 단백질로, 이러한 세포투과형 성장인자는 피부세포에 생리활성능을 증가시키고, 콜라겐 생합성 증진 효과 및 상처 치유능을 가지고 있어 기능성 화장품의 핵심 소재로써 산업적 활용가치가 높다.

Description

세포투과형 성장인자들의 피부 생리활성 피부외용제 조성물{Topical formulation with Skin Physiological Activity Composed of Cell Permeable Growth Factors}

본 발명은 세포투과형 성장인자들의 피부 생리활성 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, EGF, IGF-1, PDGF와 같은 성장인자에 세포투과형 펩타이드가 결합된 세포투과형 성장인자들을 함유하는 높은 피부 생리활성을 가진 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 친수성이고 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포안으로 들어갈 수 없다고 알려져 있다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포내로 들어오지 못하게 막으며 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포내로 들어오더라도 세포의 리소좀(lysosomal compartment)와 융합되어 결국 분해되므로 이들 거대분자 바이오 활성소재를 외부에서 전달하는 데 많은 제약이 따르는게 일반적이 이론이다. 이러한 공지의 우려는 재조합단백질 성장인자류들이 더욱 널리 바이오화장품 및 코스메슈티컬의 핵심 소재로 활용되는데 제약으로 작용되고 있다.

현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 고분자 물질의 세포내 전달 및 이를 통한 응용이 진행되어져왔으며, 특히 SOD, Catalase, SOCS 와 같은 enzyme, dnPI3K, ZAP70 mutant와 같은 세포내 신호전달 단백질의 저해 형태의 단백질, Foxp3, RORgt 와 같은 전사인자 단백질 혹은 전사인자의 DNA binding domain 부분 과 같이 다양한 단백질 전달을 통해 세포내 기능을 조절하고자 하는 시도가 되어졌다. 특히 cyclosporinA 와 같은 저분자 화합물 약물을 세포내 및 조직내로 전달하여 장기 및 세포 이식시 발생하는 거부반응을 조절하고자 하는 시도, psoriasis 와 같은 자가면역을 조절하고자 하는 시도가 진행되어져 왔다. 생식제품과 함께 과일, 채소류 등 농산물에 대한 신선도와 편의성에 대한 관심이 높아짐에 따라 과일, 채소류 등 농산물을 건조 및 가공하여 그대로 섭취할 수 있는 신선편이(fresh-cut) 제품의 요구가 증가하고 있으나, 과일, 채소류 등의 일부는 절단, 건조 및 가공공정에서 흑색 또는 갈색으로 변색하여 제품의 상품성에 악 영향을 주는 문제점이 발생한다.

HIV 바이러스의 TAT 단백질이 세포내로 전달이 될 수 있다는 보고가 1988년도에 Cell 지에 보고된 이래에 세포투과성 펩타이의 세포내 전달 기작이 밝혀지고, 양이온성 아미노산, 소수성 아미노산이 세포막 단백질 및 지질과 결합하여 전달이 될 수 있는것으로 밝혀졌고, 단백질, 펩타이드, DNA, RNA 등 다양한 고분자 물질의 전달이 in vitro와 in vivo 동물 모델에서 다양하게 확인이 되어졌다. 그러나, 그동안 시도되었던 많은 세포투과성 펩타이드와 결합된 바이오신약 후보물질의 임상 실패는 인간세포에 전달 효능이 매우 떨어지거나 cargo 의 효과가 떨어지는것으로 사료되며, 최근에 동정되어 발표되고 있는 인간세포에 전달이 잘 되는 세포 투과성 펩타이드를 활용하여 적용한다면, 세포내 신호전달을 조절할 수 있는 다양한 단백질 및 펩타이드 등 고분자 물질을 활용한 새로운 개념의 바이오신약개발이 이루어질 수 있을것으로 기대되고 있다. 또한, 이러한 세포투과성 펩타이드를 활용하여 항체를 세포내로 전달할 수 있으므로 항체 신약개발의 표적을 세포막 단백질, 수용성 단백질에서 세포내 단백질로 확대해 나갈 수 있는 큰 파급력이 있는것으로 기대된다. 또한, 최근 임상 3상까지 진행되고 있는 약물들이 있어서, 앞으로 세포투과성 펩타이드를 이용한 약물로서 한두가지 성공사례가 나온다면, 매우 다양한 방법으로 세포투과성 펩타이드를 응용한 바이오신약의 성공사례가 연속적으로 나올 수 있을것으로 전망하고 있다.이러한 신약개발의 성공을 위해서는 세포투과성 펩타이드는 heparin sulfate, sialic acid, phosphatidyl serine 등 특정분자의 발현이 많이 있는 세포에 더욱 지향성을 가지고 전달이 되므로, 약물개발의 표적 세포, 표적 조직을 적절히 결정하여 활용하는 전략이 필요하다. 점막조직의 표피세포, 혈관의 내피세포, 대식세포는 세포투과성 펩타이드의 가장 좋은 표적 세포들이며 관련 질병에 접근하는것이 매우 적절하고, 또한, 간조직, 비장, 소장, 대장은 생쥐에 복강주사 및 정맥주사시 가장 잘 전달이 되는 조직으로서 관련된 질병에 약물개발에 활용하는것이 좋으며, 국소적 전달을 통해 안과적 질환, 호흡기질환, 피부질환에 응용 가능성이 매우 높으며 최적의 전략을 통해, 앞으로 인간 단백질 유래의 고효율 세포투과성 펩타이를 응용한 다양한 바이오신약개발이 이루어질 수 있을 것으로 기대되고 있다.

이렇듯, 단백질을 in vivo 및 in vitro에서 세포내로 전달할 수 있는 PTD (Protein Transduction Doamin)의 발견은 이와 같은 차세대 단백질신약개발을 식물세포에서도 가능하게 하여, 전 세계적으로 새로운 PTD의 발견 및 이를 이용한 다양한 질환치료제의 개발이 무서운 속도로 진행되고 있다. Protein transduction은 특정 아미노산배열을 가진 적은 크기의 peptide(9 - 34개)가 이와 연결된 120 kDa 이상의 분자량이 매우 큰 단백질들도 단시간 내에(30분 이내) 효율적으로 (모든 세포에 100%에 가까운 효율) 세포 내로 전달할 수 있는 기술로써, 지금까지 가장 큰 문제가 되어온 유전자와 단백질 등의 hydrophilic molecule들의 세포 내 전달을 손쉽게 하여 많은 질환의 신약개발 분야에 있어서 게 해결할 수 있는 혁신적인 기술로써, 신약개발 분야의 새로운 시대를 이끌어 나아갈 차세대 기술로 평가되고 있다. 한편, 종래 PTD를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시킨 경우, 이러한 융합 단백질의 세포 내 수송이 효율적이라는 것이 밝혀진 이후, PTD를 이용한 다양한 응용이 시도되었으나(특허문헌 0001), 아직까지 세포투과성 펩타이드와 성장인자들을 결합시켜 화장료 조성물의 핵심소재로 활용하려는 시도는 없었다.

대한민국 특허등록 제10-0568457호

따라서, 본 발명자들은 바이오화장품 및 코스메슈티컬의 핵심 소재들인 재조합단백질 성장인자류에 모두 적용할 수 있는 플랫폼 기술로써 저분자 펩타이드를 유전학적인 방법으로 융합하는 기술로 피부생리활성 성장인자들을 세포투과형으로 개량하고, 그 복합조성물을 사용해 우수한 피부 생리활성 효과를 입증하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 성장인자를 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 성장인자를 담지한 리포좀을 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 성장인자를 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명자들은, 바이오화장품 및 코스메슈티컬의 핵심 소재들인 재조합단백질 성장인자류에 모두 적용할 수 있는 플랫폼 기술로써 저분자 펩타이드를 유전학적인 방법으로 융합하여 성장인자들을 개량하고, 그 생리활성 효과를 입증하였다. 그 결과, 항노화 생리활성을 갖는 단백질의 아미노 말단에 세포 침투성 펩타이드를 결합시킨 융합 단백질을 제조하고, 상기 융합 단백질이 피부 재생과 주름개선에 유효적이고 세포 내로 효율적으로 운반할 수 있고, 합성이 용이하고, 독성에 대한 염려가 전혀 없다는 것을 확인하는 기술을 개발하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 성장인자를 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 성장인자는 aFGF, bFGF, IGF-2, KGF, NGF, PDGF-A, PDGF-B, Noggin, VEGF, SCF, PGF, Sirtuin 등이 있으며, 바람직하게는, EGF, IGF-1, 및 PDGF 중 어느 하나 이상이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물에는 단일 성장인자가 포함될 수도 있고, 둘 이상의 복수의 성장인자가 포함될 수 있다.

바람직하게는, EGF, IGF-1, 및 PDGF 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며,

예컨대, 세포투과형 EGF 성장인자, 세포투과형 IGF-1 성장인자, 세포투과형 PDGF 성장인자 모두가 포함될 수도 있다. 이 경우, 조합비율에 특별히 제한없으나, 예컨대, 1:0.1:0.01 내지 1:1:1이거나, 0.1:1:0.01 내지 1:1:0.5이거나, 1:1:0.02 내지 1:1:0.1 이다.

본 발명에 있어서, 상기 세포투과형 펩타이드는 Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2 Tat 펩타이드, Pep-1 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 저분자 펩타이드 (LMWP (Low Molecular Weight Protamine))이다.

서열번호 1 (14개의 아미노산서열) :

Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg

본 발명에 있어서, 상기 조성물에는 히알루론산을 더 포함할 수 있다.

여기서, 히알루로산이 상기 세포투과형 성장인자와의 적절한 조합비는 세포투과형 성장인자 대비하여 100배 내지 10,000배 농도, 바람직하게는 200 내지 1000배 농도(중량,부피)로 함유될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부주름개선 또는 상처 치유용 조성물일 수 있다.

본 발명은 상기 세포투과형 성장인자들을 담지한 리포좀을 포함한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명에 있어서, 상기 세포투과형 성장인자들은 리포좀, 밀리캡슐, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 스폰지, 소낭, 미셀, 밀리스피어, 마이크로스피어, 나노스피어, 리포스피어, 밀리파티클, 마이크로파티클 및 나노파티클로 구성되는 군으로부터 선택되는 미용상 또는 피부약제학상 허용가능한 전달 시스템 및/또는 서방형 시스템에 혼입되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 세포투과형 성장인자들을 포함한 하이드로겔을 제공한다. 상기 하이드로겔 이외에도, 본 발명에 있어서, 습윤 와이프(wet wipe), 하이드로겔, 접착성 패치, 비접착성 패치 및 페이스 마스크로 구성되는 군으로부터 선택되는 고체 지지체에 혼입될 수 있다.

본 발명에 따른 세포투과형 성장인자들은 포유류, 바람직하게는 인간의 몸에 적용되는 다양한 종류의 외용 조성물의 일부를 구성할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명은 적어도 하나의 세포투과형 성장인자를 포함하는 화장료 또는 피부약제 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 기술 분야의 당업자에게 공지된 종래 방법으로 제조될 수 있다. 세포투과형 성장인자들은 종래의 미용상 또는 피부약제학상 허용가능한 용매, 이를 테면, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 부틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합물에 용해될 수 있다. 세포투과형 성장인자들은 활성 성분의 침투를 향상시키기 위한 미용상 또는 약제학상 전달 시스템 및/또는 서방형 시스템에 미리 혼입될 수 있고, 이러한 시스템의 비제한적인 예로는, 리포좀, 밀리파티클, 마이크로파티클 및 나노파티클뿐만 아니라, 스폰지, 소낭, 미셀, 밀리스피어, 마이크로스피어, 나노스피어, 리포스피어, 밀리캡슐, 마이크로캡슐 및 나노캡슐을 들 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 세포투과형 성장인자들은 탈크, 벤토나이트, 전분 또는 말토덱스트린 등 고체 유기 고분자나 미네랄 지지체에 흡착될 수도 있다. 이러한 제제는 바른 후(leave on) 씻어내는(rinse-off) 제형을 포함하는 크림, 수중 오일과 실리콘의 에멀젼, 수중 오일의 에멀젼, 수중 실리콘의 에멀젼, 오일과 실리콘 중 물의 에멀젼, 오일 중 물의 에멀젼, 실리콘 중 물의 에멀젼, 오일, 밀크, 밤, 폼, 로션, 젤, 리너먼트(liniments), 세럼, 비누, 연고, 바, 펜슬 또는 스프레이 등 다른 형태의 제형에 이용될 수도 있고, 본 기술 분야에 공지된 기법으로 습윤 와이프(wet wipe), 하이드로겔, 접착성(또는, 비접착성) 패치 또는 페이스 마스크 등 다양한 종류의 고체 보조제에 혼입되거나, 컨실러, 메이크업 파운데이션, 메이크업 리무버 밀크 또는 로션, 아이섀도우, 립스틱 등 다양한 메이크업류 제품에 혼입될 수도 있다. 본 발명에 있어서, 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 세포투과형 성장인자들 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 세포투과형 성장인자들을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 융합 성장인자를 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른 피부 노화 방지, 피부 재생, 상처치유 등 항노화 기능을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 상처 치유, 당뇨병성 상처치유 예방, 치료를 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 세포투과형 성장인자들 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명에 따른 세포투과형 성장인자들은 세포투과형 펩타이드가 EGF, IGF-I, PDGF와 같은 성장인자와 융합된 형태의 재조합단백질로, 이러한 세포투과형 성장인자들은 합성이 용이하고, 독성에 대한 염려가 없으며, 피부세포에 생리활성능을 증가시키고, 콜라겐 생합성 증진 효과 및 상처 치유능을 가지고 있어 피부 재생 및 주름 개선에 유용한 기능성 화장품의 핵심 소재로써 산업적 활용가치가 높다.

도 1은 (A) 상피세포 성장인자(EGF)의 N-말단 DNA 서열에 저분자 프로타민(LMWP)의 DNA 서열이 연결된 저분자 프로타민-상피세포 성장인자(IntoCell-EGF)의 cDNA 염기서열, (B) IntoCell-EGF의 발현벡터(pET-41b(+)-IntoCell-EGF) 지도이다.
도 2는 저분자 펩타이드가 콘쥬게이트된 성장인자와 천연 성장인자의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다 - Markers (M); EGF (lane 1); IntoCell-EGF (lane 2); IGF-I (lane 3); IntoCell--IGF-I (lane 4); PDGF-A (lane 5); IntoCell-PDGF-A (lane 6).
도 3은 matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy에 의해 측정된 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, 및 IntoCell-PDGF-A의 실제 분자량이다.
도 4는 NIH 3T3 세포들의 viability에 천연 성장인자와 저분자 펩타이드가 콘쥬게이트된 성장인자가 어떠한 영향을 미치는지를 나타낸 것이다. (A) EGF and IntoCell-EGF, (B) IGF-I and IntoCell-IGF-I, 및(C) PDGF-A and IntoCell-PDGF-A. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=10).
도 5는 (A) native or (B) IntoCell-conjugated growth factors와 조합하여 인큐베이션 한 후의 NIH 3T3 세포들의 증식결과를 나타낸 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=10).
각각, EGF (100 ng/mL) + IGF-I (100 ng/mL) + PDGF-A (10 ng/mL) 및 IntoCell-EGF (100 ng/mL) + IntoCell-IGF-I (100 ng/mL) + IntoCell-PDGF-A (10 ng/mL) 그룹들과 비교하여, ^* p < 0.05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001.
도 6은 (A) 천연 또는 IntoCell-컨쥬게이트된 성장인자들 그리고 (B) 천연 또는 IntoCell-컨쥬게이트된 성장인자와 히알루론산 조합하여 인큐베이션 한 후 CCD-986SK 세포들의 증식 결과를 나타낸 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=4).
도 7은 천연 또는 IntoCell-컨쥬게이트된 성장인자들과 히알루론산 조합하여 인큐베이션 한 후 CCD-986SK세포들의 프로콜라겐 타입 I C-펩티드 합성 결과를 나타낸 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=4). 대조군에 대하여, ^* p < 0.05, ^** p < 0.01, ^*** p < 0.001.
도 8은 (A) 천연 (B) IntoCell- 콘쥬게이트된 성장인자 조합들 24시간 인큐베이션 후에 NIH 3T3 세포들의 상대적인 스크래치 상처 회복을 나타낸 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=6). 각각, EGF (100 ng/mL) + IGF-I (100 ng/mL) + PDGF-A (10 ng/mL) 및 IntoCell-EGF (100 ng/mL) + IntoCell-IGF-I (100 ng/mL) + IntoCell-PDGF-A (10 ng/mL) 그룹들과 비교하여, ^* p < 0.05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001.
도 9는 (A) 천연 또는 IntoCell- 콘쥬게이트된 성장인자와 히알루론산 조합들 48시간 인큐베이션 후에 CCD-SK986 세포들의 상대적인 스크래치 상처 회복 그리고, 성장인자-히알루론산 조합들로 처리 후 0, 12, 24, 36, 48 시간 후에 스크래치 상처의 대표적인 이미지를 나타낸 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=6). 대조군과 비교하여, ^* p < 0.05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001.
도 10은 인 비트로 스킨 PAMPA 투과 후에, 비히클, 엘라스틱 리포좀, NE-based 하이드로겔 각각으로부터의 (A) EGF and IntoCell-EGF; (B) IGF-I and IntoCell-IGF-I; (C) PDGF-A and IntoCell-PDGF-A 의 누적 투과량 농도를 time-course로 나타낸 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=6). 각각의 천연 성장인자와 비교하여, ^* p < 0.05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001.
도 11은 passive diffusion에 의한 헤어리스 마우스 스킨 통과하는, 비히클, 엘라스틱 리포좀, NE-based 하이드로겔 각각으로부터의 (A) EGF and IntoCell-EGF; (B) IGF-I and IntoCell-IGF-I; (C) PDGF-A and IntoCell-PDGF-A 의 스킨 플럭스 비교한 것이다. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=6). 각각의 천연 성장인자와 비교하여, ^* p < 0.05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001.
도 12는 full thickness excisional 당뇨병성 상처 모델에서 엘라스틱(유동성) 리포좀이 담지된 IntoCell-컨쥬게이트된 성장인자들-히알루론산 복합체들의 효과를 나타낸 것이다.
(A) 11일동안 측정된 상처 면적(area)의 측정 (B) 비히클 (비어있는 유동성 리포좀), 천연 성장인자 조합-히알루론산 복합체가 담지된 유동성 리포좀 (EGF [500 ug/mL] + IGF-I [500 ug/mL] + PDGF-A [10 ug/mL] + hyaluronic acid [10 mg/mL]), and IntoCell-conjugated growth factor combination-hyaluronic acid complex loaded elastic liposome (IntoCell-EGF [500 ug/mL] + IntoCell-IGF-I [500 ug/mL] + IntoCell-PDGF-A [10 ug/mL] + hyaluronic acid [10 mg/mL])으로 처리된 상처들의 대표적인 사진들. 각각의 수치는 평균±표준편차 (n=10). 대조군과 비교하여, ^* p < 0.05, ^**p < 0.01, ^*** p < 0.001. 천연 성장 인자 조합-히알루론산 복합체로 담지된 유동성 리포좀과 비교하여 ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, ^### p < 0.001.
스케일 바 = 10 mm.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더 상세히 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 세포투과형 성장인자들의 제조

1.1 세포투과형 펩타이드가 융합된 성장인자의 제조

PCR 혹은 유전자 합성을 통해 확보한 3종의 피부투과형 성장인자 IntoCell-EGF (서열번호 1의 아미노산 서열, Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg (LMWP (Low Molecular Weight Protamine))이 N-말단에 연결된 EGF), IntoCell-IGF-I (서열번호 1의 아미노산 서열이 N-말단에 연결된 IGF-1), IntoCell-PDGF-A (서열번호 1의 아미노산 서열이 N-말단에 연결된 PDGF-A)를 암호화하는 cDNA를 도 1과 같이 제조하였다. (바이오니아 의뢰)

이후, IntoCell-EGF, IntoCell-IGF 및 IntoCell-PDGF의 cDNA를 제한 효소를 이용하여 각각 발현벡터(pET-41b(+) 유진바이오텍 (한국))에 삽입하고 이를 숙주 세포(E. coli, BL21-DE3 유진바이오텍 (한국))에 이식하여 형질전환체를 구축하였다.

이후 형질전환체를 배양을 (37℃, 120 rpm 배양) 통해 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF 및 IntoCell-PDGF의 발현을 유도하고 His-tag affinity chromatography와 공지의 단백질 정제 방법을 적절히 조합하는 단백질 정제 방법(목적하는 세포투과형 성장인자들이 발현된 대장균을 sonication으로 파쇄하고 (15 sec burst, 55 sec cooling, 5 times), 고속원심분리장치 (high speed centrifuge)로 15,000 rpm , 4℃, 50 min 원심분리하여 목적단백질을 갖는 상등액들을 얻었다. 이 상등액을 미리 준비한 Ni2+- NTA agarose affinity column에 가하여 washing buffer (20 mM imidazole, 0.1 % Na-chlorate, 0.5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 7.5))로 2차례 씻어준 후 elution buffer (500 mM mM imidazole, 0.1 % Na-chlorate, 1 % Triton x-100, 0.5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 7.5))로 elution하여 목적 단백질들을 정제하였다.)을 통해 순도 96 ~ 98% 전후의 순수한 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF 및 IntoCell-PDGF을 얻었고, 유전자 서열 및 아미노산 서열은 아래와 같았다.

IntoCell-EGF, IntoCell-IGF 및 IntoCell-PDGF의 유전자 서열과 아미노산 서열

성장인자	구분	서열정보
IntoCell-EGF (서열번호2)	cDNA	GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGAAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC
IntoCell-EGF (서열번호3)	아미노산	VSRRRRRRGGRRRRNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
IntoCell-IGF (서열번호4)	cDNA	GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGAGGACCGGAGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTTCAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACAAGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGCCTCAGACAGGCATCGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGAGCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCACCCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCT
IntoCell-IGF (서열번호5)	아미노산	VSRRRRRRGGRRRRGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
IntoCell-PDGF (서열번호6)	cDNA	GTGAGCCGTAGACGTAGACGTAGAGGTGGTCGTAGACGTAGAAGCATCGAGGAAGCTGTCCCCGCTGTCTGCAAGACCAGGACGGTCATTTACGAGATTCCTCGGAGTCAGGTCGACCCCACGTCCGCCAACTTCCTGATCTGGCCCCCGTGCGTGGAGGTGAAACGCTGCACCGGCTGCTGCAACACGAGCAGTGTCAAGTGCCAGCCCTCCCGCGTCCACCACCGCAGCGTCAAGGTGGCCAAGGTGGAATACGTCAGGAAGAAGCCAAAATTAAAAGAAGTCCAGGTGAGGTTAGAGGAGCATTTGGAGTGCGCCTGCGCGACCACAAGCCTGAATCCGGATTATCGGGAAGAGGACACGGGAAGGCCTAGGGAGTCAGGTAAAAAACGGAAAAGAAAAAGGTTAAAACCCACC
IntoCell-PDGF (서열번호7)	아미노산	VSRRRRRRGGRRRRSIEEAVPAVCKTRTVIYEIPRSQVDPTSANFLIWPPCVEVKRCTGCCNTSSVKCQPSRVHHRSVKVAKVEYVRK KPKLKEVQVRLEEHLECACATTSLNPDYREEDTGRPRESGKKRKRKRLKPT

상기와 같이, 융합 성장인자의 제조 및 정제 후 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 및 Coomassie blue staining을 통해 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I 및 IntoCell-PDGF-A의 순도와 분자량을 확인하였다.

분자량 확인용 SDS-PAGE를 수행하기 위하여, 12% SDS-PAG을 만든다. 상기의 정제과정에서 얻어진 샘플들 20 ㎕에 5x sample buffer 5 ㎕를 넣은 tube를 5 min동안 끓였다. 이 샘플들을 30㎕씩 loading하고, 80 V에서 30 min동안 초기 running 하였다. 120 V 에서 dye가 끝에 올 때까지 running 하였다. Coomassie brilliant blue (staining solution)로 30 min동안 staining하고, destaining solution에 넣고 dye를 뺀 후 순도를 확인하였다.

제조 및 정제한 융합 성장인자의 SDS-PAGE 분석결과 도 2에서와 같이, IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I 및 IntoCell-PDGF-A의 분자량은 대략 8.2, 9.5 및 16.3 kDa으로 평가되었으며 BandScan software를 이용한 densitometric quantification 결과 각 융합 성장인자는 98% 이상의 순도를 나타냄을 확인하였다.

1.2 : 제조된 융합 성장인자 (IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A)의 분자량 측정

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy (MALDI-TOF-MS) 측정을 통해 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I 및 IntoCell-PDGF-A의 실제 분자량을 측정하였다 (도3).

MALDI-TOF-MS 측정 결과 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I 및 IntoCell-PDGF-A의 실제 분자량은 각각 8083.5 Da, 9650.8 Da 및 16390.0 Da으로 평가되었으며 이는 이론상 분자량 및 SDS-PAGE로 측정한 겉보기 분자량과 동등한 수준으로서 기존 EGF, IGF-I 및 PDGF-A의 N-말단에 IntoCell에 해당하는 14개 아미노산 (Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg)이 추가로 결합되어 제조되었음을 알 수 있었다.

1.3 : 융합성장인자의 N-말단 아미노산 서열 분석

서열분석(목포대학교 자체 수행) 방법은 Edman degradation 법으로, Automated Edman Sequencer로 수행하였습니다. 정제된 시료들을 micro-glass fiber filer에 고정을 시킨 후, phenylisothiocyanate (PITC) coupling 반응을 통한 N 말단의 polypeptide 사슬들이 형성되는 초기 반응을 개시로 phenylthiocarbamyl (PTC) -polypetide, anilinothiazolamine (ATZ) -amino acid 그리고 최종 phenylthiohydantoin (PTH) derivative amino acid 형태의 안정화된 구조 형성을 통해 PTH-C18 column을 기반으로 하는 HPLC에 매 cycle 에서 생성된 아미노산 유도체를 주입하여 순차적으로 서열을 확인하였다.

상기 얻어진 융합인자의 N-말단 아미노산 서열분석을 통한 EGF, IGF-I, PDGF-A의 N-말단에 IntoCell에 해당하는 14개 아미노산 (Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg)이 추가로 연결됨을 확인하였다.

실험예 1: 피부세포 독성 시험

EGF, IGF-I, PDGF-A 및 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A의 피부세포에 대한 독성을 평가하기 위해 마우스 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cell)를 96-well plate의 각 well에 5 × 10³ cells/100 μL 10% FBS 포함 DMEM 농도로 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMEM으로 EGF, IGF-I, PDGF-A, IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A를 각각 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1,000 ng/mL 농도로 각 well에 100 μL씩 처리하고 12시간동안 추가로 배양하였다. 이후 CCK-8 용액을 각 well에 10 μL씩 처리한 후 37℃에서 2시간동안 배양한 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 성장인자의 처리 후 마우스 섬유아세포의 생존활성을 DMEM만 처리한 음성대조군의 흡광도와 비교하여 세포 생존율을 평가하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 마우스 섬유아세포에 대한 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A의 세포 독성을 평가한 결과 EGF, IGF-I, PDGF-A 및 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 모두 1-1,000 ng/mL의 농도 범위에서 세포 생존율이 80% 이상으로 평가되어 독성을 나타내지 않았으며 이는 기존 성장인자의 N-말단에 IntoCell에 해당하는 14개 아미노산을 추가로 결합해도 세포 독성을 유발하지 않음을 의미한다.

실험예 2 : 섬유아세포 증식 활성 시험

2.1 본 발명의 융합 성장인자의 섬유아세포 증식 활성 시험

IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A의 생리학적 활성 및 섬유아세포 성장을 촉진하는 최적의 농도 조합을 도출하기 위해 마우스 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cell)를 96-well plate의 각 well에 4 × 10³ cells/100 μL 10% FBS 포함 DMEM 농도로 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후 각 well을 100 μL 0.05% FBS 포함 DMEM으로 처리하고 다시 24시간동안 배양하였고, 배양액을 제거한 후 0.5% FBS 포함 DMEM으로 10, 100, 500 ng/mL 농도의 EGF, IGF-I, PDGF-I, IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I 및 IntoCell-PDGF-A 용액을 제조하고 각 물질을 농도별로 조합하여 처리하고 배양하였다. 24시간 후 각 well에 5 mg/mL WST-1 인산염완충액 (pH 7.4)을 10 μL씩 처리한 후 2시간 동안 추가 배양하였고, 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하고 0.5% FBS 포함 DMEM을 처리한 음성 대조군의 흡광도와 비교하여 각 성장인자 및 이들의 조합 처리 시 마우스 섬유아세포의 증식 활성도 (%)를 평가하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, EGF, IGF-I 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I의 경우 처리 농도가 증가할수록 마우스 섬유아세포의 증식이 증가하였다. 또한 10 ng/mL PDGF-A 혹은 IntoCell-PDGF-A를 EGF와 IGF-I의 혼합물 혹은 IntoCell-EGF과 IntoCell-IGF-I의 혼합물에 각각 추가했을 때 섬유아세포의 증식은 더욱 증가하였다. 그러나 PDGF-A 혹은 IntoCell-PDGF-A를 100 ng/mL 이상으로 처리한 경우 오히려 섬유아세포의 증식은 감소하였다.

2.2 본 발명의 융합 성장인자 및 히알루론산 조합한 경우 활성 시험

IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체의 인간 피부세포 증식 촉진 시너지 효능을 나타내는 최적의 농도 조합과 성장인자-히알루론산 복합체의 피부세포 증식 활성 시너지 효능을 확인하기 인간섬유아세포 (CCD-986sk)를 96-well plate에 5 × 10³ cells/well씩 분주하여 10% FBS 포함 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 0.05% FBS 포함 DMEM 배양액에서 다시 24시간 배양하였다. 이후 0.5% FBS 포함 DMEM으로 EGF, IGF-I, PDGF-A 및 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A와 히알루론산 (HA)을 여러 농도별로 제조하여 조합한 후 각 well에 100 μL씩 가하고 24시간 동안 CO₂ incubator에서 추가 배양하였다. 이후 5 mg/mL WST-1 인산염완충액 (pH 7.4)을 각 well에 10 μL씩 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 0.5% FBS 포함 DMEM만 처리한 음성 대조군의 흡광도와 비교하여 각 성장인자-히알루론산 복합체 처치 군의 인간섬유아세포의 증식 활성도(%)를 평가하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 인간섬유아세포에서도 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A을 각각 단독으로 처리했을 경우보다 이들을 조합하여 처리했을 때 섬유아세포의 증식이 유의적으로 증가하였으며 EGF, IGF-I, PDGF-A을 100, 100, 10 ng/mL 혹은 500, 500, 10 ng/mL의 농도 비율로 혼합하여 처리했을 때 섬유아세포 증식 시너지 효과를 나타내었다. IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 역시 100, 100, 10 ng/mL 혹은 500, 500, 10 ng/mL의 농도 비율로 혼합하여 처리했을 때 단독으로 처리한 경우 및 높은 농도 비율로 처리한 군 보다 섬유아세포의 증식이 유의적으로 증가하였다. 또한 3가지 성장인자의 조합에 히알루론산을 추가로 처리했을 때 섬유아세포의 증식은 더욱 증가하였으며 500, 500, 10 ng/mL의 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 혼합액에 각각 100 μg/mL의 히알루론산을 추가하여 처리한 경우 인간섬유아세포 증식 시너지 활성을 나타냈다.

실험예 3 : 콜라겐 생합성 시험

EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A의 성장인자 조합과 히알루론산 복합체의 인간섬유아세포 활성 증진에 의한 콜라겐 생성 촉진 활성을 다음과 같이 평가하였다. 인간섬유아세포 (CCD-986sk)를 96-well plate에 1 × 10⁴cell/well씩 분주하고 10% FBS 포함 DMEM에서 24시간동안 배양하였다. 이후 DMEM으로 희석한 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A의 성장인자 조합에 히알루론산을 농도별로 추가한 성장인자-히알루론산 복합체를 각 well에 100 μL씩 가하고 24시간 동안 CO₂ incubator에서 추가 배양한 후 각 well의 세포 배양액을 취해 Procollagen type I C-peptide EIA kit (Takara, Japan)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정함으로서 인간섬유아세포의 콜라겐 생합성 양을 측정하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 상기 인간섬유아세포 증식 시너지 효과 결과와 마찬가지로 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A를 각각 단독으로 처리한 경우보다 조합하여 처리한 경우 유의적으로 높은 콜라겐 생합성 효과를 나타냈으며 이들 성장인자 조합에 히알루론산을 100 μg/mL 농도로 추가한 성장인자-히알루론산 복합체를 처리했을 때 가장 높은 콜라겐 생합성 효과를 나타냈다.

실험예 4 : 상처 치유 시험

4.1. 융합 성장인자의 in vitro 상처 치유 시험

EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체의 상처치유 시너지 효능을 평가하기 위해 마우스 섬유아세포 (NIH 3T3 cell)를 96-well plate에 3 × 10⁴ cell/well씩 분주하고 10% FBS 포함 DMEM 배지에서 24시간 배양하여 섬유아세포 monolayer를 형성시켰다. 이후 배양액을 제거하고 wound maker를 이용하여 각 well에 cell-free zone (scratch wound)을 형성시키고 인산염완충액 (pH 7.4) 100 μL로 4회 세척한 뒤 serum free DMEM으로 희석한 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 농도별 조합액을 각 well에 100 μL씩 처리하였다. CO2 incubator에서 Incucyte Zoom microscope (Essen Bioscience)로 4시간 간격으로 24시간동안 각 well의 scratch wound의 회복(재생)율을 측정하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 상기 in vitro scratch wound assay에서도 EGF 및 IGF-I 혹은 IntoCell-EGF 및 IntoCell-IGF-I 복합체는 그 처리 농도가 증가할수록 상처회복속도가 증가하였으며 각각의 두 가지 성장인자 복합체에 10 ng/mL 농도로 PDGF-A 혹은 IntoCell-PDGF-A를 추가했을 때 상처회복 효능은 더욱 증가하였다. 특히, EGF (100 ng/mL) + IGF-I (100 ng/mL) + PDGF-A (10 ng/mL) 혹은 IntoCell-EGF (100 ng/mL) + IntoCell-IGF-I (100 ng/mL) + IntoCell-PDGF-A (10 ng/mL)의 세 가지 성장인자 복합체를 처리한 경우 EGF (100 ng/mL) + IGF-I (100 ng/mL) 혹은 IntoCell-EGF (100 ng/mL) + IntoCell-IGF-I (100 ng/mL)의 두 가지 성장인자 복합체를 처리한 경우에 비해 각각 1.09배 및 1.15배 상처회복 속도가 증가하였다. 반면, EGF 및 IGF-I 혹은 IntoCell-EGF 및 IntoCell-IGF-I의 두 가지 성장인자 복합체에 100 ng/mL 이상 농도로 PDGF-A 혹은 IntoCell-PDGF-A를 추가하여 처리할 경우 상처회복 속도는 상대적으로 감소하였다. 따라서 피부재생 및 상처치유 시너지 효능을 위한 EGF:IGF-I:PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF:IntoCell-IGF-I:IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체의 최적 농도 비율은 1:1:0.02 부터 1:1:0.1이다.

4.2. 융합성장인자 및 히알루론산 조합의 in vitro 상처치유 시험

EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체에 히알루론산의 첨가에 따른 상처치유 시너지 효능을 평가하였다. 인간섬유아세포 (CCD-986sk)를 96-well plate에 3.5 × 10⁴ cell/well씩 분주하고 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 72시간 배양하여 인간섬유아세포 monolayer를 형성시킨 후 배양액을 제거하고 wound maker를 이용하여 각 well에 cell-free zone (scratch wound)을 형성시키고 각 well을 인산염완충액 (pH 7.4) 100 μL로 4회 세척한 후 serum free DMEM으로 희석한 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체와 여기에 히알루론산을 농도별로 추가한 성장인자-히알루론산 복합체를 각 well에 100 μL씩 첨가하고 CO₂ incubator에서 Incucyte Zoom microscope (Essen Bioscience)로 4시간 간격, 48시간 동안 scratch wound의 회복(재생)율을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 in vitro scratch wound assay에서도 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체는 음성 대조군 대비 빠른 상처회복 속도를 나타냈으며 각 성장인자 복합체에 100 μg/mL 농도로 히알루론산을 추가할 경우 상처회복 시너지 효능은 더욱 증가하였다. 따라서 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A의 성장인자 복합체에 EGF 혹은 IntoCell-EGF 대비 200 내지 1,000배 농도의 히알루론산을 첨가할 때 피부재생 및 상처치유 시너지 효능을 나타냄을 알 수 있다.

실험예 5 : 피부 투과 시험

5.1. 융합 성장인자를 포함한 외용제 제형 제조

EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A를 각각 500:500:10의 농도 비율(부피비)로 혼합한 성장인자 복합체를 vehicle (6% poloxamer 188 수용액)에 분산시킨 제형을 제조하였다.

상기 성장인자 복합체를 포함한 유동성 리포좀 (elastic liposome)은 Lipoid P100-3, cholesterol 및 DOTAP을 8:4:1의 비율로 chloroform에 용해시킨 후 tween 80 및 성장인자 복합체 수용액을 첨가하여 혼합한 후 Microfluidizer를 이용하여 10,000 psi에서 분산시켰다. 최종 분산액에서 chloroform을 증발시켜 제거하여 상기 성장인자 복합체가 담지된 유동성 리포좀 (elastic liposome)을 제조하였다.

Water-in-oil (w/o) 나노에멀젼 분산 하이드로겔 (NE-based hydrogel)의 경우 각 성장인자 복합체 용액에 surfactant + co-surfactant mixture (Smix; Labrasol : Transcutol P, 1:1, w/w)를 첨가한 후 혼합하고 oleic acid (oil phase)를 추가하고 초음파로 분산시켜 1차 w/o 나노에멀젼을 제조하였다. 성장인자 복합체 aqueous phase와 Smix 및 oil phase의 조성비는 16.6% : 58.4% : 25%이었다. 성장인자 복합체 aqueous phase가 분산된 1차 w/o 나노에멀젼을 하이드로겔 (3% Kollidone 90 수용액) 및 Smix (Labrasol : Transcutol P, 1:1, w/w)의 혼합액에 1차 w/o 나노에멀젼과 Smix 및 하이드로겔의 조성비를 50% : 33.3% : 16.7%로 하여 첨가한 후 2차로 분산시켜 성장인자 복합체 w/o 나노에멀젼 분산 하이드로겔 (NE-based hydrogel)을 제조하였다.

5.2. 인공피부막을 통한 피부투과도 평가

인공피부막 시스템 (skin PAMPA Explorer Test System; PionInc., MA, USA)을 이용하여 상기 제조한 제형으로부터 각 성장인자의 피부투과도를 비교하였다. 먼저, skin PAMPA sandwich plate donor compartment의 각 well을 200 μL hydration solution (pH 7.4)으로 12시간동안 hydration 시킨 후 skin PAMPA sandwich acceptor plate의 각 well에 200 μL의 Prisma-HT buffer solution (pH 7.4)을 채우고 donor compartment plate를 결합하였다. 이후 donor compartment plate의 각 well에 일반 성장인자 복합체 혹은 IntoCell의 14개 피부흡수증진 아미노산 서열이 결합된 성장인자 복합체를 포함하는 각 제형을 200 μL 씩 첨가한 후 상온에서 방치하였다. 성장인자 복합체 첨가한 후 3, 6, 9, 12, 24시간 째 PAMPA sandwich를 분리하고 각 well의 donor 및 acceptor 용액을 150 μL 씩 취해 skin PAMPA 인공피부막을 투과한 각 성장인자의 농도를 HPLC로 측정하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 24 시간 후 vehicle 제형의 경우 IntoCell-EGF의 투과도는 EGF 대비 13.4배 증가하였다. 반면, 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔에 포함된 EGF는 24시간동안 인공피부막을 통해 투과되지 않았다. 그러나 유동성 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔에 포함된 IntoCell-EGF의 경우 24시간 째 각각 2.44 ± 0.24 및 0.93 ± 0.10 μg/mL의 농도로 투과되었다. Vehicle, 유동성 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔에 포함된 IntoCell-IGF-I 역시 24시간 후 투과도는 각 제형으로부터 IGF-I의 투과도 대비 각각 2.84배, 4.88배, 4.92배 증가하였다. Vehicle, 유동성 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔에 포함된 IntoCell-PDGF-A의 경우 24시간 후 투과도는 각 제형으로부터 PDGF-A의 투과도 대비 각각 1.67배, 1.64배, 1.30배 증가하였다.

5.3. 헤어리스 마우스 피부를 통한 투과도 평가

상기 제조한 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A 성장인자 복합체를 포함한 제형으로부터 각 성장인자의 헤어리스 마우스의 피부를 통한 투과도를 비교하였다. 먼저, Franz diffusion cell system의 receptor cell에 각각 5.5 mL 인산염완충액 (pH 7.4)을 채우고 헤어리스 마우스에서 적출한 피부를 각질층을 위로하여 올려놓는다. 이후 donor cell을 결합하고 32oC에서 1시간 동안 receptor cell의 완충액을 600 rpm에서 교반하여 마우스 피부를 충분히 수화시킨 후 각 donor cell에 EGF, IGF-I, PDGF-A 혹은 IntoCell-EGF, IntoCell-IGF-I, IntoCell-PDGF-A를 500:500:10의 농도 비율로 조합한 성장인자 복합체가 포함된 vehicle (6% poloxamer 188 수용액), 유동성 리포좀 (elastic liposome) 및 w/o 나노에멀젼 분산 하이드로겔 (NE-based hydrogel)을 500 μL씩 도포한 후 1, 3, 6, 9, 12, 24시간 째 receptor cell의 용액을 취해 HPLC 시스템을 이용하여 각 제형으로부터 헤어리스 마우스 피부를 통해 흡수된 성장인자의 확산도 (flux, 플럭스)를 계산하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 24 시간 후 vehicle, 유동성 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔로부터 IntoCell-IGF-I의 헤어리스 마우스 skin flux는 각 제형으로부터 IGF-I의 skin flux 대비 각각 123%, 141% 및 243% 증가하였으며 IntoCell-PDGF-A 역시 vehicle, 유동성 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔로부터 24시간 후 skin flux는 각 제형으로부터 PDGF-A의 skin flux 대비 각각 186%, 208% 및 297% 증가하였다. 24 시간 후 모든 제형으로부터 EGF는 마우스 피부를 통해 투과되지 않았으나 vehicle, 유동성 리포좀 및 나노에멀젼 분산 하이드로겔로부터 IntoCell-EGF의 헤어리스 마우스 skin flux는 0.040 ± 0.016, 0.049 ± 0.003 및 0.050 ± 0.001 μg/cm2/h로 평가되었다. 따라서 각 성장인자에 피부세포 투과도 증진 펩타이드인 IntoCell을 융합시킴으로써 각 성장인자의 피부투과도가 급격히 증가하였으며 피부전달 제형 내 포함된 융합 성장인자의 피부투과도 역시 일반 성장인자 대비 매우 우수한 피부투과도 증진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6 : 당뇨병성 상처치유 효능 시험

피부흡수 증진 아미노산이 결합된 성장인자 (Intocell-EGF, Intocell-IGF-I, Intocell-PDGF-A)와 히알루론산 복합체를 포함하는 유동성 리포좀의 당뇨병성 만성상처치유 효능을 평가하기 위해 6주령 암컷 C57 BL/6 마우스에 streptozocin (50 mg/kg)을 1일 1회, 5일간 복강 주사하였다. 평균 혈당이 250 mg/dL 이상이 될 때 각 마우스의 등 부위 중앙에 직경 8-mm round biopsy punch로 full-thickness wound를 형성하였다. 상처 유도 1일 후 아래의 성장인자-히알루론산 복합체 리포좀 용액을 상처부위에 30 μL 씩 1일 1회, 11일간 도포하였다 - 도포 군: vehicle (성장인자 및 히알루론산을 포함하지 않은 유동성 리포좀), 일반 성장인자-히알루론산 복합체 포함 리포좀 (500 μg/mL EGF + 500 μg/mL IGF-I + 10 μg/mL PDGF-A + 100 mg/mL HA), 융합 성장인자-히알루론산 복합체 포함 리포좀 (500 μg/mL Intocell-EGF + 500 μg/mL Intocell-IGF-I + 10 μg/mL Intocell-PDGF-A + 100 mg/mL HA).

도포 후 일정 시간 간격으로 각 개체의 상처를 디지털 카메라로 촬영한 후 image-analysis software로 상처 크기를 측정하고 도포 3, 7 및 9일째 일부 개체의 피부를 적출하여 H&E, Masson’s trichrome stain, anti-cytokeratin 6 (anti-CK6) 및 anti-α-SMA antibody로 염색하고 현미경으로 상처부위 조직을 관찰하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 융합 성장인자-히알루론산 복합체 (IntoCell-EGF + IntoCell-IGF-I + IntoCell-PDGF-A + HA)을 포함하는 유동성 리포좀을 도포한 군은 vehicle 및 일반 성장인자-히알루론산 복합체 포함 리포좀을 도포한 군에 비해 신속하고 우수한 당뇨병성 상처치유 효과를 보였고, 특히, 도포 3일차 융합 성장인자-히알루론산 복합체-유동성 리포좀 도포군은 비이클 대조군 및 일반 성장인자-히알루론산 복합체-유동성 리포좀 도포군에 비해 매우 우수한 상처회복 효능을 보였다. [잔여 상처 면적: 52.2 ± 7.36% (융합 성장인자-히알루론산 복합체), 64.1 ± 7.09% (일반 성장인자-히알루론산 복합체), 80.0 ± 13.3% (비이클 대조군)].

도포 9일째 융합 성장인자-히알루론산 복합체-유동성 리포좀 도포 개체의 상처는 거의 치유되어 도포 11일째 모든 상처가 회복된 반면, 도포 11일째 다른 군의 개체의 상처는 여전히 남아 있고, 이는 조직염색 결과와도 일치하였다. IntoCell 아미노산 결합 융합 성장인자 복합체는 일반 성장인자 복합체 및 대조군과 비교하여 훨씬 두껍고 큰 재상피화 면적을 나타냈으며 다른 군에 비해 더 많은 mature collagen fiber가 생성되어 도포 11일째 다른 군과 달리 당노병성 상처조직이 완전히 remodeling phase 상태였다. 이러한 융합 성장인자 복합체의 신속한 당뇨병성 상처치유 효능은 각 IntoCell 융합 성장인자의 높은 피부투과도와 성장인자 조합 및 히알루론산 복합체의 상처회복 시너지 효능에 기인한 것으로 판단된다.

화장료 조성물의 제조

본 발명의 세포투과형 융합 성장인자를 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
세포투과형 융합 성장인자	2.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
세포투과형 융합 성장인자	7.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
세포투과형 융합 성장인자	5.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
세포투과형 융합 성장인자	7.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
세포투과형 융합 성장인자	1.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> BIOFDNC <120> Topical formulation with Skin Physiological Activity Composed of Cell Permeable Growth Factors <130> KPA01234 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Low Molecular Weight Protamine <400> 1 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IntoCell-EGF <400> 2 gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta gaaatagtga ctctgaatgt 60 cccctgtccc acgatgggta ctgcctccat gatggtgtgt gcatgtatat tgaagcattg 120 gacaagtatg catgcaactg tgttgttggc tacatcgggg agcgatgtca gtaccgagac 180 ctgaagtggt gggaactgcg c 201 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IntoCell-EGF <400> 3 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Asn Ser 1 5 10 15 Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly 20 25 30 Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val 35 40 45 Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp 50 55 60 Glu Leu Arg 65 <210> 4 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IntoCell-IGF cDNA <400> 4 gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta gaggaccgga gacgctctgc 60 ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag acaggggctt ttatttcaac 120 aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc agacaggcat cgtggatgag 180 tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt attgcgcacc cctcaagcct 240 gccaagtcag ct 252 <210> 5 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IntoCell-IGF <400> 5 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Gly Pro 1 5 10 15 Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys 20 25 30 Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser 35 40 45 Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg 50 55 60 Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro 65 70 75 80 Ala Lys Ser Ala <210> 6 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IntoCell-PDGF cDNA <400> 6 gtgagccgta gacgtagacg tagaggtggt cgtagacgta gaagcatcga ggaagctgtc 60 cccgctgtct gcaagaccag gacggtcatt tacgagattc ctcggagtca ggtcgacccc 120 acgtccgcca acttcctgat ctggcccccg tgcgtggagg tgaaacgctg caccggctgc 180 tgcaacacga gcagtgtcaa gtgccagccc tcccgcgtcc accaccgcag cgtcaaggtg 240 gccaaggtgg aatacgtcag gaagaagcca aaattaaaag aagtccaggt gaggttagag 300 gagcatttgg agtgcgcctg cgcgaccaca agcctgaatc cggattatcg ggaagaggac 360 acgggaaggc ctagggagtc aggtaaaaaa cggaaaagaa aaaggttaaa acccacc 417 <210> 7 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IntoCell-PDGF <400> 7 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Ser Ile 1 5 10 15 Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu 20 25 30 Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp 35 40 45 Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser 50 55 60 Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg Val His His Arg Ser Val Lys Val 65 70 75 80 Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln 85 90 95 Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu 100 105 110 Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp Thr Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly 115 120 125 Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys Pro Thr 130 135

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 EGF;
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 IGF-1;및
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 PDGF를 포함하는, 피부 외용제 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 히알루론산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 주름 개선 또는 상처 치유용 피부 외용제 조성물.
제1항에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 EGF; 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 IGF-1;및 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 PDGF를 담지한 리포좀을 포함하는 당뇨병성 상처치유용 피부 외용제 조성물.
제1항에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 EGF; 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 IGF-1;및 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포투과형 펩타이드가 융합된 재조합 PDGF를 포함한 하이드로겔.