KR102042758B1 - 경피투과도가 향상된 신경전달물질 조절 펩타이드 화장료 조성물 - Google Patents

경피투과도가 향상된 신경전달물질 조절 펩타이드 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부투과 촉진 펩타이드가 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 결합된 융합 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 피부투과 촉진 펩타이드에 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 상기 융합 펩타이드를 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 및 상기 화장료 조성물을 포함하는 피부개선용 기능성 화장품에 관한 것이다.

Description

경피투과도가 향상된 신경전달물질 조절 펩타이드 화장료 조성물 {Cosmetic composition containing peptide regulating neurotransmitters to neuron cells}
본 발명은 신경전달물질 방출 조절 펩타이드를 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부투과 촉진 펩타이드에 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 상기 융합 펩타이드를 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 및 상기 화장료 조성물을 포함하는 피부개선용 기능성 화장품에 관한 것이다.
피부를 통과하는 약물은 사용의 편리성에 의해서 진통패치, 금연패치, 임신 조절제 등에서 사용되고 있고, 피부를 통하여 체순환계(systemic circulation)에 전달하려는 목적을 가진다. 이와 함께 아토피 치료제, 미백, 주름 개선용 화장품 등 피부자체의 기관에 전달하려는 목적을 가지는 경우도 있다. 이런 편리성과 기능성을 가지는 목표에도 불구하고 피부의 구조상 약물의 전달의 어려움을 가지는데, 이는 피부의 구조를 보면 이해할 수 있다. 약 10~15 층의 각질세포(corneocyte)로 이루어진 피부의 각질층은, 케라틴이 풍부한 각질세포로 이루어져 있는 브릭(brick) 구조와, 이러한 각질세포 사이를 세라마이드(ceramide), 지방산(fatty acid), 또는 왁스(wax) 등과 같은 지질이 채운 모르타르(mortar) 구조로 이루어져 있으며, 약 10~45um 정도의 두께를 이루고 있다. 이러한 구조는 내부의 수분의 손실을 막고 외부로부터의 침입을 막는 역할을 한다. 따라서, 그 역할에 충실하게 물질 투과성이 아주 낮은데, 500Da 이하의 저분자 구조 성분들만 확산 방식에 의해서 피부 내로 전달된다(Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9.). 이는 모르타르 구조의 세포 내 지질층이나, 지질층 사이의 수용성 구조를 통해서 이루어지고, 물질 투과성은 약물의 성질에 따라 크게 좌우된다(Current Drug Delivery, 2005, 2, 23-3). 또한 피부표면을 직접 통과하는 방식 이외에 피부의 땀샘, 모공, 피지선 등의 구조를 이용하여 전달되기도 한다.
이러한 이유로, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.
예를 들어, 미국등록특허 제7,659,252호에는 피부질환의 치료 및 약학적 활성제제의 피부투과 촉진에 사용될 수 있는 피부투과성 펩타이드가 개시되어 있다. 상기 펩타이드는 우수한 피부 투과도를 나타낼 뿐만 아니라 다른 약물의 경피전달용 담체로서도 사용될 수 있다는 장점이 있으나, 피부를 투과한 다음에는 체내의 순환시스템을 통해 소모되기 때문에, 피부를 표적으로 하는 약물의 경우에는 별다른 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있었다.
한편 신경전달물질의 방출은, 신경전달물질을 함유하는 신경말단에 위치하는 시냅스 소포(synaptic vesicle)와 시냅스 전막(presynaptic membrane)이 융합된 후 두 경계 간의 통로가 형성됨에 의해 발생된다. 소포 단백질 VAMP(synaptobrevin)와 원형질막 결합단백질인 신택신(Syntaxin) 1a, SNAP-25로 이루어진 3종의 단백질 복합체인 SNARE 단백질이 시냅스 소포와 시냅스 전막의 융합에 근원적인 힘을 제공한다. 여기서 시냅스 소포와 시냅스 전막 간의 막 융합에 의해 신경전달물질 방출 통로가 열리는 것은, 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는 신택신 1a 단백질과 SNAP-25 단백질 2종의 복합체인 t-SNARE 및 소포(vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE의 작용에 따른 결과이다. 상기 막 융합 시에는 지질 이중층(lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내므로, 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들 간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이러한 힘을 제공하는 것이 SNARE 단백질인 것으로 알려졌다. 이와 같이 SNARE 복합체의 형성은 신경전달물질의 방출을 포함하는 세포외 방출작용(exocytosis)의 핵심 현상이다.
최근 들어 비마비성 방식으로 독소의 부작용 없이 근육의 수축을 감소시키는, 보톡스(botox)와 유사한 역할을 갖는 펩타이드에 대한 개발이 이루어지고 있다. 이러한 펩타이드는 근육 세포의 수축을 담당하는 아세틸콜린 등과 같은 신경전달 물질의 분비를 한시적으로 차단하여 주름 발생을 완화시키는 역할을 한다.
그러나, 상기 보톡스와 유사한 역할을 하는 펩타이드의 개발에도 불구하고, 크림 등의 제형으로 피부에 도포 시 그 효과가 미비하여 본래의 효능을 그대로 발휘하지 못하는 문제가 있었다.
본 발명자들은 피부투과성 및 피부 잔류성이 우수한 물질을 개발하고자, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 피부투과 촉진 펩타이드를 발굴하였다. 또한, 신경전달물질 방출 조절 펩타이드 또는 이의 유도체를 피부에 효과적으로 전달하기 위해 분리된 펩타이드를 이용할 수 있으며, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열을 이용하여 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 효능에 변형이 없으면서, 피부 투과도와 피부 잔류성을 높일 수 있음을 밝혔다.
그러나, 기존의 성장인자와 같이 분자량이 큰 성장인자의 피부 투과를 촉진하는 경우, 투과촉진 펩타이드의 분자량이 상대적으로 작아서 융합성장인자와 기본 성장인자간의 분자량 변화가 적고 추가되는 펩타이드의 분자량에 의해 피부 투과가 저해 받을 가능성이 적었다. 따라서 파지라이브러리를 통해 선별된 펩타이드의 대부분이 성장인자의 피부투과를 촉진 시킬 수 있었다. 그러나 짧은 펩타이드나 효능성분의 경우 투과촉진 펩타이드가 융합된 경우 분자량이 2배 이상 증가하고 이는 피부투과를 오히려 억제하는 효과를 가져와서 기존의 방식으로는 개발하는데 여려움이 있었다. 본 발명을 통해서 분자량이 작은 효능물질에 결합하여도 피부투과 촉진 기능을 하는 펩타이드를 발굴 할 수 있었다.
아울러, 상기 발굴된 피부투과 촉진 펩타이드를 신경전달 물질 방출을 조절하며, 주름개선 등 피부개선 효과를 갖는 펩타이드와 결합하였고, 상기 피부투과 촉진 펩타이드와 결합된 융합 펩타이드가 기존 단백질에 비해 용해도가 증가되면서도 피부투과성 및 피부 잔류성이 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 피부투과 촉진 펩타이드가 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 결합된 융합 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 기능성 화장품을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하고, 본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 피부투과 촉진 펩타이드가 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 결합된 융합 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 상기 서열 번호 1의 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
피부투과 촉진 펩타이드: NGSLNTHLAPIL (서열번호 1)
구체적으로, Asparagine(아스파라긴) Asn N- Glycine(글리신) Gly G- Serine(세린) Ser S- Leucine(류신) Leu L- Asparagine(아스파라긴) Asn N- Threonine(트레오닌) Thr T- Histidine(히스티딘) His H- Leucine(류신) Leu L- Alanine(알라닌) Ala A Proline(프롤린) Pro P- Isoleucine(이소루신) Ile I- Leucine(류신) Leu L으로 나타낼 수 있다.
상기 펩타이드와 결합된 신경전달물질 방출 조절 펩타이드 (펩타이드 또는 이의 유도체)은 피부 투과성이며, 피부 잔류성을 가지는 것으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "피부투과 촉진 펩타이드"란, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있으며, 피부 투과성 및 피부 잔류성이 우수한 펩타이드를 의미한다.
본 발명에 있어서, "피부 투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 피부투과 촉진 펩타이드는 다른 펩타이드에 비하여 현저히 우수한 피부투과성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, "피부 잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부 내의 조직에 결합되어 피부 내에서 잔류하는 능력을 의미한다. 피부조직을 표적조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 경우에는, 상기 펩타이드와 결합된 성분이 피부조직 또는 피부세포에 장기간 작용할 수 있도록 피부조직에 잔류하는 특성이 우수한 담체를 사용함이 바람직하다. 본 발명의 피부투과 촉진 펩타이드는 피부투과성뿐만 아니라 피부잔류성이 현저히 우수하므로, 약학적 제제 또는 화장료의 담체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 피부투과 촉진 펩타이드는 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한 파지 디스플레이 방법을 수행하여 발굴된, 피부 투과성과 피부 잔류성이 우수한 펩타이드를 포함할 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 파지 디스플레이 방법을 통해 피부투과 촉진 펩타이드로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제조하였다(실시예 1).
본 발명에 있어서, "신경전달물질"은 뇌를 비롯하여 체내의 신경 세포에서 방출되어 인접해 있는 신경 세포 등에 정보를 전달하는 일련의 물질로서, 하나의 뉴런에서 또 다른 '표적' 뉴런으로 시냅스를 가로질러 신호를 전달하는 내인성 화학물질이다. 신경전달물질은 시냅스의 시냅스 전 부분에서 축삭 말단의 막 아래에 군집화된 시냅스 소낭으로 패키징된 후, 시냅스 간극 내에 방출되어 시냅스 간극을 가로질러 발산되는데, 이때 신경전달물질은 시냅스의 시냅스 후 부분에서 막의 특이적 수용체에 결합된다. 본 발명의 신경전달물질은 도파민, 세로토닌, 히스타민, 아세틸콜린, 아드레날린, 노르아드레날린, 감마아미노뷰티릭산(GABA), L-글루탐산, 글라이신 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "신경전달물질 방출 조절 펩타이드"는 신경전달물질이 신경전달물질의 수용체로 전달되는 것을 차단하여 근 수축 효과를 억제할 수 있으며, 주름 개선 효과를 나타낼 수 있는 펩타이드를 의미한다. 보다 구체적으로, 근육을 움직이기 위해서는 신경전달물질이 신경세포에서 근육세포로 시냅스를 통해 전달되어야 하는데, 시냅스에서 신경전달물질인 아세틸콜린이 분비되기 위해서는 신경세포 말단에서 스네어 복합체(SNARE Complex)가 형성되어 시냅스로 방출되는 과정이 필요하다. 일반적으로 알려진 보톡스는 스네어 복합체를 형성하는 성분(SNAP-25)을 파괴하여 아세틸콜린이 시냅스로 방출되지 못하게 한다. 반면, 보톡스 유사 펩타이드는 스네어 복합체의 구성 성분(SNAP-25) 일부와 유사한 구조를 갖고 있어, SNAP-25 대신 복합체의 구성 과정에 관여하여 아세틸콜린이 방출되는 과정을 막는 역할을 한다.
본 발명의 신경절달물질 방출조절 펩타이드는 업계에서 널리 알려진 것이 사용될 수 있으며, 펩타이드 종류에 특별히 제한되지 않는다. 천연 펩타이드 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 펩타이드도 포함될 수 있다. 또한 주름개선 효과를 갖는 것으로 알려진 펩타이드의 펩타이드 유도체도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 Argireline™(Acetyl-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg (Acetyl-EEMQRR, 서열번호 2), Infinitec社의 X50 MyoceptTM, Palmitoyl-hexapeptide-52([Pal]-Asp-Asp-Met-Gln-Arg-Arg ([Pal]DDMQRR 서열번호 3), Palmitoyl-heptapeptide-18([Pal]-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe ([Pal]YPWTQRF 서열번호 4)), GABA (γ-amino butyric acid), 보톡스 독신(botulinum toxin) 또는 이들의 혼합물 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드, 이의 이성질체, 라세미 화합물, 이의 화장학적 또는 약학적으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
R1-AA-R2
상기 화학식 1에서 AA는 3-40의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, R1은 H 또는 C3 내지 C24 알킬, 아릴, 또는 아실 그룹 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며;
상기 화학식 1의 펩타이드의 R1은 탄소수 3 내지 24의 아실기일 수 있으며, 상기 아실기는 포화(saturated) 또는 불포화(unsaturated)일 수 있으며, 선형(linear), 가지형(branched) 또는 고리형(cyclic)일 수 있다.
구체적으로, 상기 R1은 화학식 CH3-(CH2)m-CO-의 아실기로, m은 1 내지 22에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 더 구체적으로 상기 R1은 분자량 200 내지 35,000 Da인 폴리에틸렌 글라이콜 폴리머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 AA는 MAEDADMRNELEEMQRRADQL (서열번호 5), ADESLESTRRMLQLVEESKDAGI (서열번호 6), ELEEMQRRADQLA (서열번호 7), ELEEMQRRADQL (서열번호 8), ELEEMQRRADQ (서열번호 9), ELEEMQRRAD (서열번호 10), ELEEMQRRA (서열번호 11), ELEEMQRR (서열번호 12), LEEMQRRADQL (서열번호 13), LEEMQRRADQ (서열번호 14), LEEMQRRAD (서열번호 15), LEEMQRRA (서열번호 16), LEEMQRR (서열번호 17), EEMQRRADQL (서열번호 18), EEMQRRADQ (서열번호 19), EEMQRRAD (서열번호 20), EEMQRRA (서열번호 21), EEMQRR (서열번호 22), LESTRRMLQLVEE (서열번호 23), NKDMKEAEKNLT (서열번호 24), KNLTDL (서열번호 25), IMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG (서열번호 26), SNKTRIDEANQRATKMLGSG (서열번호 27), TRIDEANQRATKMLGSG (서열번호 28), DEANQRATKMLGSG (서열번호 29), NQRATKMLGSG (서열번호 30) 및 QRATKMLGSG (서열번호 31)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 AA는 SNAP-25 단백질의 아미노 및 카르복시기 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 화학식 1의 펩타이드의 R2는 C1 내지 C24 알리파틱(aliphatic) 또는 사이클릭(cyclic)기는 치환되지 않거나, 아미노기, 하이드록실기 또는 티올기 중에서 선택된 어느 하나 이상으로 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 R1 및 R2의 치환기들은 US 2010-0021510 A1에 공지된 예들이 이용될 수 있으며, 상기 US 2010-0021510 A1의 전체 내용은 본 명세서에 포함된다. 상기 화학식 1의 화합물들은 US 2010-0021510 A1에 공지된 예들이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 신경전달물질 방출 조절 펩타이드인 Acetyl-EEMQRR, Palmitoyl-DDMQRR, 및 Palmitoyl-YPWTQRF을 단독으로 사용하는 경우보다 서열번호 1의 피부 투과 촉진 펩타이드와 융합하여 사용할 경우, SNARE의 형성을 직접 억제하고 신경세포 내 Ca2 + 이온의 유입을 차단하여 간접적으로 SNARE의 형성을 억제할 수 있어, 함께 사용할 때 더욱 우수한 피부주름 감소 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, "융합 펩타이드" 란 상기 피부투과 촉진 펩타이드가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 펩타이드로서, 구체적으로 상기 피부투과 촉진 펩타이드 및 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 피부투과 촉진 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드는 서열번호 2 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드, 구체적으로는 서열번호 2, 3, 4의 펩타이드이거나, 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드, 이의 이성질체, 라세미 화합물, 이의 화장학적 또는 약학적으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다. 보다 더 구체적으로 상기 융합 펩타이드는 서열번호 32, 33, 34 및 보튤리늄톡신+서열번호 1의 융합 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 융합 펩타이드는 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 융합 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 구성하는 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 단백질 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 펩타이드를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 융합 펩타이드는 18 내지 40개의 아미노산으로 구성되는 짧은 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 융합 펩타이드는 상기 피부투과 촉진 펩타이드 및 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 융합 펩타이드는 상기 피부투과 촉진 펩타이드가 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커(Linker)를 통해 융합 연결될 수도 있다.
상기 링커는 구체적으로 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 구체적으로 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등의 아미노산을 여러 개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 보다 더 구체적으로 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부투과 촉진 펩타이드의 C-말단과 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 N-말단을 2개의 펩타이드(GG)로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합 펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드로서 Argireline™, (Acetyl-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg, Acetyl-EEMQRR) 서열번호 2), Palmitoyl-hexapeptide-52([Pal]-Asp-Asp-Met-Gln-Arg-Arg ([Pal]DDMQRR 서열번호 3), Palmitoyl-heptapeptide-18([Pal]-Tyr-Pro-Trp-The-Gln-Arg-Phe ([Pal]YPWTQRF 서열번호 4)), 보톡스 독신(botulinum toxin)에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 피부투과 촉진 펩타이드를 결합하여 융합 펩타이드를 제조(서열번호 32, 33, 34, 및 보튤리늄톡신+서열번호 1)하였으며, 상기 제조된 융합 펩타이드의 효과를 종래의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드와 비교한 결과, 피부투과도 및 피부 잔류성이 현저히 향상되고 주름 개선 효과 또한 우수함을 확인하였다(표 1, 표 2 및 도 1).
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "주름 개선"이란 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명의 융합 펩타이드는 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 융합 펩타이드의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50 중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 피부투과 촉진 펩타이드를 결합하여 제조된 융합 펩타이드를 함침하여 크림을 제조하고, 상기 크림의 피부개선 효과를 확인한 결과, 종래의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 함침된 크림에 비해 주름 개선 효과가 2배 이상 우수함을 확인하였다(표 3 및 도 2).
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 기능성 화장품을 제공한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 기능성 화장품을 제공할 수 있다. 상기 화장료 조성물 및 주름 개선은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서, "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.
본 발명의 기능성 화장품은 상기 화장료 조성물에 일반 피부용 화장품의 제조 시에 사용되는 적절한 담체를 가하여 제조할 수 있다. 이때, 사용되는 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 기능성 화장품은 주름 개선 효과를 나타내고, 그의 제형은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림, 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있고, 구체적으로는 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼 또는 오일젤의 제형으로 제조될 수 있는데, 이때, 사용되는 담체는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 파우더 또는 스프레이 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더, 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 용액 또는 유탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 현탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 화장비누 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 피부외용연고는 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 바셀린 50 내지 97 중량% 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5 중량%를 함유하도록 제조될 수 있고; 유연화장수는 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 프로필렌글리콜 또는 글리세린과 같은 다가알콜류 1 내지 10 중량% 및 폴리에틸렌올레일에테르 또는 폴리옥시에틸렌 경화피마자유와 같은 계면활성제 0.05 내지 2 중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 스쿠알란, 바셀린 또는 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5 내지 20 중량% 및 세탄올, 스테아릴알콜 또는 밀납과 같은 왁스성분 3 내지 15 중량%을 함유하도록 제조될 수 있고; 에센스는 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 글리세린 또는 프로필렌글리콜과 같은 다가알콜류 5 내지 30 중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 마사지크림은 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 유동파라핀, 바셀린 또는 이소노닐이소노나노에이트와 같은 오일류를 30 내지 70 중량% 함유하도록 제조될 수 있고; 팩은 본 발명의 융합 펩타이드 이외에 폴리비닐알콜을 5 내지 20 중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩으로 제조되거나 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연 또는 이산화티탄과 같은 안료가 5 내지 30 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조될 수 있다.
본 발명의 융합 펩타이드는 신경전달물질 방출 조절 능력이 있는 펩타이드에 피부투과 촉진 펩타이드가 결합되어, 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 펩타이드의 능력이 유지 또는 향상되면서도, 동시에 피부투과성과 피부 잔류성을 현저하게 향상시키므로, 피부개선용 화장료 조성물 및 기능성 화장품의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니된다.
도 1은 Argireline™ (Acetyl-EEMQRR 서열번호 2) 및 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드(서열번호 32)의 근 수축 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 인체를 대상으로 Argireline™ (Acetyl-EEMQRR) 및 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 함유 크림의 주름개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 피부투과 촉진 펩타이드의 선별
피부투과 촉진 펩타이드를 선별하기 위해서 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하였다.
먼저, 1% BSA를 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) 용액 500μL Ph.D-12 파지 라이브러리 키트 (New England Biolab)로부터 유래된 109개의 파지를 가하여 파지용액을 수득하였다.
다음으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5mL, Permgear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착한 뒤 상단에 상기 파지 용액을 가하고, 16시간 동안 반응시킨 다음, 상기 돼지 피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 도달된 파지를 수득하고, 이를 증폭시켰다.
상기 증폭은 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)을 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 25mL의 LB 배지에 진탕 배양된 대장균 ER2738 균주에 상기 파지용액 5mL를 가하고 4시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 8,000G로 원심 분리하여 파지분획이 포함된 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 6mL의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 반응시켜서 파지를 침전시키고, 상기 반응액을 8,000G로 원심 분리하여 파지를 침전시켰으며, 상기 침전물을 TBS 용액에 현탁시켜서 증폭된 파지용액을 수득하였다.
이처럼, 돼지 피부에 파지를 가하여 피부를 투과시킨 파지를 수득하고, 이를 증폭시키는 과정을 1회 진행하는 것을 1 Round라고 정의하였으며, 1 Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2 Round를 진행하여 피부 투과력을 경쟁하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 선별하였고, 총 3 Round를 수행하였다.
상기 3 Round 수행 결과 최종적으로 얻어진 파지에 포함된 펩타이드의 서열을 확인하기 위하여, 상기 파지를 포함하는 TBS 용액을 대장균 ER2738 균주에 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액에 TOP agar를 가하여 혼합한 다음, 상기 혼합물을 LB/X-gal/IPTG 평판배지의 상단에 가하여 고형화시켰다. 그런 다음, 고형화된 배지를 16시간 동안 배양한 후, 청색의 콜로니(colony)를 선별하였다. 상기 선별된 콜로니로부터 유래된 균주를 6시간 동안 배양하고, 이로부터 DNA를 수득하여 파지로부터 유래된 염기서열을 분석함으로써, 돼지 피부를 투과하는 특성을 나타내는 피부투과 촉진 펩타이드(서열번호 1)를 선별하였다.
실시예 2: 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 피부투과 촉진 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진 펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 서열번호 32의 융합 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진 펩타이드와 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 서열번호 33의 융합 펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진 펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 서열번호 34의 융합 펩타이드 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진 펩타이드와 보톡스 톡신(botulinum toxin)의 신경전달물질 방출 조절 펩타이드가 결합된 보튤리늄톡신+서열번호 1의 융합 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 합성하고 분리 및 정제하여 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 제조하였다.
실시예 2-1: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 합성
상기 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 펩타이드 자동합성기(Applied Biosystems Model 431A)를 이용하여 고체상(solid phase) 펩타이드 합성법으로 합성하였다.
구체적으로, 0.25mmol의 파라히드록시 메틸페닐옥시메칠 폴리스티렌(HMP) 레진을 표준 반응용기(38mL)에 넣고, 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단의 Fmoc-아미노산을 넣은 뒤 합성을 시작하였다. 1mmol의 Fmoc-아미노산이 들어있는 카트리지를 카르복실 말단 아미노산에서부터 아미노산 말단의 아미노산까지 배열순서대로 가이드웨이에 배열하였다. 이 때 카트리지의 금속 뚜껑을 제거하고 맨 처음과 맨 끝에는 아미노산이 들어있지 않은 빈 카트리지를 놓았다.
펩타이드 합성은 ABI사에서 개발한 표준 스케일 Fmoc 커플링 프로토콜(protocol)에 따라 시행 전에 파라메타를 편집하였고 자동합성 메뉴에 따라 시행하였다(ABI User's Manual. Jan, 1992 참조). 표준 스케일 Fmoc을 사용할 때는 디프로텍션(deprotection)을 N-메틸피롤리딘(NMP)으로 희석한 20% 피페리딘을 사용하여 21분 동안 수행하였으며, NMP로 9분 동안 세척하고 커플링을 71분 동안 실시하였다. 커플링에는 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT)을 사용하였고 NMP로 7 분간 세척하는 시스템을 이용하였다.
실시예 2- 2: 융합 펩타이드의 분리 및 정제
상기 실시예 2-1에서 합성된 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 하기와 같은 과정을 통해 분리 및 정제하였다.
먼저, 실시예 2-1에서 합성된 융합 펩타이드를 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 고체 지지체(solid support)로부터 분리하고, ABI사의 매뉴얼 (Introduction to Cleavage Techniques, P6-19(1990))을 참고로 하여 상기 융합 펩타이드를 분리하였다. 구체적으로, 실시예 2-1에서 합성된 융합 펩타이드가 붙은 레진을 둥근 플라스크에 넣고 냉각시킨 후, 결정 페놀 0.75g, 1,2-에탄디티올(EDT) 0.25mL, 티오아니솔 0.5mL, 증류수 0.5mL, 및 TFA 10mL를 넣고 뚜껑을 닫은 다음 실온에서 1∼2 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 레진과 반응액을 규화(sintered) 유리 깔대기를 통해 저진공으로 여과하여 레진과 융합 펩타이드 용액을 분리하였다. 플라스크와 유리 깔대기를 5∼10mL 디클로로메탄(DCM)으로 씻은 용액이 융합 펩타이드 용액과 섞이게 하였으며, 50mL 이상의 차가운 디에틸에티르를 첨가하여 융합 펩타이드의 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 저진공으로 깔대기로 여과하여 깔대기 위에 모아진 침전물을 건조시킨 후, 30% 초산에 녹여 냉동 건조시켰다. 이렇게 하여 얻어진 융합 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였다. 이때 칼럼은 C18 analytical column(Pharmacia)을 사용하였으며, 완충용액 A는 10% 아세토니트닐 + 0.05% TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 80% 아세토니트닐 + 0.05% TFA를 사용하여 융합 펩타이드를 용출하였다. 그 결과 고순도로 정제된 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드(서열번호 32)를 얻었으며 합성 수율은 30 ± 5 % 정도였다.
실험예 : 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 효과검증
상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 개선 용도를 확인하기 위하여 하기와 같이 근 수축 억제 효과, 피부 투과성, 피부 잔류성 및 주름 개선 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.
실험예 1: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 근 수축 억제 효과
상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 근 수축 억제 효과를 확인하기 위해, 먼저 C2C12세포를 플레이트에 10% (v/v) 태아 송아지 혈청과 1% (v/v) 항생물질이 들어간 DMEM배지에서 배양한 후, 신경아세포를 같은 플레이트에 추가적으로 공동 배양하였다. 그런 다음, C2C12세포의 세포 수축이 시작할 때 30초간 C2C12 세포의 수축 횟수를 측정하고, 배지를 모두 제거한 후 PBS로 3회 세정한 후 송아지 혈청이 들어있지 않은 배지와 상기 융합 펩타이드 50ppm 을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 이후 C2C12 세포의 수축횟수를 다시 30초간 측정하여 근 수축 억제 정도를 확인하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 피부투과 촉진 펩타이드가 결합되지 않은 대조군인 Argireline™ 뿐만 아니라, 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드도 신경세포로부터 신경전달물질의 방출을 억제하여 C2C12 세포의 수축 횟수를 감소시키는 것을 알 수 있었다.
실험예 2: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 투과성 확인
상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 투과성을 확인하기 위해, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하였다.
구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% Tween 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비하였다. 그런 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 상기 TBS를 500μL 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 상기 TBS를 5mL 가하였다. 이어서, 대조군 펩타이드(AgirellineTM, [Pal]DDMQRR, [Pal]YPWTQRF, Botulinum toxoid) 2μg과 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 2μg 각각을 상기 Glass cell의 상단에 가하고, 16시간 동안 반응시켰다. 이후 하단에 존재하는 대조군 펩타이드 또는 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 농도를 정량 분석하고, 대조군 펩타이드 함량에 대한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 양의 상대적인 함량을 투과 촉진량으로 산출하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부투과성
처리 펩타이드 투과 촉진량(%)
Argireline™ 100±14
Agirelline™ (Acetyl-EEMQRR)- 투과 펩타이드 360±31
[Pal]DDMQRR- 투과 펩타이드 420±22
[Pal]YPWTQRF- 투과 펩타이드 280±15
Botulinum toxoid-투과 펩타이드 350±22
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 처리할 경우 대조군 보다 피부 투과성이 약 2.8~4,2배 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 사용하면, 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 피부 투과율이 현저하게 증가함을 알 수 있다.
실험예 3: 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 잔류성 확인
상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 잔류성을 확인하기 위해, Franz glass cell (Standard 직경 9mm, Receiver 5mL, Permegear)을 이용하였다.
구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 각각 500μL와 5mL의 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)용액에 1% BSA(Sigma), 0.01% Tween 20을 녹인 후, 상기 Glass cell의 상단에는 상기 TBS를 500μL 가하고, 상기 Glass cell의 하단에는 상기 TBS를 5mL 가하였다. 대조군인 대조군 펩타이드(AgirellineTM, [Pal]DDMQRR, [Pal]YPWTQRF, Botulinum toxoid)와 상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 돼지 피부를 이용한 Franz cell system의 Donor chamber에 처리하고 돼지 피부 내에 존재하는 대조군 펩타이드와 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 양을 측정하기 위하여 돼지 피부 조직을 파쇄 후 HPLC 정량을 이용하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 피부 잔류성
처리 펩타이드 상대 투과량(%)
Argireline™ 100±14
Agirelline™ (Acetyl-EEMQRR)- 투과 펩타이드 9800±1200
[Pal]DDMQRR- 투과 펩타이드 7220±422
[Pal]YPWTQRF- 투과 펩타이드 6290±1350
Botulinum toxoid-투과 펩타이드 8320±242
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 처리할 경우 대조군 펩타이드 보다 피부 잔류량이 약 62~98배 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 사용하면 신경전달물질 방출 조절 펩타이드의 피부 잔류성이 현저하게 증가함을 알 수 있다.
실험예 4: 주름 개선 효과
상기 실시예 2에서 제조한 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드의 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 일반적인 수중유형 유화제형 (oil in water emulsion)의 크림에 Argireline™과 상기 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드를 각각 함침하여 주름 개선 효과를 비교하였으며, 각 함유 크림에 포함된 성분 및 함량은 하기 표 3과 같다.
성분 Argireline™
함유 크림		 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 함유 크림
C14-22알코올, C12-20알킬글루코사이드
(혼합물 C14-22 알코올 : C12-20 알킬글루코사이드 = 80 : 20 중량비)		 1.5 1.5
글리세릴스테아레이트, 피이지-100스테아레이트 (혼합물 50:50 중량비) 1.2 1.2
글리세릴스테아레이트 0.9 0.9
세테아릴알코올 1.5 1.5
폴리글리세릴-3메칠글루코오스디스테아레이트 1.5 1.5
하이드로제네이티드폴리데센 4.5 4.5
사이클로헥사실록산 3.5 3.5
카보머 0.2 0.2
트로메타민 0.2 0.2
글리세린 3 3
DPG 5 5
1,2-헥산디올 2 2
Argireline™ 0.1
신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 0.1
정제수 잔여량 (To 100) 잔여량 (To 100)
Argireline™ 함유 크림과 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 함유 크림을 눈가 주름에 12주간 매일 처리하여, 주름 개선 정도를 실리콘 모사판(silicone replica) 및 주름 영상 분석 방법으로 통해 확인하였다(N=21).
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, Argireline™ 크림에 비해 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드 크림이 2배 이상 우수한 개선효과를 보였으며, 이로서 신경전달물질 방출 조절 융합 펩타이드가 신경전달물질 방출 조절 펩타이드에 비해 피부 내로 효과적으로 침투하여, 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있었다.
이는 기존 성장인자와 같이 분자량이 큰 인자에 비하여 신경전달물질은 분자량이 작기 때문에 피부투과 촉진 펩타이드를 결합시킨 융합단백질의 경우에도 분자량이 더 작아져, 피부 투과성 및 피부 잔류성이 증가하고, 이를 통해 피부 주름 개선효과가 증가됨을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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  8. 서열번호 32로 이루어진 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물로서, 상기 융합 펩타이드는 피부투과성 및 피부잔류성이 증가된 것인, 화장료 조성물.
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  12. 제8항의 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 개선용 기능성 화장품.
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