KR102079050B1 - 인슐린유사 성장인자-1의 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)의 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 IGF-1가 결합된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물, 탈모개선용 화장료 조성물 및 상기 융합 단백질을 포함하는 의약외품 조성물에 관한 것이다.

Description

인슐린유사 성장인자-1의 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with IGF-1}

본 발명은 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)의 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 IGF-1가 결합된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물, 탈모개선용 화장료 조성물 및 상기 융합 단백질을 포함하는 의약외품 조성물에 관한 것이다.

피부를 통과하는 약물은 사용의 편리성에 의해서 진통패치, 금연패치, 임신 조절제 등에서 사용되고 있고, 피부를 통하여 체순환계(systemic circulation)에 전달하려는 목적을 가진다. 이와 함께 아토피 치료제, 미백, 주름 개선용 화장품 등 피부자체의 기관에 전달하려는 목적을 가지는 경우도 있다. 이런 편리성과 기능성을 가지는 목표에도 불구하고 피부의 구조상 약물의 전달의 어려움을 가지는데, 이는 피부의 구조를 보면 이해할 수 있다. 약 10~15 층의 각질세포(corneocyte)로 이루어진 피부의 각질층은, 케라틴이 풍부한 각질세포로 이루어져 있는 브릭(brick) 구조와, 이러한 각질세포 사이를 세라마이드(ceramide), 지방산(fatty acid), 또는 왁스(wax) 등과 같은 지질이 채운 모르타르(mortar) 구조로 이루어져 있으며, 약 10~45um 정도의 두께를 이루고 있다. 이러한 구조는 내부의 수분의 손실을 막고 외부로부터의 침입을 막는 역할을 한다. 따라서, 그 역할에 충실하게 물질 투과성이 아주 낮은데, 500Da 이하의 저분자 구조 성분들만 확산 방식에 의해서 피부 내로 전달된다(Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9.). 이는 모르타르 구조의 세포 내 지질층이나, 지질층 사이의 수용성 구조를 통해서 이루어지고, 물질 투과성은 약물의 성질에 따라 크게 좌우된다(Current Drug Delivery, 2005, 2, 23-3). 또한 피부표면을 직접 통과하는 방식 이외에 피부의 땀샘, 모공, 피지선 등의 구조를 이용하여 전달되기도 한다.

이러한 이유로, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.

예를 들어, 미국등록특허 제7,659,252호에는 피부질환의 치료 및 약학적 활성제제의 피부투과 촉진에 사용될 수 있는 피부투과성 펩타이드가 개시되어 있다. 상기 펩타이드는 우수한 피부 투과도를 나타낼 뿐만 아니라 다른 약물의 경피전달용 담체로서도 사용될 수 있다는 장점이 있으나, 피부를 투과한 다음에는 체내의 순환시스템을 통해 소모되기 때문에, 피부를 표적으로 하는 약물의 경우에는 별다른 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있었다.

이러한 단점은 콜라겐 합성, 내피세포 성장 또는 히알루론산 생성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 다양한 유효성분이 정상적으로 피부를 통해 흡수되지 못하는 것이 주된 원인으로 알려져 있기 때문에, 상기 유효성분의 흡수를 촉진시키는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 매우 우수한 IL-10-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타낼 뿐, 다른 약물의 전달용 담체로서 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 이러한 단점은 피부투과성이 우수하는 특성만으로는 약물의 전달에 사용할 수 없다는 것을 암시하는 것으로 분석되었으므로, 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부 잔류성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질의 개발이 요구되었으나, 아직까지는 별다른 연구결과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부잔류성이 우수한 두 가지 특성을 포함하는 새로운 물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도 피부에 오래 잔류할 수 있는 피부투과 촉진용 펩타이드를 개발하였으며, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드에 IGF-1를 융합시킨 융합 단백질이 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부잔류성을 향상시키는 특성을 모두 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)에 결합된 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)에 결합된 융합 단백질을 제공한다.

본 발명에서 사용된 상기 서열 번호 1의 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.

피부투과 촉진용 펩타이드: NGSLNTHLAPIL (서열번호 1)

구체적으로, Asparagine(아스파라긴) Asn N- Glycine(글리신) Gly G- Serine(세린) Ser S- Leucine(류신) Leu L- Asparagine(아스파라긴) Asn N- Threonine(트레오닌) Thr T- Histidine(히스티딘) His H- Leucine(류신) Leu L- Alanine(알라닌) Ala A- Proline(프롤린) Pro P- Isoleucine(이소루신) Ile I- Leucine(류신) Leu L으로 나타낼 수 있다.

상기 펩타이드와 결합된 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)는 피부 투과성이며, 피부 잔류성을 가지는 것으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, "피부투과 촉진용 펩타이드"란, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있으며, 피부 투과성 및 피부 잔류성이 우수한 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 있어서, "피부 투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 피부투과 촉진용 펩타이드는 다른 펩타이드에 비하여 현저히 우수한 피부투과성을 나타낸다.

본 발명에 있어서, "피부 잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부 내의 조직에 결합되어 피부 내에서 잔류하는 능력을 의미한다. 피부조직을 표적조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 경우에는, 상기 펩타이드와 결합된 성분이 피부조직 또는 피부세포에 장기간 작용할 수 있도록 피부조직에 잔류하는 특성이 우수한 담체를 사용함이 바람직하다. 본 발명의 피부투과 촉진용 펩타이드는 피부투과성뿐만 아니라 피부잔류성이 현저히 우수하므로, 약학적 제제 또는 화장료의 담체로서 사용될 수 있다.

본 발명의 피부투과 촉진용 펩타이드는 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한 파지 디스플레이 방법을 수행하여 발굴된, 피부 투과성과 피부 잔류성이 우수한 펩타이드를 포함할 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 파지 디스플레이 방법을 통해 피부투과 촉진용 펩타이드로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제조하였다(실시예 1).

본 발명에 있어서, “인슐린유사 성장인자(Insulin-like growth factor; IGF)”는 신호전달단백질의 일종으로, 인슐린과 구조가 비슷한 분자량 7,500의 폴리펩타이드로 이루어진 성장인자를 의미한다. 인슐린유사 성장인자는 혈청 내에서 인슐린과 유사한 작용을 하지만, 인슐린 항체에 의해 억제되지 않는 물질로서, IGF-1, IGF-2구조가 알려져 있다. IGF-1과 IGF-2 모두 A~D 4종류의 폴리펩타이드사슬로 구성되어 있으며, 연골세포의 증식이나 단백질생합성에서 생장호르몬의 작용을 매개하는 것 외에 인슐린과 유사한 생리작용을 한다.

또한, IGF-1은 크기가 약 7.6kDa이며, 단량체로 인슐린유사성장인자수용체에 결합하여 세포내의 기작을 조작할 수 있다.

본 발명에 있어서, IGF-1는 각질세포 성장 촉진을 통해 손상된 피부의 재생, 모발의 재생 및 성장을 촉진하는 효과를 나타내는 한, 그의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는데, 상기 IGF-1의 전체 아미노산 서열을 사용할 수도 있고, 이의 변이된 아미노산 서열을 사용할 수도 있으며, 이의 일부 단편을 사용할 수도 있다. 상기 IGF-1의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 IGF-1는 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드가 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, "융합 단백질" 이란 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 펩타이드로서, 구체적으로 상기 피부투과 촉진용 펩타이드 및 상기 IGF-1를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 상기 IGF-1는 서열번호 2로 이루어진 펩타이드 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 융합 단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질은 당해 분야에 공지된 화학적 단백질 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 상기 피부투과 촉진용 펩타이드 및 상기 IGF-1 사이에 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 융합 단백질은 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 상기 IGF-1의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커(Linker)를 통해 융합 연결될 수도 있다.

상기 링커는 구체적으로 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 구체적으로 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등의 아미노산을 여러 개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 보다 더 구체적으로 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 IGF-1의 N-말단을 2개의 펩타이드(GG)로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합 단백질을 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 융합 단밸질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합단백질과 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호 3로 기재되는 염기 서열, 또는 상기 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 더욱 구체적으로는 90 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열로 이루어 질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pPIC, pGAP 벡터 등을 사용할 수 있으며, 대장균, 유산균, 바실러스균 등의 박테리아 및 효모에서 발현되는 벡터 등을 모두 포함할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩타이드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서의 “피부 탄력 증진” 또는 “피부 주름 개선”이란 피부가 쳐지거나 늘어지는 정도를 완화시켜주는 것, 또는 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것으로, 피부 표피의 각질 세포 성장을 촉진하여 피부를 회복시킴에 따라 피부 탄력이 유지되고 그에 따라 주름 생성이 완화되는 것을 말한다.

상기 용어 “각질세포(keratinocyte)”는 표피세포 중 각질화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 각질 세포는 표피의 기저층(배아층)에서 유사분열을 통해 형성되며, 이후 표층으로 이동하며 분화하여 끊임없이 표면에서 탈락해 간다. 이 과정에서 핵이 있는 분열된 세포에서 일반적인 피부표면으로부터 떨어진 핵이 없는 죽은 세포인 각질세포로 변하게 된다. 각질세포는 표피세포의 약 80 내지 90 %를 차지하며, 표피의 각질층 뿐 아니라 모발과 손발톱의 구조 단백질을 형성하는 각질을 생산하는 특수한 기능을 가진다. 각질세포는 각질층을 구성하여 피부의 최외곽에서 수분증발을 억제하는 역할을 통하여 피부탄력 유지 및 피부주름 생성 완화에 영향을 미친다.

구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 피부탄력 및 피부 주름 개선 등의 효과를 확인하기 위하여 융합 단백질이 각질 세포 성장에 미치는 효과를 확인하였다. 피부각질세포에 IGF-1 및 융합 단백질(T- IGF-1)을 첨가하여 배양한 결과, 대조군에 비하여 T- IGF-1도 IGF-1와 동등한 수준의 각질세포 성장 기능을 가지고 있음을 확인하였다(표 1).

이를 통해, IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 IGF-1의 피부주름 및 탄력 개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에서는 상기 IGF-1에 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 피부투과 촉진용 펩타이드를 결합하여 융합 단백질을 제조(서열번호 3)하였으며, 상기 제조된 융합 단백질의 효과를 종래의 IGF-1와 비교한 결과, 피부투과도 및 피부 잔류성이 현저히 향상되고 주름 개선 효과 또한 우수함을 확인하였다(표 3 및 4).

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 손상된 피부 및 모발의 재생을 증가시키는 IGF-1 자체의 효능을 유지하면서도, 피부 투과성과 피부 잔류성을 현저하게 향상시킬 수 있으므로, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 융합 단백질의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50 중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "탈모개선”은, 유전적인 원인, 호르몬 불균형, 사회생활의 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취 등의 다양한 습관과 환경적 영향으로 인하여 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 개선하고, 탈모가 진행되는 것을 방지하고 털이 나는 것을 의미한다.

구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 융합 단백질을 처리한 피부 모유두 세포(dermal papilla cell)를 배양하여 Cell Counter Kit-8 (Dojindo社)를 이용하여 세포증식 양의 차이를 정량 분석한 결과, 대조군에 비하여 T-IGF-1도 IGF-1와 동등한 수준의 세포증식효능을 가지고 있음을 확인하였다(표 2).

이를 통해, IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 IGF-1의 탈모개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.

상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형으로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용되는 모발이란, 머리의 모근 및 모낭, 머리카락 및 속눈썹과 겉눈썹, 수염, 겨드랑이, 음모, 신체 전반에 모근 및 모낭이 있는 모든 부위를 포함한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 의약외품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 용어 융합 단백질, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 탈모개선은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 의약외품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 피부 손상 방어, 탄력 증진, 주름 개선 및 보습 성분을 포함할 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 당업계에 공지된 미백 성분으로서, 코직산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid); 당업계에 공지된 피부 탄력, 주름 개선 또는 보습 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물; 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 5 중량%로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.

본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물은 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 탄력 증진, 피부 주름 개선용, 또는 탈모개선에 사용될 수 있다. 상기 개체는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 융합 단백질은 IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 펩타이드의 능력이 유지 또는 향상되면서도, 동시에 피부투과성과 피부 잔류성을 현저하게 향상시키므로, 피부개선용 화장료 조성물, 탈모개선용 화장료 조성물, 피부개선용 의약외품 조성물 또는 탈모개선용 의약외품 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 피부투과 촉진용 펩타이드의 선별

피부투과 촉진용 펩타이드를 선별하기 위해서 파지 라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하였다.

먼저, 1% BSA를 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) 용액 500μL Ph.D-12 파지 라이브러리 키트 (New England Biolab)로부터 유래된 109개의 파지를 가하여 파지용액을 수득하였다.

다음으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5mL, Permgear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착한 뒤 상단에 상기 파지 용액을 가하고, 16시간 동안 반응시킨 다음, 상기 돼지 피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 도달된 파지를 수득하고, 이를 증폭시켰다.

상기 증폭은 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)을 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 25mL의 LB 배지에 진탕 배양된 대장균 ER2738 균주에 상기 파지용액 5mL를 가하고 4시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 8,000G로 원심 분리하여 파지분획이 포함된 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 6mL의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 반응시켜서 파지를 침전시키고, 상기 반응액을 8,000G로 원심 분리하여 파지를 침전시켰으며, 상기 침전물을 TBS 용액에 현탁시켜서 증폭된 파지용액을 수득하였다.

이처럼, 돼지 피부에 파지를 가하여 피부를 투과시킨 파지를 수득하고, 이를 증폭시키는 과정을 1회 진행하는 것을 1 Round라고 정의하였으며, 1 Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2 Round를 진행하여 피부 투과력을 경쟁하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 선별하였고, 총 3 Round를 수행하였다.

상기 3 Round 수행 결과 최종적으로 얻어진 파지에 포함된 펩타이드의 서열을 확인하기 위하여, 상기 파지를 포함하는 TBS 용액을 대장균 ER2738 균주에 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액에 TOP agar를 가하여 혼합한 다음, 상기 혼합물을 LB/X-gal/IPTG 평판배지의 상단에 가하여 고형화시켰다. 그런 다음, 고형화된 배지를 16시간 동안 배양한 후, 청색의 콜로니(colony)를 선별하였다. 상기 선별된 콜로니로부터 유래된 균주를 6시간 동안 배양하고, 이로부터 DNA를 수득하여 파지로부터 유래된 염기서열을 분석함으로써, 돼지 피부를 투과하는 특성을 나타내는 피부투과 촉진용 펩타이드(서열번호 1)를 선별하였다.

실시예 2: 인슐린유사 성장인자-1( IGF1 )에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합 된 융합 단백질의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)의 N-말단이 두 개의 아미노산(GG)으로 구성된 링커를 매개로 연결된 형태의 융합 단백질인 T-IGF-1(서열번호 3)를 생산하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 합성하고, 두 개의 아미노산(GG)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 중심으로 연결시켜서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 pPIC 발현 벡터에 도입하여 발현벡터를 제작하였다.

상기 제작된 발현벡터를 Pichia pastoris에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 수득한 형질전환체를 배양한 다음, 배양액을 여과하여 피부투과 촉진용 펩타이드-VEGF로 구성된 융합 단백질을 회수 하였다. GPC 컬럼 크로마토그래피에 적용함으로써, 최종적으로 피부투과 촉진용 펩타이드-IGF-1로 구성된 융합 단백질인 T-IGF-1(서열번호 3)를 생산하였다.

실시예 3: 융합 단백질의 효과검증

상기 실시예 2에서 제조한 T-IGF-1의 피부 개선 용도를 확인하기 위하여 하기와 같이 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 탈모 개선, 피부 투과성 및 피부 잔류성 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.

실시예 3-1: 피부장벽 강화 효능 검정

상기 실시예 2에서 합성된 T-IGF-1를 IGF-1와 비교하여 각질세포(Keratinocyte) 성장에 미치는 효과를 검증하고자 하였다.

구체적으로 피부 각질세포를 96well 플레이트에서 하루 동안 배양하여 well당 6,000개의 세포수를 나타내는 배양물을 수득하였다. 상기 배양물을 PBS로 세척 후에 무혈청 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 다시 PBS로 세척을 한 후, 100ng/ml의 T-IGF-1 또는 IGF-1가 포함되어 있는 무혈청 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 배양물을 수득하고 Cell Counter Kit-8 (Dojindo社)를 이용하여 세포증식량의 차이를 정량 분석하였다. 이때 대조군으로는 T-IGF-1 또는 IGF-1가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 배양한 결과물을 사용하였다. (표 1)

각질 세포 성장에 미치는 융합 단백질의 효과

처리단백질	생성 수준 (%)
대조군	100 ± 12
IGF-1	250 ± 20
T-IGF-1	235 ± 15

상기 표 1에서 나타난 바와 같이, IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합된 T-IGF-1도 IGF-1와 동등한 수준의 피부주름 탄력 개선 효능을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 3-2: 모낭줄기세포증식 효능 검증

상기 실시예 2에서 합성된 T-IGF-1를 IGF-1와 비교하여 피부세포 증식에 미치는 효과를 검증하였다.

구체적으로, 피부 모유두 세포 (dermal papilla cell)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양하여 웰(well)당 6,000개의 세포수를 나타내는 배양물을 수득하였다. 상기 배양물을 PBS로 세척 후에 무혈청 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 다시 PBS로 세척을 한 후, 1ng/ml의 T-IGF-1 또는 IGF-1가 포함되어 있는 무혈청 DMEM 배지에서 1일간 배양하였다. 배양물을 수득하고 Cell Counter Kit-8 (Dojindo社)를 이용하여 세포증식 양의 차이를 정량 분석하였다. 이때 대조군으로는 T-IGF-1 또는 IGF-1가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 배양한 결과물을 사용하였다(표 2).

모낭줄기세포증식에 미치는 융합 단백질의 효과

처리단백질	증식 수준 (%)
대조군	100 ± 15
IGF-1	440 ± 45
T-IGF-1	320 ± 40

상기 표 3에 나타난 바와 같이, IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합된 T-IGF-1도 IGF-1와 동등한 수준의 세포증식효능을 가지고 있음을 확인하였다.

이를 통해, IGF-1에 피부투과 촉진용 펩타이드가 융합되어도 IGF-1의 탈모개선 효능을 그대로 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 3-3: 피부투과성 검증

상기 실시예 2에서 합성된 융합 단백질 T-IGF-1를 IGF-1와 비교하여 피부투과성을 검증하였다.

구체적으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% 트윈 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 IGF-1 또는 T-IGF-1를 상단에 가하고, 16시간 동안 반응시킨 후, 하단에 존재하는 IGF-1 또는 T-IGF-1의 농도를 ELISA kit (R&D Systems社)를 이용하여 정량분석하고, IGF-1의 함량에 대한 T-IGF-1의 양의 상대적인 함량을 투과량으로 산출하였다(표 3).

융합 단백질의 피부투과성

처리단백질	투과량 (%)
IGF-1	100 ± 14
T-IGF-1	280 ± 18

상기 표 3에 나타나 바와 같이, T-IGF-1의 경우 IGF-1보다 피부투과성이 약 3배 증가함을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 융합 단백질을 사용하면 피부투과성이 현저하게 증가함을 알 수 있다.

실시예 3-4: 피부잔류성 검증

상기 실시예 2에서 합성된 융합 단백질 T-IGF-1를 IGF-1와 비교하여 피부잔류성을 검증하였다.

구체적으로, 실시예 3-4에서 실험 후 남은 돼지피부를 회수한 다음, 액체질소 냉동 후 분쇄하였으며, 이에 포함된 IGF-1 또는 T-IGF-1의 함량을 ELISA kit (R&D Systems社)를 이용하여 정량분석하였다. 또한, IGF-1의 함량에 대한 T-IGF-1의 양의 상대적인 함량을 잔류량으로 산출하였다(표 4).

융합 단백질의 피부잔류성

처리단백질	잔류량 (%)
IGF-1	100 ± 28
T-IGF-1	9,100 ± 650

상기 표 4에 나타나 바와 같이, T-IGF-1의 경우 IGF-1보다 피부잔류성이 약 100배 증가함을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 융합 단백질을 사용하면 피부잔류성이 현저하게 증가함을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with IGF-1 <130> KPA170151-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for skin permeation promotion <400> 1 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Human IGF1 <400> 2 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <210> 3 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein of T-IGF1 <400> 3 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys 20 25 30 Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser 35 40 45 Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg 50 55 60 Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro 65 70 75 80 Ala Lys Ser Ala <210> 4 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-IGF1 <400> 4 aacggttctt taaatacaca tttggctcca attcttggcg gaggtcctga gactctgtgt 60 ggagctgaac tagttgatgc cttacaattc gtttgtggtg atagaggatt ctattttaat 120 aaaccaaccg ggtatggtag ttcttctagg agagcacccc agactggtat cgttgatgaa 180 tgctgttttc gttcctgtga cttaagaaga ttggaaatgt actgtgcacc attgaagcct 240 gctaaatcag ct 252

Claims (11)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 인슐린유사 성장인자-1(IGF-1)에 결합된 융합 단백질로서,
   상기 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되며, IGF-1의 피부 투과성 및 피부 잔류성이 증대된 것인, 융합 단백질.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 IGF-1의 N-말단에 결합된 것인, 융합 단백질.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 IGF-1는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 융합 단백질.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진용 의약외품 조성물.
11. 삭제