KR102252305B1

KR102252305B1 - 경피 투과 촉진 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질

Info

Publication number: KR102252305B1
Application number: KR1020140099900A
Authority: KR
Inventors: 허유진; 이설훈; 강내규
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2014-08-04
Filing date: 2014-08-04
Publication date: 2021-05-17
Also published as: KR20160017312A

Abstract

본 발명은 피부투과성 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 피부를 투과하여 약물을 전달할 수 있는 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 비롯하여, 상기 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

경피 투과 촉진 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질{Peptide promoting skin permeation and fusion protein comprising the same}

피부를 통과하는 약물은 편리한 사용에 근거하여 진통패치, 금연패치, 임신 조절제 등에서 사용되고 있고, 피부를 통하여 대순환계(systemic circulation)에 전달하고자 하는 목적을 가진다. 뿐만 아니라, 아토피 치료제, 미백, 주름 개선용 화장품 등 피부자체에 전달하려는 목적을 가지는 경우도 있다. 이러한 편리성과 기능성에도 불구하고, 피부의 구조상 약물의 전달의 어려움을 갖는다. 피부의 외부에는 약 10 내지 15층의 사세포(corneocyte)가 존재하고, 이는 약 10 ㎛ 내지 45 ㎛ 정도의 두께를 이루고 있다. 이는 모르타르(mortar)와 브릭(brick) 구조라 불리는 형태로 이루어져 있다. 브릭(brick)의 구조는 케라틴이 풍부한 사세포로 이루어져 있고, 그 사이를 세라미드(ceramide), 지방산, 왁스 등의 구조가 모르타르(mortar)를 이루고 있다. 이를 통해서 내부의 수분의 손실을 막고 외부로부터의 침입을 막을 수 있는 구조를 가진다. 따라서 피부투과성이 낮고, 500Da 이하의 저분자 구조 성분들만이 확산(Diffusion) 방식에 의해서 피부 내로 전달된다(Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9.). 이는 모르타르(mortar) 구조의 세포내 구조의 지질층이나, 지질층 사이의 수용성 구조를 통해서 이루어지고, 약물의 성질에 따라서도 크게 좌우된다(Current Drug Delivery, 2005, 2, 23-3). 또한 피부표면을 직접 통과하는 방식 이외에 피부의 땀샘, 모공, 피지선 등을 통하여 전달되기도 한다.

이러한 이유로, 약물 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.

예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 매우 우수한 IL-10-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타낼 뿐, 다른 약물의 전달용 담체로서 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 또한, 이러한 단점을 극복하기 위하여 펩타이드로서 미국등록특허 제7,659,252호에는 피부질환의 치료 및 약학적 활성제제의 피부투과 촉진에 사용될 수 있는 피부투과성 펩타이드가 개시되어 있다. 상기 펩타이드는 우수한 피부투과도를 나타낼 뿐만 아니라 다른 약물의 경피전달용 담체로서도 사용될 수 있다는 장점이 있으나, 피부를 투과한 다음에는 체내의 순환시스템을 통해 소모되기 때문에, 피부를 표적으로 하는 약물의 경우에는 별다른 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도 피부에 잔류할 수 있는 특성을 가지는 피부투과성 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 대한민국 등록특허 제10-1329411호를 통하여 피부투과도가 우수한 펩타이드를 등록받은 바 있으며, 추가적으로 연구를 계속한 끝에 본 발명의 신규한 서열의 피부투과성 펩타이드 역시 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도, 생리활성 단백질을 결합하여 제조한 융합단백질 또한 피부투과성이 높고, 피부에 오랫동안 잔류할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 피부투과성 펩타이드 또는 이의 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 이의 유도체를 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드, 이의 유도체 또는 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 이의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드, 이의 유도체 또는 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드, 이의 유도체 또는 상기 융합단백질을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과성 펩타이드 또는 이의 유도체를 제공한다.

피부투과성 펩타이드: QIGTPTHTASSF (서열번호 1)

본 발명에서 "피부투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 펩타이드는 다른 펩타이드에 비하여 현저히 우수한 피부투과성을 나타낸다.

상기 피부투과성 펩타이드 또는 이의 유도체는 우수한 피부투과성뿐만 아니라, 우수한 피부잔류성을 나타낼 수 있다.

본 발명에서 "피부잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부 내의 조직에 결합되어 피부 내에서 잔류하는 능력을 의미한다. 피부조직을 표적조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 경우에는, 상기 펩타이드와 결합된 성분이 피부조직 또는 피부세포에 장기간 작용할 수 있도록 피부조직에 잔류하는 특성이 우수한 담체를 사용함이 바람직하다. 본 발명의 펩타이드는 피부투과성뿐만 아니라 피부잔류성이 현저히 우수하므로, 약학적 제제 또는 화장료의 담체로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 "유도체"란, 상기 피부투과성 펩타이드의 N-말단, C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 또는 아미노산이 추가/치환/결실되어 변형된 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 유도체는 우수한 피부투과성 및/또는 피부잔류성을 나타내는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 피부투과성 펩타이드 유도체는 단실(dansyl)기가 결합된 유도체가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 파지 디스플레이 방법을 이용하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 피부투과성 펩타이드를 선발하였고, 선발된 피부투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 우수한 피부투과성을 확인하였다(실시예 2, 표 1). 또한, 상기 펩타이드의 C-말단에 단실(dansyl)기가 결합된 형태의 유도체를 각각 합성하였고, 상기 유도체 역시 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였다(실시예 3, 표 2). 아울러, 상기 피부투과성 펩타이드 또는 이의 C-말단에 단실기가 결합된 유도체를 포함하는 파지의 우수한 피부잔류성을 확인하였다(실시예 4 및 5, 표 3 및 4).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 피부투과성 펩타이드 또는 이의 유도체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명에서 "융합단백질"이란, 상기 피부투과성 펩타이드가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질로서, 바람직하게는 상기 피부투과성 펩타이드 및 생리활성 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "생리활성 단백질"은 치료학적 효과를 위해 사용되는 모든 단백질을 포함한다. 본 발명에서 생리활성 단백질은, 생체의 기능(생리)을 조절하는 단백질을 총칭하며, 생리활성 폴리펩타이드라고도 한다. 본 발명의 생리활성 단백질은 피부에 처리할 수 있는 단백질이면 제한됨이 없고, 상기 생리활성 단백질의 천연형과 실질적으로 동등하거나 증가된 기능, 구조, 활성 또는 안정성을 갖는 한, 임의의 유도체도 본 발명의 생리활성 단백질의 범위에 포함된다. 상기 생리활성 단백질은 호르몬, 사이토카인, 경단백질, 효소, 항체, 성장인자 등을 모두 포괄하는 개념이며, 구체적인 예로서, 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘-유사 펩타이드류, 엑센딘-4 펩타이드류, ANP, BNP, CNP, DNP, 지프로테인 관련 수용체 (Gprotein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 소마토스타틴, 옥트레오타이드(소마토스타틴 아고니스트), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 융합단백질은 이에 포함된 상기 피부투과성 펩타이드에 의하여 피부투과성 및 피부잔류성이 높아 피부에 사용될 수 있는 의약품 또는 화장품에 효율적으로 적용될 수 있으며, 그에 따라 생리활성 단백질에 특별한 부작용이 없는 한 알려진 모든 생리활성 단백질을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 생리활성 단백질로서, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)와 상기 피부투과성 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제조하였으며(실시예 6), 상기 융합단백질의 피부투과성 및 피부잔류성이 우수함을 확인함으로써(표 5, 표 6), 상기 피부투과성 펩타이드에 생리활성 단백질이 융합되더라도 동일한 활성을 유지할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 피부투과성 펩타이드가 상기 생리활성 단백질의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 융합단백질의 활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 피부투과성 펩타이드의 C-말단과 생리활성 단백질의 N-말단을 2개의 글라이신(GG)으로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합단백질을 제조하였다.

상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과성 펩타이드가, 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단에 결합되어, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 피부투과성 펩타이드를 발굴하였다. 상기 발굴된 피부투과성 펩타이드에 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 생리활성 단백질(EGF)을 결합하여, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질(T3-EGF)을 제조하였다. 상기 제조된 융합단백질의 활성을 피부투과성 펩타이드와 결합하지 아니한 생리활성 단백질의 활성과 비교한 결과, 피부투과성 및 피부잔류성이 현저히 향상되었음을 확인하였다(표 5 및 표 6).

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 생리활성 단백질에 피부투과성 펩타이드가 결합되어, 생리활성 단백질 자체의 효능을 유지하면서도, 피부투과성과 피부잔류성을 현저하게 향상시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드, 이의 유도체 또는 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 피부투과성 펩타이드 또는 이의 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

피부투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드:

CAG ATT GGG ACT CCT ACG CAT ACT GCG TCG AGT TTT (서열번호 2)

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

상기 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

상기 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂침전법, CaCl₂침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

상기 형질전환체는 또한 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 융합단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 융합단백질을 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 이의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체 또는 피부외용제용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "피부외용제"란, 유지류, 바셀린, 라놀린, 글리세롤 등의 다양한 기제에 약품을 혼합하여 쉽게 피부에 바를 수 있도록 한 고형, 반고형 또는 액상의 외용약을 의미한다. 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.

본 발명의 목적상 상기 피부외용제는 본 발명의 펩타이드 또는 이의 유도체를 포함하고, 적절한 피부외용제용 담체인 기제를 포함하는 제제로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

한편, 본 발명의 피부외용제용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질을 포함하고 추가적으로 피부를 통과하여 체내에 도달하려는 약물 또는 피부 자체의 기관에 전달하려는 약물이 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 50.0 중량%로, 바람직하게는 5 중량% 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여 대상개체는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 및 인간 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들어, 국소도포 등을 통한 경피투여 방식을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 상기 융합단백질을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조성물을 경피투여하는 단계를 포함하는, 피부 상태의 개선 방법을 제공한다.

본 발명의 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 융합단백질은 피부투과성 및 피부잔류성이 현저히 우수하므로, 피부를 개선시킬 수 있는 화장료 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명에서 "피부개선"이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미한다. 구체적인 예로는 주름개선, 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 유지 및/또는 증진, 상처회복, 노화 억제, 피부염 완화 또는 개선 등의 효과를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

상기 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질은 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적인 보조제 예를 들어, 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 뿐만 아니라 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제와 함께 일반 화장품 또는 기능성 화장품의 구성요소로서 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 기능성 화장품을 제공한다.

상기 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 화장품 등을 포함한다.

본 발명의 기능성 화장품은 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, HAS2 등의 기능성 물질의 합성 촉진효과 등을 통하여 피부개선 효과를 나타낼 수 있다. 그의 제형은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림, 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있고, 바람직하게는 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼 또는 오일젤의 제형으로 제조될 수 있는데, 이때, 사용되는 담체는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 이의 유도체를 이용하여 약물의 피부투과를 촉진시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 약물의 피부투과를 촉진시키는 방법은 (ⅰ) 목적하는 약물 또는 물질을 상기 펩타이드 또는 이의 유도체에 결합시켜 결합체를 형성하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함할 수 있다.

이때, 상기 약물은 상기 펩타이드 또는 이의 유도체와 직접적으로 또는 링커 등을 이용하여 간접적으로 결합할 수 있으면서도, 그의 원천적인 활성이 저하되지 않는 모든 약물을 사용할 수 있고, 상기 물질은 생리활성 단백질과 같은 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 결합체는 상기에서 설명한 융합단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 피부투과성 펩타이드 또는 이의 유도체는 우수한 피부 침투활성뿐만 아니라 우수한 피부 잔류 효과를 나타내고, 여기에 생리활성 단백질을 결합하여 제조한 융합단백질 또한 생리활성 효과를 나타내는 물질의 합성능이 유지 또는 향상되면서도, 피부투과성과 피부잔류성을 현저하게 향상시키므로, 상기 피부투과성 펩타이드, 이의 유도체 또는 이를 포함하는 융합단백질은 피부조직을 표적조직으로 하는 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학적 조성물의 유효성분으로 널리 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 피부투과성 펩타이드의 선발

피부투과성 펩타이드를 선별하기 위해서 경피제제의 용출 실험 방법을 응용하였다. 이를 위해 Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5㎖, Permgear)을 이용하였다. Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고 상단에 파지를 처리한 뒤, 돼지피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 잔류하는 파지를 증폭하였다. 이 과정을 1회 진행하는 것을 1 라운드로 선별한 것으로 정의하였다. 1 라운드에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2 라운드를 진행하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 경쟁하는 방식으로 선별하였고 총 3 라운드를 수행하였다.

피부와 파지의 코팅(coating) 단백질 사이에 생길 수 있는 비특이적인 결합을 줄이기 위하여, 상단과 하단에는 각각 500㎕와 5㎖의 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)용액에 1% BSA(Sigma)를 용해시켜서 사용하였다.

무작위적인 펩타이드 서열을 가지는 파지를 가지고 시작하기 위해서, Ph.D-12 phage library kit(New England Biolab)를 사용하였다. 500㎕의 TBS(1% BSA)에 10⁹개의 파지를 처리하였다. 이후 16시간동안 배양하였고, 상기 수용부의 TBS 5㎖를 모두 사용하여 파지를 증폭하였다.

파지를 증폭하기 위한 숙주세포로서 E. coli ER2738(New England Biolab)를 이용하였다. 25㎖의 LB배지에 진탕 배양된 ER2738를 접종하고 O.D.(550nm) 0.5에서 투과한 파지가 있는 TBS 5㎖를 모두 처리하고 4시간 배양하였다. 이후 8000G로 원심 분리하여 E.coli와 파지를 분리하였다. 파지가 있는 상층액에 6㎖의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 파지를 침전시켰다. 8000G로 원심 분리후 침전된 파지에 TBS용액을 처리하여 파지를 분리하여 보관하였다.

최종적으로, 피부투과성 파지가 가지는 펩타이드를 확인하기 위해서 파지를 단일 콜로니에서 증폭시켰다. 파지를 가지는 ER2738 E. coli는 LB/X-gal/IPTG 플레이트에서 파란색을 띄는 성질을 이용하였다. ER2738 배양액에 300㎕에 파지를 TBS로 적정량 희석하고 2㎕를 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4㎖에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 청색의 콜로니를 선별하였다. 각각의 콜로니를 5㎖의 ER2738 배양액에 6시간동안 추가로 배양하고, Ph.D-13 phage spin kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리한 다음, 이들의 염기서열을 분석함으로써, 1종의 피부투과성 펩타이드(서열번호 1)를 선별하였다.

실시예 2: 피부투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 피부투과성 확인

상기 실시예 1에서 선발된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 각각의 펩타이드를 발현시킬 수 있는 파지들의 피부투과성을 확인하였다.

구체적으로, Franz glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부를 장착하고, 피부와 파지의 코팅(coating) 단백질 사이에 생길 수 있는 비특이적인 결합을 줄이기 위하여, 상단과 하단에는 각각 500㎕와 5㎖의 TBS용액에 1% BSA를 용해시켜서 사용하였다. 처리하는 파지의 수를 10¹⁰ 개로 일정하게 맞추어서 상기 Franz glass cell의 상단에 처리하였다. 이때, 피부를 투과하지 않고 Franz cell 상단에 잔류하는 phage를 무작위 추출하여 그 펩타이스 서열을 대조군으로 사용하였는데, 본 발명에서의 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR" (서열번호 3) 펩타이드 서열을 발현시킬 수 있는 파지를 이용하였다. 6시간동안 반응시킨 후에 투과하여 수용부에 있는 파지의 수를 측정하였다. 이를 위해 ER2738 배양액 300㎕ 및 파지를 포함하는 수용부의 TBS 10㎕를 혼합하고, 이를 TOP agar 4㎖에 섞은 후, LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고, 16시간 동안 추가로 배양한 다음, 청색 콜로니의 수를 계수하였다(표 1).

돼지피부를 투과한 Phage의 수

Phage의 종류	투과한 Phage의 수
대조군파지 서열번호 1 발현가능한 파지	11 20700

상기 표 1에서 보듯이, 상기 선발된 1종의 펩타이드는 모두 대조군보다도 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 피부투과성 펩타이드 유도체의 피부투과성 확인

상기 실시예 1에서 선발된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 각각의 펩타이드의 C 말단에 단실(Dansyl)기가 결합된 형태의 유도체를 각각 합성하고, 이들 유도체의 피부투과성을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 각각의 펩타이드들을 화학적으로 합성하고, C-말단에 Dansyl기를 추가한 유도체를 각각 합성하였으며, 대조군으로는 C-말단에 Dansyl기를 추가한 "TDMNKTEIRFVR(서열번호 3)"의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 사용하였다. 각각 펩타이드의 합성은 펩트론에 의뢰하여 제작하였다. 1회 실험에 약 40㎍의 펩타이드를 사용하였는데 대조군과 실험군 펩타이드의 형광세기를 측정하여 동일한 형광세기를 나타내는 펩타이드를 처리하였다.

그런 다음, Franz glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부를 장착하고, 상기 cell의 상단과 하단에 각각 500㎕와 5㎖의 TBS용액을 가한 다음, 상단에 각각의 유도체를 동일한 농도로 가하면서, 16시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 하단의 수용부에 존재하는 각 유도체의 양을 victor fluorescence meter(340/520)로 측정하여 투과정도를 비교하였다(표 2).

돼지피부를 투과한 펩타이드 유도체의 양

유도체의 종류	형광 세기(340/520)
대조군 파지 서열번호 1 유도체 발현가능한 파지	1280 34000

상기 표 2에서 보듯이, 상기 합성된 펩타이드 유도체는 대조군보다 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 피부투과성 펩타이드를 포함하는 파지의 피부잔류성 확인

약물 등이 피부를 투과하게 되는 주요 메커니즘은 피부의 성분에 용해되어서, 최상층에서 하층으로 확산되는 방식으로 진행되는 것이다. 이를 통하여 피부 전체에 유효물질이 효과적으로 전달될 수 있다. 피부의 표면은 각질과 각질간극 물질 등으로 이루어져 있고, 선별된 펩타이드가 피부를 잘 투과하기 위하여서는 피부 표면을 이루는 성분에 대한 용해성이 좋아야 한다. 피부성분에 대한 용해성은, 짧은 시간(10분) 피부와 반응 후 결합된 양을 측정하여 분석할 수 있다. 또한 wash-off 제품에 사용될 경우 피부와의 결합력이 좋아야 한다. 이 경우, 먼저 피부와의 결합 후 내부로 확산되게 된다. 따라서 선별된 파지의 피부 결합성을 측정하여 펩타이드의 우수성을 확인하고자 하였다.

이를 위해, 먼저 돼지 피부를 10mm × 10mm 크기로 절단하고, 상기 실시예 1에서 선별한 각각의 펩타이드를 발현시킬 수 있는 파지를 가한 다음, 상기 돼지 피부에 대한 결합정도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR(서열번호 3)" 서열을 발현시키는 파지를 이용하였다.

상기 돼지 피부에 결합한 파지의 양을 측정하기 위하여, anti-M13 antibody HRP conjugate를 이용하였다. Antibody 자체와 피부와의 결합에 의한 시그널을 제거하기 위해서 파지가 없는 대조군을 음성대조군으로 설정하였다. 절단한 돼지 피부를 1.5㎖ 튜브에 넣고 500㎕의 TBS(1% BSA)를 가한 다음, 상기 음성대조군의 경우 파지를 넣지 않고, 대조군과 측정하고자 하는 파지의 경우, 10¹⁰개의 파지를 가하여 10분간 배양하였다. 그런 다음, 1% BSA를 포함하는 TBS용액을 이용하여 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척하였다. 이어, anti-M13 antibody HRP(Horseradish peroxidase) conjugate가 포함된 1% BSA를 포함하는 TBS용액 500㎕를 가하고, 5분간 추가로 배양하였다. 상기 배양물에 1% BSA를 포함하는 TBS용액을 가하고, 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척한 다음, 잔류하는 완충액을 모두 제거하였으며, TMB(Tetramethylbenzidine) solution(Amersham)을 추가로 가하였다. 이때, 상기 TMB는 항체에 결합된 HRP에 의해서 분해되어 파란색을 발색시킨다. 최종적으로, 0.2N 의 황산을 처리하여 반응을 정지시키고, 파란색을 노란색으로 변화시킨 다음, 흡광도(450nm)를 측정하여 파지-피부간 결합정도를 측정하였다. 각각의 흡광도에서 음성 대조군의 흡광도를 삭제하여 산출한 각각의 활성을 상호 비교하였다(표 3).

음성 대조군, 대조군 및 서열번호 1의 펩타이드를 발현시키는 파지가 각각 돼지 피부에 결합하는 양

Phage의 종류	흡광도(450nM)
음성 대조군 파지 대조군 파지 서열번호 1 발현가능한 파지	0.01 0.06 0.72

상기 표 3에서 보듯이, 피부에 잔류하는 각 펩타이드의 수준은 모든 펩타이드가 대조군보다도 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 피부투과성 펩타이드 유도체의 피부잔류성 확인

상기 실시예 3에서 합성된 각 유도체들의 피부 결합성을 확인하기 위해서, 돼지 피부와 상기 유도체를 반응시키고, 표면에 용해된 펩타이드의 양을 측정하였다. 구체적으로, 잘라낸 돼지 피부를 1.5㎖ 튜브에 넣고 500㎕의 TBS(1% BSA)를 넣었다. 여기에 대조군과 측정하고자 하는 각 유도체를 추가하여 피부와 함께 10분간 배양하였다. 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR(서열번호 3)" 펩타이드를 이용하였다. 각각 펩타이드의 합성은 펩트론에 의뢰하여 제작하였다. 1회 실험에 약 40㎍의 펩타이드를 사용하였는데 대조군과 실험군 펩타이드의 형광세기를 측정하여 동일한 형광세기를 나타내는 펩타이드를 처리 하였다. 배양 이후 TBS(1% BSA)를 이용하여 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척하고, 상기 반응이 종료된 돼지 피부를 24웰 플레이트에 옮긴 다음, 표면에 잔류하는 펩타이드의 양을 victor fluorescence meter(340/520)로 측정하여 비교하였다(표 4).

돼지 피부에 잔류한 펩타이드 유도체의 양

유도체의 종류	형광 세기(340/520)
대조군 서열번호 1 유도체 발현가능한 파지	4000 363000

상기 표 4에서 보듯이, 피부에 잔류하는 각 펩타이드 유도체의 수준은 모든 펩타이드 유도체가 대조군보다도 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 피부투과 촉진 펩타이드가 상피세포 성장인자( EGF )에 결합된 융합단백질의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 상피세포 성장인자(EGF)의 N-말단이 두 개의 아미노산(GG)으로 구성된 링커를 매개로 연결된 형태의 융합단백질인 T3-EGF(서열번호 5)를 생산하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 합성하고, 두 개의 아미노산(GG)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 중심으로 연결시켜서, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 한편, N-말단의 정확한 가공을 위해서 엔테로키나제(Enterokinase)에 의해 절단될 수 있는 절단부위인 DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 이를 상기 제작된 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 연결하여, 엔테로키나제 절단부위-피부투과성 펩타이드-EGF로 구성된 융합단백질을 코딩하는 최종 폴리뉴클레오티드를 수득하였으며, 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 GST 발현 벡터에 도입하여 발현벡터를 제작하였다.

상기 제작된 발현벡터를 대장균에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 수득한 형질전환체를 배양한 다음, 배양물을 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하였으며, 상기 수득한 세포 파쇄물을 GST 친화성 컬럼에 적용하여, GST-엔테로키나제 절단부위-피부투과성 펩타이드-EGF로 구성된 융합단백질을 회수하였다. 상기 회수된 융합단백질에 엔테로키나제를 처리하여 GST 부분을 제거한 다음, 상기 반응물을 GPC 컬럼 크로마토그래피에 적용함으로써, 최종적으로 피부투과성 펩타이드-EGF로 구성된 융합단백질인 T3-EGF(서열번호 5)를 제조하였다.

실시예 7: 융합단백질의 피부투과성 검증

Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하여 융합단백질의 피부투과성을 검증하였다.

구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% Tween 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 상기 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 상기 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 EGF 또는 T3-EGF를 상단에 가하고, 16시간 동안 반응시킨 후, 하단에 존재하는 EGF 또는 T3-EGF의 농도를 정량분석하고, EGF의 함량에 대한 T-EGF의 양의 상대적인 함량을 투과량으로 산출하였다(표 5).

융합단백질의 피부투과성

처리단백질	투과량(%)
EGF T3-EGF	100±19 405±17

상기 표 5에서 보듯이, EGF 보다는 T3-EGF를 처리할 경우 피부투과성이 약 4배 이상 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, EGF의 피부투과율이 현저하게 증가함을 알 수 있다.

실시예 8: 융합 단백질의 피부잔류성 검증

Franz glass cell (Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하여 융합단백질의 피부잔류성을 검증하였다.

구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 상단과 하단에는 각각 500 ㎕와 5 ㎖의 TBS(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl)용액에 1% BSA(Sigma), 0.01% Tween 20을 녹여서 사용하였다. 기존의 EGF와 T3-EGF를 porcine skin을 이용한 Franz cell system의 Donor chamber에 처리하고 porcine skin 내에 존재하는 EGF의 양을 측정하기 위하여 porcine skin 조직을 파쇄 후 elisa kit를 이용하였다. (표 6).

융합단백질의 피부잔류성

처리단백질	잔류량(%)
EGF T3-EGF	100±22 14250±1380

상기 표 6에서 보듯이, EGF보다는 T3-EGF를 처리할 경우 피부투과성이 약 140배 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, EGF의 피부잔류율이 현저하게 증가함을 알 수 있다.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Peptide promoting skin permeation and fusion protein comprising the same <130> KPA140722-KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transdermal peptide <400> 1 Gln Ile Gly Thr Pro Thr His Thr Ala Ser Ser Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transdermal peptide-coding polynucleotide <400> 2 cagattggga ctcctacgca tactgcgtcg agtttt 36 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> control peptide <400> 3 Thr Asp Met Asn Lys Thr Glu Ile Arg Phe Val Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF <400> 4 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 5 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein(T3-EGF) <400> 5 Gln Ile Gly Thr Pro Thr His Thr Ala Ser Ser Phe Gly Gly Asn Ser 1 5 10 15 Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly 20 25 30 Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val 35 40 45 Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp 50 55 60 Glu Leu Arg 65

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과성 펩타이드, 또는 이의 유도체로서, 상기 유도체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과성 펩타이드의 C-말단에 단실(Dansyl)기가 결합된 형태인 것인, 펩타이드 또는 이의 유도체.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드, 또는 이의 유도체는 추가로 피부잔류성을 나타내는 것인 펩타이드 또는 이의 유도체.
제1항의 피부투과성 펩타이드, 또는 이의 유도체를 포함하는 융합단백질.
제3항에 있어서,
상기 펩타이드, 또는 이의 유도체를 포함하는 융합단백질은 추가로 피부잔류성을 나타내는 것인 융합단백질.
제3항에 있어서,
상기 융합단백질은 상기 피부투과성 펩타이드 및 생리활성 단백질을 포함하는 것인 융합단백질.
제3항에 있어서,
상기 피부투과성 펩타이드는 생리활성 단백질의 N-말단에 결합된 것인 융합단백질.
제3항에 있어서,
상기 피부투과성 펩타이드는 생리활성 단백질의 N-말단에 링커(linker)를 통하여 결합된 것인 융합단백질.
제5항에 있어서,
상기 생리활성 단백질은 상피세포 성장인자(EGF)인 융합단백질.
제8항에 있어서,
상기 상피세포 성장인자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합단백질.
제3항에 있어서,
상기 융합단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합단백질.
제1항 또는 제2항의 펩타이드, 또는 이의 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제11항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제3항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항의 펩타이드, 또는 이의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체.
제1항 또는 제2항의 펩타이드, 또는 이의 유도체를 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물.
제3항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항의 펩타이드, 또는 이의 유도체를 포함하는 화장료 조성물.
제3항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합단백질을 포함하는 화장료 조성물.