KR101040168B1

KR101040168B1 - 신규의 ｋｇｆ2-fｎ10 융합 단백질 및 그의 피부재생 촉진 용도

Info

Publication number: KR101040168B1
Application number: KR1020090030368A
Authority: KR
Inventors: 장준혁; 김현이; 정성민
Original assignee: 주식회사 제노스; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2011-06-09
Also published as: KR20100111899A

Abstract

본 발명은 신규의 융합 단백질 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 신규의 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질 및 그것의 케라티노사이트 증식 및 분화 촉진 용도 및 궁극적으로 이를 이용한 피부재생 촉진 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, KGF2-FN10 융합 단백질은 원래 KGF2와 비교하였을 때 현저히 상승된 인간 케라티노사이트의 미토게닉(mitogenic) 활성과 케라티노사이트 분화(differentiation) 활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 KGF2-FN10 융합 단백질은 피부재생 촉진용 화장료 또는 약제로서 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규의 ＫＧＦ2-ＫＮ10 융합 단백질 및 그의 피부재생 촉진 용도 {Novel KGF2-FN10 fusion protein and its use for promoting skin regeneration}

본 발명은 신규의 융합 단백질의 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 신규의 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질 및 그것의 케라티노사이트 증식 및 분화 촉진 용도 및 궁극적으로 이를 이용한 피부재생 촉진 용도에 관한 것이다.

케라티노사이트 성장인자 2 (KGF2)는 상동성-기초한 폴리머라제 체인 반응에 의해 랫트 배아 cDNA 에서 처음으로 분리되었으며, fibroblast growth factor (FGF) superfamily 의 구성원이다[Emoto, H. et al. Structure and expression of human fibroblast growth factor-10. J Biol Chem 1997, 272: 23191-2319]. KGF2는 주로 간엽세포(mesenchymal cell)에서 합성되고, 파라크라인(paracrine) 방식으로 상피세포(epithelial cell)에 우세하게 작용한다 [Beer, H. D. et al. Mouse fibroblast growth factor 10: cDNA cloning, protein characterization, and regulation of mRNA expression. Oncogene 1997, 15: 2211-2212]. KGF2-매개된 간엽세포-상피 상호작용(communication)은 상처가 치료되는 동안 상피 재생 작용을 하고, 발생 과정 동안 정상 피부 구조의 기초 작업에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[Soler, P. M. et al. In vivo characterization of keratinocyte growth factor-2 as a potential wound healing agent. Wound Repair Regen 1999, 7: 172-17].

성장 인자-유도된 증식 및 분화는 세포외부기질(ECM) 구성성분에 세포들이 부착할 것을 필요로 한다 [Ingham, K. C. et al. Interaction of heparin with fibronectin and isolated fibronectin domains. Biochem J 1990, 272: 605-61]. 피브로넥틴(FN)은 부착용 기질로써 많은 세포 타입에 의해 사용된 주요한 ECM 구성성분이다 [Ruoslahti, E. Fibronectin and its receptors. Annu Rev Biochem 1988, 57: 375-41]. 정상적인 피부에서, 피브로넥틴은 dermal-epidermal 접합에 존재하고 상처 치료시 피부 조직에서 증가한다 [Stenman, S. and Vaheri, A. Distribution of a major connective tissue protein, fibronectin, in normal human tissues. J Exp Med 1978, 147: 1054-106]. 피브로넥틴은 40-90 아미노산으로 구성되는 상동성 반복 모듈을 가지는 분자 구조를 가진다 [Ruoslahti, E. Fibronectin and its receptors. Annu Rev Biochem 1988, 57: 375-41]. Tenth type III domains of fibronectin (FN10)은 피브로넥틴의 주요한 세포-부착 도메인이고 인테그린의 구성원에 의해 인지되는 서열인 Arg-Gly-Asp (RGD)을 포함한다 [Choung, P. H. et al. Synergistic activity of fibronectin and fibroblast growth factor receptors on neuronal adhesion and neurite extension through extracellular signal-regulated kinase pathway. Biochem Biophys Res Commun 2002, 295: 898-90].

본 발명자들은 세포 부착 기능을 위해 FN1을 포함하는 신규한 KGF2 융합 단백질 (KGF2-FN10)을 디자인하였고, 1차(primary) 인간 케라티노사이트에서의 세포 부착, 증식 및 분화에의 상기 단백질의 효과를 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 신규의 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 KGF2-FN10 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 재조합벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 KGF2-FN10 융합 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 KGF2-FN10 융합 단백질의 케라티노사이트 증식 및 분화 촉진 용도 및 궁극적으로 이를 이용한 피부재생 촉진 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 것을 특징으로 하는 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)는 fibroblast growth factor (FGF) 패밀리의 일원으로서 FGF10으로도 알려져 있으며, 이 단백질은 케라틴화되는 표피(epidermal) 세포의 미토게닉(mitogenic) 활성을 나타내며, 상처 치료 과정의 주요 인자로 기능을 한다고 알려졌다 [Emoto H et al. (1997). "Structure and expression of human fibroblast growth factor-10.". J. Biol. Chem. 272 (37): 23191-4]. 본 발명의 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 KGF2 또는 FGF10으로 알려진 단백질 또는 그와 동등한 기능을 한다고 알려진 변이체의 어떤 아미노산 서열도 가질 수 있으나, 바람직하게는 인간의 KGF2 단백질 (NM_004465) 의 아미노산 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 피브로넥틴은 세포 표면 리셉터인 인테그린(integrins)에 넓은 결합 특이성을 갖는 세포외부기질(ECM) 단백질의 일종이다. 피브로넥틴은 많은 중요한 기능들, 예컨대 상처 치료, 세포 부착, 혈액 응고, 세포 분화 및 이동 등에 관여한다고 알려졌다[Dean DC et al. (1987). "Cloning and analysis of the promotor region of the human fibronectin gene". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (7): 1876-1880]. 피브로넥틴의 서열의 주요 부분은 3가지 유형 도메인의 반복으로 구성되며, 그들은 유형 I, II, 및 III로 불리운다 [Skorstengaard K et al. (1986). "Complete primary structure of bovine plasma fibronectin". Eur. J. Biochem. 161 (2): 441-453]. 이중 본 발명에 사용된 제10 (tenth) 피브로넥틴 유형 III 도메인 (FN10)은 인테그린 결합에 직접적으로 관여하는 RGD 서열을 갖는 피브로넥틴의 작은 자율적(autonomous) 도메인이다. 본 발명의 FN10 도메인은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 FN10으로 알려진 도메인 또는 그와 동등한 기능을 한다고 알려진 변이체의 어떤 아미노산 서열도 가질 수 있으나, 바 람직하게는 인간의 FN10 도메인 (AAD00019)의 아미노산 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 KGF2-FN10 융합 단백질은 KGF2와 FN10가 결합되어 있는 어떤 융합 단백질의 아미노산 서열도 가질 수 있으나, 바람직하게는 KGF2와 FN10 사이에 단백질 사이의 연결을 위한 5-10 아미노산 잔기를 갖는 링커를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 KGF2-FN10 융합 단백질을 코딩할 수 있는 어떤 염기서열을 가질 수도 있으나, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 KGF2-FN10 융합 단백질을 코딩하는 염기서열, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 KGF2-FN10 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 상기 KGF2-FN10 융합 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드가 벡터(vector)에 삽입된 어떤 재조합벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현할 수 있는 프로모터를 포함하는 벡터에 삽입된 재조합 벡터 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 1b의 개열지도를 갖는 pBAD/HisA-KGF2-FN10 재조합벡터인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 KGF2-FN10 융합 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 재조합벡터의 종류에 따라 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으나, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 KGF2-FN10 융합 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 KGF2-FN10 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 KGF2-FN10 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 케라티노사이트의 세포증식 및 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예 4에서는 케라티노사이트의 세포증식 촉진 효과를 실험적으로 증명하였으며, 실시예 5에서는 케라티노사이트의 분화 촉진 효과를 실험적으로 증명하였다. 실시예 5에 사용된 human cytokeratin K10는 keratinocyte differentiation markers로서 널리 알려져 있다 [Berge U et al. Kinetin-induced differentiation of normal human keratinocytes undergoing aging in vitro. Ann N Y Acad Sci. 2006 May;1067:332-6].

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 KGF2-FN10 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 피부재생 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부재생 촉진용 조성물은 피부 개선용 화장료 또는 상처 치료용 약제로 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 KGF2-FN10 융합단백질이 상처 치료용 약제로 이용될 경우 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합단백질은 약제로 사용될 경우 상처치료용 드래싱 또는 연고의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 KGF2-FN10 융합단백질을 유효성분으로서 투여하는 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 드래싱 또는 연고로 도포할 경우 1일 1회 0.1-100mg의 융합단백질로로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 신규한 KGF2-FN10 융합 단백질을 제공한다. 여기서, KGF2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함하며, FN10는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티 드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상이 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 KGF2 단백질 또는 FN10 도메인과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 단백질의 생리활성을 크게 변경시키지 않고 단백질의 아미노산을 교환하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 상기 UDG 단백질은 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 KGF2-FN10 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 염기서열을 가지는 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 또는 RNA 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 또는 화학적 합성법(Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Engl. 37:73-127, 1988) 에 의해 제조될 수 있다. 그러나 바람직하게는 인간으로부터 PCR 등의 방법에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 가진다.

상기 본 발명에 따른 KGF2-FN10 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터내로 삽입되어 숙주세포를 형질전환 할 수 있다. "발현 벡터"라는 용어는 KGF2-FN10 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. “작동 가능하게 연결 (operably linked)”된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘 (CaCl2) 및 열쇼크 (heat shock) 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG (polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 세균 (bacteria)이 바람직하며, 그 예로는 대장균이 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 KGF2-FN10 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 형질전환된 숙주 세포내에서 본 발명의 KGF2-FN10 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 상기 형질전환된 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면, 형질전환된 세포가 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이후, 상기 형질전환된 세포에서 발현이 유도된 본 발명의 KGF2-FN10 융합단백질의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포를 용해 후, 용해물을 원심분리하여, 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등 을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 KGF2-FN10 융합단백질을 생산할 수 있다[참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Habor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)].

성장인자-유도된 증식 및 분화를 위해서는 종종 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포외부기질 단백질(extracellular matrix proteins)에의 세포 부착이 필요하다. 본 발명은 세포외부기질 단백질 위의 피브로넥틴에 융합된 케라티노사이트 성장인자 2 (KGF2)의 단백질 조작에 따른 KGF2 활성에의 효과에 대해서 연구한 결과이다. 본 발명의 실시예에 따라 Escherichia coli에서 발현된 융합 단백질(KGF2-FN10)은 인간 케라티노사이트(keratinocytes)에서 KGF2의 상당히 상승된 미토게닉(mitogenic) 활성을 나타냈다. 게다가 KGF2-FN10 융합 단백질은 원래 KGF2과 비교했을 때 상당히 증가된 케라티노사이트 분화 활성을 나타냈다.

피브로넥틴과 같은 세포외부기질에의 세포부착은 증가된 FAK 자기인산화(autophosphorylation) 및 ERK-type MAP kinase의 활성화를 포함하여 많은 내세포 신호 전달을 유도한다. 이러한 인테그린-매개된 신호 전달은 세포 증식 및 분화 를 조정하기 위해서 다른 미토게닉 신호 전달 경로가 연관되어 있음을 암시한다. 이전의 연구에서, 우리는 피브로넥틴-매개된 신호전달이 ERK-type MAP kinase pathway를 통해 FGFRs로부터 발생된 신호들로 증폭된다는 것을 밝혔다. 비록 상승된 인간 케라티노사이트 내 향상된 생물학적 활성과 KGF2-FN10의 연관성에 관한 세부화된 매커니즘이 밝혀져야 하겠으나, KGF2 및 피브로넥틴의 증폭된 효과는 KGF2-FN10의 잠재적 활성에 중요한 역할을 할 것으로 판단된다.

KGF-2는 피부 상처 치료 및 재-표피화(epithelialization)를 증강시킨다. 흉터 형성의 래킷 모델에서, KGF-2는 상처 치료에 가장 효과적이고 KGF-1 및 TGF-β를 포함한 다른 성장 인자와 비교하여 명백한 흉터를 남기지 않았다. 게다가, 피브로넥틴은 상처 치료시 케라티노사이트 부착 및 이동을 증진시킨다.

본 발명에서, 우리는 성공적으로 원래 KGF2 및 피브로넥틴 모두의 활성을 유지하는 융합 단백질을 생산했다. 이들 융합 단백질은 인간 케라티노사이트에서 KGF2의 상당히 향상된 미토게닉 활성을 나타냈다. 게다가, KGF2-FN10 융합 단백질은 원래 KGF2와 비교하여 상당히 증가된 케라티노사이트 분화 활성을 나타냈다. 그러므로 현재 in vitro 실험들은 KGF2-FN10 융합 단백질이 원래 KGF2를 상회하는 어떤 이점들을 가지고 있으며 KGF2의 치료 효과를 잠재하는 새로운 전략을 제공할 가능성이 있음을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 발현 플라스미드의 구성 및 정제(Construction of expression plasmids and purification)

PCR primers는 다음과 같이 tenth type III domain of human fibronectin (FN10)를 인지하기 위해 디자인되었다 FN10 upstream primers, 5‘- CTCGAGCAACAATCAACAGTTTC-3, FN10 downstream primers, 5‘- CTCGAGTGGTTTGTCAATTTC-3. PCR은 Human cDNA library (Invitrogen)를 주형으로 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 100 μg ml^-1 gelatin, 0.2 mM dNTPs, 1.25 units Taq polymerase (iNtRON), 각각 50 pmol upstream 및 downstream primers를 함유하는 30 μl 반응물에서 수행되었다. PCR에서 사용된 thermocycling 파라미터들은 하기와 같다 어닐링(annealing) 1 min at 55℃; 연장(extension) 2 min at 72℃; 변성(denaturation) 1 min at 94℃. 30 cycles 이후에, PCR-amplified cDNA products는 PstI로 분해시켰다. 분해 이후에, PCR 산물들은 KGF2의 cDNA가 클로닝된 벡터 pBAD-HisA2 [도 1a 참조; Jang, J. H. Stimulation of human hair growth by the recombinant human keratinocyte growth factor-2 (KGF-2). Biotechnol Lett 2005, 27: 749-75]의 멀티 클로닝 사이트내에 in-frame 라이게이션(ligate)되어 최종적으로 재조합 벡터 pBAD-HisA-KGF2-FN10 (도 1b 참조)를 제조하였다. poly-His 태그를 포함하는 KGF2-FN10 융합 단백질은 제조자 프로토콜 (Invitrogen)에 따라 E. coli strain BL21 (DE3)에 형질전환하여 발현되고 변성 조건 하에서 Ni2+ affinity column를 사용하여 정제되었다. 도 2는 정제된 재조합 KGF2-FN10 융합 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다. 재조합 KGF2-FN10은 히스티딘(His6)으로 표지된 융합 단백질로써 도시되었고, Ni-NTA column 을 사용하여 정제되었다. 희석된 물질은 감소 조건 하에서 SDS-PAGE 에 적용하고, Coomassie Blue 염색에 의해 시각화되었다. 단백질은 10 % (w/v) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 하였다. 분자 질량 마커들은 kDa 로 나타냈다.

실시예 2: 세포 배양(Cell culture)

1차(primary) 인간 케라티노사이트(Invitrogen)를 이용하여 실험을 수행하였다. 이 세포들은 제조 프로토콜(Invitrogen)에 따라 Keratinocyte-SFM 에서 배양되었다. 세포들은 5% CO2를 포함한 습한 공기 중 37℃ 에서 배양되었다. 배지는 일주일에 3번 교환하였고, 배양물은 포화 상태에 이르기 전에 37℃ 에서 5분 동안 0.05% (w/v) Trypsin-EDTA 로 세포들을 처리하여 분리시켰다.

실시예 3: 세포 부착 분석(Cell adhesion assay)

1차 인간 케라티노사이트들은 0.05% (w/v) Trypsin-EDTA에 의해 수확되고, Keratinocyte-SFM 에 재현탁하고, 500 μg ml-1 Soybean Trypsin Inhibitor 을 함 유하는 성장 배지로 3번 세척했고, Keratinocyte-SFM 안에서 웰당 5 x 10⁴ 세포들로 플레이트되었다. 24 웰 플레이트는 4℃에서 기술한 조건 하에서 밤새도록 KGF2, FN10 또는 KGF2-FN10 (0.5-1μM)로 코팅되었고, 그리고 나서 PBS 내 1% (w/v) BSA로 30분 동안 블록처리(block) 되었고, PBS로 세척되었다.

비특이적 부착은 37 ℃ 에서 1시간 동안 PBS 내 0.5% BSA를 이용한 부화에 의해 블록되었다. 37 ℃에서 45분 경과 후 부착 세포들은 PBS로 2번 세척하였고, 3% (w/v) paraformaldehyde (Sigma)와 혼합한 후 0.25% (w/v) Crystal violet (Sigma) in 2% (v/v) ethanol/water로 염색되었다. 증류수로 헹궈낸 후에, 플레이트를 건조시켰다. 흡광도는 570 nm에서 측정하였고 음성 대조군으로서 비특이적 부착은 1% (w/v) BSA로 코팅된 웰 안에서 결정되었다.

도 3은 1차 인간 케라티노사이트들의 KGF2, FN10, 및 KGF2-FN10로 코팅된 플레이트에의 부착능을 비교한 그래프이다. 부착 분석은 기술된 바와 같이 다양한 substrata위에 심어진 케라티노사이트 위에서 수행되었다. 결과는 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색된 세포들의 O.D. 값으로, 평균 S.E으로 나타냈다. (*, p < 0.05 n=4).

실시예 4: 성장 분석(Growth assays)

세포 성장은 기재된 바와 같이 생존한 세포의 숫자를 세는 the MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium) tetrazolium assay (Celltiter96TM AQ Non-radioactive Cell proliferation Assay, Promega, USA) 에 의해 분석되었다. 이러한 분석은 a methyl terazol sulfate (MTS)에서 490 nm를 흡광하는 수용성 formazan 생산물로의 전환을 측정한다.

세포들은 0.5 μM 의 농도가 되도록 FN10, KGF2, 또는 KGF2-FN10를 추가하면서 이들과 함께 웰당 5000 세포들의 농도로 24-웰 플레이트에서 길렀다. 5일간 37℃에서세포들을 부화시킨 후에, MTS (40μL)를 추가하고, 그 다음 4시간 동안 37℃에서 추가적으로 부화시켰다. an ELISA reader (Tecan)를 사용하였을 때 Optical 농도는 490 nm에서 측정되었다.

도 4는 인간 케라티노사이트에 대한 KGF2-FN10의 성장-자극 효과를 나타낸 그래프이다. 인간 케라티노사이트들을 5일 간 FN10, KGF2, 및 KGF2-FN10와 함께 부화시켰다. 데이터들은 비처리된 대조군의 퍼센티지로써 나타냈고 평균 S.E 이다(*, p < 0.05 n = 4).

실시예 5: 정량적 실시간 RT-PCR (Quantitative real-time RT-PCR)

첫번째 가닥 cDNA는 제조자 설명서에 따라 RT-PCR (Invitrogen)을 위한 SuperScript first strand 합성 시스템을 사용하여 전체 RNA (2 μg)로부터 합성되었다. 반응 혼합물의 양은 50 μl가 되었다. Quantitative real-time PCR 은 SYBR GreenER qPCR SuperMix reagents (Invitrogen) 및 Bio-Rad iCycler을 사용하여 수행되었다. 상대적 트랜스크립트 양은 샘플로부터 증폭된 내생 관련 유전자로써 β- actin를 이용한 ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었다. 프라이머 서열은 다음과 같다 인간 cytokeratin K10 forward: 5‘-gaaccacgaggaggaaatga-3‘, reverse: 5‘-tgcacacagtagcgaccttc-3‘ involucrin forward: 5‘-caactgaagcatctggagca-3‘, reverse: 5‘-agggctggttgaatgtcttg-3‘ β-actin forward: 5‘-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3‘, reverse: 5‘- GCCGATCCACACGGAGTACTT -3‘.

도 5는 인간 케라티노사이트에서 내생 cytokeratin K10 및 involucrin mRNA 레벨에 대한 KGF2-FN10의 효과를 나타낸 그래프이다. 모든 RNA는 KGF2 또는 KGF2-FN10 처리된 인간 케라티노사이트에서 수득되고 cytokeratin K10 및 involucrin mRNA 의 내생 레벨을 정량화하기 위해 1일간 배양 후 quantitative real-time PCR를 수행하였다. 데이터는 1 unit 로서 비처리된 대조군의 신호를 의미하는 fold 발현으로 나타난다. 수치는 적어도 3번의 실험 ± S.E 의 평균값이다(*, p < 0.05).

결과 1: E. coli 내 재조합 융합 단백질의 발현 및 정제(Expression and purification of the recombinant fusion protein in E. coli)

KGF2와 피브로넥틴 조각을 연결시키기 위해, the tenth type III domains of FN (FN10)를 구성하는 주요 셀-연결 FN 도메인을 KGF2와 융합시켜서, 이를 KGF2-FN10라 명명했다. FN10를 코딩하는 cDNA는 실시예 1에서 기술하는 바와 같이 박테리아에서의 발현을 위해 XhoI 제한 효소 사이트에서 pBAD/HisA-KGF2 e발현 벡터안으로 서브클로닝시켰다. 이러한 벡터는 친화력 정제를 위해 아미노-말단 폴리히스티딘 서열 및 염격히-조절되는 발현을 위해 araBAD 프로모터를 포함한다.

재조합 KGF2-FN10의 발현을 위해 E. TOP10 세포들을 37℃ LB-Amp medium안에서 밤새도록 배양하였다. 배양물이 A600=0.6에 달했을 때, induction은 inducer로써 0.02% (w/v) L-arabinose를 이용하여 시작했다. 3시간 경과 후에 박테리아는 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고, 용해시키고, 초음파 처리했다. 용해성 추출물은 냉장된 원심분리기에서 30분 동안 14,000×g 원심분리하여 준비하고 supernatant는 fresh tube로 옮겼다.

초음파처리된 박테리아의 supernantant에서 수득한 조단백질(crude protein)은 헥사히스디딘 표지태그(hexahistidine tag)를 (단백질의 아미노 말단 끝에 위치하는) nickel-nitrilotriacetic acid resin column에 연결시켜서 정제한다. 재조합 단백질의 정제 정도는 변성 조건하에서 10 % (v/v) SDS-PAGE의 Coomassie blue 염색에 의해 결정된다. L-arabinose를 이용한 induction 시에, E. Top 10은 KGF2-FN10 및 amino-terminal His·Tag을 포함하는 융합 단백질로 예상되는 크기, Mr550,000(SDS-PAGE에 의한 측정치)의 단백질을 생산했다(도 2).

결과 2: KGF2-FN10 융합 단백질의 세포 부착 활성(Cell adhesion activity of KGF2-FN10 fusion protein)

세포 부착을 증진시키는 KGF2-FN10 융합 단백질의 능력을 분석하기 위해서, 1차 인간 케라티노사이트를 FN10, KGF2 및 KGF2-FN10로 코팅된 플라스틱조직-배양 플레이트 위에 심었다. 세포들은 FN10-coated plates 및 KGF2-FN10-coated plates 모두에 잘 부착되었다. 그러나 KGF2-coated plates 또는 non-coated plates 위에는 세포가 거의 부탁되지 않음을 관찰할 수 있었다(도 3)

결과 3: 세포 성장에 있어서 KGF2-FN10의 효과

다음으로 배양 중인 인간 케라티노사이트에 대한 KGF2-FN10의 미토게닉 활성을 평가했다. 분석은 뇌 추출물과 같은 다른 가즉물질의 첨가를 배제한 채 보충물의 부재상태에서 수행되었다. 도 4에서 보듯이, KGF2-FN10는 KGF2 또는 FN10와 비교해 보건대, 1차 인간 케라티노사이트의 증식을 상당히 자극했다(p < 0.05). 이들 결과는 FN10와 융합된 KGF2가 인간 케라티노사이트에의 KGF2의 미토게닉 활성을 증강시킨다는 것을 암시한다.

결과 4: 케라티노사이트 분화에 관한 KGF2-FN10의 효과 (Effect of KGF2-FN10 on the keratinocyte differentiation)

케라티노사이트 분화에의 KGF2-FN10의 영향을 분석하기 위해 우리는 real-time PCR에 의해 분화 마커들의 발현에 관한 KGF2-FN10의 효과를 실험했다. 도 5에서 보듯이, KGF2-FN10는 KGF2 와 비교하여 보건대 분화 마커, cytokeratin K10 및 involucrin mRNA의 발현양이 상당히 증가되었다(p < 0.05). 이들 결과는 KGF2-FN10 융합 단백질이 케라티노사이트 분화에의 그들의 능력에 있어서 본래 KGF2 보다 더 많은 잠재력을 가진다는 것을 암시한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, KGF2-FN10 융합 단백질은 원래 KGF2와 비교하였을 때 현저히 상승된 인간 케라티노사이트의 미토게닉(mitogenic) 활성과 케라티노사이트 분화(differentiation) 활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 KGF2-FN10 융합 단백질은 피부재생 촉진용 화장료 또는 약제로서 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

도 1a는 본 발명의 재조합벡터를 만드는데 사용된 벡터 pBAD/HisA의 맵이고, 도 1b는 본 발명의 실시예에 따라 최종적으로 제작된 재조합벡터 pBAD/HisA-KGF2-FN10의 맵이다.

도 2는 정제된 재조합 KGF2-FN10 융합 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다.

도 3은 1차 인간 케라티노사이트들의 KGF2, FN10, 및 KGF2-FN10로 코팅된 플레이트에의 부착능을 비교한 그래프이다.

도 4는 인간 케라티노사이트에 대한 KGF2-FN10의 성장-자극 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 인간 케라티노사이트에서 내생 cytokeratin K10 및 involucrin mRNA 레벨에 대한 KGF2-FN10의 효과를 나타낸 그래프이다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION GENOSS CO.,LTD. <120> Novel KGF2-FN10 fusion protein and its use for promoting skin regeneration <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser 1 5 10 15 Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly 20 25 30 Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val 35 40 45 Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu 50 55 60 Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn 65 70 75 80 Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr 85 90 95 Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn 115 120 125 Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser 130 135 140 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The tenth type III domains of fibronectin (FN10) <400> 2 Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala 1 5 10 15 Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr 20 25 30 Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro 35 40 45 Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser 50 55 60 Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr 65 70 75 80 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 85 90 95 Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro 100 <210> 3 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA of KGF2-FN10 fusion protein <400> 3 agctacaatc accttcaagg agatgtccgc tggagaaagc tattctcttt caccgagtac 60 tttctcaaga ttgagaagaa cgggaaggtc agcgggacca agaaggagaa ctgcccgtac 120 agcatcctgg agataacatc agtagaaatc ggagttgttg ccgtcaaagc cnttaacagc 180 aactattact tagccatgaa caagaagggg aaactctatg gctcaaaaga atttaacaat 240 gactgtaagc tgaaggagag gatagaggaa aatggataca atacctatgc atcatttaac 300 tggcagcata atgggaggca aatgtatgtg gcattgaatg gaaaaggagc tccaaggaga 360 ggacagaaaa cacgaaggaa aaacacctct gctcactttc ttccaatggt ggtacactca 420 ctcgagatct gcagccaaca atcaacagtt tctgatgttc cgagggacct ggaagttgtt 480 gctgcgaccc ccaccagcct actgatcagc tgggatgctc ctgctgtcac agtgagatat 540 tacaggatca cttacggaga aacaggagga aatagccctg tccaggagtt cactgtgcct 600 gggagcaagt ctacagctac catcagcggc cttaaacctg gagttgattg taccatcact 660 gtgtatgctg tcactggccg tggagacagc cccgcaagca gcaagccaat ttccattaat 720 taccgaacag aaattgacaa acca 744 <210> 4 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF2-FN10 fusion protein <400> 4 Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser 1 5 10 15 Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly 20 25 30 Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val 35 40 45 Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu 50 55 60 Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn 65 70 75 80 Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr 85 90 95 Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn 115 120 125 Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser Leu Glu Ile Cys 130 135 140 Ser Ser Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val 145 150 155 160 Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala 165 170 175 Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 180 185 190 Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr 195 200 205 Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala 210 215 220 Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 225 230 235 240 Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro 245

Claims

케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 것을 특징으로 하는 융합(fusion) 단백질
제 1항에 있어서, 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 융합(fusion) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제 8항에 있어서, 상기 재조합벡터는 도 1b의 개열지도를 갖는 pBAD/HisA-KGF2-FN10 인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제 8항에 따른 재조합벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 10항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 8항에 따른 숙주세포를 배양하는 단계; 케라티노사이트 성장인자 2(KGF2)와 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인(FN10)이 결합된 융합(fusion) 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 KGF2-FN10 융합(fusion) 단백질의 제조방법.
제 1항에 따른 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 케라티노사이트의 세포증식 및 분화 촉진용 조성물.
제 1항에 따른 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 피부재생 촉진용 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 조성물은 피부 개선용 화장료 또는 상처 치료용 약제로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.