JP2001190280A - コラーゲン結合性生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】生理活性ペプチドの活性が維持され、かつコラ
ーゲンに対する結合活性が付与されたコラーゲン結合性
生理活性ポリペプチドを提供する。 【解決手段】フィブロネクチン由来のペプチドに生理活
性ぺプチドが連結されたコラーゲン結合性及び生理活性
の両活性を有するハイブリッドポリペプチド及び該ポリ
ペプチドをコラーゲンに複合化させたコラーゲンマトリ
ックス。生理活性ペプチドの活性が維持され、かつコラ
ーゲンに対する結合活性が付与されたコラーゲン結合性
生理活性ポリペプチドは生理活性ペプチドのドラッグデ
リバリーシステム（ＤＤＳ）として有用である。さら
に、該ポリペプチドはコラーゲンに複合化させることが
可能であり、このように機能修飾されたコラーゲンマト
リックスは組織再生の新しいバイオマテリアルとして有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はハイブリッドポリペ
プチドに関し、更に詳しくはフィブロネクチン（ＦＮ）
由来のペプチドと生理活性ペプチドとが遺伝子工学的手
法により連結されたポリペプチドであって、コラーゲン
結合活性及び生理活性の両活性を有することを特徴とす
るコラーゲン結合性生理活性ポリペプチド並びに該ポリ
ペプチドとコラーゲン由来のポリペプチドを複合化させ
たバイオマテリアルに関する。

【０００２】

【従来の技術】サイトカイン、細胞成長因子などの生理
活性ペプチドの中には医薬品としての用途を期待されて
いるものが多い。例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ）は、中胚葉、神経外胚葉由来の様々な細胞
の増殖と分化促進活性、血管内皮細胞、繊維芽細胞、血
管平滑筋細胞、アストログリア細胞に対する細胞増殖活
性、細胞遊走活性及び血管新生活性など多彩な生物活性
を有するポリペプチドであり培養細胞の増殖因子として
も広く利用されている(Journal of Cell Biology、第１
０９巻、第１号、１〜６頁（１９８９））。その細胞増
殖活性、細胞遊走活性、血管新生活性から、ｂＦＧＦは
創傷治癒剤等の用途が期待されている（R. A. F. Clark
編、The Molecular and Cellular Biology of Wound Re
pair、第２版、第６章、２３７〜２４８頁（１９８
８）、Plenum出版、New York) 。また上皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）についても上皮細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞
などの増殖促進、血管新生活性などから創傷治癒剤とし
ての用途が期待されている(Zieglerら編、Growth Facto
rs and Wound Healing、第３部、第１２章、２０６〜２
２８頁（１９９７）、Springer-Verlag 、New York) 。

【０００３】しかしながら、一般的に生理活性ペプチド
は生体内での安定性が悪く、局所保持や徐放が困難なた
めに標的組織での効果が低く、他部位での副作用があ
る。そのため、実用性が危惧されているものが多く、効
率のよいドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が切望
されている。

【０００４】この問題を解決するため、生理活性ペプチ
ドと、生体適合性を有する高分子とを混合することによ
り、生体内における徐放性を確保しようとする試みが多
数行われてきた。生体適合性を有する高分子の中でもコ
ラーゲンは生体の損傷を修復するためのバイオマテリア
ルとして、または薬剤のキャリアーとして医療分野で広
く利用されているタンパク質であり、優れた生体適合性
を有している。

【０００５】生理活性ペプチドをコラーゲンとの混合に
より、その徐放性をコントロールする技術については、
例えば特許第２６４１７５５号、特開平５−４３４５３
号公報に開示されている。特公平４−１８８６５号公報
には、細胞増殖因子をコラーゲンと混合後、熱脱水架橋
した細胞増殖因子含有コラーゲンマトリックスが開示さ
れている。さらに生理活性ペプチドの徐放性を目的とし
て、ヘパリンと、ヘパリン結合性を有する生理活性ペプ
チドと、コラーゲンとを混合する徐放性マトリックスの
調製法（特開平８−２５３４２９号公報、特開平８−３
２５１６０号公報）が開示されている。このような材料
の混合により、ヘパリン結合性生理活性ペプチドの徐放
性を図ることも可能であると推測される。しかしながら
ヘパリンと生理活性ペプチドを共に用いる方法では、ヘ
パリンの抗凝固作用の問題と共にヘパリン結合性を有さ
ない生理活性ペプチドに対しては適用できないという制
限がある。

【０００６】またインターフェロンを高濃度のコラーゲ
ンと混合・練合し、風乾したコラーゲンペレットを生体
内に埋入することにより、その安定性や局所保持性を高
めるという方法が報告されている（Fujioka ら、Journa
l of Controlled Release 第３３巻 第３０７〜３１５
頁（１９９５））。

【０００７】あるいはヘパリンとコラーゲンとを化学的
に直接結合した抗血栓材料（Raghunath ら、Journal of
Biomedical Materials Research、第１７巻、第６１３
〜６２１頁（１９８３）、Nimni ら、Journal of Biome
dical Materials Research、第２１巻、第７４１〜７７
１頁（１９８７））が提案されている。さらに別の方法
としては生理活性ペプチドとコラーゲンとを、グルタル
アルデヒド等により化学的に結合する方法も試みられて
いる。

【０００８】前記したように、多くの生理活性ペプチド
に対して効率のよいＤＤＳが切望され、またコラーゲン
は生理活性ペプチドの徐放性を高めるキャリアーとして
期待されているが、コラーゲンと生理活性ペプチドの親
和性は一般に低く、単に両者を混合するだけでは、生理
活性ペプチドを長時間、安定にコラーゲンマトリックス
に保持することは不可能である。また、生理活性ペプチ
ドとコラーゲンを化学的に結合する方法では、その生理
活性が消失するかまたは低下するという問題がある。

【０００９】これに対して、近年、生理活性ペプチド
を、他のペプチドと遺伝子工学的にハイブリッド化し、
生理活性ペプチドのターゲッティングを達成しようとす
る技術の開発が進められている。すなわち遺伝子組換え
技術を用いてハイブリッドポリペプチドを大腸菌等で発
現させることが可能となっているが、発現されるハイブ
リッドポリペプチドが必ずしも元の活性を示すとは限ら
ず、所望活性、特に生理活性を得る事が困難な場合があ
る。

【００１０】特開平５−１７８８９７号公報には、細胞
外マトリックス成分の一つであるフィブロネクチン（Ｆ
Ｎ）の細胞接着ドメイン配列と、ｂＦＧＦとをハイブリ
ッド化した機能性ポリペプチドの製造法が開示されてい
る。この機能性ポリペプチドは、細胞に接着し、細胞増
殖活性を示すが、一方、細胞に直接結合するため長期的
な徐放効果や局所保持は期待できない。また機能性ポリ
ペプチドのｂＦＧＦとしての活性は著しく低下すること
が記載されている。

【００１１】細胞外マトリックスを介しての徐放効果を
ねらったものとしては、ウシフォンビルブランド因子由
来のコラーゲン結合性デカペプチド（decapeptide)とト
ランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β) とのハイ
ブリッドポリペプチドであるコラーゲンターゲッティン
グＴＧＦ−βが報告されている (ＵＳＰ 5,800,811、Tu
anら、Connective Tissue Reserch 、第３４巻、１号、
１〜９頁（１９９６）、Han ら、Protein Expression a
nd Purification 、第１１巻、１６９〜１７８頁（１９
９７）、Gordonら、Human Gene Therapy、第8 巻、1385
〜1394頁（１９９7 ））。しかしながら、大腸菌で生産
された封入体から回収された組換えタンパクの多くはそ
のコラーゲン結合活性が損なわれており、かつ生理活性
の低下も認められている。特にその中でコラーゲン結合
活性の残存したハイブリッドポリペプチドはコラーゲン
に結合させた後、細胞の捕捉は可能であったが、ＴＧＦ
−βの増殖活性は認められないと報告しており、ＴＧＦ
−β増殖活性の局所保持や徐放の目的は達成されていな
い。このためハイブリッドポリペプチドであるコラーゲ
ン結合性生理活性ポリペプチドのコラーゲン結合性ペプ
チド部分としては、フォンビルブランド因子のコラーゲ
ン結合性デカペプチドは適切とはいえない。

【００１２】一方、Nishi らは、嫌気性のグラム陽性桿
菌であるクロストリジウム ヒストリチカム(Clostridi
um histolyticum)のコラゲナーゼ由来のコラーゲン結合
性ポリペプチドと、ｂＦＧＦまたはＥＧＦとのハイブリ
ッドポリペプチドであるコラーゲン結合性細胞増殖因子
を試みているが、このコラーゲン結合性細胞増殖因子
は、コラーゲンコートされた細胞培養器または多くのコ
ラーゲン材料へは結合不能であったことから充分なコラ
ーゲン結合活性を有していないことが記載されている(P
roc. Nat. Acad. of Sci. USA 、第９５巻、７０１８〜
７０２３頁（１９９８））。当然の事ながら、コラーゲ
ン材料に結合後、細胞増殖活性を示すことは不可能であ
る。さらに、このコラーゲン結合性細胞増殖因子のＥＧ
Ｆ活性は低下することが認められている。また、免疫学
的には細菌のコラゲナーゼ由来のポリペプチドがヒトの
組織再生に適切ではないことは明白である。

【００１３】また工業生産を考慮して遺伝子組換え技術
を用い、ハイブリッドポリペプチドを生産する際、低コ
スト化のためには、原核生物（例えばバクテリア）又は
酵母での生産、特に大腸菌系発現の実現は重要な課題で
ある。しかしながら大腸菌系発現では、得られたポリペ
プチドが元の活性を示さなかったり、所望活性のポリペ
プチドを効率よく産生させることが困難な場合が多い。
大腸菌系発現における主な問題の１つとしては、可溶性
のポリペプチドが充分得られない場合である。これは、
ポリペプチドが封入体として不溶性になる場合と、合成
後すぐに分解される場合がある。外来性のポリペプチド
の高発現が大腸菌にとってストレスとなり、それを排除
する機構が働く結果と考えられている。封入体形成のメ
カニズムはまだ不明な点も多く、これを防ぐ万全の解決
策は存在しない。封入体を強力なタンパク質変性剤によ
って可溶化し、その後、目的タンパク質を再生させる手
段も有効であるが、一度変性過程を経るため目的のポリ
ペプチドの立体構造が最終的に正しく再生されず、正常
な生理活性を示さない場合も多い。

【００１４】汎用のハイブリッドポリペプチドの発現方
法のうちには、大腸菌発現系で、活性を保持した可溶性
タンパク質が効率よく産生され、封入体が形成されても
再生可能な方法も知られている。この方法で用いられる
ハイブリッド用ポリペプチドパートナーとしては、チオ
レドキシン、プロテインＡ、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェレース、lac リプレッサー、ガラクト
ース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢ
Ｐ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられ、既に発現
ベクターが市販されているものも多い。

【００１５】これらポリペプチドパートナーを用いれ
ば、可溶性で活性を保持したハイブリッドポリペプチド
が得られる可能性が比較的高いが、このうちにはコラー
ゲン結合性を示すものはない。そしてこれら以外のパー
トナーを用いる場合のハイブリッドポリペプチドでは、
その発現産生の可能性は低く、活性を維持したタンパク
質を得る可能性はさらに低い事が予想され、実現可能で
ある場合でも種々の障害が生じ、その達成を妨げる。即
ち、活性を有するハイブリッドポリペプチドの実現性を
証明するには、パートナーを用いたハイブリッドポリペ
プチドの産生及びその活性を示すことが必要となる。

【００１６】コラーゲン（ゼラチン）結合性のポリペプ
チドパートナーとして、ＦＮコラーゲン結合性領域を用
いることが考えられる。たとえば有用タンパク質の精製
のためのタッグとしてＦＮ由来のポリペプチドを選択す
ることが提案されている。具体的には、ＦＮのゼラチン
結合領域と、有用タンパク質を連結したポリペプチドを
発現させるベクター及びその有用タンパク質の精製法
（米国特許第5,342,762 号及び米国特許第5,460,955
号）、ＦＮのコラーゲン結合部分と、他のポリペプチド
または治療剤とが結合したポリペプチド及びその精製法
（特開昭６２−８９６９９号）が提案されている。

【００１７】上記米国特許では、ラットＦＮの配列限定
されたゼラチン結合領域がクレームされ、このＦＮ由来
のポリペプチド（精製タッグ）のコラーゲン／ゼラチン
への親和性によって、ＦＮ由来のポリペプチドと有用タ
ンパク質とのハイブリッドポリペプチドを捕捉させた
後、次いで特異的なプロテアーゼ等の切断を受けて有用
タンパク質部分のみを回収している。

【００１８】具体的には、ＦＮのゼラチン結合性領域の
アミノ末端に、昆虫細胞または動物細胞から培地中へ組
み換えポリペプチドを分泌させる３２残基のアミノ酸配
列であるＦＮのプレプロ配列またはリーダーシグナルペ
プチド配列を付加させ、バキュロウイルス発現システム
による昆虫細胞での生産、精製による実施例又はＣＯＳ
細胞のような動物細胞を宿主にして生産、精製してい
る。より具体的には、上記ＦＮのゼラチン結合性領域の
アミノ末端側にトリプシンによる切断部位が位置し、そ
のアミノ末端側に有用タンパク質が位置し、続いてファ
クターXIIIa サイトが位置し、さらにそのアミノ末端側
にＦＮのプレプロ配列またはリーダーシグナルペプチド
配列が付加されている。

【００１９】しかしながら上記米国特許公報には、ハイ
ブリッドポリペプチドにおけるＦＮ由来のポリペプチド
以外の部分である有用タンパク質の生理活性があるか否
かについては全く開示されていない。すなわち有用タン
パク質の精製法の例として、ＦＮのホモロジーユニット
I-12(12 番目のI 型ホモロジーユニット）、ＦＮのホモ
ロジーユニットI-9(9 番目のI 型ホモロジーユニット）
とIII-1(1 番目のIII 型ホモロジーユニット）またはヒ
トのファクターＩＸのさまざまな部分を発現、精製して
いるが、これらポリペプチドは本発明で述べる生理活性
ペプチドではなく生理活性もない。従って有用タンパク
質が生理活性ペプチドであった場合のハイブリッドポリ
ペプチド自体の活性、機能、用途についても全く記載さ
れていない。つまりヒトの細胞増殖、組織再生、臓器再
生などの用途に関する言及もなく、仮に用途を考えた場
合でも、上記のような構成では不適切である。

【００２０】すなわち上記のように有用タンパク質がＦ
Ｎのゼラチン結合領域のアミノ末端側に位置した連結で
は、トリプシンによる切断部位が存在していたり、また
はそこへプロテアーゼ切断配列を新たに挿入しても有用
タンパク質のカルボキシル末端にプロテアーゼ認識配列
などの余分なアミノ酸配列などがプロテアーゼによる切
断後少なくとも一つ付加されたまま残り、有用タンパク
質が生理活性ペプチドである場合、生理活性の低下、消
失を招く。

【００２１】単に精製が目的であれば、試験管内または
生体外で例えばトリプシンなどのエンドプロテアーゼに
よる切断、続いてカルボキペプチダーゼＢなどによる分
解で、余分な配列を含まない有用タンパク質を得ること
が可能である。しかしながら、このような手順の処置を
施さない限り、有用タンパク質のカルボキシル末端には
エンドプロテアーゼによる切断後、余分なアミノ配列を
含むことになり、有用タンパク質の活性低下または消失
の原因となる。従って、本発明のようにハイブリッドポ
リペプチドであるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
ドを直接使用する目的には適さない。

【００２２】また上記のような構成のポリペプチドは、
特に大腸菌など原核生物でのハイブリッドペプチドの生
産では、コラーゲン結合性の低下もしくは消失を招くか
または有用タンパク質が生理活性ペプチドである場合に
は生理活性の低下を生じるかもしくは消失する。或いは
封入体から活性を有するポリペプチドの回収率が著しく
低いか不可能である。すなわち動物由来のポリペプチド
を動物細胞又は昆虫細胞を宿主にして、機能を維持させ
たまま生産する事は比較的容易であるが、原核生物（バ
クテリアなど）又は酵母でのその実現は非常に困難であ
り、特に大腸菌のような原核生物による遺伝子組み換え
ポリペプチドの生産は低コスト化に非常に有利である反
面、非常に困難で、その実現には創意工夫が必要であ
る。

【００２３】また前記特開昭６２−８９６９９号には、
ヒトＦＮのＴｈｒ³⁷⁹ からＶａｌ^{44 5} までのアミノ配列
で構成されるポリペプチドを含む配列が示されている
が、ここに示されるポリペプチドがハイブリッドポリペ
プチドのパートナーとして有用であるとはいえない。後
述するようにこの公報の実施例で使用された配列は、プ
ロテアーゼ処理で得られる配列とは異なり、遺伝子工学
的に産生され得る配列であり、該配列をポリペプチドパ
ートナーとする生理活性ペプチドとのハイブリッドポリ
ペプチドでは、コラーゲン結合性をほとんど示さなかっ
た。また生理活性が低下または消失した。

【００２４】機能性蛋白質を細胞外マトリックスにター
ゲティングさせ得る他の技術として、ＦＮ分子のＮ末端
７０kDa 領域とＣ末端３７kDa 領域との間に異種タンパ
ク質またはペプチドのアミノ酸鎖を挿入してなるキメラ
蛋白質が特開平８−１４０６７７号に提案されている。
この発明の実用上の障害は主に二つある。すなわち、Ｆ
Ｎ分子の間に挿入するので、高次構造の維持が困難であ
り、動物細胞に発現させて一部の機能性蛋白質の機能を
保つ例はあるが、汎用性が低い。また分子量が大きく、
水に不溶性であることからEscherichia coli（大腸菌）
等での工業生産は不可能である。機能を保持可能な場合
でも，使用法としてはヒトの細胞で直接遺伝子発現させ
る遺伝子治療のみであると考えられる。

【００２５】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子組換え技術を用
いて大腸菌等でハイブリッドポリペプチドを発現させる
ことは提案されているが、活性のあるハイブリッドポリ
ペプチドが得られない事が多い。本発明の目的は、生理
活性ペプチドの活性を消失させることなく、遺伝子工学
的にコラーゲン結合活性が付与されたコラーゲン結合性
生理活性ポリペプチドを提供することにあり、さらに生
理活性ペプチドの局所保持または長期的かつ調節可能な
徐放機能を実現するための該コラーゲン結合性生理活性
ポリペプチドとコラーゲン由来のポリペプチドを複合化
したバイオマテリアル（生理活性ペプチド複合化コラー
ゲン）を提供することである。

【００２６】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明者らは遺伝子工学的手法でフィブロネクチン
（ＦＮ）のコラーゲン結合性ドメインと、生理活性ペプ
チドとを連結することにより、生理活性ペプチドの活性
が維持され、かつコラーゲンに対する結合活性が付与さ
れたコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの製造が可
能であることを証明し、さらに該コラーゲン結合性生理
活性ポリペプチドとコラーゲン由来のポリペプチドとを
複合化させたバイオマテリアル（生理活性ペプチド複合
化コラーゲン）を考案し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明の課題は以下の１）〜１５）によって解決さ
れる。

【００２７】１）フィブロネクチン由来のペプチドと生
理活性ペプチドとが連結したポリペプチドであって、コ
ラーゲン結合活性及び生理活性の両活性を有するコラー
ゲン結合性生理活性ポリペプチド。 ２）該生理活性ペプチドが、フィブロネクチン由来のペ
プチドのカルボキシル末端に連結されている上記１）に
記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチド。

【００２８】３）該フィブロネクチン由来のペプチド
が、フィブロネクチンのプロテアーゼによる分解により
得られ、かつコラーゲン結合性ドメインを構成するアミ
ノ酸配列からなるか、あるいは該配列と相同な配列、ま
たはその一部置換、欠失、挿入または付加体である配列
からなり、かつコラーゲン結合性を有する上記１）また
は２）に記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
ド。上記フィブロネクチンは、好ましくはヒト・フィブ
ロネクチンである。またヒト・フィブロネクチンのプロ
テアーゼによる限定分解または自然分解により得られる
ものが好ましい。プロテアーゼはプラスミンとキモトリ
プシンの両者の組合せであることが好ましい。

【００２９】より具体的には、 ４）該フィブロネクチン由来のペプチドが、ヒト・フィ
ブロネクチンのAla ²⁶⁰からTrp ⁵⁹⁹ までのポリペプチ
ドを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同であ
るかまたはその一部置換、欠失、挿入または付加体であ
る配列からなる上記１）〜３）に記載のコラーゲン結合
性生理活性ポリペプチドである。ここでコラーゲン結合
性は、ゼラチン結合性と同義である。

【００３０】５）該生理活性ペプチドがサイトカイン、
細胞成長因子である上記１）〜４）に記載のコラーゲン
結合性生理活性ポリペプチド。細胞成長因子として、繊
維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーまたは上皮増殖
因子（ＥＧＦ）ファミリーが好適である。

【００３１】６）該生理活性ペプチドが該フィブロネク
チン由来のペプチドに遺伝子工学的手法により連結され
ている上記１〜５）に記載のコラーゲン結合性生理活性
ポリペプチド。 ７）該生理活性ペプチドが該フィブロネクチン由来のペ
プチドの好ましくはカルボキシル末端に遺伝子工学的手
法により連結され、バクテリア好ましくはEsherichia c
oli （大腸菌）で産生される上記１〜６）に記載のコラ
ーゲン結合性生理活性ポリペプチド。上記において、生
理活性ペプチドと該フィブロネクチン由来のペプチドの
連結部位にスペーサーとしてアミノ酸またはペプチドが
挿入されていてもよい。この場合、該スペーサーまたは
該スペーサー及びその隣接配列とのいずれかがプロテア
ーゼ認識配列を含むものが好ましい。プロテアーゼ認識
配列はエンテロキナーゼの認識配列であることが好まし
い。

【００３２】８）コラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
ドが水溶性である上記１）〜７）に記載のコラーゲン結
合性生理活性ポリペプチド。

【００３３】９）コラーゲンに結合後、結合を保持した
ままかまたは徐放されることにより生理活性を示す上記
１）〜８）に記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプ
チド。 １０）上記１）〜９）のいずれかに記載のコラーゲン結
合性生理活性ポリペプチドを含有する生理活性ポリペプ
チドの局所維持剤、徐放剤、または生理活性付与剤。

【００３４】１１）コラーゲン結合性生理活性ポリペプ
チドとコラーゲン由来のポリペプチドとが複合化された
生理活性ペプチド複合化コラーゲンを含有するバイオマ
テリアル。 １２）コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドが上記
１）〜９）のいずれかに記載のコラーゲン結合性生理活
性ポリペプチドである上記１１）記載のバイオマテリア
ル。上記１１）または１２）に記載のバイオマテリアル
を用いて細胞、組織、臓器に、増殖、分化、再生または
物質産生促進の生理活性を与える方法を提供することが
できる。 １３）上記１１）または１２）に記載のバイオマテリア
ルを含有する生理活性ポリペプチドの局所維持剤、徐放
剤、または生理活性付与剤。

【００３５】１４）上記１）〜９）のいずれかに記載の
コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドをコードする遺
伝子。上記１）〜９）のいずれかに記載のコラーゲン結
合性生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子を含有す
る組換えベクター。上記１）〜９）のいずれかに記載の
コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドをコードする遺
伝子を含有する形質転換体。上記１）〜９）のいずれか
に記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有するバクテリア。１５）請求項１）
〜９）のいずれかに記載のコラーゲン結合性生理活性ポ
リペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えベクタ
ーを含む形質転換体。上記１）〜９）のいずれかに記載
のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドをコードする
遺伝子を含有する組換えベクターを含むバクテリア。上
記１）〜９）のいずれかに記載のコラーゲン結合性生理
活性ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換え
ベクターを含むEscherichia coli（大腸菌）。上記１）
〜９）に記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチド
をEsherichiacoli （大腸菌）を用いて生産する方法。

【００３６】

【発明の実施の形態】フィブロネクチン（ＦＮ）は、血
漿、細胞外マトリックス及び培養細胞表面に存在する細
胞接着性の糖タンパク質で、コラーゲン（ゼラチン）、
ヘパリン、フィブリン及びインテグリンなどの生体高分
子に結合し、細胞接着、組織構築及び組織損傷の修復な
どの生物学的作用を持つことが知られている(Ruoslaht
i、Annual Review of Biochemistry 、第５７巻、第３
７５〜４１３頁（１９８８））。

【００３７】本発明のコラーゲン結合性生理活性ポリペ
プチドは、上記のようなＦＮ由来のペプチドと、生理活
性ペプチドとが連結したポリペプチドであって、コラー
ゲン結合活性及び生理活性の両活性を有し、コラーゲン
結合後生理活性を示す。すなわちＦＮ由来のペプチド
と、生理活性ペプチドとを、遺伝子工学的に連結した機
能性ハイブリッドポリペプチドである。

【００３８】なお前述した過去の他の研究では、ＦＮ由
来のペプチド以外のコラーゲン結合性ペプチドと生理活
性ペプチドを含むハイブリッドポリペプチドにおいて、
コラーゲン結合活性および生理活性の両方を維持するこ
とは困難であった。特にこれらハイブリッドポリペプチ
ドは、コラーゲンに結合後、生理活性を示す事が実用上
重要になるが、従来これを十分には達成できなかった。
本発明者らも、ヒト・フォンビルブランド因子のコラー
ゲン結合性ペプチドを用いて、ＦＧＦまたはＥＧＦとの
ハイブリッドポリペプチドの作製を試みたが、コラーゲ
ン結合活性について良好な結果が得られず、生産量とし
ても充分得られず断念した。

【００３９】そして、上記のようにコラーゲン結合性ペ
プチドとしてＦＮ由来のコラーゲン結合性ポリペプチド
を用いることによりハイブリッドポリペプチドのコラー
ゲン結合活性と生理活性の両方を良好に維持し、かつコ
ラーゲン結合後の生理活性ペプチドの生理活性も維持さ
れることが明らかにされ、新規な機能性ハイブリッドポ
リペプチドであるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
ドとその用途が考案された。

【００４０】これにより、元来コラーゲン結合性を有さ
ない生理活性ポリペプチドは当然のことながら、コラー
ゲン結合性を有する生理活性ペプチドに対してもＦＮ由
来のペプチドに依存したコラーゲン結合性を付与するこ
とが可能になった。ここで「コラーゲン」とは、コラー
ゲン、あるいはゼラチンなどの熱変性コラーゲンを含む
意味で用いられる。したがってゼラチン結合性は、コラ
ーゲン結合性と同等の意味を有し、本明細書ではこれら
を単にコラーゲン結合性またはゼラチン結合性と表記す
ることもある。

【００４１】ＦＮ由来のペプチドのコラーゲン結合活性
は、ハイブリッドポリペプチドにおいても強固で非常に
安定である。そして、コラーゲンに結合後、結合を保持
したままかまたは徐放されて生理活性を示す新規のバイ
オマテリアルである生理活性ペプチド複合化コラーゲン
を完成することが可能となった。

【００４２】さらに、本発明のコラーゲン結合性生理活
性ポリペプチドは、そのコラーゲン結合性が血しょうＦ
Ｎにより競合阻害される性質を持ち、血しょう、血清、
血液への暴露、その添加又共存化ではコラーゲンからの
放出が起こり、血しょう、血清、血液の不足した即ち液
性因子（細胞増殖因子）の飢餓状態にある部位ではコラ
ーゲンに保持される特徴を持つのである。したがってコ
ラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの作製において、
コラーゲン結合性ペプチド部分としてＦＮ由来のコラー
ゲン結合性ペプチドを用いたことが本発明の完成の鍵に
なっている。

【００４３】現在、組換えＤＮＡ技術、遺伝子工学の技
術によれば、ＦＮ由来のどの部分のペプチドの遺伝子で
も生理活性ペプチドの遺伝子とのハイブリッド遺伝子
（融合遺伝子）を作製することが原理的には可能であ
る。しかしながら、コラーゲン結合性および生理活性を
維持したままハイブリッドポリペプチドを作製するに
は、適切なコラーゲン結合性ペプチド配列の選択が必要
である。この配列の選択も本発明の一つである。

【００４４】＜ＦＮ由来のペプチド（ＦＮＣＢＤ）＞す
なわち本発明を構成するＦＮ由来のペプチドとは、ＦＮ
由来のコラーゲン結合性ペプチドであり、ＦＮのプロテ
アーゼ分解、好ましくは限定分解または自然分解により
得られるものが好ましい。

【００４５】具体的に上記ＦＮ由来のペプチドは、コラ
ーゲンおよび／またはゼラチンに対して結合活性を有す
るＦＮ由来のコラーゲン結合性ドメインを構成するポリ
ペプチドを構成するアミノ酸配列と、全て相同であるか
または１個若しくは数個の付加がある配列か、或いはそ
れらの一部置換、欠失または付加体からなる配列である
ことが好ましい。

【００４６】上記プロテアーゼとしては、好ましくはト
リプシン、キモトリプシン、サーモリシン、プラスミ
ン、トロンビン、カテプシンＤ、またはペプシンなどが
挙げられ、これらのいずれか或いは２種以上組合わせが
挙げられる。ＦＮは、ヒトＦＮが好ましいが、他の動物
種のＦＮでもよい場合もある。

【００４７】したがって本明細書において、ＦＮのコラ
ーゲン結合性ドメインとは、具体的にＦＮのアミノ末端
から約２８kDa の位置から約７５kDa までの間に位置
し、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、プラ
スミン、トロンビン、カテプシンＤ、カテプシンＧ、ペ
プシン、ズブチリシン、キマーゼ、白血球エラスターゼ
のいずれかまたはそれらプロテアーゼの組み合わせのい
ずれかにより限定分解されたＦＮ由来のコラーゲン／ゼ
ラチン結合性ポリペプチドを意味する。

【００４８】具体的にはトリプシンの限定分解、または
ズブチリシンの限定分解で得られる約３０kDa のコラー
ゲンまたはゼラチン結合性ポリペプチド、あるいはキモ
トリプシンの限定分解、カテプシンＤとトロンビンの限
定分解、白血球エラスターゼの限定分解、サーモリシン
の限定分解、またはキマーゼの限定分解で得られるコラ
ーゲンまたはゼラチン結合性の約３９〜４５kDa のポリ
ペプチドまたはプラスミンとキモトリプシンの限定分解
で得られるヒトＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリ
ペプチドである。

【００４９】上記のようなコラーゲン結合性ＦＮペプチ
ドの別の具体例として、たとえばヒトＦＮのＡla²⁶⁰ か
らＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプチドを構成するアミノ酸配列
あるいは、該配列と相同であるかまたはその一部置換、
欠失、挿入または付加体である配列が挙げられる。別の
具体例として、本発明のヒトＦＮ由来のペプチドとし
て、（１）プロテアーゼによる限定分解または自然分解
によりヒトＦＮから得られ、かつコラーゲン／ゼラチン
に対して結合活性を有するヒトＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp
⁵⁹⁹ までのアミノ酸配列であるか、該配列と相同である
かまたはその一部置換、欠失、挿入または付加体である
配列、（２）ヒトＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポ
リペプチドを構成するアミノ酸配列であるか、該配列と
相同であるか、またはそれらの一部欠失体または一部置
換、欠失、挿入または付加体と同一の配列であり、かつ
カルボキシル末端がヒトＦＮ由来のアミノ酸であるプロ
テアーゼ認識配列を有するもの、（３）ヒトＦＮのＡla
²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプチドを構成するアミノ
酸配列の全てを含む配列であるか、該配列と相同である
か、またはそれらの一部置換、欠失、挿入または付加体
と同一の配列、（４）プロテアーゼによる限定分解また
は自然分解によりヒトＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ まで
のポリペプチドから得られ、かつコラーゲン／ゼラチン
に対して結合活性を有するポリペプチドを構成するアミ
ノ酸配列であるか、該配列と相同であるか、またはその
一部置換、欠失、挿入または付加体である配列が挙げら
れる。

【００５０】上記のようなＦＮペプチドをポリペプチド
パートナーとするハイブリッドポリペプチドにおいてゼ
ラチン結合性が維持される事は、例えば本願実施例で用
いたヒト・ＦＮのＡla²⁶⁰ からＴrp⁵⁹⁹ までのポリペプ
チドと生理活性ペプチドから成るハイブリッドポリペプ
チドを上述のプロテアーゼで限定分解して得られるポリ
ペプチドのゼラチン結合活性を調べることでも比較的簡
単に確認できる。またゼラチン結合性の程度は、高濃度
の塩たとえば２Ｍ ＮａＣｌ存在下での結合の維持、あ
るいは血漿ＦＮとの競合阻害実験で調べることができ
る。

【００５１】なお、プロテアーゼによる限定分解または
自然分解により得られ、かつゼラチンに対して結合活性
を有するＦＮ由来のポリペプチドを構成するアミノ酸配
列と相同であるアミノ酸配列との僅かな相違ではハイブ
リッドポリペプチドのコラーゲン結合活性を消失させな
い例外もある。

【００５２】ただし、ほとんどの場合、コラーゲン結合
性ドメインの全てまたは一部の配列を含んでいても、プ
ロテアーゼの分解部位又自然分解による部位を全く無視
して遺伝子工学的手法でのみ得られるようなＦＮ由来の
アミノ酸配列を生理活性ペプチドに融合させて作製した
ハイブリッドポリペプチドは、著しくコラーゲン結合活
性の低下を招く。例えば、特開昭６２−８９６９９号公
報に示されるようなヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からSer ⁵⁷⁷
までのアミノ酸配列からなるポリペプチド、ヒト・ＦＮ
のThr ³⁷⁹ からVal ⁴⁴⁵ までのアミノ酸配列からなるポ
リペプチドを遺伝子工学的に生理活性ペプチドに融合さ
せたハイブリッドペプチドでは、著しくコラーゲンまた
はゼラチン結合活性が損なわれる。また、特開昭６２−
８９６９９号の発明者らが発表した論文（Owens ら、EM
BO J、第5 巻、第2825〜2830頁（1986））で報告したヒ
ト・ＦＮのThr ³¹⁴ からMet ⁴⁴⁶ までのポリペプチド、
ヒト・ＦＮのThr ³¹⁴ からGly ⁵⁰⁷ までのポリペプチ
ド、ヒト・ＦＮのThr ³⁷⁴ からGly ⁵⁰⁷ までのポリペプ
チドなどや、ヒト・ＦＮの Thr³⁷⁴ からMet ⁴⁴⁶ までの
アミノ酸配列からなるポリペプチドを遺伝子工学的に生
理活性ペプチドに融合させたハイブリッドペプチドでも
著しくゼラチン結合活性が損なわれる。

【００５３】従って、遺伝子工学的手法によりハイブリ
ッドのコラーゲン結合性生理活性ペプチドを作製する場
合でも、ＦＮ由来のコラーゲン結合性ペプチドの配列の
選択には、プロテアーゼによる限定分解または自然分解
により得られるゼラチン結合性のペプチドと相同の配列
を選択して作製するのがよい。

【００５４】プロテアーゼによる切断部位は、例えばト
リプシンではアルギニンとリジンのＣ末端側、キモトリ
プシンではイソロイシン、ロイシン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンのＣ末
端側、サーモリシンではイソロイシン、ロイシン、バリ
ン、フェニルアラニン、メチオニンのＣ末端側、プラス
ミンではアルギニンとリジンのＣ末端側、トロンビンで
はアルギニンとグリシンの間、カテプシンＤではリジ
ン、チロシン、フェニルアラニンおよびアルギニンのＣ
末端側、ペプシンではロイシン、フェニルアラニン、チ
ロシン、メチオニンのＣ末端側、白血球エラスターゼで
はGly やAla またはVal など側鎖の短いアミノ酸が２〜
３個連続しているアミノ酸のＣ末端側、カテプシンＧは
ロイシン、チロシン、ファニルアラニンのＣ末端側、ズ
ブチリシンはアラニンのＣ末端側などである。

【００５５】ただし、実際のＦＮの分解において、特に
限定分解においては、高次構造に依存して切断され易い
箇所と切断され難い部位がある。つまり、プロテアーゼ
の限定分解で得られるコラーゲン／ゼラチン結合性のペ
プチドの種類は非常に限られている。従って、遺伝子工
学的作製でコラーゲン結合性ペプチド部分の区切りを選
択する場合にもプロテアーゼで切断され易い部位を区切
りとして選択するのである。

【００５６】具体的には、過去の論文（Ruoslahti ら、
J. Biol. Chem.、第254 巻、第6054-6059 頁 (1979) 、
Balianら、J Biol Chem.、第254 巻、第1429-32 頁、
（1979）、Ruoslahti ら、J. Biol. Chem.、第254 巻、
第6054-6059 頁 (1979) 、Hahnら、Proc. Natl. Acad.
Sci.、第76巻、第1160-1163 頁 (1979) 、Goldら、 Pro
c Natl Acad Sci U S A.、第76巻、第4803-7頁、（197
9）、Furie ら、J Biol Chem.第255 巻、第4391-4頁、
（1980）、Engvall ら、Coll. Relat. Res. 、第1巻、
第505-516 頁(1981)、McDonaldら、 J Biol Chem. 、第
256 巻、第5583-7頁（1981）、Vartio Tら J Biol Che
m. 第256 巻、第471-7 頁（1981）、De PetroGら Proc
Natl Acad Sci U S A.第78巻、第4965-9頁（1981）、Ru
oslahti ら、J Biol Chem.、第256 巻、7277-81 頁（19
81）、VartioらEur J Biochem.第123巻、第223-33頁、
（1982）、Petersenら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第80
巻、第137-141 頁 (1983) 、Skorstengaard ら、Eur.
J. Biochem.、第 140巻、第235-243 頁 (1984) 、Zardi
ら、Eur. J. Biochem.、第146 巻、第571-579 頁(198
5)、Skorstengaard ら、 Eur. J. Biochem. 、第161
巻、第 441-453頁 (1986) 等）からＦＮのプロテアーゼ
に切断されやすい部位及びそのゼラチン結合性を知る方
法または実際にＦＮをプロテアーゼで限定分解し、ゼラ
チンに結合するペプチドのアミノ末端、カルボキシル末
端またはアミノ酸配列を調べるなどでその部位を調べる
方法などがある。

【００５７】なお現在まで、ＦＮ由来のコラーゲン結合
性ペプチドを同定する研究が多くの研究者によってなさ
れたが、各研究者の報告で対立があり、いまだに不明な
点が多く残されている（Owens ら、EMBO J、第5 巻、第
2825〜2830頁（1986）、Inghamら、J. Biol. Chem 、第
264 巻、第16977 〜16980 頁（1989）、Litvinovich
ら、J. Mol. Biol、第217 巻、第563 〜575 頁（199
1）、Banyaiら、Eur. J. Biochem 、第193 巻、第801
〜806 頁（1990）、Skorstengaard ら、FEBS letters、
第343 巻、第47〜50頁（1994）) 。本発明者らによれ
ば、それらの報告の不一致は遺伝子工学的に産生された
ペプチドとプロテアーゼ処理で得られたペプチドを同様
に考えて議論しているので生じると判断される。

【００５８】遺伝子工学的にＦＮ由来のペプチドを産生
する際、不適切な部位で配列を区切り、さらに精製タッ
グを付加する事は、本来コラーゲン結合性を有する領域
でもその活性を消失または低下させる原因となってい
る。特にハイブリッドポリペプチド中においては、ＦＮ
由来のペプチド単体でコラーゲン／ゼラチン結合性を有
していてもその結合性が維持されない場合が多い。すな
わち、本来の高次構造をゆがめる原因になり、機能しな
くなったのである。

【００５９】本発明のコラーゲン結合性生理活性ペプチ
ドは、上述したような適切な部位で配列を区切り、かつ
精製タッグを付加しないＦＮのコラーゲン結合性ペプチ
ドを生理活性ペプチドに融合させて作製する。本発明の
コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは、大腸菌で生
産された組換えハイブリッドペプチドとして、ＦＮのコ
ラーゲン／ゼラチン結合性によりほとんどすべてがゼラ
チンに結合し、容易にアフィニティー精製可能であり、
生理活性ペプチドに由来する生理活性も良好に維持して
いる。

【００６０】なおコラーゲン結合性ペプチドの配列とし
ては、ＦＮに由来するもの以外では、マトリックスメタ
ロプロテアーゼであるコラゲナーゼ及びゼラチナーゼ並
びに細胞外マトリックスではフォンビルブランド因子、
デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカ
ン、オステオネクチン、ヴィトロネクチン、トロンボス
ポンジン等に由来する配列などが報告されている。しか
しながら、上述の細菌のコラゲナーゼ及びフォンビルブ
ランド因子由来のコラーゲン結合性ペプチドを選択した
試みも含め本発明と同等の機能を持ったハイブリッドポ
リペプチドは報告されていない。

【００６１】本発明では、ヒト・ＦＮ由来のペプチド
（ハイブリッドのための）に好適な例として、ヒト・Ｆ
ＮのCys ²⁷⁷ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列で構成さ
れるポリペプチド（特開昭62-89699号公報記載の配列）
の全てを含んでいなくてもコラーゲン結合性生理活性ポ
リペプチドのＦＮ由来のポリペプチドとして適切である
アミノ酸配列の例を挙げることができる。

【００６２】具体的には、プラスミン、キモトリプシン
とペプシンの限定分解で得られるヒト・ＦＮのAla ²⁶⁰
からLeu ³⁷⁶ までのアミノ酸配列で構成されるポリペプ
チド、プラスミン、キモトリプシンとペプシンの限定分
解で得られるヒト・ＦＮのAla ²⁶⁰ からLeu ⁴⁸³ までの
アミノ酸配列で構成されるポリペプチド、トリプシンの
限定分解で得られるヒト・ＦＮのAla ²⁶⁰ からArg ⁴⁸⁴
までのアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、プラス
ミン、キモトリプシンとペプシンの限定分解で得られる
ヒト・ＦＮのAla ³⁷⁷ からLeu ⁴⁸³ までのアミノ酸配列
で構成されるポリペプチド、プラスミン、キモトリプシ
ンとペプシンとの限定分解で得られるヒト・ＦＮのVal
³⁷⁷ からTrp ⁵⁹⁹ までのアミノ酸配列で構成されるポリ
ペプチド、プラスミン、キモトリプシンとペプシンとの
限定分解で得られるヒト・ＦＮのLeu ⁴⁸³ からTrp ⁵⁹⁹
までのアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、トリプ
シンとキモトリプシンとの限定分解で得られるヒト・Ｆ
ＮのArg ⁴⁸⁴ からTrp ⁵⁹⁹ までのポリペプチドのアミノ
酸配列である。

【００６３】またヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からSer ⁵⁷⁷ ま
でのアミノ酸配列で構成されるポリペプチド配列の全て
を含んでいてコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの
ＦＮ由来のポリペプチドとして適切であるポリペプチド
配列の例を挙げることができ、具体的にプラスミンとキ
モトリプシンの限定分解で得られるヒト・ＦＮのAla
²⁶⁰ からTrp ⁵⁹⁹ までのポリペプチド、ズブチリシンと
キモトリプシンの限定分解で得られるヒト・ＦＮの Val
²⁶² からTrp ⁵⁹⁹ までのポリペプチドのアミノ酸配列が
挙げられる。

【００６４】なおヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からSer ⁵⁷⁷ ま
でのアミノ酸配列で構成されるポリペプチド配列の全て
を含んでいても、コラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
ドのＦＮ由来のポリペプチドとしては、不適切なポリペ
プチドの例は多くあり、その例を挙げると枚挙にいとま
がないが、例えば ヒト・ＦＮのAsn ²²⁰ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのArg ²²¹ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのGly ²²² からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのAsn ²²³ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのLeu ²²⁴ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのLeu ²²⁵ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのGln ²²⁶ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²²⁷ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのIle ²²⁸ からSer ⁵⁷⁷ までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からCys ¹²⁰¹までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からThr ¹²⁰²までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からPhe ¹²⁰³までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からAsp ¹²⁰⁴までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からAsn ¹²⁰⁵までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からLeu ¹²⁰⁶までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からSer ¹²⁰⁷までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からPro ¹²⁰⁸までのアミノ酸配列 ヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からGly ¹²⁰⁹までのアミノ酸配列 などで構成されるポリペプチドが挙げられる。

【００６５】以上からヒト・ＦＮのCys ²⁷⁷ からSer
⁵⁷⁷ までのポリペプチド（特開昭62-89699号公報記載の
配列）のアミノ酸配列の全てを含むか、含まないかは本
発明のコラーゲン結合性生理活性ペプチドのＦＮ由来の
ペプチドのアミノ酸配列の選択には重要でない。ＦＮ由
来のペプチドとして適切な場合、不適切な場合の何れに
おいてもThr ³⁷⁹ からVal ⁴⁴⁵ のアミノ酸配列を含んで
いるため、本発明のコラーゲン結合性生理活性ペプチド
のＦＮ由来のペプチドとしての充分条件ではない。ま
た、特開昭62-89699号公報ではコラーゲン結合能を有す
る連続部分としてThr ³⁷⁹ からVal ⁴⁴⁵ を記載している
が、その後の他者の論文（Skorstengaard ら、FEBS let
ters、第343 巻、第47〜50頁（1994）) でThr ³⁷⁹ から
Val ⁴⁴⁵ を含んでいるThe ³⁷⁴ からAla ⁴⁷⁹ までのアミ
ノ酸配列で構成されるポリペプチドは単独でもコラーゲ
ン結合能が無かったと報告している。

【００６６】＜生理活性ペプチド＞本明細書で意味する
生理活性ペプチドとは、種々の生理活性を有するペプチ
ド、ポリペプチド及びタンパク質の総称であり、例えば
サイトカイン、細胞成長因子が挙げられる。例えば、繊
維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、トランスフォ
ーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリー、上皮増
殖因子（ＥＧＦ）ファミリー、血小板由来増殖因子（Ｐ
ＤＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増
殖因子（ＮＧＦ）ファミリー、血管内皮細胞増殖因子
（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の細胞増殖
因子類及び骨形成因子類（ＢＭＰ類）等の細胞分化因子
類を含む細胞成長因子並びにインターフェロン（ＩＦ
Ｎ）類、インターロイキン（ＩＬ）類、コロニー刺激因
子（ＣＳＦ）類、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（Ｔ
ＮＦ）等を含むサイトカイン類、若しくはインシュリ
ン、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）等の各種ホルモン
類またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）類
等のプロテアーゼ等の酵素類を挙げることができる。た
だし、通常、遺伝子工学の分野で用いられる融合パート
ナーや精製タッグとして汎用されるペプチドであるマル
トース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタッグまた
はβ−ガラクトシダーゼなどは、本明細書では生理活性
ペプチドに含めない。

【００６７】また、本明細書が意味する生理活性または
生理活性ペプチドの活性とは上述した生理活性ペプチド
由来の活性の一部または全てを意味し、例えばサイトカ
インまたは細胞成長因子であれば増殖活性、分化活性、
遊走活性または物質生産促進などであって、単なる細
胞、またはレセプターへの結合ではない。ＦＮ由来の活
性は本明細書では生理活性に含めない。

【００６８】また、前述したような融合パートナーある
いは精製タッグの機能、例えば特定の物質に対する結合
活性など、具体的には、チオレドキシンの金属キレート
へのアフィニティー、プロテインＡのＩｇＧへの結合
性、クロラムフェニコールアセチルトランスフェレース
のクロラムフェニコールへの結合性、lac リプレッサー
の lacオペレーターへの結合性、ガラクトース結合タン
パク質のガラクトースへの結合性、ＭＢＰではアミロー
ス結合性、ＧＳＴではグルタチオン結合性、ヒスチジン
タッグではニッケル結合性、そしてβ−ガラクトシダー
ゼの酵素活性の一部または全てに対しても本明細書にお
いては生理活性に含めない。

【００６９】これらの融合パートナーや精製タッグの結
合性または酵素活性は、以前からさまざまなハイブリッ
ドペプチドでその機能が維持されること、またそれら融
合パートナーや精製タッグと融合されたポリペプチドの
活性も損われにくい事は周知の事実であり特例といえ
る。

【００７０】＜ハイブリッドポリペプチド＞本発明にお
いてはフィブロネクチンコラーゲン結合性ドメイン（Ｆ
ＮＣＢＤ）と生理活性ペプチドとは、遺伝子工学的手法
により連結されており、生理活性ペプチドは、ＦＮＣＢ
Ｄのカルボキシル末端側に連結されていることが望まし
い。本発明のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは
水溶性である。またバクテリア好ましくはEsherichia c
oli で工業的に生産することができる。したがって生理
活性ペプチドが該フィブロネクチン由来のペプチドのカ
ルボキシル末端に遺伝子工学的手法により連結され、バ
クテリア好ましくはEsherichia coli で産生されること
が望ましい。また酵母、昆虫細胞、動物細胞で産生する
ことも可能である。

【００７１】例えば、ＦＮのコラーゲン結合性ドメイン
のカルボキシル末端側に生理活性ペプチドを連結させ、
生理活性ペプチドのアミノ末端側にプロテアーゼ（例え
ばヒトの生体中に存在する）により切断され得る任意の
アミノ酸配列を挿入し、余分な配列を付加せずに生理活
性ペプチドを遊離させることが可能である。詳しく説明
すると、多くのプロテアーゼは認識配列のカルボキシル
末端を切断するので、生理活性ペプチドのアミノ末端に
プロテアーゼ認識配列を付加すると、プロテアーゼによ
る切断後は生理活性ペプチドのアミノ末端には余分なア
ミノ酸配列が残らないのである。このプロテアーゼの認
識配列は新しく挿入するだけでなく、ＦＮのコラーゲン
結合性ドメインのＣ末端側がプロテアーゼ認識配列及び
切断部位でもよい。従って、直接このカルボキシル末端
に生理活性ペプチドを連結すれば全く人工的な配列の挿
入を含めないことも可能である。そして、この部位にお
ける切断後は、ＦＮのコラーゲン結合性ドメイン及び生
理活性ペプチドの両者ともに余分なアミノ酸配列は残存
しない。マトリクラインおよびジャクスタクライン活性
という固相からレセプターに結合して、細胞に生理活性
を及ぼす様式が可能な場合は、ハイブリッドポリペプチ
ドのままでもレセプターに結合し生理活性を示すことが
可能かもしれない。一方、生理活性ペプチドがＦＮのコ
ラーゲン結合性ドメインから切断され、液相に遊離する
必要がある場合は上記方法は重要である。

【００７２】上記のようにＦＮＣＢＤと生理活性ペプチ
ドとが連結された本発明のコラーゲン結合性生理活性ポ
リペプチドは、コラーゲンに対する結合活性及び生理活
性の両活性が維持されていることから、生理活性ペプチ
ドをコラーゲンマトリックス中に安定に保持させること
が可能となり、生理活性を持続的に示すことができる。

【００７３】上記において、生理活性ペプチドと該フィ
ブロネクチン由来のペプチドの連結部位にスペーサーと
してアミノ酸またはペプチドが挿入されていてもよい。
この場合、該スペーサーと該スペーサー及びその隣接配
列とのいずれかがプロテアーゼ認識配列を含むものが好
ましい。またプロテアーゼ認識配列はエンテロキナーゼ
の認識配列であることが好ましい。

【００７４】エンテロキナーゼ認識配列は、スペーサー
としてＦＮＣＢＤとｂＦＧＦ又はＥＧＦとの間の距離の
調整やエンテロキナーゼによりＦＮＣＢＤからｂＦＧＦ
又はＥＧＦが遊離するための役割を果たす。エンテロキ
ナーゼは高等動物の十二指腸粘膜、膵臓に存在するプロ
テアーゼである。従って、エンテロキナーゼ認識配列は
十二指腸粘膜、膵臓でエンテロキナーゼにより認識、切
断され、ｂＦＧＦ又はＥＧＦが遊離される。また、エン
テロキナーゼはＤＤＤＤＫという非常に特異的配列を認
識してＫ(Lys) のＣ末端側を切断する酵素であり、コラ
ーゲン結合性生理活性ペプチドの生理活性を示すメカニ
ズムを研究するために必要な配列である。今後、コラー
ゲン結合性生理活性ペプチドを産業上利用していくため
に必要不可欠である。

【００７５】本発明のハイブリッドポリペプチドのコラ
ーゲン結合活性またはコラーゲン結合性は、ＦＮ由来の
ペプチドに依存したコラーゲンに対する結合性であり、
生理活性ペプチドに依存したコラーゲンへの結合ではな
い。コラーゲン結合活性がＦＮに由来するかまたは生理
活性ペプチドに由来するのかは天然のＦＮまたは生理活
性ペプチドを用いた競合阻害実験で確認可能である。

【００７６】本明細書で意味するコラーゲンまたはコラ
ーゲン由来のポリペプチドは、天然コラーゲン、未成熟
コラーゲン、アテロコラーゲン、またはゼラチン或いは
それらを構成するポリペプチドである。

【００７７】本発明のハイブリッドポリペプチドの一用
途として、上記コラーゲン結合性生理活性ポリペプチド
を含む生理活性ポリペプチドの局所維持剤、徐放剤、ま
たは生理活性付与剤が提供される。またコラーゲンの分
解によるかまたは生理活性ペプチドとＦＮ由来のペプチ
ドとの連結部位またはその近傍におけるプロテアーゼに
よる切断によって生理活性ペプチドが徐放され、生理活
性がコントロールされたバイオマテリアルが提供され
る。上記バイオマテリアルを用いて細胞、組織、臓器
に、増殖、分化、再生または物質産生促進の生理活性を
与える方法を提供することができる。

【００７８】従って、例えば外傷や外科手術後の創傷治
癒効果または慢性潰瘍、難治性潰瘍の治癒促進を持続的
かつ最大限に発揮させるためにｂＦＧＦ及びＥＧＦなど
の細胞成長因子の徐放性や局所保持を狙ったコラーゲン
結合性細胞成長因子及び細胞成長因子複合化コラーゲン
マトリックスが提供される。生体組織は多くの割合でコ
ラーゲンから構成されていて、あらゆる部位でコラーゲ
ンは存在しているため、生理活性ポリペプチドにコラー
ゲン結合性が備わっていれば、投与した部位またはその
近傍のコラーゲンに結合し、局所濃度を高く維持し、有
効性が高まる。それと同時に他部位へ拡散して生じる副
作用を防ぐことになる。

【００７９】また本発明では、上記コラーゲン結合性生
理活性ポリペプチド（ハイブリッドポリペプチド）を用
いた細胞増殖方法が提供される。すなわち本発明の生理
活性ペプチドが細胞増殖因子であるハイブリッドポリペ
プチドは、そのコラーゲン／ゼラチン結合性を利用して
コラーゲン／ゼラチンマトリックスに固定することがで
き、細胞増殖因子は灌流される培養液で流出しないた
め、容易に細胞増殖を行うことができる。

【００８０】本発明は、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを用いた創
傷治癒という目的に限られず、生理活性を持つ多くのペ
プチドに適用可能である。即ち、本発明により、さまざ
まな生理活性ペプチドの生理活性が維持され、かつコラ
ーゲンに対する結合活性が付与されることで生理活性ペ
プチドの徐放性や局所保持を狙ったコラーゲン結合性生
理活性ポリペプチドが提供される。

【００８１】また上記コラーゲン結合性生理活性ポリペ
プチドをコードする遺伝子、および該遺伝子を含有する
組換えベクター、該遺伝子を含有する形質転換体、また
は該遺伝子を含有するバクテリア好ましくはEscherichi
a coli（大腸菌）も提供される。あるいはコラーゲン結
合性生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子を含有す
る組換えベクターを含む形質転換体、該ベクターを含む
バクテリア好ましくはEscherichia coliも提供される。
さらに、該コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドをコ
ードする遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ベクター等のウイルスベクターまたはリポソー
ム法等を用いたベクターに組み込むことで遺伝子治療用
ベクターが提供され、さらに該ベクターが細胞へ導入さ
れることで該ポリペプチドまたは該遺伝子を含む細胞医
薬が提供される。

【００８２】該ポリペプチドをコラーゲンと複合化させ
ることで生理活性で機能修飾された生理活性ペプチド複
合化コラーゲンマトリックスが提供され、医療分野で利
用される新規な組織再生のバイオマテリアルとして有用
である。すなわち本発明は、人工組織（血管、神経、骨
など）や三次元構造を有する人工器官（耳、鼻、指、皮
膚など）や人工臓器（十二指腸などの腸管、胃、心臓、
肝臓、膵臓、腎臓など）を構築させるための足場と生理
活性を兼ね備えた生理活性ペプチド複合化コラーゲンか
らなるバイオマテリアルを提供する。コラーゲン生理活
性ペプチド複合化コラーゲンマトリックスの概念図を図
２に示す。

【００８３】以下に本発明の実施態様例について、より
詳細に説明する。ヒトＦＮｃＤＮＡ及びタンパク質の一
次構造は、各々 EMBL データバンク（EMBL DATA BANK )
及びThe EMBO Journal、第４巻、第７号、1755-1759 頁
(1985)に記載されている。

【００８４】まず、ヒトＦＮをプロテアーゼ（プラスミ
ンとキモトリプシン）で限定分解して得られるコラーゲ
ン／ゼラチン結合性ドメインのアミノ酸配列に相当する
配列をクローニングした。ヒトの細胞から抽出されたｍ
ＲＮＡを用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡか
ら、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction : Saiki
ら、Science 、第２３０巻、１３５０〜１３５４頁（１
９８５））によりヒトＦＮのコラーゲン結合性ドメイン
（ＦＮＣＢＤ）に対応するｃＤＮＡ部分が増幅される。
この際、ＰＣＲに用いられるセンスプライマーには５'
末端に制限酵素認識配列と開始コドン配列が、またアン
チセンスプライマーには５' 末端に制限酵素認識配列と
終始コドンが付加されている。

【００８５】そして、ＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ断片がクロ
ーニングベクターpBlueScript SKに挿入され、プラスミ
ドpBS(ＦＮＣＢＤ) が構築される。塩基配列確認後、こ
のｃＤＮＡ断片が切り出され発現ベクター pTYB1に組み
込まれてプラスミドpTYB1(ＦＮＣＢＤ) が構築される。
pTYB1(ＦＮＣＢＤ) は、ヒトＦＮのAla ²⁶⁰ −Trp ⁵⁹⁹
（３４０アミノ酸残基）を発現するプラスミドであり、
大腸菌に導入されることによりコラーゲン結合性ポリペ
プチドが調製される。

【００８６】本発明で必要とされるＦＮＣＢＤのｃＤＮ
Ａとしては、プラスミドpBS(ＦＮＣＢＤ) 由来のｃＤＮ
Ａ断片が用いられるが、ＰＣＲプライマーの設計によ
り、ｃＤＮＡ断片の５' 末端には開始コドン配列が付加
されており、ＦＮＣＢＤ翻訳領域のＣ末端に付加された
終止コドン直前にクローニングサイト、例えばＸｈｏＩ
の認識配列が導入されている。これにより、ＦＮＣＢＤ
のｃＤＮＡと生理活性ペプチドのｃＤＮＡを連結させる
ことが可能である。

【００８７】本発明のポリペプチドは、ＦＮＣＢＤのｃ
ＤＮＡと生理活性ペプチドのｃＤＮＡを連結し、遺伝子
工学的に発現させて調製される。本発明による機能性ポ
リペプチドは、例えば、配列表配列番号１で表されるヒ
トＦＮをプロテアーゼ（プラスミンとキモトリプシン）
で限定分解したときに得られるAla ²⁶⁰ −Trp ⁵⁹⁹ に相
当する３４０アミノ酸残基のポリペプチドを、配列表配
列番号２または配列番号３で表されるヒトｂＦＧＦまた
はＥＧＦに各々結合させた人工の機能性ポリペプチドで
ある。即ち、該ポリペプチドはＦＮＣＢＤのｃＤＮＡに
ｂＦＧＦまたはＥＧＦのｃＤＮＡが連結され、遺伝子工
学的に調製される。

【００８８】配列表配列番号１のアミノ酸番号１はヒト
ＦＮＣＢＤを遺伝子工学的に発現させるための開始コド
ンに対応するMet 、アミノ酸番号２〜３４１はヒトＦＮ
ＣＢＤのアミノ酸配列、アミノ酸番号３４２〜３４３は
生理活性ペプチドのｃＤＮＡと連結するためのＸｈｏＩ
認識配列由来のアミノ酸Leu 及びGlu である。但し、ハ
イブリッドポリペプチドではＸｈｏＩ認識配列とＳａｌ
Ｉ認識配列の連結によりGlu は除かれる。

【００８９】配列表配列番号２のアミノ酸番号1 はＦＮ
ＣＢＤのｃＤＮＡとの連結するためのＳａｌＩ認識配列
由来のAsp 、アミノ酸番号１〜５はエンテロキナーゼの
認識配列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ;DDDDK) 、アミノ酸番
号６〜１５９はヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列である。

【００９０】配列表配列番号３のアミノ酸番号１はＦＮ
ＣＢＤのｃＤＮＡと連結するためのＳａｌＩ認識配列由
来のAsp 、アミノ酸番号１〜５はエンテロキナーゼの認
識配列（DDDDK)、アミノ酸番号６〜５８はヒトＥＧＦの
アミノ酸配列である。

【００９１】なお、ヒトＦＮのアミノ酸に付された肩数
字はEMBLデータバンク（EMBL DATABANK )中の成熟型ヒ
トＦＮのＮ末端から数えたアミノ酸残基数を示す。ま
た、配列表配列番号１で表されるヒトＦＮのAla ²⁶⁰ −
Trp ⁵⁹⁹ に相当する３４０アミノ酸残基のポリペプチド
は、EMBL DATA BANK中のアミノ酸配列と２アミノ酸残基
異なり、人工的変異ではない。

【００９２】ヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡ及びタンパク質の
一次構造は、Kurokawaら、(FEBS Letter、第２１３巻、
第１号、１８９ー１９４頁（１９８７））に記載されて
いる。また、ヒトＥＧＦのｃＤＮＡ及びタンパク質の一
次構造は、Bellら（NucleicAcids Reserch 、第１４
巻、第２１号、８４２７−８４４６頁（１９８６））に
記載されている。

【００９３】本発明では、ヒトのｍＲＮＡを用いて調製
したｃＤＮＡから、ＰＣＲ法によりヒトｂＦＧＦ及びＥ
ＧＦのｃＤＮＡが増幅される。それぞれのＰＣＲには
５' 末端に制限酵素認識配列とプロテアーゼ認識配列を
コードする塩基配列が付加されたセンスプライマーと
５' 末端に制限酵素認識配列が付加されたアンチセンス
プライマーを用いた。次に、これらｃＤＮＡ断片をｐBl
uescripSK に挿入して、pBS(ＦＧＦ) ベクター及びpBS
(ＥＧＦ) ベクターが作成される。

【００９４】前記したヒトＦＮＣＢＤのc ＤＮＡをプラ
スミドpBS(ＦＧＦ) あるいはpBS(ＥＧＦ) のｂＦＧＦあ
るいはＥＧＦの5 ′末端制限酵素認識配列に結合し、ヒ
トＦＮＣＢＤのＣ末端にヒトｂＦＧＦまたはＥＧＦの各
々が連結しているｃＤＮＡを有するプラスミドpBS(ＦＮ
ＣＢＤ−ＦＧＦ) あるいはpBS(ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ)が
得られる。これらのプラスミドから切り出されたハイブ
リッド遺伝子断片を発現ベクターpTYB1 に挿入し、配列
表配列番号４または配列番号５で表されるポリペプチド
を発現する組換体プラスミドpTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＦＧ
Ｆ) またはpTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ) が得られる。

【００９５】ＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとｂＦＧＦまたはＥ
ＧＦのｃＤＮＡとの連結部位にはＰＣＲプライマー由来
の塩基配列が挿入されており、エンテロキナーゼ認識配
列などをスペーサーペプチドとして発現させることによ
り、ＦＮＣＢＤに対するｂＦＧＦまたはＥＧＦの分子間
距離の調整および／またはプロテアーゼ認識配列の挿入
が可能である。スペーサー中のプロテアーゼ認識配列の
有無、種類、ペプチドの配列、長さは目的に応じて選択
する。

【００９６】配列表配列番号４はヒトＦＮＣＢＤとヒト
ｂＦＧＦのハイブリッドポリペプチドであり、アミノ酸
番号１は開始コドンに対応するMet 、アミノ酸番号２〜
３４１はヒトＦＮＣＢＤのアミノ酸配列、アミノ酸番号
３４２〜３４３はヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとｂＦＧＦ
のｃＤＮＡとの連結（ＸｈｏＩ認識配列とＳａｌＩ認識
配列のライゲーション）により生じる塩基配列がコード
するLeu 及びAsp 、アミノ酸番号３４３〜３４７はエン
テロキナーゼの認識配列（DDDDK)、アミノ酸番号３４８
〜５０１はヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列である。

【００９７】配列表配列番号５はヒトＦＮＣＢＤとヒト
ＥＧＦのハイブリッドポリペプチドであり、アミノ酸番
号1 は開始コドンに対応するMet 、アミノ酸番号2 〜34
1 はヒトＦＮＣＢＤのアミノ酸配列、アミノ酸番号３４
２〜３４３はヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとＥＧＦのｃＤ
ＮＡとの連結（ＸｈｏＩとＳａｌＩサイトのライゲーシ
ョン）により生じる塩基配列がコードするLeu 及びAsp
、アミノ酸番号３４３〜３４７はエンテロキナーゼ認
識配列（DDDDK)、アミノ酸番号３４８〜４００はヒトＥ
ＧＦのアミノ酸配列である。

【００９８】上記の様に構築されたプラスミドpTYB1(Ｆ
ＮＣＢＤ) 、pTYB1(ＦＮＣＢＤ- ＦＧＦ) 及びpTYB1(Ｆ
ＮＣＢＤ−ＥＧＦ) は各々大腸菌に導入され、適当な条
件下で培養されることにより、目的ポリペプチドが大腸
菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティン
グが用いられる。即ち、組換え大腸菌の全菌体タンパク
質がSDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離さ
れ、ニトロセルロース膜転写後、ＦＮＣＢＤ、ｂＦＧＦ
及びＥＧＦを各々認識するモノクローナル抗体で目的ポ
リペプチドのバンドが検出される。

【００９９】本発明のポリペプチドは、例えば次のよう
に調製される。プラスミドが導入された組換え大腸菌は
SBブロス等の培地で培養され、ＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−ガラクトシド）が添加される。これによって
導入された遺伝子の発現が誘導され、さらに培養してか
ら菌体が回収される。集められた菌体は超音波処理によ
って破砕される。そして、菌体破砕液から遠心分離して
回収される沈殿に目的ポリペプチドは封入体として得ら
れ、８Ｍ尿素により変性可溶化される。

【０１００】次いで、尿素濃度を段階的に低下させなが
ら透析して、目的タンパク質が再活性化される（リフォ
ールディング処理）。以上のように調製される40kDa 、
57kDa 及び46kDa のポリペプチドは各々、ＦＮＣＢＤ
（図１のＡ）、ＦＮＣＢＤとｂＦＧＦとのハイブリッド
ポリペプチド（ＦＮＣＢＤ- ＦＧＦ、図１のＢ）及びＦ
ＮＣＢＤとＥＧＦとのハイブリッドポリペプチド（ＦＮ
ＣＢＤ- ＥＧＦ、図１のＣ）であり、Ｂ及びＣがコラー
ゲン結合性生理活性ポリペプチドの具体例である。

【０１０１】上記のように調整されたポリペプチドのコ
ラーゲン結合活性は２種類の方法により調べられる。一
つは、バッチ法でゼラチン（ゼラチンセファロース４B
、アマシャムファルマシアバイオテク) に対する結合
活性を調べる方法である。1.5ｍｌのマイクロチューブ
に上記ポリペプチドとゼラチンセファロース４B 混濁液
添加後、４℃１時間回転器で混合され、遠心後、その上
清が回収される。沈殿画分は１Ｍ塩化ナトリウム溶液で
2 度洗浄後、その上清が回収される。同様の操作で１Ｍ
尿素、２Ｍ尿素、４Ｍ尿素で順次、ゼラチンに結合した
ポリペプチドの溶出が試みられる。最後に、ドデシル硫
酸ナトリウム(SDS) バッファー中で煮沸されて上清が回
収される。各々回収された上清のSDS-ポリアクリルアミ
ド電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) において、バンドの有
無からポリペプチドのゼラチンへの結合及びゼラチンか
らの溶出が調べられる。

【０１０２】別の方法では、異なる状態にあるコラーゲ
ン、即ちゼラチン、天然コラーゲン及びアテロコラーゲ
ン対するＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ- ＦＧＦ及びＦＮＣＢ
Ｄ−ＥＧＦの結合活性が調べられる。まず、ゼラチン、
天然コラーゲン及びアテロコラーゲンが各々９６ウェル
プレートにコートされた後、血清アルブミンでブロッキ
ングされ、ＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ及びＦＮＣ
ＢＤ−ＥＧＦ各々の分注後、３７℃で約１時間インキュ
ベートされる。洗浄後、抗ＦＮＣＢＤモノクローナル抗
体の添加、洗浄、標識2 次抗体反応、洗浄を経て、基質
の添加による呈色の吸光度測定からコラーゲン結合活性
が調べられる。

【０１０３】各々のコラーゲン結合性生理活性ポリペプ
チドの細胞増殖活性は、ミトコンドリア呼吸鎖の脱水素
酵素活性を測定する事で生細胞数に直接相関するＸＴＴ
法(Roehmら、Journal Immunological Methods 、第142
巻、257 〜265 頁（1991））またはＷＳＴ-1法(Liuら、
Nature Medicine 、第１巻、第267 〜271 （1995））に
より調べられる。即ち、各々の該ポリペプチドが添加さ
れた培地中で、マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞またはヒ
ト繊維芽細胞を4 日間培養後、ＸＴＴまたはＷＳＴ-1試
薬が添加され、更に３−６時間培養される。その後、培
地の吸光度を特定の波長で測定することで、該ポリペプ
チドの細胞増殖活性が測定可能である。

【０１０４】ＸＴＴ法またはＷＳＴ-1法で上記と同様
に、コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドが複合化さ
れたコラーゲンマトリックスの細胞増殖活性が調べられ
る。コラーゲンコートされた細胞培養器に異なる量の該
ポリペプチド溶液が添加され、37℃に静置される。1 時
間後溶液を除いてリン酸緩衝液で洗浄後、各々の生理活
性ペプチドが複合化されたコーラゲンマトリックスが形
成される。このマトリックス上にＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞、ＮＲＫ４９Ｆラット繊維芽細胞またはヒト繊維芽細
胞が４日間培養される。さらにＸＴＴまたはＷＳＴ-1試
薬が添加されて３−６時間培養される。その後、特定の
波長の吸光度が測定されることで、生理活性ペプチド複
合化コラーゲンマトリックスの細胞増殖活性が測定可能
である。

【０１０５】

【実施例】以下、本発明の実現性を実施例により具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 （実施例１）ヒトＦＮＣＢＤとヒトｂＦＧＦとのハイブ
リッドポリペプチド、及びヒトＦＮＣＢＤとＥＧＦとの
ハイブリッドポリペプチドの調製 （ａ）ヒトＦＮＣＢＤをコードするｃＤＮＡのクローニ
ング ヒト腎臓の細胞から抽出したｍＲＮＡをテンプレートと
してプライマー（２）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、プ
ライマー（１）及び（２）の１組のプライマーを用い
て、プラスミンとキモトリプシンで限定分解したときの
配列に相当するヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅
させた（ＲＴ−ＰＣＲ）。

【０１０６】配列表配列番号６で表されるプライマー
（１）の塩基番号1 〜２は、ＰＣＲ後のＫｐｎＩ消化に
備えた隣接付加配列、塩基番号３〜８は、クローニング
用のＫｐｎＩ認識配列、塩基番号７〜12は、ＮｃｏＩ認
識配列、塩基番号13〜14は、発現フレーム合わせの配
列、塩基番号15〜20は、ＮｄｅＩ認識配列、塩基番号18
〜20は、ヒトＦＮＣＢＤを発現させるための開始コドン
配列、塩基番号21〜49は、ヒトＦＮＣＢＤの塩基配列で
ある。

【０１０７】また、配列表配列番号７で表されるプライ
マー（２）の塩基番号１〜２は、ＰＣＲ後のＢａｍＨＩ
消化に備えた隣接付加配列、塩基番号３〜８は、クロー
ニング用のＢａｍＨＩ認識配列、塩基番号９〜11は、終
止コドンのアンチセンス配列、塩基番号12〜17は、ｂＦ
ＧＦまたはＥＧＦなどの生理活性ペプチドのｃＤＮＡと
連結させるためのＸｈｏＩ認識配列、塩基番号18〜46
は、ヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡのアンチセンス配列であ
る。

【０１０８】ＲＴ−ＰＣＲは、RNA LAPCR Kit (AMV) Ve
r.1.1 （宝酒造）を用いて、まずトータルＲＮＡ 0.8μ
ｇを２０μｌの反応液量で６０℃で２０分間逆転写し、
さらに９９℃で５分間加温した。得られたｃＤＮＡをテ
ンプレートとしたＰＣＲ反応は、１００μｌの反応液量
で、９４℃で１分間保持した後、９４度で３０秒間→６
３度で１分間→７２度で２分間の温度サイクルを１２回
繰り返した。反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動
で解析した結果、約１kbp のＤＮＡ断片が認められた。
これは、ヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡに相当するサイズで
あった。

【０１０９】この増幅されたｃＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及
びＢａｍＨＩで消化後、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化
したクローニングベクターpBluescriptSK に、２５℃で
３分間、ライゲーションした（宝酒造製ライゲーション
キットVer.２を使用）。

【０１１０】塩基配列解析の結果、配列表配列番号８で
表されるｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド得られ、こ
れをｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ) と命名した。配列表配列番号
８の塩基番号１〜６は、クローニング用のＫｐｎＩ認識
配列、塩基番号５〜10は、ＮｃｏＩ認識配列、塩基番号
11〜12は、フレーム合わせの配列、塩基番号13〜18は、
ＮｄｅＩ認識配列、塩基番号16〜18は、ヒトＦＮＣＢＤ
を発現させるための開始コドン配列、塩基番号19〜1038
は、ヒトＦＮＣＢＤのｃＤＮＡの塩基配列、塩基番号10
39〜1044は、ｂＦＧＦまたはＥＧＦなどの生理活性ペプ
チドのｃＤＮＡと連結させるためのＸｈｏＩ認識配列、
塩基番号1045〜1047は、終止コドン、塩基番号1048〜10
53は、クローニング用のＢａｍＨＩ認識配列である。な
おＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬデータバンク
（EMBL DATA BANK )に登録された配列と５塩基異なって
いたが、この相違はＰＣＲによる点変異に起因しないこ
とは確認された。

【０１１１】（ｂ）ヒトｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ
のクローニング ヒト腎臓の細胞より抽出したｍＲＮＡをテンプレートと
してプライマー（４）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、プ
ライマー（３）及び（４）の１組のプライマーを用いて
ヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。配列表配
列番号９で表されるプライマー（３）の塩基番号１〜２
はＰＣＲ後のＳａｌＩ消化に備えた隣接付加配列、塩基
番号３〜８はクローニング用及びＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ
との連結用ＳａｌＩ認識配列、塩基番号６〜20はエンテ
ロキナーゼの認識配列（DDDDK)をコードした塩基配列、
塩基番号21〜40はヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡの塩基配列で
ある。

【０１１２】また配列表配列番号１０で表されるプライ
マー（４）の塩基番号１は、ＰＣＲ後のＥｃｏＲＩ消化
に備えた隣接付加配列、塩基番号２〜７は、クローニン
グ用のＥｃｏＲＩ認識配列、塩基番号８〜10は、終止コ
ドンのアンチセンス配列、塩基番号11〜31は、ヒトｂＦ
ＧＦのｃＤＮＡのアンチセンス配列である。

【０１１３】ＲＴ−ＰＣＲはRNA LAPCR Kit (AMV) Ver.
1.1 （宝酒造）を用い、まずテンプレートのトータルＲ
ＮＡ０．８μｇを反応液量２０μｌで、６０℃で２０分
間逆転写し、さらに９９℃で５分間加熱した。ＰＣＲ反
応は、ｃＤＮＡを加えた１００μｌの反応液で、９４℃
で２分間保持した後、９４℃で３０秒間→６５℃で４分
間の温度サイクルを３０回行った。反応液の1/10量をア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、約４５０ｂｐの
ＤＮＡ断片が認められた。これはヒトｂＦＧＦに相当す
るサイズであった。

【０１１４】このｃＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化後、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化したpBlues
criptSK にライゲーションした。そして配列表配列番号
１１で表されるｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドを得
てｐＢＳ（ＦＧＦ) と命名した。配列表配列番号１１の
塩基番号１〜６は、クローニング用及びＦＮＣＢＤのｃ
ＤＮＡとの連結用ＳａｌＩ認識配列、塩基番号４〜18は
エンテロキナーゼの認識配列（DDDDK)をコードする塩基
配列、塩基番号19〜480 はヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡの塩
基配列、塩基番号481 〜483 は終止コドン、塩基番号48
4 〜489 はクローニング用のＥｃｏＲＩ認識配列であ
る。なお、得られたヒトｂＦＧＦの塩基配列はＥＭＢＬ
データバンク（EMBL DATABANK )に登録された配列と１
塩基異なっていたが、この相違はＰＣＲによる点変異に
起因した。しかしながら、アミノ酸変化のないサイレン
ト点変異であったのでそのまま用いた。

【０１１５】（ｃ）ヒトＥＧＦをコードするｃＤＮＡの
クローニング ヒト腎臓の細胞より抽出したｍＲＮＡをテンプレートと
してプライマー（６）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、プ
ライマー（５）及び（６）の１組のプライマーを用いて
ヒトＥＧＦのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。配列表配列
番号１２で表されるプライマー（５）の塩基番号１〜２
はＰＣＲ後のＳａｌＩ消化に備えた隣接付加配列、塩基
番号3 〜8 はクローニング用及びＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ
との連結用ＳａｌＩ認識配列、塩基番号6 〜20はエンテ
ロキナーゼの認識配列（DDDDK)をコードした塩基配列、
塩基番号21〜44はヒトＥＧＦのｃＤＮＡの塩基配列であ
る。

【０１１６】また、配列表配列番号１３で表されるプラ
イマー（６）の塩基番号１はＰＣＲ後のＥｃｏＲＩ消化
に備えた隣接付加配列、塩基番号２〜７はクローニング
用のＥｃｏＲＩ認識配列、塩基番号８〜10は終止コドン
のアンチセンス配列、塩基番号11〜30は、ヒトＥＧＦの
ｃＤＮＡのアンチセンス配列である。

【０１１７】ＲＴ−ＰＣＲは、TaKaRa RNA LA ＰＣＲ K
it (AMV) Ver.1.1（宝酒造）を用い、まずテンプレート
のトータルＲＮＡ１．０μg を反応液量２０μｌで、６
０℃で３０分間逆転写反応させ、９９℃で５分間加熱し
た。ＰＣＲ反応は、反応液量１００μｌで９４℃で１分
間保持した後、９４℃で３０秒間→６５℃で４５秒間の
温度サイクルを３５回行った。

【０１１８】反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動
で解析した結果、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片が認められ
た。これは、ヒトＥＧＦに相当するサイズであった。こ
のＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化後、Ｓａ
ｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化したpBluescriptSK にライゲ
ーションした。そして、配列表配列番号１４で表される
ｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドが得られ、ｐＢＳ
（ＥＧＦ) と命名した。

【０１１９】配列表配列番号１４の塩基番号１〜６はク
ローニング用及びＦＮＣＢＤのｃＤＮＡとの連結用Ｓａ
ｌＩ認識配列、塩基番号４〜18はエンテロキナーゼの認
識配列（DDDDK)をコードした塩基配列、塩基番号19〜17
7 はヒトＥＧＦのｃＤＮＡの塩基配列、塩基番号178 〜
180 は終止コドン配列、塩基番号181 〜186 はクローニ
ング用のＥｃｏＲＩ認識配列である。なお得られたヒト
ＥＧＦの塩基配列は、ＥＭＢＬデータバンク（EMBL DAT
A BANK）に登録された配列と同じであった。

【０１２０】（ｄ）ヒトＦＮＣＢＤ発現ベクターの調製 上記（ａ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ)
を、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩ（ＮｏｔＩ認識配列はpBlues
criptSK のマルチクローニングサイトに存在）で処理し
た。挿入されていたＦＮＣＢＤのｃＤＮＡ断片を切り出
し、発現ベクターであるｐＴＹＢ１（New England BioL
ab) ）のＮｄｅＩ−ＮｏｔＩサイトにライゲーションし
た。構築されたプラスミドをｐＴＹＢ（ＦＮＣＢＤ) と
命名した。

【０１２１】（ｅ）ＦＮＣＢＤとｂＦＧＦのハイブリッ
ドポリペプチド発現ベクターの調製 上記（ａ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ)
はＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化した。なお、EMBL DATA
BANKに登録された配列にはＸｈｏＩ認識配列は存在しな
いが腎臓ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得られたＦＮＣＢＤ
のｃＤＮＡ配列中にはＸｈｏＩ認識配列が存在したので
部分消化した。

【０１２２】この処理により挿入されていたＦＮＣＢＤ
のｃＤＮＡ断片が切り出され、上記（ｂ）で得られたプ
ラスミドｐＢＳ（ＦＧＦ) のＫｐｎＩ−ＳａｌＩサイト
にライゲーションされた。このように構築されたプラス
ミドには、配列表配列番号１５で表されるＤＮＡが組み
込まれており、このプラスミドをｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ−
ＦＧＦ) と命名した。

【０１２３】配列表配列番号１５の塩基番号１〜６はク
ローニング用ＫｐｎＩ認識配列、塩基番号５〜10はＮｃ
ｏＩ認識配列、塩基番号11〜12はフレーム合わせの配
列、塩基番号13〜18はＮｄｅＩ認識配列、塩基番号16〜
18は開始コドン配列、塩基番号19〜1038はヒトＦＮＣＢ
ＤのｃＤＮＡ配列、塩基番号1039〜1044はＸｈｏＩ認識
配列とＳａｌＩ認識配列のライゲーションによって生じ
た塩基配列、塩基番号1042〜1056はエンテロキナーゼの
認識配列（DDDDK)をコードする塩基配列、塩基番号1057
〜1518はヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡ配列、塩基番号1519〜
1521は終止コドン、塩基番号1522〜1527はクローニング
用のＥｃｏＲＩ認識配列である。

【０１２４】ｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ) に挿入され
ていたハイブリッド遺伝子ＤＮＡ断片がＮｄｅＩとＥｃ
ｏＲＩで切り出され、この断片は発現ベクターであるｐ
ＴＹＢ1 のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトにライゲーショ
ンされた。このように構築されたプラスミドをｐＴＹＢ
１（ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ) と命名した。

【０１２５】（ｆ）ＦＮＣＢＤとＥＧＦのハイブリッド
ポリペプチドの発現ベクターの調製 上記（ａ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ)
から、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（部分消化）処理で、挿入
されていたＦＮＣＢＤのＤＮＡ断片が切り出され、上記
（ｃ）で得られたプラスミドｐＢＳ（ＥＧＦ) のＫｐｎ
Ｉ−ＳａｌＩサイトにライゲーションされた。このよう
に構築されたプラスミドには配列表配列番号１６で表さ
れるＤＮＡが組み込まれており、このプラスミドをｐＢ
Ｓ（ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ) と命名した。

【０１２６】配列表配列番号１６の塩基番号１〜６はク
ローニング用のＫｐｎＩ認識配列、塩基番号５〜10はＮ
ｃｏＩ認識配列、塩基番号11〜12はフレーム合わせの配
列、塩基番号13〜18はＮｄｅＩ認識配列、塩基番号16〜
18は開始コドン配列、塩基番号19〜1038はヒトＦＮＣＢ
ＤのｃＤＮＡ配列、塩基番号1039〜1044はＸｈｏＩ認識
配列とＳａｌＩ認識配列のライゲーションによって生じ
た塩基配列、塩基番号1042〜1056はエンテロキナーゼの
認識配列（DDDDK)をコードする塩基配列、塩基番号1057
〜1215はＥＧＦのｃＤＮＡ配列、塩基番号1216〜1218は
終止コドン、塩基番号1219〜1224はクローニング用のＥ
ｃｏＲＩ認識配列である。

【０１２７】ｐＢＳ（ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ) に挿入され
ていたハイブリッド遺伝子ＤＮＡ断片がＮｄｅＩとＥｃ
ｏＲＩで切り出され、発現ベクターであるｐＴＹＢ1 の
ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトにライゲーションされた。
このように構築されたプラスミドをpTYB1(ＦＮＣＢＤ−
ＥＧＦ) と命名した。

【０１２８】（ｇ）ＦＮＣＢＤとｂＦＧＦのハイブリッ
ドポリペプチド、及びＦＮＣＢＤとＥＧＦのハイブリッ
ドポリペプチドの発現の確認 pTYB1(ＦＮＣＢＤ) 、pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ) 及び
pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ) で大腸菌株ER2566（NEW EN
GLAND BioLabs ）を各々形質転換した。形質転換された
大腸菌は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地２ｍｌで、一夜37℃で培養された。この前培養液
０．０２ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
ＳＢ培地２ｍｌに接種した。菌濁度が０．５になるまで
培養後、１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−
β−Ｄ−ガラクトシド）を添加し、さらに３７℃で２時
間培養後集菌した。

【０１２９】全菌体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１
２％ゲル）で展開した後クマシー染色を行った。その結
果、染色ゲルにおいて、それぞれの大腸菌からＦＮＣＢ
Ｄ、ＦＮＣＢＤとｂＦＧＦのハイブリッド及びＦＮＣＢ
ＤとＥＧＦのハイブリッドそれぞれの分子量に相当する
４０kDa 、５７kDa 及び４６kDa に各々のバンドが観察
され、組換えポリペプチドの発現が確認された。

【０１３０】別に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをニトロ
セルロース膜に転写し、ＦＮＣＢＤを特異的に認識する
モノクローナル抗体（FNC4-4、宝酒造）、ｂＦＧＦを特
異的に認識するモノクローナル抗体（FGF-2(C-18) 、Sa
nta Cruz Biotechnology）、及びＥＧＦを特異的に認識
するモノクローナル抗体（Clone10825.1 R&D Systems）
を作用させた。

【０１３１】その結果、４０kDa のポリペプチドには抗
ヒトＦＮＣＢＤモノクローナル抗体が反応し、５７kDa
のポリペプチドには抗ヒトＦＮＣＢＤモノクローナル抗
体及び抗ヒトｂＦＧＦモノクローナル抗体が反応し、４
６kDa のポリペプチドには抗ヒトＦＮＣＢＤモノクロー
ナル抗体及び抗ヒトＥＧＦモノクローナル抗体が反応す
ることが確認された。従って、４０kDa のポリペプチド
はヒトのＦＮＣＢＤ、５７kDa のポリペプチドはヒトＦ
ＮＣＢＤとヒトｂＦＧＦとのハイブリッドポリペプチド
（ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ）、そして４６kDa のポリペプチ
ドはヒトＦＮＣＢＤとヒトＥＧＦとのハイブリッドポリ
ペプチド（ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ）と考えられる。

【０１３２】以上のようにプラスミドpTYB1(ＦＮＣＢ
Ｄ) 、pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ) 及び pTYB1( ＦＮＣ
ＢＤ−ＥＧＦ) で形質転換され、各々のポリペプチドの
発現が確認された大腸菌ＥＲ2566（NEW ENGLAND BioLab
s ）を、各々、ＥＲ2566 [pTYB1(ＦＮＣＢＤ)]、ＥＲ25
66 [pTYB1(ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ)]、ＥＲ2566 [pTYB1(Ｆ
ＮＣＢＤ−ＥＧＦ)]と命名した。

【０１３３】（ｈ）発現ポリペプチドの調製 上記（ｇ）で得られた大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで一夜３７℃で前培養し
た。この前培養液０．２ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＳＢ培地２ｍｌに接種した。ＩＰＴＧを
添加し、さらに３７℃で培養した後集菌した。

【０１３４】得られた菌体は２ｍｌの超音波処理緩衝液
［５０ｍＭトリス(Tris)−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、５０
ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸(E
DTA)］で洗浄後、遠心分離して再び同緩衝液２ｍｌに懸
濁し、超音波の１５秒処理・１５秒休止を氷冷で６回繰
り返して菌体を破砕した。

【０１３５】この懸濁液に終濃度１％になるようにトラ
イトンＸ-100(TritonX-100) を添加し、４℃、 5,000回
転／分で20分間遠心分離した。得られた沈査をさらに封
入体洗浄液［０．５％TritonX-100 、１ｍＭ EDTA ］で
３回洗浄した。遠心分離後、不溶画分を８Ｍ尿素溶液
［８Ｍ尿素、５０ｍＭ Tris-塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１
ｍＭのＥＤＴＡ］中に１時間室温で静置して溶解した。
次にこの溶解液を４℃、14,000回転／分で２０分間遠心
分離し、上清を回収した。

【０１３６】上清は、４Ｍ尿素溶液、２Ｍ尿素溶液に対
して順次透析され、最後に結合活性実験用として超音波
処理緩衝液、あるいは細胞増殖活性実験用としてリン酸
緩衝液［１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０、５０ｍＭ塩
化ナトリウム] に対して透析された。

【０１３７】透析後、４℃、14,000回転／分で２０分間
遠心分離し、上清を可溶化組換えタンパク質標品とし
た。得られた標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、アミノ酸
配列から算出される４０kDa 、５７kDa 及び４６kDa の
位置に各々のバンドが検出され、組換えタンパク質であ
るポリペプチドが確認された。さらに、実施例２の（ｂ
−３）以降は、ゼラチンセファロース４Ｂで精製後、リ
ン酸緩衝液で透析されたポリペプチドサンプルが使用さ
れた。

【０１３８】（実施例２） ＜生物活性の検討＞前記実施例１で得られたＦＮＣＢ
Ｄ、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ及びＦＮＣＢＤ−ＥＧＦを用い
てコラーゲン結合活性及び細胞増殖活性を調べた。 （ａ）コラーゲン結合活性の測定 ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのゼラチン（ゼラチンセファロース
４Ｂ、アマシャムファルマシアバイオテク) に対する結
合活性はバッチ法によって調べた。その方法の概要を図
３に示す。

【０１３９】組換えタンパク質標品としては、超音波処
理緩衝液に透析された約５０μｇ／ｍｌのＦＮＣＢＤ−
ＦＧＦを用いた。１．５ｍｌのマイクロチューブに５０
０μｌのＦＮＣＢＤ−ＦＧＦと１００μｌのゼラチンセ
ファロース４Ｂ混濁液（超音波処理緩衝液で２回洗浄
後、５０％（容積／容積) 混濁液とした）を加え、４℃
で１時間回転器で混合した。5000回転／分で３０秒遠心
後、その上清を回収した。次に沈査に１Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液を５００μｌ加え混濁後、5,000 回転／分で３０
秒遠心し、その上清を回収した。同様に再度、１Ｍ塩化
ナトリウム溶液で沈査を洗浄した。次に同様の操作で１
Ｍ尿素、２Ｍ尿素、４Ｍ尿素溶液で順次ゼラチンセファ
ロース４Ｂに結合しているタンパク質の溶出を試みた。
最後に、１００μｌのＳＤＳバッファー中で９０℃に加
熱してゼラチンセファロース４Ｂに結合しているタンパ
ク質を溶出させた。

【０１４０】以上の操作とは別にＦＮＣＢＤ−ＦＧＦの
ヘパリン（ＡＦ−へパリントヨパール、トーソー) に対
する結合活性をバッチ法により調べた。１．５ｍｌのマ
イクロチューブに５００μｌのＦＮＣＢＤ−ＦＧＦと１
００μｌのＡＦ−へパリントヨパール混濁液（超音波処
理緩衝液で２度洗浄後、５０％（容積／容積) 混濁液と
した）を加え、4 ℃で1 時間回転器で混合した。 5,000
回転／分で３０秒遠心後、その上清を回収した。沈査は
1 Ｍ塩化ナトリウム溶液５００μｌで２回洗浄後（この
上清は電気泳動しなかった。）、１００μｌのＳＤＳバ
ッファー中で９０℃、５分間加温して結合しているタン
パク質を溶出した。各々、回収した上清５μｌに６倍濃
度のＳＤＳバッファー１μｌを混合し、９０℃で５分間
静置後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【０１４１】図４に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルでは、
レーン３にアミノ酸配列から計算される57 kDaの付近に
ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのバンドが検出されず、ＦＮＣＢＤ
−ＦＧＦのゼラチンへの結合が明らかになった。次い
で、１Ｍ塩化ナトリウム溶液による２回の洗浄によって
もバンドは検出されず（レーン４及び５）、1 Ｍ塩化ナ
トリウム溶液の洗浄では、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦはゼラチ
ンから溶出しないことが明らかとなった。同様の操作で
１Ｍ尿素、２Ｍ尿素、４Ｍ尿素で溶出を試みた結果、１
Ｍ尿素、２Ｍ尿素では、ほとんどバンドは検出されず
（レーン６及び7 ）、４Ｍ尿素で薄いバンドが検出され
た（レーン８）。

【０１４２】９０℃のＳＤＳバッファーによる溶出によ
り、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのバンドは検出された（レーン
９）。即ち、1 Ｍ尿素、２Ｍ尿素では、ＦＮＣＢＤ−Ｆ
ＧＦはゼラチンからほとんど溶出されず、４Ｍ尿素で部
分的に溶出し、90℃のSDS バッファーによって殆どが溶
出されることから、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのゼラチンに対
する強固な結合が裏付けられた。

【０１４３】ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのヘパリンに対する結
合では、レーン10でバンドが検出されず、その結合活性
が明らかになった。１Ｍ塩化ナトリウム溶液による洗浄
後、90℃のＳＤＳバッファーによりヘパリンからＦＮＣ
ＢＤ−ＦＧＦが溶出してバンドが検出され（レーン1
1）、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのヘパリンに対する結合が裏
付けられた。即ちｂＦＧＦ部分は天然のｂＦＧＦと同様
の立体構造を持ち、生理活性としても保持されている。
以上のことから、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦはＦＮＣＢＤ部分
において強固なゼラチン結合性を保持し、ｂＦＧＦ部分
はヘパリン結合性を保持していることが証明された。

【０１４４】酵素結合免疫評価法（ＥＬＩＳＡ法) で
は、ウシゼラチン（シグマ）、ウシ天然コラーゲン (Ｉ
−ＡＣ、高研）、ウシアテロコラーゲン（Ｉ−ＰＣ、高
研）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ）に対す
るＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ及びＦＮＣＢＤ- Ｅ
ＧＦの結合活性を調べた。ＥＬＩＳＡ法の概念図を図５
に示す。

【０１４５】最初に、ＥＬＩＳＡ用平底の９６ウエル
（well）マルチプレートに各々１００μｇ／ｍｌのゼラ
チン、天然コラーゲン、アテロコラーゲン、血清アルブ
ミンのリン酸緩衝化生理的食塩水溶液を２００μｌ／ウ
エルで分注し、４℃で一夜静置した。

【０１４６】その溶液を捨て、一昼夜、３％血清アルブ
ミンでブロッキングした。０．０５％ Tween 20 のリン
酸緩衝化生理的食塩水溶液でウエルを３回洗浄後、リン
酸緩衝化生理的食塩水で希釈した１μｇ／ｍｌ、100 ｎ
ｇ／ｍｌ、10ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌのＦＮＣＢＤ、
ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ及びＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ溶液を 100
μｌ、各々のウエルに分注し、37℃で１時間、静置し
た。

【０１４７】Tween 20を０．０５％含むリン酸緩衝化生
理的食塩水溶液で３回洗浄後、１０００分の１に希釈さ
れた抗ヒトＦＮＣＢＤモノクローナル抗体（宝酒造) を
１００μｌ分注し、室温で１時間静置した。０．０５％
Tween 20／リン酸緩衝化生理的食塩水溶液でウエルを３
回洗浄後、１０００倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスイムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコジャパ
ン）を１００μｌウエルに分注し、室温で１時間静置し
た。０．０５％ Tween20／リン酸緩衝化生理的食塩水溶
液でウェルを６回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌオルトフェニレ
ンジアミン(o-phenylenediamine)と、0.０３％過酸化水
素を含む 0.1Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．７を分注し、１
０分静置後、４規定硫酸５０μｌで反応を停止し、４９
２ｎｍ−６９０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１４８】図６に１００μｇ／ｍｌのゼラチン、天然
コラーゲン、アテロコラーゲン、血清アルブミンを各々
マルチプレートに固相化し、１μｇ／ｍｌのＦＮＣＢＤ
を反応させた場合の結果を示す。縦軸には吸光度を示
す。血清アルブミンを固相化した場合の吸光度は0.08、
ゼラチン、天然コラーゲン、アテロコラーゲンの場合の
吸光度は、各々、2.27、2.08、1.93であり、血清アルブ
ミンの10倍を越える吸光度となった。

【０１４９】図７には、 0.1μｇ／ｍｌＦＮＣＢＤ−Ｆ
ＧＦを、ゼラチン、天然コラーゲン、アテロコラーゲ
ン、血清アルブミンに反応させた結果を示す。ゼラチ
ン、天然コラーゲン、アテロコラーゲンの場合の吸光度
は、各々、1.60、2.12、2.20、血清アルブミンを用いた
場合の吸光度は0.27であった。このように、ＦＮＣＢＤ
−ＦＧＦのゼラチン、天然コラーゲン、アテロコラーゲ
ンに対する結合度は、血清アルブミンに対する結合度に
比べて顕著に高い値を示す。

【０１５０】同様に、図８に示すように、ＦＮＣＢＤ−
ＥＧＦを血清アルブミン、ゼラチン、天然コラーゲン、
アテロコラーゲンに反応させた結果では、吸光度は各
々、0.11、1.54、1.66、1.54を示し、固相化したゼラチ
ン、天然コラーゲン、アテロコラーゲンに対する結合は
血清アルブミンに対する結合より明らかに高値であっ
た。

【０１５１】ＥＬＩＳＡ法における吸光度は、結合活性
に相関して高くなると考えられるが、非特異的な結合と
見なせる固相化血清アルブミンとの反応に比べ、ＦＮＣ
ＢＤと固相化ゼラチン、天然コラーゲン、アテロコラー
ゲンとの反応では約１０倍高い吸光度を示すことから、
これらの反応は特異的な結合反応と考えられる（図
６）。同様に図７に示すＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ及び図８に
示すＦＮＣＢＤ−ＥＧＦの固相化ゼラチン、コラーゲン
への反応も特異的な結合といえる。このことは、本発明
で遺伝子工学的に産生されたポリペプチドが、ＦＮＣＢ
Ｄが本来持っているコラーゲン結合活性を消失すること
なく細胞成長因子がハイブリッド化された分子であるこ
とを示す。すなわち、ハイブリッドポリペプチドとした
ことにより、細胞成長因子にコラーゲン結合活性の付与
が可能であった。

【０１５２】（ｂ）細胞増殖活性の測定 上記（ａ）でコラーゲン結合活性を示したＦＮＣＢＤ、
ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ及びＦＮＣＢＤ−ＥＧＦについてさ
らに、それらが細胞増殖活性を維持しているかどうかを
検討した。

【０１５３】（ｂ−１）マウス繊維芽細胞株 ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞株）を、３
％牛胎児血清を含むイスコブ改変ダルベッコイーグル培
地（３％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ）に懸濁し、２４穴マイクロ
プレートに２×10³ 細胞／ウェルで分注後、５％二酸化
炭素存在下、３７℃で５時間培養した。その後、培地を
０．６％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ培地（０．６％ＦＢ
Ｓ−ＩＭＤＭ）に交換し、更に３７℃で２４時間培養し
た。次に、ＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦまたはＥＧ
Ｆを培地中に添加し、３７℃で４日間培養した。細胞
は、さらにＷＳＴ-1試薬（ベーリンガーマンハイム
（株））が培地の１０分の１容添加された後、３７℃で
３時間培養した。培地を９６穴マイクロプレートに移
し、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍ−６
９０ｎｍの吸光度を測定し、細胞増殖活性を調べた。

【０１５４】図９に示すように、ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ
は、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対して、濃度依存的に細
胞増殖活性を示し、ＥＧＦの細胞増殖活性を越える結果
となった。一方、ＦＮＣＢＤについても、ＢＡＬＢ／ｃ
３Ｔ３細胞に対して細胞増殖活性を示した。従って、Ｆ
ＮＣＢＤをＥＧＦにハイブリッド化させることで、ＥＧ
Ｆの細胞増殖活性は消失しなかったと考えられる。さら
に、ＦＮＣＢＤが細胞増殖活性を示した事及びＦＮＣＢ
Ｄ−ＥＧＦがＥＧＦを越える細胞増殖活性を示した事か
ら、ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦは、ＦＮＣＢＤとＥＧＦとが相
加した増殖活性を示したと考えられる。

【０１５５】（ｂ−２) ヒト繊維芽細胞 ヒト繊維芽細胞を、３％牛胎児血清を含むイスコブ改変
ダルベッコイーグル培地（３％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ）に懸
濁し、２４穴マイクロプレートに５×10³ 細胞／ウェル
で分注後、５％二酸化炭素存在下、３７℃で５時間培養
した。その後、培地を０．６％牛胎児血清を含むＩＭＤ
Ｍ培地（０．６％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ）に変更し、更に、
３７℃で２４時間培養した。次にＦＮＣＢＤまたはＦＮ
ＣＢＤ−ＦＧＦを添加し、３７℃で４日間培養した。Ｘ
ＴＴ試薬（ベーリンガーマンハイム（株））を培地容量
の２分の１添加して更に、３７℃で６時間培養した。培
地は96穴マイクロプレートに移され、マイクロプレート
リーダーによって、４９２ｎｍ−６９０ｎｍの吸光度測
定を行い、細胞増殖活性を調べた。

【０１５６】図１０に示すように、ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦ
は、ヒト繊維芽細胞に対して、濃度依存的に細胞増殖活
性を示した。一方、ＦＮＣＢＤについても、ＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３細胞の場合より弱いがヒト繊維芽細胞に対して
細胞増殖活性を示した。以上の結果から、ＦＧＦにコラ
ーゲン結合性を付与したことで、ｂＦＧＦの細胞増殖活
性は消失しなかったと考えられる。

【０１５７】（ｂ−３）ＮＲＫ49Ｆ細胞 これ以降はゼラチンセファロース４Ｂで精製し、リン酸
緩衝液で透析した組換えタンパク質標品を用いた。ＮＲ
Ｋ49Ｆ細胞（ラット繊維芽細胞株）は、2 ％牛胎児血清
を含むダルベッコ改変イーグル培地（2%FBS-DMEM）に懸
濁され、24穴マイクロプレートに1 ×10⁴ 細胞／ウェル
で分注後、5 ％二酸化炭素存在下、37℃で7 時間培養さ
れた。次に、5 倍希釈系列のＦＮＣＢＤ、ＦＮＣＢＤ−
ＥＧＦ又はＥＧＦ（各々ｎ＝３）を各々のウエルの培地
中に添加し、３７℃で４日間培養された。細胞はさらに
WST-1 試薬（同仁化学研究所）を培地の10分の1 容添加
後、37℃で３時間培養された。培地を96穴マイクロプレ
ートに移し、マイクロプレートリーダーによって、450
nm−690 nmの吸光度から細胞増殖活性を調べた。図１１
に示すように、 NRK49F 細胞に対して、ＦＮＣＢＤ−Ｅ
ＧＦは濃度依存的に細胞増殖活性を示し、ＥＧＦの細胞
増殖活性と類似した結果となった。一方、ＦＮＣＢＤに
ついては、この濃度では NRK49F 細胞に対して細胞増殖
活性を示さなかった。従って、ＦＮＣＢＤをＥＧＦにハ
イブリッド化させることで、ＥＧＦの細胞増殖活性は消
失しなかったと考えられる。

【０１５８】（実施例３） ＜機能性の比較＞コラーゲン結合性細胞増殖因子と、元
の細胞増殖因子の機能を比較した。 （ａ）細胞増殖因子複合化コラーゲンの細胞増殖活性 コラーゲン結合活性及び細胞増殖活性が確認されたコラ
ーゲン結合性細胞増殖因子の例として、ＦＮＣＢＤ−Ｅ
ＧＦをコラーゲンに結合後（ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ複合化
コラーゲン）、その細胞増殖活性が調べられた。この実
施例を模式化して図１２に示す。最初に、組織培養用24
穴マイクロプレートに3 mg/ml のアテロコラーゲン塩酸
溶液（pH3.0 ）を500 μl/ウエルで分注し、一夜、4 ℃
で静置した。その溶液を捨て、0.05％ Tween 20 のリン
酸緩衝化生理的食塩水溶液で4 回洗浄し、続いてリン酸
緩衝化生理的食塩水溶液で2 回洗浄後、無血清DMEM培地
で1 回洗浄した。次に、無血清DMEM培地で希釈した0 n
M、2.5 nM、5 nM、10 nM 、20 nM 、もしくは40 nM のF
NCBD-EGF またはEGF 溶液を250 μl 、各々のウエルに
分注し、37℃で2 時間、静置した。溶液を捨て0.05％ T
ween 20 のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で2 回洗浄
し、続いてリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で6 回洗浄
後、ハンクス緩衝液で1 回洗浄した。次に無血清ヒト角
化細胞基礎培地(KBM2)へ添加剤であるウシ下垂体抽出物
(BPE) を添加した培地（KBM2+BPE）にヒト角化細胞が懸
濁され、24穴マイクロプレートに10⁴ 細胞／0.5 ml/ ウ
ェルで分注された。ウエルにコートされたコラーゲンに
ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ又はＥＧＦの各々が100 ％保持され
た場合、終濃度は0 nM、1.25 nM 、2.5 nM、5 nM、10 n
M または20 nM になる。この条件でヒト角化細胞は5 ％
二酸化炭素存在下、37℃で4 日間培養された。そして、
WST-1 試薬を培地の10分の1 容添加後、細胞はさらに37
℃で３時間培養された。培地を96穴マイクロプレートに
移し、マイクロプレートリーダーによって、450 nm−69
0 nmの吸光度を測定し、細胞増殖活性が調べられた。

【０１５９】図１３に示すように、EGF と異なり、FNCB
D-EGF はヒト角化細胞に対して濃度依存的に細胞増殖活
性を示した。この結果は、FNCBD-EGF とEGF とのコラー
ゲン結合性の差異により生じたと考えられる。従って、
FNCBD-EGFは、フィブロネクチン由来のペプチドとEGF
とが連結されているポリペプチドであり、かつコラーゲ
ン結合活性及びEGF 活性の両活性を有することを特徴と
するコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドと言える。
また、コラーゲンに結合後、結合を保持したままか又は
徐放されることによりEGF 活性を示すことを特徴とする
コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドでもある事が判
明した。

【０１６０】また FNCBD-EGFの結合したコラーゲンは、
コラーゲン結合性EGF 及びコラーゲン由来のポリペプチ
ドを含むことを特徴とするバイオマテリアル（EGF 複合
化コラーゲン）の一つである。また、上記ヒト角化細胞
の培養法は、生理活性ペプチド複合化コラーゲンを用い
て細胞に対して増殖活性の促進などの生理活性を与える
方法の一例である。

【０１６１】（ｂ）FNCBD-EGF とEGF のコラーゲンに対
する結合活性の比較 ELISA法を用い、コラーゲンに対するFNCBD-EGF とEGF
の結合活性を比較した。最初に、組織培養用平底の96 w
ell マルチプレートに 3mg/ml のI 、II、IIIもしくはI
V型アテロコラーゲンの塩酸溶液（pH3.0 ）またはBSA
またはBlock Ace （ブロッキング剤）を200 μl/ウエル
で分注し、一夜、4 ℃で静置した。その溶液を捨て、0.
05％/Tween 20 のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で、6
回ウエルを洗浄後、無血清DMEM培地で希釈した0 nM、1.
25 nM 、 2.5 nM 、 5 nM 、 10nM、 20 nMのFNCBD-EGF
溶液又は0 nM、1.25 nM 、 2.5 nM 、 5 nM 、 10 n
M、20 nMのEGF 溶液を100 μl 、各々のウエルに分注
し、37℃で2 時間、静置した。次に0.05％Tween 20／リ
ン酸緩衝化生理的食塩水溶液で3 回洗浄後、原液を1000
分の1 に希釈された抗ヒトEGF モノクローナル抗体を10
0 μl 分注し、室温で１時間静置させた。続いて0.05％
Tween 20／リン酸緩衝化生理的食塩水溶液で３回ウエル
洗浄後、1000倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗マウスイ
ムノグロブリンポリクローナル抗体100 μl をウエルに
分注し、室温で1 時間、静置させた。最後に0.05％ Twe
en 20 ／リン酸緩衝化生理的食塩水溶液でウェルを６回
洗浄後、1 mg/ml オルト- フェニレンジアミン(o-pheny
lenediamine)と0.03% 過酸化水素を含む0.1 M クエン酸
緩衝液pH4.7 を分注し、約10分静置後、4 規定硫酸50μ
lで反応を停止した。プレートリーダーにより、492 nm-
690 nm の吸光度を測定した。

【０１６２】図１４に得られた吸光度の値をグラフで示
す。縦軸はコラーゲン結合活性を吸光度で示し、FNCBD-
EGF 又はEGF の濃度を横軸に表した。I 、II、III また
はIV型アテロコラーゲンのいずれをコートしたウエルで
も、FNCBD-EGF を1.25 nM 、2.5 nM 、 5 nM 、 10 n
M、 20 nMの濃度で分注したウエルの吸光度の値は、 FN
CBD-EGFを0 nMで分注したウエルの吸光度を0 として、
濃度依存的に高い値を示した。一方、EGF を1.25 nM 、
2.5 nM 、 5 nM 、 10 nM、 20 nMの濃度で分注したウ
エルの吸光度は、0 nMの濃度で分注したウエルとほぼ同
じであった。ELISA 法における吸光度は、結合活性に相
関して高くなると考えられるため、EGF にフィブロネク
チンのコラーゲン結合性ドメインを融合したFNCBD-EGF
は、元のEGF に比べて顕著なコラーゲン結合性を示すこ
とが明らかにされた。従って、実施例３の(a) で示され
たFNCBD-EGF のヒト角化細胞への増殖促進活性は、その
コラーゲン結合性に基づくと裏付けられた。すなわち、
FNCBD-EGF はコラーゲンを介して保持され、局所におけ
る細胞増殖活性を示すことが可能であった。以上の実施
例は、元の生理活性ペプチドでは不可能であった局所保
持、徐放およびコラーゲンへのターゲッティングの機能
が本発明により生理活性ペプチドの生理活性を保持した
まま付与された事を意味する。

【０１６３】（ｃ）細胞増殖因子複合化コラーゲンの細
胞増殖活性の長期安定性 コラーゲン結合活性及び細胞増殖活性が確認されたコラ
ーゲン結合性細胞増殖因子の例として、FNCBD-EGF をコ
ラーゲンに結合後（FNCBD-EGF 複合化コラーゲン）、そ
の細胞増殖活性が調べられた。最初に、組織培養用24穴
マイクロプレートに１mg/ml のアテロコラーゲン塩酸溶
液（pH3.0 ）を500 μl/ウエルで分注し、一夜、4 ℃で
静置した。その溶液を捨て、0.05％ Tween 20 のリン酸
緩衝化生理的食塩水溶液で4 回洗浄し、続いてリン酸緩
衝化生理的食塩水溶液で2 回洗浄後、無血清IMDM培地で
１回洗浄した。次に、無血清DMEM培地で希釈した０nM、
８nM、40 nM 、200 nMまたは1000nMのFNCBD-EGF 溶液
(n=3)を250 μl 、各々のウエルに分注し、37℃で2 時
間、静置した。溶液を捨てリン酸緩衝化生理的食塩水溶
液で２回洗浄後、DMEMで1 回洗浄した。DMEMを500 μl/
ウエルで分注し、一週間37℃で静置した。次に、無血清
DMEM培地で希釈した0 pM、8 pM、40pM、200 pMまたは10
00pMのＥＧＦ溶液 (n=2)を２５０μl 、各々のウエルに
分注し、37℃で２時間、静置した。溶液を捨て、 FNCBD
-EGF又はEGF を分注したウエルを0.05％Tween 20 のリ
ン酸緩衝化生理的食塩水溶液で2 回洗浄し、続いてリン
酸緩衝化生理的食塩水溶液で６回洗浄後、DMEMで１回洗
浄した。２％ウシ胎児血清を含んだDMEM培地にNRK49Fラ
ット繊維芽細胞が懸濁され、24穴マイクロプレートに10
⁴細胞／0.5 ml／ウェルで分注された。ウエルにコート
されたコラーゲンにFNCBD-EGF 又はEGF の各々が100 ％
保持された場合、終濃度は0 pM、4 pM、20pM、100pMま
たは500 pMになる。この条件でNRK49F細胞は5 ％二酸化
炭素存在下、37℃で4 日間培養された。そして、WST-1
試薬を培地の10分の1 容添加後、細胞はさらに37℃で３
時間培養された。培地を96穴マイクロプレートに移し、
マイクロプレートリーダーによって、450 nm−690 nmの
吸光度を測定し、細胞増殖活性が調べられた。

【０１６４】図１５に示すように、EGF と異なり、FNCB
D-EGF はＮＲＫ４９Ｆ細胞に対して濃度依存的に細胞増
殖活性を示した。この結果は、FNCBD-EGF とEGF とのコ
ラーゲン結合性の差異により生じたと考えられる。ま
た、FNCBD-EGF は一週間37℃で放置されたにも関わら
ず、コラーゲン結合活性及びEGF 活性の両活性を維持
し、コラーゲンに結合後、結合を保持したままか又は徐
放されることによりEGF 活性を示すことが分かった。こ
の結果は、生体中に置いても、生体中のコラーゲンにFN
CBD-EGF が結合するかまたはコラーゲン材料からなるバ
イオマテリアル（EGF複合化コラーゲン）として細胞、
組織、臓器に対して増殖、分化、再生又は物質産生の促
進などの生理活性を与え得ることを意味する。

【０１６５】（ｄ）FNCBD-EGF とEGF のコラーゲンター
ゲティング活性の比較 ELISA法を用い、高濃度混入タンパク質存在下でのコラ
ーゲンに対するFNCBD-EGF とEGF のターゲティング活性
を比較した。最初に、組織培養用平底の96 well マルチ
プレートに３mg/ml のI 型アテロコラーゲンの塩酸溶液
（pH3.0 ）を200 μl/ウエルで分注し、一夜、4 ℃で静
置した。その溶液を捨て、0.05％/Tween20 のリン酸緩
衝化生理的食塩水溶液で、6 回ウエルを洗浄後、80 mg/
ml高濃度ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のDMEM培地溶液
で希釈した0 nM、2 nM、 4 nM 、8 nM のFNCBD-EGF 溶
液又は0 nM、2 nM、 4 nM 、 8 nM のEGF 溶液を100 μ
l、各々のウエルに分注し、37℃で１時間、静置した。
次に0.05％Tween 20／リン酸緩衝化生理的食塩水溶液で
３回洗浄後、原液を1000分の１に希釈された抗ヒトEGF
モノクローナル抗体を100 μl 分注し、室温で1 時間静
置させた。続いて0.05％Tween 20／リン酸緩衝化生理的
食塩水溶液で3 回ウエル洗浄後、1000倍希釈のペルオキ
シダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンポリクローナル
抗体100 μlをウエルに分注し、室温で１時間、静置さ
せた。最後に0.05％ Tween 20 ／リン酸緩衝化生理的食
塩水溶液でウェルを６回洗浄後、1 mg/ml オルト- フェ
ニレンジアミン(o-phenylenediamine)と0.03% 過酸化水
素を含む0.1 M クエン酸緩衝液pH4.7 を分注し、約10分
静置後、4 規定硫酸50μl で反応を停止した。プレート
リーダーにより、492 nm-690 nm の吸光度を測定した。

【０１６６】図１６に得られた吸光度の値をグラフで示
す。縦軸はコラーゲンターゲティング活性を吸光度で示
し、FNCBD-EGF 又はEGF の濃度を横軸に表した。I 型ア
テロコラーゲンをコートしたウエルで、FNCBD-EGF を0
nM、2 nM、 4 nM 、 8 nM の濃度で分注したウエルの吸
光度の値は、濃度依存的に高い値を示した。一方、EGF
を0 nM、2 nM、 4 nM 、 8 nM の濃度で分注したウエル
の吸光度は、0 nMの濃度で分注したウエルとほぼ同じで
あった。ELISA 法における吸光度は、コラーゲンターゲ
ティング活性に相関して高くなると考えられるため、EG
F にフィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメインを融
合したFNCBD-EGF は、元のEGF に比べて高濃度混入タン
パク質存在下で顕著なコラーゲンターゲティング活性を
示すことが明らかにされた。すなわち、FNCBD-EGF は生
体中または生体外でも高濃度混入タンパク質存在下でも
コラーゲンを特異的にターゲッティングし、局所におけ
る細胞増殖活性を示すことが可能である。以上の実施例
は、元の生理活性ペプチドでは不可能であった局所保
持、コラーゲンへのターゲッティングの機能が本発明に
より生理活性ペプチドの生理活性を保持したまま付与さ
れた一例である。また、本発明は、生理活性ペプチドの
新規なドラッグデリバリーシステムである事が証明され
た。

【０１６７】（ｅ）FNCBD-EGF の血漿FNによる徐放、放
出特性 ELISA法を用い、血漿FNによるコラーゲンからのFNCBD-E
GF の徐放、放出特性を検討した。最初に、組織培養用
平底の96 well マルチプレートに３mg/ml のIまたはIV
型アテロコラーゲンの塩酸溶液（pH3.0 ）を200 μl/ウ
エルで分注し、一夜、4 ℃で静置した。その溶液を捨
て、0.05％/Tween 20 のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液
で、６回ウエルを洗浄後、DMEM培地溶液で希釈した 20
nMのFNCBD-EGF 溶液を100 μl 、各々のウエルに分注
し、37℃で90分、静置した。次に0.05％Tween 20／リン
酸緩衝化生理的食塩水溶液で３回洗浄後、ＰＢＳ溶液で
希釈した 20 、40、80、160 、320 、640 、1280 nM 濃
度のFN溶液またはＦＮと同じ重量濃度（μg/ml）希釈系
列のＢＳＡを100 μl 、各々のウエルに分注し、37℃で
90分、静置した。0.05％Tween 20／リン酸緩衝化生理的
食塩水溶液で３回洗浄後、原液を1000分の１に希釈され
た抗ヒトEGF モノクローナル抗体を100 μl 分注し、室
温で１時間静置させた。続いて0.05％Tween 20／リン酸
緩衝化生理的食塩水溶液で３回ウエル洗浄後、1000倍希
釈のペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンポ
リクローナル抗体100 μl をウエルに分注し、室温で１
時間、静置させた。最後に0.05％ Tween 20 ／リン酸緩
衝化生理的食塩水溶液でウェルを６回洗浄後、1 mg/ml
オルト- フェニレンジアミン(o-phenylenediamine)と0.
03%過酸化水素を含む0.1 M クエン酸緩衝液pH4.7 を分
注し、約10分静置後、4 規定硫酸50μl で反応を停止し
た。プレートリーダーにより、492 nm-690 nm の吸光度
を測定した。

【０１６８】図１７に得られた吸光度の値をグラフで示
す。縦軸はコラーゲン結合活性を吸光度を示し、FNCBD-
EGF とＦＮのモル濃度比を横軸に表した。I 型アテロコ
ラーゲンをコートしたウエルにFNCBD-EGF を結合後 20
、40、80、160 、320 、640、1280 nM 濃度でＦＮを分
注したウエルの吸光度の値は、ＦＮの濃度依存的に減少
した。ELISA 法における吸光度の低下は、コラーゲンに
結合しているFNCBD-EGF の減少に相関して低くなると考
えられるため、EGF にフィブロネクチンのコラーゲン結
合性ドメインを融合したFNCBD-EGF は、ＦＮによりその
コラーゲン結合が競合阻害されることが明らかにされ
た。すなわち、FNCBD-EGF は生体中または生体外でコラ
ーゲンに結合後、血漿ＦＮにより特異的に徐放、放出さ
れる性質を示すことが明らかになった。以上の実施例
は、血漿、血清、または血液の侵入、暴露、添加または
共存化において、コラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
ドがコラーゲンから徐放、放出すること、血漿、血清、
または血液の不足した即ち細胞増殖因子などの生理活性
ペプチドの飢餓状態にある部位ではコラーゲンに保持さ
れる特徴を持つ一例である。従って、本発明は、生理活
性ペプチドをコラーゲンにターゲティングし、保持さ
れ、制御された徐放を行う新規なドラッグデリバリーシ
ステムである事が証明された。

【０１６９】

【発明の効果】生理活性ペプチドの活性が維持され、か
つコラーゲンに対する結合活性が付与されたコラーゲン
結合性生理活性ポリペプチドは生理活性ペプチドのドラ
ッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用である。
さらに、該ポリペプチドはコラーゲンに複合化させるこ
とが可能であり、このように機能修飾されたコラーゲン
マトリックスは組織再生の新しいバイオマテリアルとし
て有用である。

【０１７０】

【配列表フリーテキスト】配列番号１ 人工配列の説明：修飾されたヒト・フィブロネクチンコ
ラーゲン結合性ドメインのアミノ酸配列 (2)..(341):/ノート="ヒト・フィブロネクチンコラーゲ
ン結合性ドメイン" 配列番号２ 人工配列の説明: エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列 (1)..(5):/ノート="エンテロキナーゼ認識配列" (6)..(159):/ノート="ヒト繊維芽細胞増殖因子" 配列番号３ 人工配列の説明: エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト上皮増殖因子のアミノ酸配列 (1)..(5):/ノート="エンテロキナーゼ認識配列" (6)..(58):/ ノート="ヒト上皮増殖因子" 配列番号４ 人工配列の説明: ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト繊維芽細胞増殖因子から成るハイブ
リッドポリペプチドのアミノ酸配列 (2)..(341):/ノート="ヒト・フィブロネクチンコラーゲ
ン結合性ドメイン" (343)..(347):/ノート="エンテロキナーゼ認識配列" (348)..(501):/ノート="ヒト繊維芽細胞増殖因子" 配列番号５ 人工配列の説明: ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト上皮増殖因子から成るハイブリッド
ポリペプチドのアミノ酸配列 (2)..(341):/ノート="ヒト・フィブロネクチンコラーゲ
ン結合性ドメイン" (343)..(347):/ノート="エンテロキナーゼ認識配列" (348)..(400):/ノート="ヒト上皮増殖因子" 配列番号６ 人工配列の説明: ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインのＰＣＲセンスプライマー 配列番号７ 人工配列の説明: ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインのＰＣＲアンチセンスプライマー 配列番号８ 人工配列の説明: 修飾されたヒト・フィブロネクチンコ
ラーゲン結合性ドメインをコードするＤＮＡの塩基配列 配列番号９ 人工配列の説明: ヒト繊維芽細胞増殖因子のＰＣＲセン
スプライマー 配列番号１０ 人工配列の説明: ヒト繊維芽細胞増殖因子のＰＣＲアン
チセンスプライマー 配列番号１１ 人工配列の説明: エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト繊維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡの塩基配
列 (228):/ ノート＝" ポリメラーゼチェーンリアクション
に起因する点変異" 配列番号１２ 人工配列の説明: ヒト上皮増殖因子のＰＣＲセンスプラ
イマー 配列番号１３ 人工配列の説明: ヒト上皮増殖因子のＰＣＲアンチセン
スプライマー 配列番号１４ 人工配列の説明: エンテロキナーゼ認識配列が付加され
たヒト上皮増殖因子をコードするＤＮＡの塩基配列 配列番号１５ 人工配列の説明: ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト繊維芽細胞増殖因子から成るハイブ
リッドポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列 配列番号１６ 人工配列の説明: ヒト・フィブロネクチンコラーゲン結
合性ドメインとヒト上皮増殖因子から成るハイブリッド
ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列

【０１７１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Terumo Corporation <120> Functional Hybrid Polypeptide with Collagen-binding Activity <130> 19990120 <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Modified Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <220> <221> INIT ＿MET <222> (1) <220> <221> DOMAIN <222> (2)..(341) <223> /note="human fibronectin collagen-binding domain" <220> <221> CONFLICT <222> (69) <220> <221> CONFLICT <222> (125) <400> 1 Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln 20 25 30 Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly 35 40 45 Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly 50 55 60 Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg 65 70 75 80 Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp 85 90 95 Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys 100 105 110 Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly 115 120 125 Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp 130 135 140 Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr Thr 145 150 155 160 Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala Ala 165 170 175 His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile Gly 180 185 190 Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys Thr 195 200 205 Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser Gln 210 215 220 Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn Asp 225 230 235 240 Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr Cys 245 250 255 Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln Cys 260 265 270 Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu 275 280 285 Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg Gly 290 295 300 Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser Ser 305 310 315 320 Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser 325 330 335 His Pro Ile Gln Trp Leu Glu 340 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Human Basic Fibroblast Growth Factor with Enterokinase Recognition Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> /note="enterokinase recognition sequence" <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(159) <223> /note="human fibroblast growth factor" <400> 2 Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp 20 25 30 Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His 35 40 45 Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile 50 55 60 Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly 65 70 75 80 Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu 85 90 95 Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu 100 105 110 Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr 115 120 125 Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly 130 135 140 Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Human Epidermal Growth Factor with Enterokinase Recognition Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> /note="enterokinase recognition sequence" <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(58) <223> /note="human epidermal growth factor" <400> 3 Asp Asp Asp Asp Lys Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp 1 5 10 15 Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp 20 25 30 Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln 35 40 45 Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 50 55 <210> 4 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hybrid Polypeptide of Human Fibronectin Collagen-Binding Domain and Human Basic Fibroblast Growth Factor <220> <221> INIT ＿MET <222> (1) <220> <221> DOMAIN <222> (2)..(341) <223> /note="human fibronectin collagen-binding domain" <220> <221> PEPTIDE <222> (343)..(347) <223> /note="enterokinase recognition sequence" <220> <221> PEPTIDE <222> (348)..(501) <223> /note="human fibroblast growth factor" <400> 4 Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln 20 25 30 Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly 35 40 45 Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly 50 55 60 Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg 65 70 75 80 Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp 85 90 95 Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys 100 105 110 Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly 115 120 125 Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp 130 135 140 Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr Thr 145 150 155 160 Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala Ala 165 170 175 His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile Gly 180 185 190 Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys Thr 195 200 205 Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser Gln 210 215 220 Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn Asp 225 230 235 240 Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr Cys 245 250 255 Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln Cys 260 265 270 Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu 275 280 285 Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg Gly 290 295 300 Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser Ser 305 310 315 320 Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser 325 330 335 His Pro Ile Gln Trp Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Gly Ser Ile 340 345 350 Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro 355 360 365 Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 370 375 380 Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu 385 390 395 400 Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly 405 410 415 Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys 420 425 430 Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe 435 440 445 Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg 450 455 460 Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys 465 470 475 480 Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro 485 490 495 Met Ser Ala Lys Ser 500 <210> 5 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hybrid Polypeptide of Human Fibronectin Collagen-Binding Domain and Human Epidermal Growth Factor <220> <221> INIT ＿MET <222> (1) <220> <221> DOMAIN <222> (2)..(341) <223> /note="human fibronectin collagen-binding domain" <220> <221> PEPTIDE <222> (343)..(347) <223> /note=" enterokinase recognition sequence" <220> <221> PEPTIDE <222> (348)..(400) <223> /note="human epidermal growth factor" <400> 5 Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln 20 25 30 Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly 35 40 45 Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly 50 55 60 Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg 65 70 75 80 Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp 85 90 95 Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys 100 105 110 Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly 115 120 125 Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp 130 135 140 Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr Thr 145 150 155 160 Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala Ala 165 170 175 His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile Gly 180 185 190 Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys Thr 195 200 205 Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser Gln 210 215 220 Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn Asp 225 230 235 240 Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr Cys 245 250 255 Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln Cys 260 265 270 Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu 275 280 285 Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg Gly 290 295 300 Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser Ser 305 310 315 320 Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser 325 330 335 His Pro Ile Gln Trp Leu Asp Asp Asp Asp Lys Asn Ser Asp Ser Glu 340 345 350 Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met 355 360 365 Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr 370 375 380 Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 385 390 395 400 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Sense Primer for Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <400> 6 gaggtaccat ggtacatatg gcagctgttt accaaccgca gcctcaccc 49 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Antisense Primer for Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <220> <400> 7 cgggatcctt actcgagcca ctggatgggg tgggagttgg gctgac 46 <210> 8 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Modified Human Fibronectin Collagen-Binding Domain <220> <221> conflict <222> (109) <220> <221> conflict <222> (206) <220> <221> conflict <222> (270) <220> <221> conflict <222> (374) <220> <221> conflict <222> (681) <400> 8 ggtaccatgg tacatatggc agctgtttac caaccgcagc ctcaccccca gcctcctccc 60 tatggccact gtgtcacaga cagtggtgtg gtctactctg tggggatgca gtggctgaag 120 acacaaggaa ataagcaaat gctttgcacg tgcctgggca acggagtcag ctgccaagag 180 acagctgtaa cccagactta cggtggcaac tcaaatggag agccatgtgt cttaccattc 240 acctacaatg gcaggacgtt ctactcctgc accacagaag ggcgacagga cggacatctt 300 tggtgcagca caacttcgaa ttatgagcag gaccagaaat actctttctg cacagaccac 360 actgttttgg ttcagactcg aggaggaaat tccaatggtg ccttgtgcca cttccccttc 420 ctatacaaca accacaatta cactgattgc acttctgagg gcagaagaga caacatgaag 480 tggtgtggga ccacacagaa ctatgatgcc gaccagaagt ttgggttctg ccccatggct 540 gcccacgagg aaatctgcac aaccaatgaa ggggtcatgt accgcattgg agatcagtgg 600 gataagcagc atgacatggg tcacatgatg aggtgcacgt gtgttgggaa tggtcgtggg 660 gaatggacat gcattgccta ctcgcagctt cgagatcagt gcattgttga tgacatcact 720 tacaatgtga acgacacatt ccacaagcgt catgaagagg ggcacatgct gaactgtaca 780 tgcttcggtc agggtcgggg caggtggaag tgtgatcccg tcgaccaatg ccaggattca 840 gagactggga cgttttatca aattggagat tcatgggaga agtatgtgca tggtgtcaga 900 taccagtgct actgctatgg ccgtggcatt ggggagtggc attgccaacc tttacagacc 960 tatccaagct caagtggtcc tgtcgaagta tttatcactg agactccgag tcagcccaac 1020 tcccacccca tccagtggct cgagtaagga tcc 1053 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Sense Primer for Human Basic Fibroblast Growth Factor <400> 9 gagtcgacga cgatgataag gcagccggga gcatcaccac 40 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Antisense Primer for Human Basic Fibroblast Growth Factor <400> 10 ggaattctca gctcttagca gacattggaa g 31 <210> 11 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Human Basic Fibroblast Growth Factor with Enterokinase Recognition Sequence <220> <221> mutation <222> (228) <223> /note="mutation caused by polymerase chain reaction" <400> 11 gtcgacgacg atgataaggc agccgggagc atcaccacgc tgcccgcctt gcccgaggat 60 ggcggcagcg gcgccttccc gcccggccac ttcaaggacc ccaagcggct gtactgcaaa 120 aacgggggct tcttcctgcg catccacccc gacggccgag ttgacggggt ccgggagaag 180 agcgaccctc acatcaagct acaacttcaa gcagaagaga gaggagtcgt gtctatcaaa 240 ggagtgtgtg ctaaccgtta cctggctatg aaggaagatg gaagattact ggcttctaaa 300 tgtgttacgg atgagtgttt cttttttgaa cgattggaat ctaataacta caatacttac 360 cggtcaagga aatacaccag ttggtatgtg gcactgaaac gaactgggca gtataaactt 420 ggatccaaaa caggacctgg gcagaaagct atactttttc ttccaatgtc tgctaagagc 480 tgagaattc 489 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Sense Primer for Human Epidermal Growth Factor <400> 12 gtgtcgacga cgatgataag aatagtgact ctgaatgtcc cctg 44 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Antisense Primer for Human Epidermal Growth Factor <400> 13 gaattcttag cgcagttccc accacttcag 30 <210> 14 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Human Epidermal Growth Factor with Enterokinase Recognition Sequence <400> 14 gtcgacgacg atgataagaa tagtgactct gaatgtcccc tgtcccacga tgggtactgc 60 ctccatgatg gtgtgtgcat gtatattgaa gcattggaca agtatgcatg caactgtgtt 120 gttggctaca tcggggagcg atgtcagtac cgagacctga agtggtggga actgcgctaa 180 gaattc 186 <210> 15 <211> 1527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hybrid Polypeptide of Human Fibronectin Collagen-Binding Domain and Human Fibroblast Growth Factor <400> 15 ggtaccatgg tacatatggc agctgtttac caaccgcagc ctcaccccca gcctcctccc 60 tatggccact gtgtcacaga cagtggtgtg gtctactctg tggggatgca gtggctgaag 120 acacaaggaa ataagcaaat gctttgcacg tgcctgggca acggagtcag ctgccaagag 180 acagctgtaa cccagactta cggtggcaac tcaaatggag agccatgtgt cttaccattc 240 acctacaatg gcaggacgtt ctactcctgc accacagaag ggcgacagga cggacatctt 300 tggtgcagca caacttcgaa ttatgagcag gaccagaaat actctttctg cacagaccac 360 actgttttgg ttcagactcg aggaggaaat tccaatggtg ccttgtgcca cttccccttc 420 ctatacaaca accacaatta cactgattgc acttctgagg gcagaagaga caacatgaag 480 tggtgtggga ccacacagaa ctatgatgcc gaccagaagt ttgggttctg ccccatggct 540 gcccacgagg aaatctgcac aaccaatgaa ggggtcatgt accgcattgg agatcagtgg 600 gataagcagc atgacatggg tcacatgatg aggtgcacgt gtgttgggaa tggtcgtggg 660 gaatggacat gcattgccta ctcgcagctt cgagatcagt gcattgttga tgacatcact 720 tacaatgtga acgacacatt ccacaagcgt catgaagagg ggcacatgct gaactgtaca 780 tgcttcggtc agggtcgggg caggtggaag tgtgatcccg tcgaccaatg ccaggattca 840 gagactggga cgttttatca aattggagat tcatgggaga agtatgtgca tggtgtcaga 900 taccagtgct actgctatgg ccgtggcatt ggggagtggc attgccaacc tttacagacc 960 tatccaagct caagtggtcc tgtcgaagta tttatcactg agactccgag tcagcccaac 1020 tcccacccca tccagtggct cgacgacgat gataaggcag ccgggagcat caccacgctg 1080 cccgccttgc ccgaggatgg cggcagcggc gccttcccgc ccggccactt caaggacccc 1140 aagcggctgt actgcaaaaa cgggggcttc ttcctgcgca tccaccccga cggccgagtt 1200 gacggggtcc gggagaagag cgaccctcac atcaagctac aacttcaagc agaagagaga 1260 ggagtcgtgt ctatcaaagg agtgtgtgct aaccgttacc tggctatgaa ggaagatgga 1320 agattactgg cttctaaatg tgttacggat gagtgtttct tttttgaacg attggaatct 1380 aataactaca atacttaccg gtcaaggaaa tacaccagtt ggtatgtggc actgaaacga 1440 actgggcagt ataaacttgg atccaaaaca ggacctgggc agaaagctat actttttctt 1500 ccaatgtctg ctaagagctg agaattc 1527 <210> 16 <211> 1224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Hybrid Polypeptide of Human Fibronectin Collagen-Binding Domain and Human Epidermal growth factor <400> 16 ggtaccatgg tacatatggc agctgtttac caaccgcagc ctcaccccca gcctcctccc 60 tatggccact gtgtcacaga cagtggtgtg gtctactctg tggggatgca gtggctgaag 120 acacaaggaa ataagcaaat gctttgcacg tgcctgggca acggagtcag ctgccaagag 180 acagctgtaa cccagactta cggtggcaac tcaaatggag agccatgtgt cttaccattc 240 acctacaatg gcaggacgtt ctactcctgc accacagaag ggcgacagga cggacatctt 300 tggtgcagca caacttcgaa ttatgagcag gaccagaaat actctttctg cacagaccac 360 actgttttgg ttcagactcg aggaggaaat tccaatggtg ccttgtgcca cttccccttc 420 ctatacaaca accacaatta cactgattgc acttctgagg gcagaagaga caacatgaag 480 tggtgtggga ccacacagaa ctatgatgcc gaccagaagt ttgggttctg ccccatggct 540 gcccacgagg aaatctgcac aaccaatgaa ggggtcatgt accgcattgg agatcagtgg 600 gataagcagc atgacatggg tcacatgatg aggtgcacgt gtgttgggaa tggtcgtggg 660 gaatggacat gcattgccta ctcgcagctt cgagatcagt gcattgttga tgacatcact 720 tacaatgtga acgacacatt ccacaagcgt catgaagagg ggcacatgct gaactgtaca 780 tgcttcggtc agggtcgggg caggtggaag tgtgatcccg tcgaccaatg ccaggattca 840 gagactggga cgttttatca aattggagat tcatgggaga agtatgtgca tggtgtcaga 900 taccagtgct actgctatgg ccgtggcatt ggggagtggc attgccaacc tttacagacc 960 tatccaagct caagtggtcc tgtcgaagta tttatcactg agactccgag tcagcccaac 1020 tcccacccca tccagtggct cgacgacgat gataagaata gtgactctga atgtcccctg 1080 tcccacgatg ggtactgcct ccatgatggt gtgtgcatgt atattgaagc attggacaag 1140 tatgcatgca actgtgttgt tggctacatc ggggagcgat gtcagtaccg agacctgaag 1200 tggtgggaac tgcgctaaga attc 1224

【図面の簡単な説明】

【図１】 コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの模
式図である。

【図２】 生理活性ペプチド複合化コラーゲンマトリッ
クスの模式図である。

【図３】 ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのゼラチン結合性を調べ
たバッチ法の概念図である。

【図４】 バッチ法における上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
ゲルを示す図である。

【図５】 コラーゲン結合活性を調べたＥＬＩＳＡの概
念図である。

【図６】 ＦＮＣＢＤのコラーゲン結合活性（ＥＬＩＳ
Ａ) を示す図である。

【図７】 ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのコラーゲン結合活性
（ＥＬＩＳＡ) を示す図である。

【図８】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦのコラーゲン結合活性
（ＥＬＩＳＡ) を示す図である。

【図９】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦのＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞に対する増殖活性を示す図である。

【図１０】 ＦＮＣＢＤ−ＦＧＦのヒト繊維芽細胞に対
する増殖活性を示す図である。

【図１１】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦのＮＲＫ４９Ｆ細胞に
対する細胞増殖活性を示す図である。

【図１２】 コラーゲン結合生理活性ポリペプチドの新
規な機能性を模式的に示す図である。

【図１３】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ複合化コラーゲンとＥ
ＧＦのヒト角化細胞に対する増殖活性を示す図である。

【図１４】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦとＥＧＦのコラーゲン
結合活性の比較を示す図である。

【図１５】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦ複合化コラーゲンによ
る細胞増殖活性の長期安定性を示す図である。

【図１６】 高濃度タンパク質溶液中でのＦＮＣＢＤ−
ＥＧＦとＥＧＦのコラーゲンターゲティング活性の比較
を示す図である。

【図１７】 ＦＮＣＢＤ−ＥＧＦのヒト血漿ＦＮによる
徐放、放出特性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｈ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 BA21 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 4B064 AG02 AG13 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C076 AA95 CC41 CC50 EE43 FF32 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA01 DA20 DA21 EA20 FA72 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フィブロネクチン由来のペプチドと生理活
   性ペプチドとが連結したポリペプチドであって、コラー
   ゲン結合活性及び生理活性の両活性を有するコラーゲン
   結合性生理活性ポリペプチド。
2. 【請求項２】前記生理活性ペプチドが、フィブロネクチ
   ン由来のペプチドのカルボキシル末端に連結されている
   請求項１に記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
   ド。
3. 【請求項３】前記フィブロネクチン由来のペプチドが、
   フィブロネクチンのプロテアーゼ分解により得られ、か
   つコラーゲン結合性ドメインを構成するアミノ酸配列、
   あるいは該配列と相同または１もしくは数個のアミノ酸
   が欠失、置換、挿入もしくは付加されたコラーゲン結合
   性のアミノ酸配列からなる請求項１または２に記載のコ
   ラーゲン結合性生理活性ポリペプチド。
4. 【請求項４】該フィブロネクチン由来のペプチドが、ヒ
   ト・フィブロネクチンのAla ²⁶⁰ からTrp ⁵⁹⁹ までのポ
   リペプチドを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と
   相同または１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿
   入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる請求項１ま
   たは２に記載のコラーゲン結合性生理活性ポリペプチ
   ド。
5. 【請求項５】該生理活性ペプチドがサイトカインまたは
   細胞成長因子である請求項１〜４のいずれかに記載のコ
   ラーゲン結合性生理活性ポリペプチド。
6. 【請求項６】該生理活性ペプチドが該フィブロネクチン
   由来のペプチドに遺伝子工学的手法により連結されてい
   る請求項１〜５のいずれかに記載のコラーゲン結合性生
   理活性ポリペプチド。
7. 【請求項７】該生理活性ペプチドが該フィブロネクチン
   由来のペプチドに遺伝子工学的手法により連結され、バ
   クテリアで産生される請求項１〜６のいずれかに記載の
   コラーゲン結合性生理活性ポリペプチド。
8. 【請求項８】コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドが
   水溶性である請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲ
   ン結合性生理活性ポリペプチド。
9. 【請求項９】コラーゲンに結合後、結合を保持したまま
   かまたは徐放されることにより生理活性を示す請求項１
   〜８のいずれかに記載のコラーゲン結合性生理活性ポリ
   ペプチド。
10. 【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載のコラー
    ゲン結合性生理活性ポリペプチドを含有する生理活性ポ
    リペプチドの局所維持剤、徐放剤、または生理活性付与
    剤。
11. 【請求項１１】コラーゲン結合性生理活性ポリペプチド
    とコラーゲン由来のポリペプチドとが複合化された生理
    活性ペプチド複合化コラーゲンを含有するバイオマテリ
    アル。
12. 【請求項１２】コラーゲン結合性生理活性ポリペプチド
    が請求項１〜９のいずれかに記載のコラーゲン結合性生
    理活性ポリペプチドである請求項１１に記載のバイオマ
    テリアル。
13. 【請求項１３】請求項１１または１２に記載のバイオマ
    テリアルを含有する生理活性ポリペプチドの局所維持
    剤、徐放剤、または生理活性付与剤。
14. 【請求項１４】請求項１〜９のいずれかに記載のコラー
    ゲン結合性生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子を
    含有する組換えベクター。
15. 【請求項１５】請求項１〜９のいずれかに記載のコラー
    ゲン結合性生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子を
    含有する組換えベクターを含む形質転換体。