JP2005517658A - 組織操作のための成長因子改変タンパク質マトリクス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、PTHおよびマトリクスと結合相互作用させるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはペプチドに関し、そして組織修復および組織再生、ならびにPTHの制御された放出における融合タンパク質またはペプチドの使用に関する。
上皮小体ホルモン(PTH)は、84アミノ酸ペプチドであり、これは、上皮小体によって作られ、分泌される。このホルモンは、種々の組織(骨を含む)に対するその作用による血清カルシウムレベルの制御において主要な役割を果たす。ヒトにおいて種々の形態のPTHを用いた研究は、骨に対して同化効果を示し、これは、骨粗鬆症および関連する骨障害の処置についてこれらPTHを興味深いものにする(Chorevらに対する、米国特許第5,747,456号およびEli Lilly & Co.に対するWO00/10596)。上皮小体ホルモンは、細胞表面レセプターへの結合によって細胞に対して作用する。このレセプターは、骨芽細胞(新規の骨を形成することを担う細胞)において見出されることが公知である。
1つのドメインの上皮小体ホルモン(PTH)および別のドメインのマトリクスに共有結合的に架橋され得る基体ドメインを含む融合ペプチド、ならびにマトリクス、ならびにこのような融合タンパク質またはペプチドを含むキットが、本明細書中で開示される。融合タンパク質は、天然材料または合成材料に共有結合され、マトリクスを形成し、これは、骨欠損を治癒するために使用され得る。必要に応じて、マトリクスを形成するための全ての成分は、骨欠損に適用され、マトリクスは、適用部位で形成される。融合ペプチドは、マトリクスに組込まれ得、その結果、融合ペプチド全体または第1のドメインのそれぞれのPTH配列のみのいずれかで、マトリクスの分解によって、酵素作用によって、および/または加水分解作用によって、遊離される。融合ペプチドはまた、第1のドメインと第2のドメインとの間に分解可能な結合を含み得、この結合は、加水分解切断部位または酵素切断部位を含む。特に、融合ペプチドは、1つのドメインにPTH、第2のドメインでマトリクスに共有結合的に架橋され得る基体ドメイン、第1のドメインと第2のドメインとの間の分解部位を含む。好ましくは、PTHは、ヒトPTHであるが、他の供給源由来のPTH(例えば、ウシPTH)は、適切であり得る。PTHは、PTH1−84(ネイティブ)、PTH1−38、PTH1−34、PTH1−31、もしくはPTH1−25であり得るか、または前述の特徴に類似する特徴(すなわち、骨形成)を示すPTHの任意の改変バージョンもしくは対立遺伝子バージョンであり得る。分解部位は、マトリクス内の種々の位置で変化する送達速度を可能にし、これは、その位置での、および/またはマトリクス内での細胞活性に依存する。さらなる利点としては、送達システム内でのより低い総薬物用量、より大きなパーセンテージの薬物が最大の細胞活性の時点で遊離されることを可能にする放出の空間制御が挙げられる。
硬組織の修復、再生または再構築のため、特に、骨の成長のための、その中に放出可能に組み込まれたPTHを有する天然および合成のマトリクスを使用する製品および方法が、本明細書中で記載される。天然マトリクスは、生体適合性かつ生分解性であり、そして移植時に、インビトロまたはインビボで形成され得る。PTHは、このマトリクスに組み込まれ得、そしてその完全な生体活性を保持する。PTHは、PTHがどのように放出されるか、およびPTHが何時放出されるか、およびPTHがどの程度放出されるかの制御を提供する技術を使用して、放出可能に組み込まれ得、その結果、このマトリクスは、制御放出ビヒクルとしてこのマトリクスを使用して、直接的または間接的に組織修復のために使用され得る。
「生体材料」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、材料に永久的または一時的に依存して、身体の任意の組織、器官または機能を評価、処置、増強または置換する生物学的系とインターフェースすることを意図される材料をいう。用語「生体材料」および「マトリクス」は、本明細書中で同義で使用され、そしてマトリクスの性質に依存して、水で膨潤され得るが、水中に溶解しない(すなわち、外傷のある硬組織または欠損硬組織の特定の支持機能を果たす特定の期間、身体中に留まるヒドロゲルを形成する)架橋ポリマーネットワークを意味する。
「多官能性」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、1分子(すなわち、モノマー、オリゴマーおよびポリマー)あたりの求電子官能基および/または求核性官能基が1つより多いことをいう。
(A.マトリクス材料)
マトリクスは、前駆体分子をポリマーネットワークにイオン的に架橋するか、共有結合的に架橋するか、またはその組み合わせによって、あるいは、1つ以上のポリマー材料(すなわち、マトリクス)を膨潤させて、マトリクス内への細胞の内方増殖または移動を可能にするために十分なポリマー間間隔を有するポリマーネットワークを形成することによって、形成される。
フィブリンは、いくつかの生物学的適用に関して報告された、天然材料である。フィブリンは、Hubbellらに対する米国特許第6,331,422号において、細胞内方増殖マトリクスのための材料として記載されている。フィブリンゲルは、その多くの組織に結合する能力および損傷治癒におけるその天然の役割に起因して、シーラントとして使用されている。いくつかの特定の適用としては、血管移植片付着、心臓弁付着、骨折における骨の配置、および腱修復のためのシーラントとしての使用が挙げられる(Sierra,D.H.,Journal of Biomaterials Applications,7:309−352(1993))。さらに、これらのゲルは、薬物送達デバイスとして、および神経再生のために、使用されている(Williamsら、Journal of Comparative Neurobiology,264:284−290(1987))。フィブリンは、組織の再生および細胞の内方増殖のための固体支持体を提供するが、これらのプロセスを直接増強するモノマーにおいて、活性な配列はほとんど存在しない。
身体への適用のための合成マトリクスを形成するための架橋反応としては、以下が挙げられる:(i)不飽和二重結合を含む2つ以上の前駆体間でのフリーラジカル重合(例えば、Hernら,J.Biomed.Mater.Res.39:266−276(1998)に記載される)、(ii)例えば、アミン基を含む前駆体とスクシンイミジル基を含む前駆体との間でのような、求核置換反応(Rheeらに対する米国特許第5,874,500号に開示される)、(iii)縮合および付加反応、ならびに(iv)強い求核試薬と共役不飽和基または結合(強い求電子試薬として)との間の、Michael型付加反応。特に好ましいものは、求核性基としてのチオール基またはアミン基を有する前駆体分子と、求電子性基としてのアクリレート基またはビニルスルホン基を含む前駆体分子との間の反応である。求核性基として最も好ましいものは、チオール基である。Michael型付加反応は、Hubbellらに対するWO00/44808に記載されており、その内容は、本明細書中に参考として援用される。Michael型付加反応は、感受性の生物学的物質の存在下でさえも、少なくとも第一および第二の前駆体成分の、生理学的条件下での、自己選択的様式でのインサイチュでの架橋を可能にする。前駆体成分の1つが少なくとも2つの官能基を有し、そして他の前駆体のうちの少なくとも1つが2つより多い官能基を有する場合、この系は、自己選択的に反応して、架橋した三次元生体物質を形成する。
細胞は、細胞表面において、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−オリゴ糖相互作用、およびタンパク質−多糖相互作用を介して、それらの環境と相互作用する。細胞外マトリクスタンパク質は、細胞に対する宿主の生物活性信号を提供する。この密なネットワークは、細胞を支持するために必要とされ、そしてマトリクス中の多くのタンパク質が、細胞の接着、拡散、移動および分化を制御することが示されている(Carey,Annual Review of Physiology,53:161−177,1991)。特に活性であることが示された特定のタンパク質のいくつかとしては、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノゲンおよびコラーゲンが挙げられる(Lander,Journal of Trends in Neurological Science,12:189−195,1989)。ラミニンの多くの研究が実施され、そしてラミニンが、インビボで神経の、そしてインビトロで神経細胞の、発達および再生において(Williams,Neurochemical Research,12:851−869,1987)、ならびに新脈管形成において、重要な役割を果たすことが示された。
PTH融合ペプチドは、架橋され得、そしてPTH融合ペプチドの架橋性基質ドメインを通じてマトリクスに共有結合し得る。基質ドメインの種類は、マトリクスの性質に依存する。フィブリンマトリクスへの組み込みについて、トランスグルタミナーゼ基質ドメインが特に好ましい。トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、第XIIIa因子基質ドメインであり得る。この第XIIIa因子基質ドメインは、GAKDV(配列番号10)、KKKK(配列番号11)、またはNQEQVSPL(配列番号12)を含み得る。PTHとトランスグルタミナーゼ基質ドメインとの間のカップリングは、化学合成により実施され得る。
本明細書中に記載される場合、用語「PTH」は、生物学的に分解可能な天然マトリクスまたは合成マトリクスに共有結合する場合、骨形成の特質を示す、PTH1〜84ならびにPTHの全ての短縮されたバージョン、修飾を受けたバージョンおよび対立形質バージョンのヒト配列を含む。PTHの好ましい短縮化バージョンは、PTH1〜38、PTH1〜34、PTH1〜31またはPTH1〜25である。最も好ましくは、PHH1−34である。好ましくは、PTHはヒトPTHである、ウシPTHのような、他の供給源由来のPTHが適切であり得る。
PTHのマトリクス内への取り込みに関する1つの好ましい実施形態において、マトリクスは、フィブリノゲンから形成されるフィブリン、カルシウム供給源およびトロンビンを含い、そしてPTH融合ペプチドは、凝固中にフィブリン内に取り込まれる。PTH融合ペプチドは、2つのドメイン、すなわち、第1ドメインと第2ドメインを含む融合タンパク質として設計される。1つのドメイン、すなわち第2ドメインは、第XIIIa因子のような酵素のための基質である。第XIIIa因子は、凝固中に活性化されるトランスグルタミナーゼである。この酵素は、トロンビンによる切断によって第XLLLa因子から自然に形成され、グルタミン側鎖とリジン側鎖との間に形成されるアミド結合を通じて、互いにフィブリン鎖に結合する機能を有する。酵素はまた、凝固中にフィブリン(例えば、細胞結合部位)に他のペプチドを結合するように機能し、ただし、この細胞結合部位は、第XIIIa因子をまた含む。
PTHを含む第1ドメイン、架橋酵素に対する基質ドメインを含む第2ドメインおよび必要に応じて第1ドメインと第2ドメインとの間にある分解部位を含むPTH融合ペプチドは、幾つかの異なるスキームを用いてフィブリンゲル内に取り込まれ得る。好ましくは、第2ドメインは、トランスグルタミナーゼ基質ドメインを含み、よりさらに好ましくは、第2ドメインは第XIIIa因子基質ドメインを含む。最も好ましくは、第XIIIa因子基質ドメインは、NQEQVSP(配列番号16)を含む。このPTH融合ペプチドが、フィブリノゲンの重合の間、(すなわち、フィブリンマトリクスの形成の間)に存在する場合、その融合ペプチドは、マトリクス内に直接取り込まれる。
マトリクスは、組織の修復、再生、もしくは再構築のため、そして/またはPTHの放出のために、移植の前または移植のときに使用され得る。いくつかの場合において、移植部位においてマトリクスを組織に適合させるために、投与の部位に架橋を誘導することが望ましい。他の場合において、移植の前に、マトリクスを調製することが便利である。
好ましい実施形態において、この物質は、インサイチュまたは身体の中もしくは身体上でゲル化される。別の実施形態において、このマトリクスは、身体の外側で形成され得、次いで、予め形成された形状で適用される。マトリクス物質は、合成または天然の前駆体組成物から作製され得る。使用される前駆体組成物の種類とは無関係に、前駆体成分は、身体への混合物の適用の前に分離され、成分の重合またはゲル化を可能にする条件下での互いの混合または接触を防止されるべきである。投与より前の接触を避けるために、組成物を互いに分離させるキットが、使用され得る。重合を可能にする条件下での混合の際に、この組成物は、生体活性因子を補充された三次元ネットワークを形成する。前駆体組成物およびそれらの濃度に依存して、ゲル化は、混合の後、半瞬間的に生じ得る。このような迅速なゲル化は、注入(すなわち、注射針を通してのゲル化物質の押し込み)をほとんど不可能なものにする。
(TGPTHの合成)
完全タンパク質と類似の活性を示すPTH1〜34マーペプチド、およびこの長さのタンパク質を、標準的な固相ペプチド合成法によって合成し得る。
骨再生を増強するTGPTHの活性を、TISSUCOL(登録商標)マトリクスにおいて、ヒツジドリル穴欠損(sheep drill holl defect)において試験した。12mmの深さの8mmの穴を、ヒツジの近位および遠位の大腿および上腕に作成した。これらの穴を、インサイチュ重合化フィブリンゲルで満たした。欠損を、空のままにし、TISSUCOL(登録商標)で満たすか、またはTGPTHを、重合化の前に400μg/mLでTISSUCOL(登録商標)フィブリンに添加した。TISSUCOL(登録商標)が使用された各例において、これを、標準的な利用可能な濃度から4倍希釈し、12.5mg/mLのフィブリノゲン濃度にした。
(材料)
フィブリンマトリクス内に組み込まれ得る改変バージョンのPTH1−34を、致命的な大きさのラット頭蓋欠損における治癒応答について試験した。
ラットに麻酔し、頭蓋骨を露出した。頭蓋の外部表面の骨膜を撤回し、その結果、骨膜は治癒プロセスにおいて役割を果たさず、そして、単一の8mm円形欠損を生じた。8mmより大きい欠損が自発的にそれ自身によって治癒されず、そして致命的な大きさの欠損であると以前に決定されたので、この欠損の大きさを選択した。次いで、この欠損を前もって形成したフィブリンマトリクスで充填し、そして動物を3および7週間治癒させた。次いで、この欠損領域を外植し、放射線学および組織学的に分析した。
TG−pl−PTH1−34を3週の時点で研究した場合、治癒のレベルは、フィブリンマトリクス単体で観察されるものと非常に類似した。他の潜在的なモルフォゲン(rhBMP−2を含む)が3週までに強力な治癒効果を示したできるだけ早い時点として、3週の時点を選択した。対照的に、TG−pl−PTH1−34についでの治癒効果は、この早い時点では観察され得なかった。しかし、より長い時点(7週)で分析される場合、フィブリンマトリクスに改変したPTH1−34を添加する致命的な大きさのラット頭蓋欠損における治癒において、中程度用量に依存する改善が観察された。結果を表3に示す。高用量の改変PTH1−34を使用する場合、治癒応答は65%まで上昇した。
(表3:ラットの頭蓋欠損における改変PTHでの治癒応答)
TG−pl−PTH1−34を、骨治癒に関するこのホルモンの効果を調べるために、長い骨欠損モデルにおいても同様に試験した。ヒツジドリル欠損モデルにおいて、約15mmの深さの8mmの円柱状のドリル欠損を、大腿骨および上腕骨の近位領域および遠位領域の両方に配置した。欠損を長骨の骨端に配置したので、この欠損は、欠損の周縁に皮質骨の薄層を有する小柱骨に囲まれた。次いで、これらの欠損を、種々の用量のTG−pl−PTH1−34またはTGPTH1−34を含むインサイチュ重合化フィブリン(約750μL)で充填した。動物を8週間治癒させ、次いで屠殺した。欠損をμCTおよび組織学で分析した。
改変したPTH1−34分子のいずれかを長骨欠損内に配置した場合、フィブリンマトリクス(コントロール)単独の使用よりも、治癒応答における有意な改善が観察された。フィブリン単独の使用では、ほとんど治癒せず、最初の欠損の20%のみが新しく形成された骨で充填された。
(PEG−ビニルスルホンの調製)
市販の分岐(4アームPEG,分子量14,800,4アームPEG,分子量10,000および8アームPEG,分子量20,000;Shearwater Polymers,Huntsville,AL,USA)を、OH末端で官能基化した。アルゴン雰囲気下で、(予め、分子ふるいを通して乾燥させた)前駆体ポリマーのジクロロメタン溶液をNaHと反応させ、次いで水素の放出後、ジビニルスルホン(モル比:OH 1:NaH 5:ジビニルスルホン 50)と反応させることによって、PEGビニルスルホンを生成した。この反応を、室温で3日間、アルゴン下で、絶え間なく攪拌しながら行った。この反応溶液を、高濃度の酢酸で中和した後、この溶液を、透明になるまで紙を通して濾過した。この誘導体化ポリマーを、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿によって単離した。この生成物を、ジクロロメタン中に再溶解し、(十分に洗浄して)ジエチルエーテル中に2回再沈殿させ、全ての過剰なジビニルスルホンを除去した。最終的に、この生成物を、真空下で乾燥させた。この誘導体化を、1H NMRで確認した。この生成物は、6.21ppm(2つの水素)および6.97ppm(1つの水素)で、特徴的なビニルスルホンピークを示した。末端基変換の程度は、100%と実測された。
アルゴン雰囲気下で、共沸的に(azeotropically)乾燥させた前駆体ポリマーのトルエン溶液を、トリエチルアミンの存在下でアクリロイルクロライドと反応させて(モル比:OH 1:アクリロイルクロライド 2:トリエチルアミン 2.2)、PEGアクリレートを生成した。この反応を、室温で暗所で一晩攪拌して進行させた。生じた淡黄色の溶液を、中性のアルミナベッドを通して濾過し;この溶媒をエバポレートした後、反応生成物をジクロロメタンに溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。
全てのペプチドを、自動化ペプチドシンセサイザー(9050 Pep Plus Synthesizer, Millipore,Framingham,USA)を用いて、標準的な9−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学を用いて、固体樹脂上で合成した。疎水性スカベンジャーおよび分割された保護基を、冷ジエチルエーテル中でのペプチドの沈殿および脱イオン水中への溶解によって、除去した。凍結乾燥後、これらのペプチドを、0.03Mトリス緩衝化生理食塩水(TBS,pH7.0)に再溶解させ、移動緩衝液としてTBS,pH7.0を用いたサイズ排除カラムにおけるHPLC(Waters;Milford,USA)を使用して、精製した。
MMP感受性ゲルを、タンパク質分解性の細胞遊走を可能にするペプチド連鎖求核およびPEG連鎖共役不飽和を伴う共役付加によって、形成した。ゲルの合成を、ビニルスルホン官能基化PEG上に、チオールPEGのマイケル型付加反応を、全面的に介して達成した。第一工程において、接着ペプチドを、マルチアームPEGビニルスルホンにペンダント状に付着させ(例えば、ペプチド
MMP感受性ゲルを、タンパク質分解性の細胞遊走を可能にする、ペプチドXリンカー含有複合アミンと親電子的活性PEGとの縮合反応によって形成した。
2つの異なる開始濃度の酵素分解可能なゲルを使用した。これらの各々において、RGDの濃度および活性因子(100μg/mLでのCplPTH)を一定に保った。分子量20kD(各分岐の分子量は5kD)の4つのビニルスルホン末端基で官能基化されたPEGから分岐した4つの分岐および以下の配列Gly−Cys−Arg−Asp−(Gly−Pro−Gln−Gly−Ile−Trp−Gly−Gln)−Asp−Arg−Cys−Gly(配列番号21)のジチオールペプチドから重合網目構造を形成した。両方の前駆成分を0.3Mのトリエタノールアミンに溶解した。官能基化PEG(第1の前駆分子)およびジチオールペプチド(第2の前駆分子)の開始濃度を変化させた。1つの場合において、この濃度は組成物(第1および第2の前駆成分+トリエタノールアミン溶液)の総重量の12.6重量%であった。12.6重量%は、第1の前駆成分のみに基づいて計算した場合、10重量%溶液に対応する(100mg/mL第1の前駆分子)。第2の開始濃度は、組成物(第1および第2の前駆成分+トリエタノールアミン溶液)の総重量の9.5重量%であり、これは、総重量の第1の前駆成分のみに基づいて計算した場合、7.5重量%に対応する(75mg/mL第1の前駆分子)。このことは、ビニルスルホンとチオールとの間のモル比が維持されるようにジチオールペプチドの量が変化したという結果を有する。
ゲルの開始濃度 石灰化組織
12.6% 2.7%
9.5% 38.4%
ゲルをより低密度にし、そして細胞浸透をより容易にすることによって、活性因子の添加により生じる治癒応答は、より強いものであった。8.5重量%より低い最終固体濃度を有することの効果は、これらの結果から明らかである。
PTH1−34融合ペプチドを、合成ゲル、およびフィブリンマトリクスについて正確に記載されたヒツジ穿孔欠損モデルにおいて試験した。ヒドロゲルネットワークを、アクリル化4アームポリエチレングリコール(MW 15,000(Peg4*15Acr))と、MW 3400の線状ポリエチレングリコールジオールとを一緒に混合することにより作製した。Michael型反応を介して、2つの成分が0.3Mトリエタノールアミンの緩衝液(pH8.0)中で混合される場合、このpHにおいて形成される得られるチオレートは、次いで、結合体化した不飽和のアクリレートと反応し、共有結合を生成し得た。多機能前駆体を一緒に混合する(例えば、合わされた多機能性は、5以上である)ことによって、ヒドロゲルが、形成される。さらに、生体活性因子は、同一の反応スキームを介して、マトリクスに付加され得る。この場合、生体活性因子(細胞接着動機、または形態学またはマイトジェン因子が挙げられる)は、システイン、チオール含有アミノ酸を配列に付加することによって、マトリクスに結合され得る。ここで、本発明者らは、細胞接着配列であるRGD、より具体的には、RGDSP(配列番号23)ならびにPTH1−34配列にシステインを付加し、そして両方を、架橋剤中のアクリレートを介して、マトリクスに結合した。続いて、これらの新たに形成されたヒドロゲルは、次いで、チオール付近に多数のエステルを有し、このエステルは、加水分解的に不安定であることが示された。この不安定性は、ゲルがゆっくりと分解し、そして新たに形成された組織によって置換されることを可能にする。
Claims (19)
- 融合ペプチドであって、該融合ペプチドは、以下:
PTHを含む第1のドメインおよび
共有結合的に架橋可能な基質ドメインを含む第2のドメイン
を含む、
融合ペプチド。 - 前記第1のドメインと前記第2のドメインとの間の分解部位をさらに含む、請求項1に記載の融合ペプチド。
- 前記PTHが、PTH 1−84、PTH 1−28、PTH 1−34、PTH 1−31およびPTH 1−25からなる群から選択される、請求項1に記載の融合ペプチド。
- 前記PTHがPTH 1−34である、請求項3に記載の融合ペプチド。
- 前記第2のドメインが、トランスグルタミナーゼ基質ドメインを含む、請求項1に記載の融合ペプチド。
- 前記第2のドメインが、第XIIIa因子基質ドメインを含む、請求項5に記載の融合ペプチド。
- 前記第XIIIa因子基質ドメインが、配列番号12を含む、請求項6に記載の融合ペプチド。
- 前記第2のドメインが、少なくとも1つのシステインを含む、請求項1に記載の融合ペプチド。
- 前記分解部位が、酵素的分解部位または加水分解性分解部位である、請求項2に記載の融合ペプチド。
- 前記分解部位が、酵素的分解部位であって、該酵素的分解部位が、プラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼからなる群から選択される酵素によって切断される、請求項8に記載のペプチド。
- 請求項1〜10に記載の融合ペプチドを含むキット。
- フィブリノゲン、トロンビンおよびカルシウム供給源をさらに含む、請求項11に記載のキット。
- 前記キットが、架橋酵素をさらに含む、請求項11に記載のキット。
- 請求項1〜10に記載の融合ペプチドを含む、細胞の増殖または内方増殖に適切なマトリクスであって、該融合ペプチドは該マトリクスに共有結合される、マトリクス。
- 前記マトリクスがフィブリンである、請求項14に記載のマトリクス。
- 請求項14に記載のマトリクスであって、該マトリクスは、n個の求核基を含む第1の前駆体分子とm個の求電子基を含む第2の前駆体分子との間でマイケル型付加反応によって形成され、ここでnおよびmは少なくとも2であり、そしてn+mの合計は少なくとも5である、マトリクス。
- 請求項16に記載のマトリクスであって、前記求電子基は不飽和基に結合体化され、そして該求核基は、チオールおよびアミンからなる群から選択される、マトリクス。
- 前記マトリクスがポリエチレングリコールを含む、請求項14に記載のマトリクス。
- マトリクスを作製するための方法であって、該方法は、以下:
架橋されたマトリクスを形成し得る少なくとも1つのマトリクス材料を提供する工程であって、ここで該マトリクス材料は、タンパク質および合成材料からなる群から選択される、工程、
請求項1〜10に記載の融合ペプチドを該マトリクス材料に添加する工程、および
該マトリクス材料を架橋し、その結果、該融合ペプチドが第2のドメインを通ってマトリクスに結合される工程
を包含する、
方法。
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