KR100925070B1 - 성장인자로 변형된 조직 엔지니어링용 단백질 메트릭스 - Google Patents
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Abstract
조직 치유, 재생 및/또는 재형성 및/또는 약물 운반에서 사용되는 단백질 또는 다당류 메트릭스에 단백질이 도입된다. 상기 단백질은 효소 작용 및/또는 확산에 의해 메트릭스가 분해되어 방출되도록 도입된다. 실시예를 통해 증명하는 바와 같이, 공유 또는 비공유 방법을 통해 메트릭스에 헤파린을 결합시켜 헤파린-메트릭스를 형성시키는 방법이 있다. 상기 헤파린은 비공유적으로 헤파린-결합 성장 인자를 단백질 메트릭스에 결합시킨다. 다른 방법으로는, 인자 ⅩⅢa 기질 및 고유 단백질 서열과 같은 가교결합 도메인을 함유하는 융합 단백질을 제작할 수 있다. 메트릭스와 생활성 인자사이에 분해가능한 결합을 도입하는 것은 장기적인 약물 운반이 바람직한 경우, 예를 들어, 신경 재생의 경우, 재생 기능에 따라 공간적으로 약제의 방출 속도가 다양한 것이 바람직한 부분에서, 예를 들어, 살아있는 조직면 근처에서는 빠르고 상처 영역에서는 보다 느리게 이동하는 것이 바람직한 부분에서 특히 유용하다. 추가적인 장점으로는 운반 시스템에서 보다 낮은 총 약물 용량, 및 세포 활성이 최대인 시점에서 보다 많은 비율의 약물을 방출할 수 있도록 하는 방출의 공간 조절을 포함한다.
피브린, 뼈 치유, PTH, 단백질, 조직, 성장 인자
Description
본 발명은 PTH 및 메트릭스와 결합작용이 가능한 아미노산 서열을 함유하는 융합 펩타이드 또는 펩타이드, 및 조직을 치유(repair)하고 재생하기 위해, 그리고 PTH의 방출을 제어하기 위해 상기 융합 펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH)은 부갑상샘(parathyroid gland)에서 만들어져서 분비되는 84개 아미노 펩타이드이다. 상기 호르몬은 뼈를 포함하여, 다양한 조직에서 작용하면서 혈청의 칼슘 수준을 제어하는 주요한 역할을 수행한다. 다양한 형태의 PTH를 갖는 인간에 대한 연구는 뼈에 대한 동화작용을 증명하였고, 이는 골다공증 및 뼈 관련 질환의 치료 분야에서 관심을 갖게 되었다(Chorev등의 미국 특허 제5,747,456호 및 Eli Lilly & Co.의 국제공개특허 제00/10596호). 부갑상선 호르몬은 세포 표면의 수용체에 결합하여 세포에 작용한다. 상기 수용체는 새로운 뼈를 형성하는 데 반응하는 세포인 골모세포(osteoblast)에서 발견되는 것으로 알려져 있다.
인간 호르몬의 N-말단 34개 아미노산 도메인(domain)은 완전한 길이의 호르 몬과 생물학적으로 대등한 것으로 보고되었다. PTH 1 - 34 및 이의 작용 형태는 미국 특허 제4,086,196호에서 처음 보고되었다. PTH 1-34에 대한 연구가 수행된 이래로, 다른 고유 인간 PTH 형태, 예를 들어, PTH1-25, PTH1-31 및 PTH1-38의 다른 절단 이형에 대한 연구가 진행되었다(Rixon RH등, J. Bone Miner. Res., 9(8):1179-89(8, 1994) 참조).
PTH가 뼈의 재형성에 영향을 주는 기전은 복잡하여, 대립되는 결과를 야기하였고, 결과적으로 정확한 기전을 위해 많은 양의 연구가 이루어졌다. PTH를 연속적으로 전신(systemically) 투여하면, 뼈의 밀도가 감소함이 증명되었다. 반대로, 동일한 물질을 박동 양식으로 투여하면, 뼈의 밀도가 증가됨이 보고되었다(Eli Lilly & Co.의 국제공개특허 제99/31137호 참조). 이러한 분명한 모순은 PTH가 뼈 재형성을 조절하고 결과적으로 뼈 밀도의 식별가능한 변수에 의한 기작을 통해 설명될 수 있다. 성숙한 뼈에서, PTH 수용체는 파골세포(osteoclasts)가 아닌 골모세포 계통의 세포 표면에만 존재하는 것으로 나타났다. 뼈 재형성에서 PTH의 역할은 파골세포에 대항하면서 골모세포를 통해 지시된다. 그러나, 골모세포 계통의 서로 다른 단계상의 세포들은 PTH에 결합했을 때 다르게 반응한다. 따라서, 다른 방법을 사용하여 PTH를 투여할 때 관찰되는 상당한 차이점은 골모세포 계통내에서 동일한 분자를 서로 다른 세포들이 갖고 있어 다른 효과를 나타내는 것으로 이해할 수 있다.
PTH가 중간엽(mesenchymal) 줄기 세포에 결합할 때, 상기 세포는 전골모세포(preosteoblast) 집단으로 분화가 유도된다. 따라서, 상기 체계에 PTH의 첨가를 통해서, 전골모세포 집단이 증가된다. 그러나, 이러한 전골모세포도 PTH 수 용체를 갖고 있고, 상기 세포상의 수용체에 PTH가 결합되면 다른 반응을 야기한다. PTH가 전골모세포에 결합하면, 뼈 흡수를 야기하는 두개의 다른 결과가 야기된다. 첫째는, 전골모세포가 골모세포로 더욱 분화하는 것을 억제하는 것이고, 두번째는 전골모세포로 부터 인터루킨6(IL6)의 분비가 증가되는 것이다. IL-6는 전골모세포 분화를 억제하고 골모세포로의 전골모세포 분화를 증가시킨다. 골모세포 계통에서 이들 세포로 부터의 이중 반응은 뻐 재형성과 PTH 노출간의 복잡한 반응으로 제공되는 것이다. PTH를 짧은 시간 주기동안 주기적으로 복용하면, 중간엽줄기 세포는 골모세포로 분화가 유도된다. 짧은 복용 기간은 새롭게 생성되는 전골모세포는 골모세포의 활성화를 방지하는 IL-6 생성이 방지된다. 따라서, 복용 간격동안, 상기 새롭게 형성된 전골모세포는 골모세포로 더욱 분화하여 뼈로 형성된다. 그러나, 일정량의 PTH가 적용되면, 전골모세포는 IL-6를 생산할 수 있는 기회를 갖게되고, 따라서, 파골세포를 활성화시키고 그 자체는 억제되어 반대 효과: 뼈 흡수를 유도하게 된다.
뼈의 치유 또는 재생을 위해서, 세포는 상처 부위로 이동해서, 증식하고, 메트릭스 성분을 발현시키거나 세포외부 메트릭스를 형성하고, 최종적으로 조직 형태를 형성하게 된다. 복수의 세포 집단은 종종 이러한 형태형성 반응에 참여하며, 종종 혈관 및 신경 세포를 포함한다. 메트릭스가 상당히 강화됨이 증명되었고, 어느 정도는 이러한 것이 발생하는데 필수적임이 밝혀졌다. 천연 또는 합성 유래 또는 이들의 혼합물로 메트릭스를 개발하려는 시도가 이루어져왔다. 자연 세포 내증식 메트릭스를 단백질 가수분해, 예를 들어, 플라스민(피브린 분해) 및 메트릭스 메탈 로프로테아제(콜라겐, 엘라스틴등 분해)를 기초로한 세포 영향을 통해 재형성시켰다. 이러한 분해는 매우 국소적이고 이동하는 세포와 직접 접촉할 경우에만 발생된다. 또한, 성장인자와 같은 특정 세포 신호 단백질의 운반이 확실하게 조절된다. 자연 모델에서, 거대다공성 세포 내증식 메트릭스는 사용하지 않으며, 세포가 메트릭스로 이동하면서, 세포가 국소적으로 필요에 따라 분해될 수 있는 미세다공성 메크릭스가 사용된다. 면역원성, 값비싼 생산성, 제한된 이용성, 뱃치 다양성 및 정제에 관련된 문제에 기인하여, 변형 폴리에틸렌글리콜과 같은 합성 전구체 분자를 기초로 한 메트릭스가 신체 내부 및/또는 신체 상의 조직 재생용으로 개발되어왔다.
PTH의 체계적인 효과를 연구하기 위한 많은 작업이 수행되는 동안, PTH의 국소 투여에 대한 연구는 전무하였다. PTH는 골모세포 계통에 직접적인 동화 작용을 갖기 때문에, 결함 부위에 적절하게 존재하며, 뼈 결함을 치료하고 뼈 밀도에 영향을 줄수 있는 강력한 가능성을 갖는다. 상기 결함이 전골모세포로 채워지고, PTH 신호가 없어지면, 새롭게 형성된 전골모세포가 골모세포로 분화되고 상처 부위가 전환되기 시작하는데, 우선 무층뼈로 전환되고 이후 성숙한 뼈 구조로 전환된다.
따라서 본 발명의 목적은 조직 치유, 재생, 및 재형성용 메트릭스에 결합할 수 있는 형태의 PTH를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 뼈 결함을 치료하기 위해 환자에게 국소 투여하기 적합한 형태로 PTH를 제공하는 데 있다.
-발명의 요약-
한 도메인에는 부갑상선 호르몬(PTH)을 함유하고 다른 도메인에는 메트릭스와 공유 가교결합할 수 있는 기질 도메인을 함유하는 융합 펩타이드 및 상기 융합 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 메트릭스 및 키트를 이하 설명한다. 융합 단백질은 천연 또는 합성 물질과 공유 결합하여 메트릭스를 형성하며, 이는 뼈 결함을 치료하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 메트릭스를 형성하기 위한 모든 성분은 뼈 결함에 적용되고 상기 메트릭스는 적용 부위에서 형성된다. 상기 융합 펩타이드를 메트릭스에 도입할 수 있으므로 제2 도메인의 전체 또는 단지 개별적인 PTH 서열의 융합 펩타이드는 효소 및/또는 가수분해 작용에 의한 메트릭스의 분해를 통해서 방출된다. 또한 상기 융합 펩타이드는 가수 분해 또는 효소 절단 부위를 함유하는 제1 및 제2 도메인 사이에 분해가능한 결합을 함유한다. 구체적으로 상기 융합 단백질은 한 도메인에는 PTH를, 제2 도메인에는 메트릭스와 공유 가교결합할 수 있는 기질 도메인, 및 상기 제1 및 제2 도메인사이에 분해 사이트를 함유한다. 바람직하게, 상기 PTH는 소의 PTH와 같이 다른 유래의 PTH도 가능하나, 인간의 PTH가 적합하다. 상기 PTH는 PTH1-84(고유(native)), PTH1-38, PTH1-34, PTH1-31, 또는 PTH1-25, 또는 뼈 형성, 상술한 바와 유사한 특성을 나타내는 모든 변형 또는 대립 이형의 PTH이다. 상기 분해 부위는 메트릭스내의 다양한 위치에서 상기 위치 및/또는 메트릭스내에서 세포 활성에 따라 다양한 전달 속도를 허락한다. 또다른 장점으로는 전달 체계에서 보다 낮은 전체 약물 용량, 및 최대 세포 활성 시간에 약물이 보다 높은 비율로 방출되도록 방출의 공간 조절을 포함한다.
방출되도록 도입된 PTH를 갖는 천연 및 합성 메트릭스를 사용하여, 경조직 치유, 재생 또는 재형성, 구체적으로 뼈 성장을 위한 제품 및 방법을 이하 설명한다. 상기 천연 메트리스는 생체적합하고(biocompatible) 생분해가능하며 이식시 시험관 내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 형성시킬 수 있다. PTH는 메트릭스에 도입시킬 수 있고 완전한 생활성을 유지할 수 있다. PTH를 어떻게 언제 어느정도로 방출하는가를 제어할 수 있는 기술을 사용하여 PTH가 방출되도록 도입시킬 수 있으며, 따라서 제어가능한 방출 매개체로 메트릭스를 이용하여, 직간접적으로 조직 치유에 상기 메트릭스를 사용할 수 있다.
용어 정의
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "생물질"은 모든 조직, 기관 또는 영구적으로 또는 일시적으로 상기 물질에 의존적인 신체 기능을 평가하고,치료하며, 확대시키거나 교체하기 위해 생물학적 시스템과 접하게 되는 물질을 의미한다. 용어 "생물질" 및 "메트릭스(matrix)"는 본 발명에서 동일하게 사용되며 상기 메트릭스의 성질에 의존적으로, 물에 용해되는 것이 아니라 팽창되는, 즉 상처를 입거나 결함이 있는 경조직에 대한 특정 지지 기능을 수행하는 기간동안 신체내에 존재하여 하이드로겔을 형성할 수 있는 가교결합된 폴리머 네트워크를 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 용어 "PTH 융합 펩타이드"는 적어도 제1 및 제2 도메인을 함유하는 펩타이드를 의미한다. 제1 도메인은 PTH(고유 또는 절단된 형태, 구체적으로 PTH1-34)를 함유하며 다른 도메인은 메트릭스와 가교결합되는 기질 도메인을 함유한다. 효소 분해 또는 가수분해 부위가 또한 상기 제1 및 제2 도메인사이에 존재할 수 있다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "강한 친핵체"는 극성 결합을 형성하는 반응에서 친전자체에 전자쌍을 줄 수 있는 분자를 언급한다. 바람직하게 상기 강한 친핵체는 생리적 pH에서 물보다 더욱 친핵성이다. 강한 친핵체의 예로는 티올 및 아민이 있다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "공액 불포화 결합"은 탄소-탄소, 탄소-헤테로원자 또는 헤테로원자-헤테로원자 다중 결합을 단일 결합으로 변경, 또는 합성 폴리머 또는 단백질등의 고분자에 작용기를 결합시키는 것을 의미한다. 상기와 같은 결합은 첨가반응을 겪게된다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "공액 불포화기"는 탄소-탄소, 탄소-헤테로원자 또는 헤테로원자-헤테로원자 다중 결합의 단일결합으로의 변경을 함유하며, 추가 반응을 겪을 수 있는 다중 결합을 갖는 분자 또는 분자 부위를 의미한다. 상기 공액 불포화기의 예로는 비닐술폰, 아크릴레이트, 아크릴아마이드, 퀴논 및 2-, 또는 4-비닐피리디늄과 같은 비닐 피리디늄, 및 이타코네이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "합성 전구체 분자"는 자연계에 존재하지 않는 분자를 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "자연적으로 발생한 전구체 성분 또는 폴리머"는 자연계에서 발견되는 분자를 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "작용기가 붙은(functionalize)"은 작용기 또는 부분이 부착되는 방식으로 분자를 변형시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 어떤 분자를 강한 친핵성 또는 공액불포화되도록 만드는 분자를 도입하여 작용기를 붙힐 수 있다. 바람직하게, 예를 들어, PEG같은 분자는 작용기가 붙어 티올, 아민, 아크릴레이트 또는 퀴논이 될 수 있다. 구체적으로, 단백질은 또한 자유 티올을 생성하도록 이중 결합의 부분 또는 완전 환원을 통해 효과적으로 작용기가 붙을 수 있다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "작용기의 수(functionality)"는 분자의 반응 위치 수를 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "브랜치된 지점의 작용기 수(functionality of the branching points)"는 분자의 한 지점에서 확장된 가지의 수를 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "부착 부위(adhesion site) 또는 세포 부착 부위"는 분자, 예를 들어, 세포 표면에서 부착-촉진 수용체(adhesion-promoting receptor)가 결합되는 펩티드 서열을 의미한다. 부착 부위의 예로는 피브로넥틴의 RGD 서열, 라미닌의 YIGSR 서열(서열번호 2)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 부착 부위는 메트릭스와 가교결합될 수 있는 기질 도메인을 포함하여 생물질에 도입된다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "생물학적 활성"은 단백질이 매개하는 기능적 사건을 의미한다. 일부 구체예에서, 이는 다른 폴리펩타이드와 폴리펩타이드의 상호작용을 측정하여 분석된 사건을 포함한다. 또한, 단백질이 세포 성장, 분 화, 사멸, 이동, 부착, 다른 단백질과의 상호작용, 효소 활성, 단백질 인산화 또는 탈인산화, 전사, 또는 해독에 미치는 효과를 분석하는 것을 포함한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "감응성 생물학적 분자"는 세포, 또는 생체에서 발견되거나, 또는 이의 존재에서 다른 분자와 반응할 수 있는 세포 또는 신체 치료에 사용할 수 있는 분자를 의미한다. 감응성 생물학적 분자의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니나, 펩타이드, 단백질, 핵산 및 약제를 포함한다. 상기 감응성 생물학적 물질에 역 효과없이 감응성 생물학적 물질 존재에서 생물질을 제조할 수 있다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "재생시키다"는 경조직, 구체적으로 뼈와 같은 것의 일부 또는 전체를 다시 성장시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 일반적으로 사용되는 "다작용기"는 분자(즉, 모노머, 올리고- 및 폴리머)당 하나 이상의 친전자성 및/또는 친핵성 작용기를 의미한다.
"자가 선택적 반응"은 조성물의 제1 전구체 성분이 혼합물 또는 반응 부위에 존재하는 다른 성분들 보다 조성물의 제2 전구체 성분과 매우 빠르게 반응하고 이의 반대도 가능한 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 바로는, 다른 생물학적 성분보다는, 상기 친핵체는 바람직하게 친전자체와 결합하고 친전자체는 바람직하게 강한 친핵체와 결합한다.
"가교결합(cross-link)"은 공유 결합의 형성을 의미한다. 그러나, 또한 이온결합, 또는 공유 및 비-공유 결합의 혼합과 같은 비-공유 결합의 형성도 의미한다.
"폴리머 네트워크"는 실질적으로 모든 모노머, 올리고- 또는 폴리머가 그들 의 이용가능한 작용기를 통해서 분자간 공유 결합으로 연결되어 하나의 거대 분자를 만드는 과정의 산물을 의미한다.
"생리적"은 살아있는 척추동물에서 발견되는 조건을 의미한다. 구체적으로, 생리적 조건은 온도, pH 등의 인간 신체 조건을 의미한다. 생리적 온도는 구체적으로 35 내지 42℃, 바람직하게 37℃ 주변의 온도 범위를 의미한다.
"가교결합 밀도(crosslink density)"는 개별 분자의 두 가교결합(Mc)간의 평균 분자량을 의미한다.
"등량"은 기질 작용기의 mmol/기질의 g을 의미한다.
"팽창(swelling)"은 생물질이 흡수한 수분에 의한 부피 및 질량 증가를 의미한다. "수분-흡수" 및 "팽창"은 본 발명에서 동일하게 사용되었다.
"평형 상태"는 수분에서 일정한 상태로 저장될 때 질량 증가 또는 손실이 없는 하이드로겔의 상태를 의미한다.
I. 메트릭스 및 PTH
A. 메트릭스 물질
메트릭스는 이온, 공유 또는 이들의 조합으로 폴리머 네트워크에 전구체 분자를 가교결합시키거나 또는 하나 이상의 폴리머 물질, 즉, 메트릭스를 팽창시켜 내증식 또는 세포 메트릭스로의 이동이 가능하도록 충분한 내부-폴리머 공간을 갖는 폴리머 네트워크가 형성된다.
구체예에 있어서 상기 메트릭스는 단백질, 바람직하게는 상기 메트릭스가 이 식되는 환자에 자연적으로 존재하는 단백질로 형성된다. 구체적으로 바람직한 메트릭스 단백질은 피브린이나, 다른 단백질, 콜라겐 및 젤라틴으로 제조된 메트릭스도 사용할 수 있다. 다당류 및 당단백질 또한 메트릭스를 형성하는 데 사용될 수 있다. 이온 또는 공유 결합으로 가교결합가능한 합성 폴리머를 또한 사용될 수 있다.
피브린 메트릭스
피브린은 여러 생의학 분야에서 보고된 천연 물질이다. 피브린은 허벨 등의 미국특허 제6,331,422호에서 세포 내증식 메트릭스용 물질로 기술되었다. 피브린 겔은 많은 조직에 결합할 수 있는 능력과 상처 치유에서의 자연적인 역할때문에 봉합제로 사용되어 왔다. 일부 특정 분야는 혈관 이식 부착, 심장 밸브 부착, 골절 및 힘줄봉합에서 뼈의 위치잡이용 봉합제로의 사용이 포함된다(Sierra, D. H., Journal of Biomaterials Applications, 7:309-352(1993)). 또한, 상기 겔은 신경 재생용 약물 전달 디바이스로 사용되어왔다(Williams, et al., Journal of Comparative Neurobiology, 264:284-290(1987)). 비록 피브린이 조직 재생 및 세포 내증식용 고상 지지체를 제공하나, 상기 과정을 직접적으로 강화시키는 모노머의 소수 활성 서열이 존재한다.
피브리노겐이 피브린으로 중합되는 과정이 또한 특징화되었었다. 초기에, 프로테아제가 두 대칭 부위에서 다이머(dimer) 피브리노겐을 절단시킨다. 피브리노겐을 절단시킬 수 있는 몇가지 가능한 프로테아제가 있는데, 트롬빈, 렙틸라제, 및 프로테아제III를 포함하며, 이들 각각은 다른 부위에서 상기 단백질을 절단한다(Francis, et al., Blood Cells, 19:291-307, 1993). 피브린이 절단되면, 피브리노겐 모노머가 서로 결합하여 비공유 가교결합된 폴리머 겔을 형성하는 자가-중합 단계가 발생한다(Sierra, 1993). 자가-어셈블리는 프로테아제 절단 발생 후 결합 부위가 노출되어 일어난다. 상기 결합 부위가 노출되면, 분자 중심부의 상기 결합 부위가 펩타이드 사슬 말단에 존재하는 피브리노겐 사슬의 다른 부위와 결합하게 된다(Stryer, L. In Biochemistry, W.H. Freeman&Company, NY, 1975). 이러한 방식으로, 폴리머 네트워크가 형성된다. 트롬빈 단백질분해에 의해 인자 ⅩⅢ로 부터 활성화된 트랜스글루타미나제인, 인자 ⅩⅢa는 이후 상기 폴리머 네트워크와 공유 가교결합하게된다. 다른 트랜스글루타미나제가 존재하며 또한 피브린 네트워크와의 공유 가교결합되고 융합될 수 있다.
가교결합된 피브린 겔이 형성되면, 이후 분해는 확실하게 제어된다. 피브린 분해를 제어하는 결정적인 분자 중 하나는 α2-플라스민 저해제이다(Aoki, N., Process in Cardiovascular Disease, 21:267-286, 1979). 상기 분자는 인자 ⅩⅢa의 작용을 통해서 피브린의 α사슬과 가교결합을 통해 작용한다(Sakata et al., Journal of Clinical Investigation, 65:290 - 297, 1980). 상기 저해제는 피브린에 플라스미노겐의 결합을 방해하고(Aoki, et al., Thrombosis and Haemostasis, 39:22 - 31, 1978) 플라스민 불활성화(Aoki, 1979)를 통해 작용한다. 정확한 서열은 가교결합되는 활성 아미노산인 제1 글루타민과 함께 NQEQVSPL(서열 번호 12)로 확인되었다.
인자 ⅩⅢa 기질 서열 및 생활성 펩타이드 서열을 함유하는 이중-도메인 펩타이드는 피브린 겔로 가교결합될 수 있고 상기 생활성 펩타이드는 시험관내에서 이의 세포 활성이 유지됨이 증명되었다(Schense, J.C., et al. (1999) Bioconj. Chem. 10:75-81).
합성 메트릭스
생체에 적용될 합성 메트릭스 형성을 위한 가교결합 반응은 (i) Hern 등이 J. Biomed.Mater. Res. 39:266-276(1998)에 기술한 불포화 이중결합을 함유하는 두개 이상의 전구체사이의 자유-라디칼 중합반응, (ii) 아민기를 포함하는 전구체와 Rhee 등의 미국특허 제5,874,500호에 기술된 숙시닌이미딜기를 포함하는 전구체간의 친핵성 치환반응, (iii) 축합과 첨가 반응 및 (iv) 강한 친핵체와 공액 불포화기 또는 결합사이의 마이클 타입(Michael type) 첨가 반응을 포함한다. 구체적으로 바람직한 반응은 친핵성 기로 티올 또는 아민 기를 갖는 전구체 분자와 친전자성 기로 아크릴레이트 또는 비닐 술폰 기를 포함하는 전구체 분자사이의 반응이다. 가장 바람직한 친핵성 기는 티올 기이다. 마이클 타입 첨가 반응은 허벌 등의 국제공개특허 제00/44808호에 기술되었으며, 본 발명의 참조문헌으로 포함시킨다. 마이클 타입 첨가 반응은 감응성 생물학적 물질의 존재하에서도, 자가-선택적 방식으로 생리적 조건하에서 적어도 제1 및 제2 전구체 성분의 인 시츄(in situ) 가교결합을 가능케 한다. 전구체 성분 중 하나는 적어도 두개의 작용기를 갖고, 다른 전구체 성분 중 적어도 하나가 두개보다 많은 작용기를 갖을 때, 상기 시스템은 자가 선택적으로 반응하여 가교결합된 3차 구조의 생물질을 형성한다.
바람직하게 상기 공액 불포화 기 또는 공액 불포화 결합은 아크릴레이트, 비닐술폰, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 아크릴로니트릴, 비 닐술폰, 2- 또는 4-비닐피리디늄, 말레이미드, 또는 퀴논이다.
상기 친핵성 기는 바람직하게 티올-기, 아미노-기 또는 하이드록실-기이다. 티올 기는 실질적으로 비프로톤화된 아민 기보다 반응성이 높다. 상술한 바와 같이, pH는 축합반응에서 중요한데: 탈프로톤화된 티올은 프로톤화된 티올보다 실질적으로 보다 반응성이 높다. 따라서, 두개의 전구체 성분을 메트릭스로 전환시키기 위한 아크릴레이트 또는 퀴논등의 공액 불포화를 포함하는 티올과의 첨가 반응은 대략 pH 8에서 가장 빠르며 자가-선택적으로 수행될 수 있다. 약 pH 8에서, 대부분의 티올은 프로톤이 떨어지고(따라서 보다 반응성이 있음) 대부분의 아민은 여전히 프로톤화되어 있다(따라서 덜 반응성이 있음). 티올이 제2 전구체 분자로 사용되면, 아민에 비례하는 티올에 대한 반응에서 선택적인 공액 구조가 매우 바람직하다.
적합한 제1 및 제2 전구체 분자는 단백질, 펩타이드, 폴리옥시알킬렌, 폴리(비닐 알콜), 폴리(에틸렌-코-비닐알콜), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-아크릴산), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(에틸렌-코-비닐 피롤리돈), 폴리(말릭산), 폴리(에틸렌-코-말릭산), 폴리(아크릴아마이드), 및 폴리(에틸렌옥사이드)-코-폴리(프로필렌옥사이드) 블럭 코폴리머를 포함한다. 구체적으로 바람직한 전구체 분자는 폴리에틸렌글리콜이다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 편리한 빌딩 블럭을 제공한다. PEG는 쉽게 구입할 수 있으며 선형(두개의 말단을 가짐) 또는 브랜치된(둘 보다 많은 말단을 의미) PEGs는 쉽게 합성할 수 있고, 이후 티올 등의 강한 친핵성 또는 아크릴레이트나 비 닐술폰등의 공액 구조를 도입하여 PEG 말단 기에 작용기를 붙힐 수 있다. 이러한 성분들은 서로 혼합하거나 또는 약간 염기성 환경에서 상응하는 성분과 혼합하면, 제1 및 제2 전구체 성분사이의 반응을 통해 메트릭스가 형성된다. PEG 성분은 비-PEG 성분과 반응할 수 있고, 이들 성분의 분자량 또는 친수성을 제어하여 물리적 특성, 투과도, 및 최종 생물질의 수분함량을 조작할 수 있다.
상기 물질은 이하 좀 더 구체적으로 설명하는 바와 같이 의학적 이식술에서 일반적으로 사용된다. 메트릭스 형성에서, 특히 생체내에서 분해되는 것이 바람직한 메트릭스인, 펩타이드는 매우 편리한 빌딩 블럭을 제공한다. 두개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 펩타이드를 합성하는 것은 수월하며, 상기 성분은 이후 손쉽게 친핵성 기를 갖는 제1 전구체 성분으로 제공된다. 예를 들어, 두개의 자유 시스테인 잔기를 갖는 펩타이드는 생리적 또는 약간 높은 pH(예를 들어, 8 내지 9)에서 PEG 트리-비닐술폰과 혼합하면 쉽게 메트릭스를 형성시킨다. 겔화는 또한 보다 높은 pH이나 자가-선택성이 가능한 곳에서 잘 진행된다. 두개의 액상 전구체 성분을 함께 혼합하면, 수 분에 걸쳐 반응하여 펩타이드로 연결된 네트워크의 중심점(nodes)을 갖는 PEG 사슬 네트워크를 이루는 탄성 겔을 형성한다. 상기 펩타이드는 피브린 메트릭스에서 처럼, 단백질-계 네트워크에서 이루어지는 바와 같이, 세포에 의해 침윤되고 분해될 수 있는 네트워크를 제조하기 위해 프로테아제 기질로 선택된다. 바람직하게 상기 도메인의 서열은 세포 이동에 관여하는 효소의 기질(예를 들어, 콜라게나제, 플라스민, 메탈로프로테아제(MMP) 또는 엘라스타제 등의 효소 기질)이며, 적절한 도메인은 이들 서열에만 한정되지 않는다. 특히 유용 한 서열은 플라스민 효소에 대한 기질이다(실시예 참조). 상기 겔의 분해 특성은 가교 결합 중심점으로 제공되는 펩타이드의 세부사항을 변화시켜 조작할 수 있다. 겔은 플라스민이 아닌 콜라게나제에 의해 분해되거나 또는 콜라게나제가 아닌 플라스민으로 분해되도록 제조될 수 있다. 또한, 효소 반응의 Km 또는 Kcat, 또는 이들 둘이 모두 변하도록 아미노산 서열을 간단히 변화시켜서 상기 효소에 대해 보다 빠르거나 느리게 반응하여 분해되도록 제조하는 것이 가능하다. 또한 세포의 정상적인 재형성 특성을 통해 재형성될 수 있는, 생체모방성 생물질을 제조할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 연구는 중요한 프로테아제 플라스민에 대한 기질 부위를 보여준다. 상기 펩타이드와 PEG의 겔화는 자가-선택적이다.
선택적으로, 생기능성 제제를 메트릭스에 도입하여 다른 종(예를 들어, 조직 표면)과 화학 결합을 제공한다. 메트릭스에 프로테아제 기질을 도입하는 것은 PEG 비닐술폰으로 메트릭스를 형성할 때 중요하다. PEG 아크릴레이트와 PEG 티올의 반응으로 형성된 메트릭스이외에는, PEG 비닐술폰과 PEG 티올로 형성된 메트릭스는 가수분해되는 결합을 함유하지 않는다. 따라서, 프로테아제 기질의 도입은 메트릭스가 생체내에서 분해되도록 한다.
합성 메트릭스는 사용상 간단하게 형성시킬 수 있다. 두개의 액상 전구체를 혼합하여; 한 전구체는 친핵성 기를 갖는 전구체 분자를 함유하고 다른 전구체 분자는 친전자성 기를 함유한다. 생리식염수를 용매로 사용할 수 있다. 반응에 의해 최소 열이 발생한다. 따라서, 상기 겔화는 독성없이 조직과 직접 접촉하면서, 생체 내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 그러므로, PEG 이외의 폴리머를 변형시키거나 측면 작용기를 변형시켜 사용할 수도 있다.
대부분의 치유 징후에 있어서, 적합한 메트릭스 분해율과 결합된 세포 내증식율 또는 메트릭스로의 세포 이동이 전체적인 치유 반응에서 매우 중요하다. 가수분해되지 않는 메트릭스에 세포가 침투할 가능성은 네트워크 밀도에 주로 의한다. 브랜치된 지점 또는 중심점간에 존재하는 공간이 세포 크기에 비해 너무 작거나 또는 메크릭스내에 공간을 더욱 생성할 수 있는 메트릭스의 분해율이 너무 느리면, 매우 제한된 치유 반응이 관찰된다. 신체내 손상에 대한 반응으로 형성되는 피브린 메트릭스같이 자연계에서 발견되는 치유 메트릭스는 세포가 매우 쉽게 침투할 수 있도록 매우 느슨한 네트워크로 이루어진 것으로 알려져있다. 침윤(infiltration)은 피브린 네트워크의 통합부인 세포 부착용 리간드에 의해 촉진된다.
폴리에틸렌 글리콜같은 합성 친수성 전구체 분자로 제조된 메트릭스는 폴리머 네트워크 형성 이후 수용성 환경에서 팽창된다. 생체내에서 메트릭스의 인-시츄 형성 동안 충분하게 짧은 겔화 시간(7 내지 8의 pH와 36 내지 38℃ 범위의 온도에서 3 내지 10분) 및 양적인 반응을 얻기위해서, 전구체 분자의 개시농도는 충분히 높아야한다. 이러한 상태하에서, 네트워크 형성 후 팽창은 일어나지 않고, 필요한 개시농도는 메트릭스가 수용성 환경에서 분해되지 않을 때 세포 침윤에 대한 메트릭스 농도가 너무 조밀해진다. 그러므로 폴리머 네트워크의 팽창은 브랜치된 지점사이의 공간을 확장하고 넓히는데 중요하다.
전구체 분자의 개시 농도에 상관없이, 4가지 PEG 비닐술폰와 SH 기를 갖는 펩타이드 같은 동일한 합성 전구체 분자로 제조된 하이드로겔은 평형상태에서 동일한 수분 함량으로 팽창된다. 이는 전구체 분자의 개시농도가 높을 수록, 평형상태에 도달할때 하이드로겔의 최종 부피가 증가됨을 의미한다. 생체내에서 이용할 수 있는 공간이 너무 작으면 충분한 팽창이 불가능하고 구체적으로 전구체 성분으로 형성된 결합이 가수분해되지 않으며, 세포 침윤율 및 치유 반응이 감소된다. 결과적으로, 생체에 적용하기 위한 두개의 상반되는 요구조건의 최적점을 찾아야만 한다. 좋은 세포 침윤성과 그에 따른 치유 반응은 실질적으로 유사한 분자량의 적어도 세개 가지를 갖는 삼작용기 브랜치된 폴리머와 적어도 이작용기 분자인 제2 전구체 분자의 반응으로 형성된 3차원 폴리머 네트워크를 사용하여 관찰되었다. 상기 제1 및 제2 전구체 분자의 작용기의 등량비는 0.9 내지 1.1이다. 상기 제1 전구체 분자 가지의 분자량, 상기 제2 전구체 분자의 분자량 및 브랜치된 지점의 작용기 수는 최종 폴리머 네트워크의 수분 함량이 수분 흡수 종류후에 폴리머 네트워크 총량의 평형 중량% 내지 92중량%가 되도록 선택된다. 수분 흡수 종료는 평형 농도에 도달하거나 생물질에서 사용할 수 있는 공간이 더이상 부피 증가 되지 않을 때 얻어진다. 따라서 전구체 성분의 개시농도는 가능한 낮게 선택하는 것이 바람직하다. 이는 모든 팽창가능한 메트릭스에 적용되나 구체적으로 세포-매개 분해되고 폴리머 네트워크에서 가수분해되는 결합을 함유하지 않는 메트릭스에도 적용된다.
구체적으로 비가수분해 겔에 대한 겔화 시간과 낮은 개시 농도사이의 균형은 전구체 분자의 구조를 기초로 최적화되어야한다. 구체적으로, 제2 전구체 분자 가지의 분자량, 제2 전구체 분자의 분자량 및 브랜치된 정도, 즉, 브랜치된 지점의 작용기 수를 그에 맞게 조절해야 한다. 실제 반응 기작은 이러한 상호작용에서 영향은 적다.
제1 전구체 분자는 각 가지의 말단에 작용기를 갖는 3 또는 4가지 폴리머이고 제2 전구체 분자는 선형 이작용기 분자, 바람직하게는 적어도 두개의 시스테인 기를 함유하는 펩타이드이고, 상기 제1 전구체 분자 가지의 분자량 및 제2 전구체 분자의 분자량은 네트워크 형성 후 브랜치된 지점 간의 결합은 10 내지 13kD(상기 결합이 브랜치된 것이 아닌 선형 조건하에), 바람직하게는 11 내지 12kD이 되도록 바람직하게 선택된다. 이는 상기 제1 및 제2 전구체 분자 합의 개시 농도가 용액에서(네트워크 형성전) 제1 및 제2 전구체 분자 총량의 8 내지 12중량%, 바람직하게는 9 내지 10중량%이 되도록 한다. 제1 전구체 성분의 브랜치된 정도가 8까지 증가하고 제2 전구체 분자는 여전히 선형 이작용기 분자인 경우, 브랜치된 지점간 결합의 분자량은 바람직하게 18 내지 24kDa의 분자량까지 증가한다. 제2 전구체 분자의 브랜치된 정도가 선형에서 3 또는 4 가지 전구체 성분인 경우 분자량, 즉 결합 길이는 그에 따라 증가한다. 바람직한 본 발명의 구체예에서 조성물은 제1 전구체 분자로 삼작용기 3 가지 15kD 폴리머, 즉 각 가지는 5kD의 분자량을 가지며 제2 전구체 분자로는 0.5 내지 1.5kD, 보다 바람직하게는 약 1kD의 분자량인 이작용기 선형 분자를 포함하여 선택된다. 바람직하게 제1 및 제2 전구체 성분은 폴리에틸렌 글리콜이다.
바람직한 구체예에서 제1 전구체 성분은 작용 기로 공액 불포화기 또는 결합, 가장 바람직하게는 아크릴레이트 또는 비닐술폰을 포함하며 제2 전구체 분자의 작용기는 친핵성기, 바람직하게는 티올 또는 아미노 기를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서는 상기 제1 전구체 분자는 각 가지의 말단에 작용기를 갖는 4개 가지 20kD(각 가지의 분자량이 5kD)이고 제2 전구체 분자는 1 내지 3kD, 바람직하게는 1.5 내지 2kD 범위의 분자량을 갖는 이작용기 선형 분자이다. 바람직하게 제1 전구체 분자는 비닐술폰기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고 제2 전구체 분자는 시스테인 기를 갖는 펩타이드이다. 상기 두 바람직한 구체예에서 제1 및 제2 전구체 분자의 합의 개시 농도는 제1 및 제2 전구체 분자 및 수분 총량(폴리머 네트워크 형성 전)의 8 내지 11중량%, 바람직하게는 9 내지 10중량% 범위이고, 바람직하게는 10분 미만의 겔화시간을 얻도록 5 내지 8중량%이다. 상기 조성물은 혼합 후 pH8.0 및 37℃에서 약 3 내지 10분의 겔화 시간을 갖는다.
상기 메트릭스가 예를 들어, 아크릴레이트와 티올사이의 바람직한 반응을 통해 형성된 가수분해가능한 결합을 포함하면, 세포 침윤에 대한 상기 네트워크 밀도는 초기에 특히 증가하나 수용성 환경에서 상기 결합은 가수분해되고 네트워크가 느슨해져 세포 침윤이 가능해 진다. 폴리머 네트워크의 전체 브랜치된 지점이 증가함에 따라 상호결합의 분자량, 즉 결합 길이가 증가되야 한다.
B. 세포 부착 부위
세포는 세포 표면에서 단백질-단백질, 단백질-올리고당류 및 단백질-다당류 상호작용을 통해 그들 환경과 상호작용한다. 세포외부 메트릭스 단백질은 세포에 다수의 생활성 신호를 제공한다. 이러한 조밀한 네트워크는 세포를 지지하기 위해 필요하고, 상기 메트릭스의 많은 단백질들은 세포 부착, 확산, 이동 및 분화를 제 어하는 것으로 나타났다(Carey, Annual Review of Physiology, 53:161-177, 1991).특별한 활성을 나타내는 일부 특정 단백질은 라미닌, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 및 콜라겐을 포함한다(Lander, Journal of Trends in Neurological Science, 12:189-195, 1989). 라미닌에 대한 많은 연구가 수행되었는데, 라미닌은 생체내에서 신경 및 시험관내에서 신경 세포의 발달 및 재생(Williams, Neurochemical Research, 12: 851-869, 1987)과 혈관신생에서 절대적인 역할을 하고 있음을 보여주었다.
세포 수용체와 직접적으로 상호작용하고 부착, 확산 또는 신호전달을 야기하는 일부 특정 서열이 확인되었다.
큰 다수도메인 단백질(Martin, Annual Review of Cellular Biology, 3:57-85, 1987)인, 라미닌은 몇개의 수용체-결합 도메인을 갖는 세 사슬로 이루어졌다. 이들 수용체-결합 도메인은 라미닌 B1 사슬의 YIGSR 서열(서열번호 2)(Graf, et al., Cell, 48:989-996, 1987; Kleinman, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 272:39-45, 1989; and Massia et al., J. of Biol. Chem., 268:8053-8059, 1993), 라미닌 A 사슬의 LRGDN(서열번호 3)(Ignatius, et al., J. of Cell Biology, 111:709-720, 1990) 및 라미닌 B1 사슬의 RNIAEIIKDI(서열번호 6)(Liesi, et al., FEBS Letters, 244:141-148, 1989)를 포함한다. 상기 특정 서열에 결합하는 수용체가 또한 종종 확인되었다. 상기 결합의 많은 부분에 관여하는 것으로 나타난 세포 수용체 서브세트는 인테그린 수퍼패밀리이다(Rouslahti, E., J. of Clin. Investigation, 87:1-5, 1991). 인테그린은 α및 β서브유니트로 이루어진 헤테로다이머 단백질이다. 종래 연구는 트리펩타이드 RGD가 몇몇 β1 및 β3 인테그린과 결합하고(Hynes, R.O., Cell, 69:1-25, 1992; Yamaea, K.M., J. of Biol., Chem., 266:12809-12812, 1991), IKVAV(서열번호 5)가 110kD 수용체에 결합하며(Tashiro, et al., J. of Biol., Chem., 264:16174-16182, 1989; Luckenbill-Edds, et al., Cell Tissue Research, 279:371-377, 1995), YIGSR(서열번호 2)는 67kD 수용체와 결합하고(Graf, et al., 1987), 콜라겐 서열인 DGEA(서열번호 7)는 α2β1 인테그린과 결합함(Zutter & Santoro, Amer. J. of Pathology
, 137:113-120, 1990)을 보여줬다. RNIAEIIKDI(서열번호 6) 서열에 대한 수용체는 보고되지 않았다.
보다 바람직한 구체예에서 세포 부착을 위한 펩타이드 부위를 메트릭스에 도입하는데, 즉, 세포 표면에서 부착-촉진 수용체에 결합하는 펩타이드를 본 발명의 생물질에 도입한다. 이러한 부착 촉진 펩타이드는 상술한 군으로 부터 선택된다. 구체적으로 바람직하게는 피브로넥틴의 RGD 서열, 라미닌의 YIGSR 서열(서열번호 2)이다. 세포 부착 부위의 도입은 합성 메트릭스에서 바람직한 구체예이나, 일부 천연 메트릭스를 또한 포함할 수 있다. 이러한 도입은, 예를 들어, 티올-함유 전구체 성분같은 친핵성 기를 포함하는 잔여 전구체 성분과 함께 혼합하기 수 분 전에 PEG 아크릴레이트, PEG 아크릴아마이드 또는 PEG 비닐술폰같은 공액 불포화기를 포함하는 전구체 분자와 시스테인-함유 세포 부착 펩타이드를 혼합하여 간단히 수행할 수 있다. 상기 세포 부착 부위가 시스테인을 포함하지 않으며, 이를 포함하도록 화학 합성할 수 있다. 이러한 첫번째 단계 동안, 상기 부착-촉진 펩타이드는 공액 불포화 기로 다수 작용기가 붙은 전구체의 한 말단에 도입되며; 잔여의 다수티올을 상기 시스템에 첨가하면, 가교결합된 네트워크가 형성된다. 본 발명에서 네트워크를 제조하는 방법에 포함된 다른 중요한 점은 부착 신호와 같은 펜던트(pendant) 생활성 수용체 도입의 효율성이다. 상기 단계는 예를 들어, 비결합 수용체(예를 들어, 부착 부위)는 세포와 메트릭스의 상호작용을 저해하기 때문에 양적이어야 한다. 이후 설명하는 바와 같이, 상기와 같은 펜던트 올리고펩타이드를 갖는 전구체의 유도는 티올보다 화학양론적으로 과량(최조: 40배)의 복수 가지인 친전자성 전구체로 첫 단계에서 수행할 수 있고 따라서 확실히 양적이다. 원치 않는 저해 방지를 제외하고, 이러한 실행은 생물학적으로 보다 중요한데: 세포 양태는 수용체 밀도에서의 작은 변화에도 매우 민감하여 도입 수용체에 대한 자세한 지식은 세포-메트릭스 상호작용을 디자인하고 이해하는 데 도움을 준다. 요약하면, 메트릭스와 공유결합하는 부착 부위의 농도는 세포 침윤율에 상당한 영향을 준다. 예를 들어, 주어진 하이드로겔에서, 세포 내증식과 세포 이동을 최적의 방법으로 지지하게 되는 RGD 농도 범위로 메트릭스에 도입될 수 있다. RGD같은 부착 부위의 최적 농도 범위는 0.04 내지 0.05mM이고 보다 바람직하게는 구체적으로 수분 흡수 종료 후 평형 농도 내지 92중량%의 수분 함량을 갖는 메트릭스에서 0.05mM이다.
우수한 뼈 치유 결과는 세포 이동율과 메트릭스 분해율을 빠르게 유지시켜 얻을 수 있다. 메트릭스 디자인에 있어서(구체적으로 PTH 1-34 공유 결합), 프로테아제 분해 사이트 GCRPQGIWGQDRC(서열번호 8) 및 0.050mM GRGDSP(서열번호 9)와 가 교결합된 약 20,000Da의 분자량을 갖는 4가지 폴리에틸렌글리콜은 특히 좋은 세포 내증식 결과와 뼈 결함 치유능을 제공한다. PEG와 펩타이드의 개시 농도는 분자와 수분 총량(팽창 전)의 10중량% 미만이다. 상기 겔은 유용한 일관성을 가지며 골모세포와 전구세포가 쉽게 메트릭스로 침윤할 수 있게 한다.
상기 메트릭스 물질은 바람직하게 자연계에 존재하는 효소에 의해 생분해가능한 것이다. 분해율은 메트릭스에서 가교결합 정도와 프로테아제 저해제의 포함정도에 따라 조작할 수 있다.
C. 가교결합가능한 기질 도메인
상기 PTH 융합 단백질은 이의 가교결합가능한 기질 도메인을 통해 메트릭스와 가교결합되어 공유결합된다. 기질 도메인의 종류는 메트릭스의 성질에 따른다. 피브린 메트릭스에 도입하기 위해서는 트랜스글루타미나제 기질 도메인이 특히 바람직하다. 상기 트랜스글루타미나제 기질 도메인은 인자 ⅩⅢa 기질 도메인일 수 있다. 상기 인자 ⅩⅢa 기질 도메인은 GAKDV(서열번호 10), KKKK(서열번호 11), 또는 NQEQVSPL(서열번호 12)를 포함할 수 있다. PTH와 트랜스글루타미나제 기질 도메인의 연결은 화학 합성으로 수행된다.
상기 트랜스글루타미나제 기질 도메인은 인자 ⅩⅢa보다는 트랜스글루타미나제 용 기질이다. 가장 바람직한 인자 ⅩⅢa 기질 도메인은 NQEQVSPL(서열변호 12)(여기서는 "TG"로 언급)의 아미노산 서열을 갖는다. 피브로넥틴같이 트랜스글루타미나제를 인지하는 다른 단백질을 상기 트랜스글루타미나제 기질 펩타이드에 연결할 수 있다.
| 서열번호 13 | YRGDTIGEGQQHHLGG(서열번호 13) 피브린 사슬에서 트랜스글루타미나제 연결 부위에 글루타민을 갖는 펩타이드 |
| 서열번호 14 | GAKDV (서열번호 14) 피브리노겐 사슬에서 라이신 연결 부위를 모방한 펩타이드 |
| 서열번호 11 | KKKK (서열번호 11) 무작위 연결 부위에 폴리라이신을 갖는 펩타이드 |
| 서열번호 12 | NQEQVSPL(서열번호 12) α2-프라스민 저해제(약어 TG)에서 가교결합 부위를 모방한 펩타이드 |
합성 전구체 성분으로 형성된 메트릭스에 PTH를 도입하기 위해서, 상기 PTH 융합 단백질 또는 도입할 다른 펩타이드는 적어도 하나의 추가적인 시스테인 기(-SH) 바람직하게는 PTH의 N-말단에 가교결합가능한 기질 도메인을 갖게 합성되어야 한다. 상기 시스테인은 직접적으로 PTH에 부착되거나 링커(linker) 서열을 통해 부착된다. 상기 링커 서열은 추가적으로 효소분해되는 아미노산 서열을 포함하며, 따라서 PTH는 실질적으로 고유 형태인 효소에 의해 메트릭스에서 절단될 수 있다. 상기 자유 시스테인 기는 마이클 타입 첨가 반응으로 전구체 성분의 공유 불포화 기와 반응한다. PTH 1-34의 경우 PTH 1-34와 합성 메트릭스의 결합은 적어도 하나의 시스테인을 함유하는 PTH 1-34의 N-말단에 추가적인 아미노산 서열을 부착하여 가능하게 만들 수 있다. 시스테인의 티올 기는 합성 폴리머상의 공액 불포화 결합과 반응하여 공유결합을 형성한다. 시스테인만이 펩타이드에 부착될 확률(a)과, 다른 확률(b)에서는 효소 분해, 구체적으로 플라스민 분해 서열이 링커로 시스테인과 펩타이드 사이에 부착될 수 있다. 제1 도메인 및 제2 도메인사이의 서열 GYKNR(서열번호15)에서, 상기 시스테인은 상기 결합을 플라스민 분해가능하게 만든다.
따라서 상기 PTH 융합 펩타이드는 부착 부위, 즉, 제2 도메인(즉, 인자 ⅩⅢa 기질 도메인 또는 시스테인)과 PTH, 즉 제1 도메인 사이에 분해가능한 부위를 함유하도록 더욱 변형시킬 수 있다. 상기 부위들은 비특이적 가수분해(즉, 에스테르 결합)에 의해 분해되거나 또는 특정 효소(단백질 또는 다당류 분해하는) 분해를 위한 기질일 수 있다. 상기 분해가능한 부위는 피브린 겔같은 메트릭스로 부터 보다 특이적인 PTH 방출을 제작가능하게 한다. 예를 들어, 효소 활성을 기초로하는 분해는 PTH 방출을 겔을 통한 인자 확산보다는 세포 과정을 통해 제어되도록 한다. 상기 분해가능한 부위 또는 결합은 메트릭스를 침투한 세포가 방출하는 효소로 절단된다.
상기 분해 부위는 PTH가 인자의 보다 높은 활성을 유도하는 초기 펩타이드 서열의 변형이 없거나 또는 적게 방출되도록 한다. 또한, 일부 다공성 물질로 부터 확산되는 것보다는 국소 단백질분해와 같은 세포의 특이적 과정으로 상기 인자의 방출이 제어되도록 한다. 이는 또한 필요한 총 PTH의 양을 감소시키는데, 세포 과정에 의해 상기 방출이 제어되기 때문이다. PTH와 이의 생체이용율의 보존은 확산 제어 방출 디바이스의 사용과는 다른 세포 특이적 단백질분해 활성의 장점이다. 메트릭스에 공유결합된 PTH에 의한 뼈 결함의 강력한 치유에 대해서 설명가능한 이유는, PTH를 연속적인 방식이 아닌 연장된 시간 기간동안(즉, 단지 단일 펄스 용량이 아님) 국소적으로 투여된다는 것이다. 이는 메트릭스의 효소 절단 또는 가수분해 절단을 통한 느린 분해를 통해 수행된다. 이러한 방법으로, 상기 분자는 지속적인 시간 기간에 걸쳐 발생하는 슈도펄스(pseudopulsed) 효과를 통해 전달된다. 앞선 세포가 메트릭스를 침윤하면, PTH 분자를 만나게 되고 전골모세포로 분화된다. 그러나, 특정 세포가 메트릭스로 부터 결합된 PTH를 계속적으로 유리시키지 않으면, 이들은 효과적으로 골모세포로 전환되어 뼈 메트릭스 생성을 시작하게 된다. 최종적으로, 상기 펩타이드의 치료학적 효과는 결함 부분에 집중되고 결과적으로 확대된다.
단백질 분해용으로 사용할 수 있는 효소는 많다. 단백질분해가능한 부위는 콜라게나제, 플라스민, 엘라스타제, 스트로멜리신, 또는 플라스미노겐 활성제에 대한 기질을 포함한다. 하기에 기질의 예를 나타내었다. P1 - P5는 단백질분해기 일어나는 부위로 부터 단백질의 아미노말단으로 향하는 아미노산 1 - 5 위치를 의미한다. P1' - P4'는 단백질분해가 일어나는 부위로 부터 단백질의 카르복시 말단으로 향하는 아미노산 1 - 4 위치를 의미한다.
| 프로테아제 | P | P4 | P3 | P2 | P1 | P1' | P2' | P3' | P4' | 참조 |
| 플라스민 | L | I | K | M | K | P | Takagi and Doolittle, 1975 Biochem. 14:5149-5156 | |||
| 플라스민 | N | F | K | S | Q | L | Takagi and Coolittle, 1975 | |||
| 스트로멜라이신 | Ac | G | P | L | A | L | T | A | L | Smithet al., 1995,J. Biol. Chem. 270:6440-6449 |
| 스트로멜라이신 | Ac | P | F | E | L | R | A | NH2 | Smithet al., 1995 | |
| 엘라스타제 | Z- | A | A | F | A | NH2 | Bessonet al., 1996,Analytical Biochemistry 237:216-223 | |||
| 콜라게나제 | G | P | L | G | I | A | G | P | Netzel-Arnettet al., 1991,J. Biol. Chem., 266:6747-6755 | |
| t-PA | P | H | Y | G | R | S | G | G | Coombset al., 1998,J. Biol. Chem., 273:4323-4328 | |
| u-PA | P | G | S | G | R | S | A | S | G | Coombset al., 1998 |
다른 바람직한 구체예에서 올리고-에스테르 도메인이 상기 제1 및 제2 도메 인 사이에 삽입되었다. 이는 락트산의 올리고머같은 올리고-에스테르를 사용하여 이룰 수 있다.
비효소 분해 기질은 산 또는 염기 촉매 기작에 의한 가수분해를 겪게되는 결합으로 이루어진다. 이의 기질은 락트산 또는 글리콜산의 올리고머같은 올리고-에스테르를 포함한다. 상기 물질의 분해율은 올리고머의 선택을 통해 제어된다.
D. PTH
본 발명에서 사용되는 용어 "PTH"는 인간 PTH 1-84 서열 및 생분해되는 천연 또는 합성 메트릭스와 공유결합되었을 때 뼈 형성 특성을 나타내는 PTH의 모든 절단체(truncated), 변형 및 대립이형을 포함한다. 바람직한 PTH의 절단 형태는 PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31, 또는 PTH 1-25이다. 가장 바람직하게는 PTH 1-34이다. 바람직하게, PTH는 인간 PTH이나, 소 PTH같이 다른 유래의 PTH도 적합할 수 있다.
생활성 인자의 도입 및/또는 방출 방법
메트릭스에 PTH를 도입하기 위한 바람직한 구체예에서, 상기 메트릭스는 피브리노겐, 칼슘원 및 트롬빈으로 형성된 피브린을 포함하고 상기 PTH 융합 펩타이드는 응고되는 동안 피브린에 도입된다. PTH 융합 펩타이드는 두개의 도메인, 제1 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질로 디자인되는데, 그 중 한 도메인, 제2 도메인은 인자 ⅩⅢa같은 가교결합 효소의 기질이다. 인자 ⅩⅢa는 응고동안 활성화되는 트랜스글루타미나제이다. 상기 효소, 즉, 트롬빈에 의해 절단되어 인자 ⅩⅢ로 부터 자연스럽게 형성된 효소는 글루타민 측사슬과 라이신 측사슬사이에 형성된 아미드 결합을 통해서 서로에게 피브린 사슬을 부착시키는 기능을 한다. 상기 효소 는 또한 응고시 다른 펩타이드를 피브린에 부착시키는 기능을 하는데, 예를 들어, 제공된 세포 부착 부위는 인자 ⅩⅢa를 역시 포함한다. 구체적으로 서열 NQEQVSP(서열번호 16)은 인자 ⅩⅢa에 대한 효율적인 기질로 기능함이 증명되었다. 본 발명에서 기술한 바와 같이 PTH와 직접 연결되거나 또는 PTH(제1 도메인) 및 NQEQVSP(서열번호 16) 서열(제2 도메인) 사이에 분해 부위를 포함한다. 이와 같이, PTH 융합 펩타이드는 인자 ⅩⅢa 기질을 통하여 응고시 피브린에 도입될 수 있다.
도입용 융합 단백질의 디자인
PTH를 포함하는 제1 도메인, 가교결합 효소를 위한 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인 및 상기 제1 및 제2 도메인 사이에 선택적으로 분해 부위를 포함하는 PTH 융합 펩타이드를 몇가지 다른 설계를 사용하여 피브린에 도입할 수 있다. 바람직하게 상기 제2 도메인은 트랜스글루타미나제 기질 도메인을 포함하고 보다 바람직하게는 인자 ⅩⅢa 기질 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게 상기 인자 ⅩⅢa 기질 도메인은 NQEQVSP(서열번호 16)을 포함한다. 상기 PTH 융합 펩타이드가 피브리노겐 중합 동안, 즉, 피브린 메트릭스의 형성 동안 존재하면, 직접적으로 메트릭스에 도입된다.
상기 PTH 융합 펩타이드의 제1 및 제2 도메인사이의 분해 부위는 상술한 바와 같이 효소 분해 부위이다. 바람직하게 상기 분해 부위는 플라스민 및 메트릭스 메탈로프로테아제로 이루어진 군으로 부터 선택된 효소로 절단가능하다. 상기 효소 분해 부위의 Km 및 kcat의 조심스러운 선택을 통해서, 각 타입의 단백질 및 적용분야 에 맞도록 제작되어 배치된 분해 부위와 함께, 단백질 메트릭스 전 또는 후에 발생하게 제어하거나 및/또는 유사하거나 다른 효소를 상기 메트릭스 분해에 사용하여 제어할 수 있다. 이러한 PTH 융합 펩타이드는 상술한 바와 같이 피브린 메트릭스와 직접적으로 가교결합된다. 그러나, 효소 분해 부위의 도입은 단백질분해동안 PTH의 방출을 변경시킨다. 세포-유래 프로테아제가 격리된 융합 펩타이드에 도달하면, 설계된 단백질을 새롭게 형성된 분해 부위에서 절단한다. 최종 분해 산물은 유리된PTH를 포함하며, 이는 거의 자유로운 설계 융합 서열뿐만 아니라 분해된 피브린이다.
II. 사용방법
상기 메트릭스는 이식 전 또는 이식 중에 조직의 치유, 재생, 또는 재형성, 및/또는 PTH 방출에 사용된다. 일부 경우에서 이식 부위에서 조직에 메트릭스를 합치시키기 위해 투여 부위에 가교결합을 유도하는 것이 바람직하다. 다른 경우에서는, 이식 전에 메트릭스를 준비하는 것이 편리하다.
이식 전 또는 이식 중에, 또는 이식 후에도, 메트릭스를 형성되도록 폴리머를 가교결합하는 중 또는 후에, 또한 상기 메트릭스에 세포를 첨가한다. 이는 메트릭스를 가교결합하는 것외에도 또는 이를 대신해서 세포 증식 또는 내증식을 촉진하도록 디자인된 세포간 공간을 생성하게 된다.
대분분의 경우 세포 성장 또는 증식을 촉진시키도록 메트릭스를 이식하는 것이 바람직하나, 어떤 경우에서는 생활성 인자를 세포 증식율을 억제하는 데 사용하게된다. 특별한 적용분야로는 외과수술 후 유착 형성을 억제하는 것이다.
III. 응용방법
바람직한 구체예에서, 상기 물질은 인 시츄 또는 생체내에서 겔화된다. 다른 구체예에서 상기 메트릭스는 신체 외부에서 형성되고 예형으로 적용된다. 상기 메트릭스 물질은 합성 또는 천연 전구체 성분으로 제조된다. 사용되는 전구체 성분의 종류에 관계없이, 상기 전구체 성분은 상기 성분의 중합 또는 겔화될 수 있는 조건하에서 서로 결합되거나 접촉하는 것을 방지하기 위해 혼합되기 전에 신체와 분리되어야만 한다. 투여되기 전 접촉을 방지하기 위해서, 각 조성물을 분리한 키트를 사용한다. 중합가능한 조건하에서 혼합하면서, 상기 조성물은 3차 네트워크를 보충하는 생활성 인자를 형성한다. 전구체 성분 및 이들의 농도에 따라서, 겔화는 혼합 후 순간적으로 일어난다. 이와같이 빠른 겔화는 주사, 즉, 주사 바늘을 통해서 겔화된 물질을 밀어넣는 것을 거의 불가능하게 만는다.
일 구체예에서 상기 메트릭스는 피브리노겐으로 형성된다. 피브리노겐은 적절한 온도 및 pH에서 트롬빈 및 칼슘원과 접촉하면, 다양한 일련의 단계적인 반응을 통해서 메트릭스로 형성된다. 세 성분, 피브리노겐, 트롬빈, 및 칼슘 원은 분리되어 저장해야 한다. 그러나, 상기 세 성분 중 적어도 하나를 분리시키고 다른 두 성분은 투여 전에 혼합된다.
제1 구체예에서 피브리노겐을 생리적 pH(pH 6.5 내지 8.0, 바람직하게 pH7.0 내지 7.5)에서 완충용액(안정성을 증가시키기 위해 아프로티닌을 추가적으로 함유할 수 있음)에 용해시키고 염화칼슘 완충용액(예를 들어, 40 내지 50mM 농도 범위)에 트롬빈 용액과 분리시켜 저장한다. 상기 피브리노겐 용 완충용액은 150mM의 바 람직한 농도의 추가적인 NaCl을 포함하는 50mM의 바람직한 농도인 히스티딘 완충용액 또는 TRIS 완충식염수(바람직하게 33mM 농도)이다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질, 피브리노겐, 트롬빈, 및 칼슘 원이 함유된 키트가 제공된다. 선택적으로, 상기 키트는 인자 ⅩⅢa같은 가교결합 효소를 함유할 수 있다. 상기 융합 단백질은 생활성 인자, 가교결합 효소를 위한 기질 도메인 및 상기 기질 도메인과 생활성 인자사이에 분해 부위를 함유한다. 상기 융합 단백질은 피브리노겐 또는 트롬빈 용액에 존재한다. 바람직한 구체예에서 상기 피브리노겐 용액은 융합 단백질을 함유한다.
상기 용액은 바람직하게 투 웨이 실린지 디바이스로 혼합되는데, 혼합 챔버 및/또는 바늘 및/또는 고정(static) 믹서를 통해서 두 실린지 내용물을 압착시켜 혼합시킨다.
바람직한 구체예에서 피브리노겐과 트롬빈은 모두 감압동결건조형태로 분리되어 저장된다. 둘 중 하나는 융합 단백질을 함유한다. 사용 전, 트리스 또는 히스티딘 완충 용액을 피브리노겐에 첨가하는데, 상기 완충용액에는 추가적으로 아프로티닌을 함유할 수 있다. 상기 감압동결건조된 트롬빈을 염화칼슘 용액에 용해시킨다. 이후, 상기 피브리노겐과 트롬빈 용액을 분리된 컨테이너/바이알/실린지 몸체에 위치시키고 투-웨이 실린지같은 투 웨이 연결 디바이스로 혼합시킨다. 선택적으로, 상기 컨테이너/바이알/실린지 몸체는 두 부분으로 되어 실린지 몸체 벽에 수직으로 조절가능한 칸막이로 분리된 두개의 챔버를 갖는다. 상기 챔버 중 하나는 감압동결건조된 피브리노겐 또는 트롬빈을 수용하고, 반면 다른 챔버에는 적절한 완 충용액이 수용된다. 플런저(plunger)를 아래로 누르면, 상기 칸막이가 이동하여 상기 완충 용액이 피브리노겐 챔버로 방출되어 피브리노겐을 용해시킨다. 상기 피브리노겐과 트롬빈이 모두 용해되면, 이분된 두 실린지 몸체를 투 웨이 연결 디바이스에 부착시키고 연결 디바이스에 부착된 주사 바늘을 통해서 내용물을 압착시켜 혼합시킨다. 선택적으로, 상기 연결 디바이스는 고정 믹서를 함유하여 내용물의 혼합을 증진시킨다.
바람직한 구체예에서 혼합하기 전 상기 피브리노겐은 8배 희석시키고 트롬빈은 20배 희석시킨다. 상기 비율은 약 1분의 겔화시간을 유도한다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 메트릭스는 마이클 첨가반응이 가능한 합성 전구체 성분으로 형성된다. 친핵성 전구체 성분(다수티올)은 염기성 pH에서 단지 다수용체(multiacceptor) 성분(공액 불포화기)과 반응하기 때문에, 세 성분: 염, 친핵성 성분 및 다수용체 성분은 혼합되기 전 분리되어 저장되야 한다. 상기 다수용체 및 다수티올 성분은 모두 완충용액에 용액으로 저장한다. 상기 두 성분은 모두 세포 부착 부위와 추가적으로 생활성 분자를 포함한다. 따라서, 상기 시스템의 제1 조성물은 예를 들어 친핵성 성분 용액을 포함하고 상기 시스템의 제2 조성물은 다수용체 성분 용액을 포함한다. 상기 두 조성물 중 하나 또는 둘 모두는 염을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 다수용체 및 다수티올 성분은 제1 조성물에 용액으로 포함되고 제2 조성물은 염을 포함한다. 연결 및 혼합은 상기 피브리노겐에 대해 기술한 바와 같은 방식으로 일어난다. 이분된 실린지 몸체를 합성 전구체 성분에 대해서도 동일하게 적절하다. 피브리노겐 및 트롬빈 대신 다수용체 및 다수티올 성 분을 두 챔버 중 하나에 분말 형태로 저장하고 다른 챔버에는 염기성 완충용액을 수용한다.
이하 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위해 포함시켰다. 상기 조성물 및 방법을 바람직한 구체예로 기술하였으나, 본 발명의 개념, 의도 및 범주를 벗어나지 않고 본 발명에서 기술한 조성물, 방법 및 상기 방법의 단계 또는 연속적인 단계에 변화를 줄 수 있음은 당 분야의 당 업자들에게는 자명하다.
도 1은 플라스민-분해 펩타이드-함유 피브린 겔 및 자유 펩타이드의 형광 탐지 크로마토그램을 나타내는 도면이다. α2PI1-7-AATIII121-134펩타이드가 도입된 분해 피브린 겔(-), 도입된 펩타이드를 함유하는 분해 피브린 겔에 자유롭게 첨가된 상기와 동일한 펩타이드(...), 및 자유 펩타이드 단독(--)의 사이즈 익스클루젼 크로마토그래피를 나타내었다. N-말단 류신 잔기가 댄실레이트(dansylate)화되었다(dL로 표시). 자유 펩타이드는 응고되는 동안 피브린 겔에 도입된 펩타이드보다 저분자량이고, 분해 피브린에 공유 부착되고 따라서 인자 ⅩⅢa 활성에 의해 공유 도입됨을 증명하도록 보다 긴 시간 동안 용리하였다.
도 2는 외부 인자 ⅩⅢ가 첨가된 피브린 겔에 dLNQEQVSPLRGD(서열번호 1)의 도입을 나타내는 그래프이다. 1U/㎖을 첨가하였을때, 도입 수준이 증가하여 25몰 펩타이드/몰 피브리노겐을 얻을 수 있었다.
도 3은 이중 도메인 펩타이드 dLNQEQVSPLRGD(서열번호 1)를 희석하지 않은 피브린 글루(glue)에 도입함을 나타내는 그래프이다. 세개의 다른 키트를 테스트하였으며 각각의 경우 높은 도입수준이 관찰되었는데, 25몰 펩타이드/몰 피브리노겐에 도달하였다. 최대 도입을 위한 외부 펩타이드의 농도는 적어도 5mM인데, 생성되는 고밀도 피브린 메트릭스내에서의 확산 제한에 기인할 가능성이 있다. 상기 도입 수준은 유사한 도입 프로파일을 제공하는 각 키트에서 매우 일관성있었다.
실시예 1 : 공유결합된 TGPTH를 함유하는 메트릭스
TGPTH의 합성
전체 단백질과 유사한 활성을 보이는 PTH 1-34-mer 펩타이드, 및 이 길이의 단백질을 표준 고상 펩타이드 합성 방법으로 합성하였다.
모든 펩타이드를 표준 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 화학을 사용하는 자동 펩타이드 합성기를 사용해 고체 레진상에서 합성하였다. 펩타이드를 c18 크로마토그래피로 정제하고 HPLC에서 역상 크로마토그래피를 사용해 분석하여 순도를 결정하고 매스 스펙트로스코피(MALDI)로 각 생성물의 분자량을 확인하였다. 이 방법을 사용하여, 하기 펩타이드("THPTH"로 지칭함)를 합성하였다:
NH3-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-
His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-
Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-COOH(서열번호 17).
생체내 결과
뼈 재생을 강화시키는 TGPTH의 활성을 양 드릴 홀 결함에서 TISSUCOL®메트릭스로 테스트하였다. 12㎜ 깊이인 8㎜ 홀을 양의 근위 및 원위 대퇴골 및 상완골에 생성시켰다. 상기 홀을 인 시츄 중합 피브린 겔로 채웠다. 결합을 비워두거나, TISSUCOL®로 채우거나 또는 중합전에 THPTH를 400㎍/㎖로 TISSUCOL®에 첨가하였다. TISSUCOL®을 사용한 각 실시예에서, 사용하는 표준 농도를 4배로 희석하여, 12.5㎎/㎖의 피브리노겐 농도를 유도하였다.
상기 결함은 8주 동안 치유되도록 하였다. 상기 치유 기간 이후, 상기 동물을 희생시키고 뼈 샘플을 적출하고 마이크로 컴퓨터 토포그래피(μCT)로 분석하였다. 이후 석회화된 뼈 조직으로 채워진 결함 부피의 퍼센트를 결정하였다. 상기 빈 상태로 남겨둔 결함에서는, 피브린 메트릭스내부에 석회화된 조직 형성이 존재하지 않았다. 피브린 겔만을 첨가한 경우, 실질적으로 뼈 치유가 존재하지 않았다. 그러나, 400㎍/㎖의 THPTH를 첨가한 경우, 결함이 35%의 석회화 뼈로 채워져 치유 수준이 상당하게 증가하였다.
실시예 2: 피브린 메트릭스에 부착된 변형 PTH1-34에 대한 치유 반응
물질
피브린 메트릭스에 도입된 PTH1-34 변형 형태로 치명적인 크기의 쥐 두개 결함에서의 치유 반응을 테스트하였다.
피브린 겔을 TISSUCOL®키트(Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH) 피브린 봉합제 전구체 성분으로 제조하였다. 피브리노겐을 멸균된 0.03M 트리스 완충용액(TBS, pH 7.4)으로 희석하여 약 8㎎/㎖ 용액으로 만들고 트롬빈을 멸균된 50mM CaCl2 용액으로 희석하여 2U/㎖ 용액으로 형성하였다. 피브리노겐의 최종 농도는 1 : 8 원래 TISSUCOL®제제(약 100㎎/㎖)이고 트롬빈의 경우는 1 : 160 원래 TISSUCOL®트롬빈 농도(약 500IE/㎖)였다. TG-pl-PTH1-34 또는 TGPTH1-34의 미리정해진 양을 상기 트롬빈에 첨가하고, 혼합하여 균질한 농도를 형성시켰다.
피브린 겔을 형성시키기 위해, 트롬빈을 함유하고 있는 튜브에 피브리노겐을 주입하여 희석된 전구체를 함께 희석하였다. 양의 드릴 결함의 경우(하기에 기술하는 바와 같이), 상기 혼합물을 곧바로 양의 해면뼈에 생성된 드릴 결함에 주입하였으며, 피브린 겔이 1 내지 5분안에 형성되었다. 첫번째 동물 실험 시리즈의 경우, 겉질뼈 치유에서 생활성 인자로 PTH1-34 (NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF: 서열번호 18)를 함유하는 융합 단백질의 효율성을 작은 동물 모델에서 테스트하였다. 서열 YKNR(서열번호 19)는 플라스민 분해가능한 결합을 만들었다("TG-pl-PTH1-34). 상기 TG-pl-PTH1-34는 화학 합성으로 제조되었다. 최종 산물로 TFA 염을 생성하게 되는 TFA를 카운터(counter) 이온으로 사용하여 역상 HPLC(C18 컬럼)를 통해 정제하였다. 상기 TG-pl-PTH1-34의 순도는 95%였다.
치유 반응을 짧은 시간(3 주)과 긴 치유 시간(7주)에서 조사하여 치유 강화가 관찰되는 가를 결정하였다.
치명적인 크기의 쥐 두개결함
쥐를 마취시키고 두개뼈를 노출시켰다. 상기 두개골의 외부면상의 골막을 접어서 치유 과정에서 역할을 수행할 수 없게 하고, 하나의 8㎜ 둥근 결함을 생성시켰다. 상기 결함 크기는 8㎜ 또는 보다 큰 결함이 자발적으로 자체적으로 치유되지 않는 치명적인 크기의 결함임이 사전에 결정되었기 때문에 선택되었다. 상기 결함에 예형 피브린 메트릭스를 맞춰 넣고 상기 동물이 3 및 7주간 치유되도록 하였다. 상기 결함 부분을 외식하고 방사선과 조직학을 통해 분석하였다.
결과
TG-pl-PTH1-34를 3주 시간점에서 연구한 경우, 치유 정도는 피브린 메트릭스 단독에서 관찰된 결과와 매우 유사하였다. 상기 3주 시간점은 3주에 강한 치유 효과를 나타낸 rhBMP-2를 포함하는 다른 강력한 형태에서의 초기 시간점으로 선택되었다. 대조적으로, TG-pl-PTH1-34의 치유 효과는 이 초기 시간점에서는 관찰되지 않았다. 그러나, 보다 긴 시간점(7주)을 분석한 결과, 변형 PTH1-34를 피브린 메트릭스에 추가한 경우 치명적인 크기의 쥐 두개 결함의 치유에서 중간정도의 용량 의존적 향상이 관찰되었다. 상기 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 높은 용량의 변형 PTH1-34를 사용한 경우, 치유 반응은 65% 증가하였다.
| 샘플 | 용량 (㎍/㎖) | 시간 (일) | 치유정도(결함을 채운 뼈%) |
| 피브린 | 0 | 63 | 38 |
| TG-pl-PTH1-34 | 10 | 63 | 43 |
| TG-pl-PTH1-34 | 200 | 63 | 50 |
| TG-pl-PTH1-34 | 500 | 63 | 62 |
상기 결과들은 PTH1-34를 피브린 메트릭스에 도입하면, 뼈 형성에서 보통의 증가로 증명된 바와 같이 어느 정도의 활성을 유지하고 있음을 증명하였다.
양의 뼈 드릴 결함
긴 뼈의 결함 모델에서 뼈를 치유하는 데 상기 호르몬의 효과를 테스트하기 위해 TG-pl-PTH1-34로 테스트하였다. 양의 드릴 결함 모델에서, 약 15㎜ 깊이의 8㎜의 원통형 드릴 결함을 대퇴골 및 상완골의 근위 및 원위 부분에 위치시켰다. 상기 결함은 긴 뼈의 골단에 위치하므로, 결함 가장자리에 겉질뼈의 얇은 층을 갖는 기둥뼈로 둘러쌓였다. 상기 결함을 다양한 용량의 TG-pl-PTH1-34 또는 TGPTH1-34를 함유하는 인 시츄 중합 피브린(약 75㎕)으로 채웠다. 8주간 상기 동물들이 치유되도록 하고 희생시켰다. 상기 결함을 μCT와 조직학으로 분석하였다.
이러한 일련의 실험 동안, 세가지 타입의 조성물을 테스트하였다. 우선, TG-pl-PTH1-34을 넓은 농도 범위에 걸쳐 테스트하였다. 두번째로는, 분해 부위없이 아미노 말단에 단지 트랜스글루타미나제 서열을 갖는 다른 변형 PTH1-34인 TGPTH1-34 (NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF;서열번호 17)를 사용하였다. 따라서, 따라서, TGPTH1-34는 피브린 메트릭스 자체의 분해를 통해서만 유리된다. TGPTH1-34를 제조하고 TG-pl-PTH1-34와 동일하게 정제하였다. 순도는 95%였다. TG-pl-PTH
1-34
와 효율을 비교하기 위해 TG-pl-PTH1-34와 유사한 몇가지 농도의 TGPTH1-34를 테스트하였다. 마지막으로, TGPTH1-34 또는 TG-pl-PTH1-34와 함께, 과립 물질의 존재하에 메트릭스를 제조하였다. 상기 과립 물질은 겔화되는 동안 메트릭스에 끼워넣어지는 표준 트리칼슘포스페이트/하이드록시아파티트 혼합물이다. 상기 과립 첨가가 PTH1-34의 효율에 미치는 영향을 실험하였다. 대조구로 비변형 피브린을 테스트하였다.
결과
변형 PTH1-34 분자 중 하나를 긴 뼈 결함에 위치시켰을 때, 피브린 메트릭스(대조구) 단독 사용보다 치유 반응에서 상당한 향상이 관찰되었다. 피브린 단독 사용은 단지 20%의 원래 결함만이 새롭게 형성된 뼈로 채워져 치유가 적게 나타났다.
TG-pl-PTH1-34는 20 내지 1000㎍/㎖의 농도 시리즈로 테스트하였다. 각 용량 테스트 동안, 치유반응이 상당하게 증가됨이 관찰되었다. 예를 들어, 100㎍/㎖의 TG-pl-PTH1-34를 사용한 경우, 치유율은 거의 60%까지 증가하였다.
두번째 일련의 실험에서는, TGPTH1-34를 테스트하였다. TGPTH1-34의 사용 역시 뼈 치유를 증가시켰다. 예를 들어, 400㎍/㎖ 사용은 치유 반응을 40% 까지 향상시켰고 1000㎍/㎖ 사용은 65%까지 뼈 치유를 증가시켰다. 따라서, 변형 PTH1-34 서열의 첨가는 대조구보다 강한 치유 반응을 유도하였다.
마지막으로, 변형 PTH1-34 분자를 메트릭스와 결합시키고 과립/메트릭스 혼합 물을 사용한 경우, PTH1-34의 효율성이 유지되었다. 이는 TG-pl-PTH1-34(표 4)와 TGPTH1-34(표 5) 모두에 대해 테스트하였다.
| 샘플 | 용량 (㎍/㎖) | 치유 (뼈로 채워진 결함%) |
| 피브린 (대조구) | 0 | 20 |
| TG-pl-PTH1-34 | 50 | 31.3 |
| TG-pl-PTH1-34 | 100 | 59.7 |
| TG-pl-PTH1-34 | 400 | 73 |
| TG-pl-PTH1-34 | 1000 | 77 |
| TG-pl-PTH1-34400TCP | 400 | 68 |
| 샘플 | 용량 (㎍/㎖) | 치유 (뼈로 채워진 결함%) |
| TGPTH1-34 | 0 | 20 |
| TGPTH1-34 | 400 | 40 |
| TGPTH1-34 | 1000 | 65 |
| TGPTH1-34 400TCP | 400 | 71 |
조직학적 평가는 원래 스핀들 결함에서 높은 침윤율과 세포외 메트릭스에서 지지되는 골모세포 전구세포를 보여준다. 크고 둥근 형태의 골모세포를 갖는 활성 뼈모양이 일반적이고, 내연골의 골화(연골세포)가 관찰되었다. 8주까지, 골모세포와 재형성의 건강 징후를 확인할 수 있었다. 그러나, 체계적인 PTH에 연속적으로 노출시켜 얻은 결과와 달리, 골모세포로 부터 분명한 반응이 관찰되지 않았고 새로운 뼈 형성은 결함부 및 주위의 흡수보다 상당하게 크지 않았다. 어떠한 외부 신체 염증 반응이 관찰되지 않았다(즉, 거대 세포는 없고 단지 경미한 단핵세포가 존재). 첨가된 미네랄 입자와 함께 샘플에 과립이 여전히 존재하였다.
실시예 3 : 합성 메트릭스용 전구체 성분의 제조
PEG-비닐술폰의 제조
상업적으로 판매하는 브랜치된 PEGs(4가지 PEG, 분자량 14,8000, 4가지 PEG, 분자량 10,000 및 8가지 PEG, 분자량 20,000;Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA)의 OH-말단에 작용기를 붙혔다.
아르곤 분위기하에서 전구체 폴리머(분자체에서 사전 건조)의 디클로로메탄 용액을 NaH와 반응시키고, 수소 방출후, 디비닐술폰(몰 비: OH 1:NaH 5:디비닐술폰 50)과 반응시켜 PEG 비닐술폰을 제조하였다. 상기 반응은 일정하게 교반하면서 아르곤하에서 3일간 상온에서 수행되었다. 농축 아세트산으로 상기 반응 용액을 중화시킨 후, 상기 용액을 투명하게 될때까지 종이로 여과시켰다. 유도된 폴리머를 아이스 콜드 디에틸에테르로 침전시켜 분리하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄에 재용해시키고 디에틸에테르에 재침전(완전하게 세척하여서)을 두번 수행하여 모든 여분의 디비닐술폰을 제거하였다. 최종적으로, 상기 생성물을 진공 건조하였다. 상기 유도체를 1H NMR로 확인하였다. 상기 생성물은 6.21ppm(2 수소) 및 6.97ppm(1 수소)에서 특징적인 비닐 술폰 피크를 나타내었다. 말단 기 변화 정도는 100%로 확인되었다.
PEG-아크릴레이트의 제조
아르곤 분위기하에서 전구체 폴리머의 공비적으로 건조시킨 톨루엔 용액을 트리에틸아민 존재하에서, 아크릴로일클로라이드와 반응시켜(몰비: OH 1: 아크릴로일클로라이드 2: 트리에틸아민 2.2) PEG 아크릴레이트를 제조하였다. 상기 반응은 교반시키면서 밤새 상온에서 암반응으로 진행시켰다. 상기 최종적인 옅은 노란색 용액을 중성 알루미나 베드를 통과시켜 여과하고; 용매를 증발시킨 후, 상기 반응 산물을 디클로로메탄에 용해시키고, 물로 세척시킨 후, 소듐설페이트로 건조시키고 차가운 디에틸에테르로 침전시켰다. 수율: 88%; OH에서 아크릴레이트로 전환: 100%(1H NMR 분석에 의함).
1H NMR(CDCl3): 3.6(341H(14800 4가지:337H theor.), 230(10000 4가지: 227H theor.), 또는 210H(20000 8가지: 227H theor.), PEG 사슬 프로톤), 4.3(t, 2H, -CH2-CH2-O-CO-CH=CH2), 5.8(dd, 1H, CH2=CH-COO-), 6.1 및 6.4(dd, 1H, CH2=CH-COO-)ppm.
FT-IR(film on ATR plate): 2990-2790(υC-H), 1724(υC=O), 1460(υs CH2), 1344, 1281, 1242, 1097(υas C-O-C),952, 842(υs C-O-C)cm-1.
펩타이드 합성
모든 펩타이드는 표준 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 화학과 함께 자동 펩타이드 합성기(9050 Pep Plus Synthesizer, Millipore, Framingham, USA)를 사용하여 고체 레진에서 합성하였다. 소수성 스캐빈저(scavenger)와 절단 보호기는 찬 디에 틸에트레에 펩타이드를 침전시키고 비이온화된 물로 용해시켜 제거되었다. 감압동결건조 후, 상기 펩타이드를 0.03M 트리스-완충 식염수(TBS, pH7.0)에 재용해시키고 러닝(running) 완충용액으로 TBS, pH7.0을 사용하여 사이즈 익스클루젼 컬럼상에서 HPLC(Waters;Milford, USA)를 사용하여 정제하였다.
공액 첨가 반응에 의한 메트릭스 형성
단백질분해 세포 이동이 가능하게 펩타이드-연결 친핵체와 PEG-연결된 공액 불포화로 공액 첨가하여 MMP-감응 겔을 형성하였다. 상기 겔 합성은 비닐술폰-작용기가 붙은 PEG상에서 티올-PEG의 마이클-타입 첨가 반응을 통해 전반적으로 수행되었다. 첫 단계에서, 부착 펩타이드(예를 들어, 상기 펩타이드는 Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(서열번호 20))를 다중가지의 PEG-비닐술폰에 메달리게 부착시키고 상기 전구체를 디티올-함유 펩타이드와 가교결합시켰다(예를 들어, MMP기질 Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH2(서열번호 21)). 통상적으로 시험관내 실험용 3차원 겔 제조에서, 4가지-PEG-비닐술폰(분자량 15000)을 TEOA 완충용액(0.3M, pH8.0)에 용해시켜서 10%(w/w) 용액을 만들었다. 겔 세포-부착을 야기하기 위해서, 용해 펩타이드 Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(서열번호 20)(동일 완충용액)를 상기 용액에 첨가하였다. 부착 펩타이드를 37℃에서 30분간 반응하도록 하였다. 이후, 가교결합 펩타이드 Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH2(서열번호 21)를 상기 용액과 혼합하여 겔을 합성하였다. 상기 겔화는 수분 내에 발생하나, 완전한 반응을 보장하기 위해 가교결합 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행하였다.
비단백질분해 세포 이동하도록 PEG-연결된 친핵체와 PEG-연결된 공액 불포화기와 함께 공액 첨가하여 MMP-비-감응 겔을 형성하였다. 상기 겔 합성은 또한 비닐술폰-작용기가 붙은 PEG상에서 티올-PEG의 마이클-타입 첨가 반응을 통해 전반적으로 수행되었다. 첫번째 단계에서, 부착 펩타이드(예를 들어, 상기 펩타이드는 Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(서열번호 20))를 다수가지의 PEG-비닐술폰에 메달리게 부착시키고 상기 전구체를 디티올-함유 펩타이드와 가교결합시켰다(m.w. 3.4kD). 통상적으로 시험관내 연구를 위한 3차 겔의 제조에서, 4가지-PEG-비닐술폰(분자량 15,000)을 TEOA 완충용액(0.3M, pH8.0)에 용액시켜서 10%(w/w) 용액을 만들었다. 상기 부착 펩타이드를 37℃에서 30분간 반응하도록 하였다. 이후, 상기 PEG-디티올 전구체를 상기 용액과 혼합하여 겔을 합성하였다. 상기 겔화는 수분내 발생하나, 완전한 반응을 보장하기 위해 가교결합 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행하였다.
축합 반응을 통한 메트릭스 형성
단백질분해 세포 이동이 가능하도록 다수의 아민을 함유하는 X-링커와 친전자성으로 활성화된 PEG의 축합반응을 통해 MMP-감응 겔을 형성하였다.
MMP-감응 하이드로겔을 또한 두개의 MMP 기질과 3 Lys를 함유한 MMP-감응 올리고펩타이드(Ac-GK
GPQGIAGQ
K
GPQGIAGQ
KG-NH2(서열번호 22))와 상업적으로 판매되는 이작용기 이중-에스테르 PEG-N-하이드록시숙신이미드(NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS)(Shearwater polymers)간의 축합반응을 수행하여 생성하였다. 첫번째 단계에서, 부착 펩타이드(예를 들어, 상기 펩타이드는 Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(서열번호 20)) 를 소량의 NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS와 반응시키고 이후 ε-아민(및 일차 아민)을 갖는 펩타이드 Ac-GK
GPQGIAGQ
K
GPQGIAGQ
KG-NH2(서열번호 22)와 혼합하여 네트워크에 상기 전구체를 가교결합시켰다. 시험관 내 실험을 위한 통상적인 3차원 겔 제조에서, 두 성분은 pH7.4의 10mM PBS에 용해시켜서 10%(w/w) 용액을 만들고 하이드로겔을 1시간 미만안에 형성시켰다.
마이클-타입 반응으로 형성된 현재 하이드로겔과 대조적으로, 이러한 접근법에서 바람직한 자가-선택성이 보장되지 않았는데, 이는 세포 또는 조직같은 생물학적 물질에 존재하는 아민이 이작용기 활성화된 이중 에스테르와 또한 반응하기 때문이다. 이는 또한 PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 또는 PEG 니트로페닐카보네이트같은 친핵성 작용기를 갖는 다른 PEGs에서도 마찬가지이다.
비-단백질분해 세포 이동하도록 PEG-아민 가교 링커와 친전자 활성 PEG의 축합반응을 통해 MMP-비-감응성 하이드로겔을 형성하였다. 하이드로 겔은 또한 상업적으로 판매되는 브랜치된 PEG-아민(Jeffamines)과 동일한 이작용기 이중-에스테르 PEG-N-하이드록시숙신이미드(NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS)간의 축합반응을 수행하여 형성하였다. 첫번째 단계에서, 상기 부착 펩타이드 (예를 들어, 상기 펩타이드는 Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(서열번호 20))를 소량의 NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS와 반응시키고 이후 상기 전구체를 다수가지 PEG-아민과 혼합하여 네트워크와 가교결합시켰다. 시험관내 실험에서 통상적인 3차원 겔의 제조에서는, 두 성분을 pH7.4의 10mM PBS에 용해시켜 10%(w/w) 용액을 만들고 하이드로겔을 한 시간 미만에 형성시킨다. 다 시, 마이클-타입 반응으로 형성된 본 하이드로겔과 비교하여, 이러한 접근법에서 바람직한 자가-선택성이 보장되지 않는데, 이는 세포 또는 조직등의 생물학적 물질에 존재하는 아민이 이작용기 활성화된 이중 에스테르와 또한 반응하기 때문이다. 이는 또한 PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 또는 PEG 니트로페닐카르보네이트같은 친전자성 작용기를 갖는 다른 PEGs에도 마찬가지이다.
실시예 4 : 효소분해가능한 합성 메트릭스에 의한 뼈 재생
두개의 다른 개시 농도의 효소분해 겔을 사용하였다. 각각의 경우에서, RGD 농도와 활성인자의 농도(100㎍/㎖의 CplPTH)는 일정하게 유지시켰다. 폴리머 네트워크를 20kD의 분자량(가가지의 분자량은 5kD)인 4개의 비닐술폰 말단기가 붙은 4-가지 브랜치된 PEG와 하기 서열을 갖는 디티올 펩타이드로 형성시켰다; Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly(서열번호 21). 두 전구체 성분을 0.3M 트리에탄올아민에 용해시켰다. 작용기가 붙은 PEG(제1 전구체 분자)와 디티올 펩타이드(제2 전구체 분자)의 개시농도를 변화시켰다. 한 경우에서 상기 농도는 조성물 총량(제1 및 제2 전구체 성분 + 트리에탄올아민 용액)의 12.6중량%였다. 상기 12.6중량%는 제1 전구체 성분만을 기초로 산출한 경우의 10중량%에 상응한다(100㎎/㎖의 제1 전구체 분자). 상기 제2 개시농도는 조성물 총량(제1 및 제2 전구체 성분 + 트리에탄올아민 용액)의 9.5중량%이고 이는 총량의 제1 전구체 분자만을 기초로 한 경우의 7.5중량%와 상응한다(7.5㎎/㎖의 제1 전구체 분자). 이는 비닐 술폰과 티을간의 몰비가 유지되도록 디티올 펩타이드의 양을 변화시킨 결과이다.
12.6중량%의 개시농도로 시작한 겔은 폴리머 네트워크에 물을 더한 총량의 8.9중량%의 농도로 팽창되며, 따라서, 상기 메트릭스는 91.1의 수분 함량을 가졌다. 9.5중량%의 개시 농도로 시작한 겔은 폴리머 네트워크에 물을 더한 총량의 7.4중량%의 최종 농도로 팽창되어, 92.6의 수분 함량을 가졌다.
이러한 변화의 효과를 실험하기 위해서, 상기 물질을 양 드릴 결함에서 테스트하였다. 양의 대퇴골 및 상완골의 골간 해면뼈에 750㎕의 결함을 위치시키고 인 시츄 겔화 효소 겔을 채웠다. N=2의 각 군으로 μCT를 통해서 결정된 하기와 같은 양의 석회화된 조직을 얻었다.
겔의 개시 농도 석회화 조직
12.6% 2.7%
9.5% 38.4%
겔을 덜 조밀하고 세포 침투가 쉽게 제조하여서, 활성 인자를 첨가한 최종 치유 반응이 보다 강하였다. 8.5중량% 미만의 최종 고체 농도를 갖는 효과는 상기 결과로 부터 분명하였다.
분명하게, 메트릭스의 디자인은 상처 결함을 치유하기 위해 매우 중요하다. 이들 하이드로겔은 각각 메트릭스를 생성하도록 말단결합된 큰 사슬의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 그러나, 효소 분해 부위를 통해서, 어떻게 결합되었는가에 대한 구체적인 내용, 링커의 밀도 및 다른 변이물도 기능적인 치유 반응에 중요하다. 이러한 차이점은 양 드릴 결함 모델에서 분명하게 관찰되었다.
실시예 5 : 가수분해 합성 메트릭스에 의한 뼈 형성
피브린 메트릭시에서 기술한 바와 같은 양 드릴 결함 모델에서와 마찬가지로 PTH1-34 융합 단백질을 합성 겔에서 테스트하였다. 아크릴레이트된 4 가지 폴리에틸렌 글리콜, 분자량 15,000(PEG 4*15 Acr)과 분자량 3400의 폴리에틸렌 글리콜 디티올을 함께 혼합하여 하이드로겔 네트워크를 생성하였다. 마이클 타입 반응을 통해서, 두 성분을 pH8.0의 0.3M 트리에탄올아민 완충용액에서 혼합하면, 상기 pH에서 형성된 최종 티오레이트는 아크릴레이트의 공액 불포화기와 반응하여 공유결합이 생성된다. 다수작용기 전구체를 함께 혼합하여, 결합된 다수작용기 수는 5 이상이고, 하이드로겔이 형성된다. 또한, 생활성 인자를 동일한 반응으로 메트릭스에 첨가할 수 있다. 이 경우, 세포 부착 모티브(motives) 또는 형태학적 또는 분열촉진인자를 포함하는 생활성 인자는 시스테인, 티올 함유 아미노산을 서열에 첨가하여 메트릭스에 결합시킬 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 시스테인을 세포 부착 서열 , RGD에 첨가하여, 보다 구체적으로는 RGDSP(서열번호 23)과 PTH1-34 서열에 첨가하고 둘을 크로스링커의 아크릴레이트를 통해서 메트릭스에 결합시켰다. 결과적으로, 이렇게 새롭게 형성된 하이드로겔은 가수분해적으로 불안정성을 나타내는 티올 근처에 다수의 에스테르를 갖게된다. 이러한 불안정성은 겔이 천천히 분해되도록 하고 새롭게 형성된 조직으로 대체된다.
상기 메트릭스에 공유결합된 RGD 및 PTH를 갖는 가수분해되는 특정 겔을 양 드릴 결함 모델에서 테스트하여 메트릭스 결합된 C-PTH1-34의 뼈 성장을 강화시키는 능력을 테스트하였다. 강화시키는 양을 결정하기 위해서, 0, 100 및 400㎍/㎖의 PTH1-34 융합 단백질을 메트릭스에 첨가하였다. 이를 수행하고, PTH1-34의 첨가에 따라 뼈 형성이 증가됨을 관찰하였다. 각 테스트에서 치유 반응은 8주의 동일한 시간점에서 측정하였다. 상기 결과는 빈 상태로 남겨 둔 결함과 비교하였다. PTH 융합 단백질이 없는 가수분해되는 합성 메트릭스를 사용하면, 치유 반응은 약 40%로 측정되었다. 이는 원래 결함 부피의 40%가 새롭게 형성된 뼈 조직으로 채워졌음을 의미한다. 이후, 400㎍/㎖의 변형 PTH1-34 융합 단백질을 사용하면, 치유 반응은 약 60%로 증가하였다. 이를 비교하면, 결함이 비워진 상태일 때, 약 10%가 석회화 조직으로 채워졌다. 상기 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
| 처리 | 치유 (석회화 조직 %) |
| 빈상태 | 10 |
| 가수분해 겔 | 40 |
| 100㎍/㎖ CPTH를 갖는 가수분해 겔 | 54 |
| 400㎍/㎖ CPTH를 갖는 가수분해 겔 | 60 |
빈 상태의 결함과 비교하면, 가수분해 PEG 겔 단독을 첨가한 경우는 뼈 치유에 상당한 효과를 가졌는데, 석회화 조직의 양이 300%까지 증가하였다. PTH1-34를 상기 메트릭스에 결합시킨 경우, 치유는 메트릭스 단독 사용경우 보다 최대 50% 수준으로 더욱 증가하였고 결함을 빈 상태로 둔 경우에 얻는 치유 정도보다 500% 높았다.
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20 25 30
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Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
Claims (19)
- 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH)을 포함하는 제1 도메인, 및제2 도메인으로서, 융합 단백질이 제2 도메인을 통해 메트릭스에 결합될 수 있도록 피브린 메트릭스 물질 또는 합성 메트릭스 물질에 공유 가교결합되는 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 상기 제1 및 제2 도메인 사이에 분해 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 PTH는 PTH 1-84, PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 및 PTH 1-25로 이루어진 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제3항에 있어서, 상기 PTH는 PTH 1-34인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 메트릭스는 피브린이며, 상기 제2 도메인은 트랜스글루타미나제 기질 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제5항에 있어서, 상기 제2 도메인은 인자 ⅩⅢa 기질 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 인자 ⅩⅢa 기질 도메인은 서열번호 12로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 메트릭스는 합성 메트릭스이며, 상기 제2 도메인은 적어도 하나의 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제2항에 있어서, 상기 분해 부위는 효소분해 또는 가수분해 부위인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제2항에 있어서, 상기 분해 부위는 플라스민 및 메트릭스 메탈로프로테아제로 이루어진 군으로 부터 선택된 효소로 절단되는 효소 분해 부위인 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 키트는 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘원을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 키트는 가교결합 효소를 더욱 포함하는 것을 특징으 로 하는 키트.
- 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 융합 펩타이드를 포함하며, 상기 융합 펩타이드는 메트릭스에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 세포 성장 또는 내증식용 메트릭스.
- 제14항에 있어서, 상기 메트릭스는 피브린인 것을 특징으로 하는 메트릭스.
- 제14항에 있어서, 상기 메트릭스는 친핵성 기를 포함하는 제1 전구체 분자와 친전자성 기를 포함하는 제2 전구체 분자간의 마이클 타입(Michael type) 첨가 반응을 통해 형성되며, 여기서 n과 m은 적어도 2이며 총합 n+m은 적어도 5인 것을 특징으로 하는 메트릭스.
- 제16항에 있어서, 상기 친전자성 기는 공액 불포화기이고, 상기 친핵성 기는 티올 및 아민으로 이루어진 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 메트릭스.
- 제14항에 있어서, 상기 메트릭스는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 메트릭스.
- 가교결합 메트릭스를 형성할 수 있는 적어도 하나의 메트릭스 물질을 제공하 는 단계, 여기서 상기 메트릭스 물질은 단백질 및 합성물질로 이루어진 군으로 부터 선택되며,상기 메트릭스 물질에 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 융합 펩타이드를 첨가하는 단계, 및상기 메트릭스 물질을 가교결합시켜 상기 제2 도메인을 통해서 융합 펩타이드를 메트릭스에 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 메트릭스의 제조방법.
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