NO331726B1 - Fusjonspeptid som omfatter et forste domene som omfatter paratyroidhormon (PTH) og et andre domene som omfatter et substratdomene, sett og matriks som omfatter fusjonspeptidet, og fremgangsmate til a fremstille en matriks - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet proteiner som er inkorporert i protein eller polysakkaridmatriser for anvendelse i vevsreparasjon, regenerasjon og/eller gjenoppbygging og/eller legemiddellevering. Proteinene kan inkorporeres slik at de blir frigjort ved degradering av matriks, ved enzymatisk virkning og/eller diffusjon. Som vist i eksemplene er én metode å binde heparin til matriks ved enten kovalent eller ikke-kovalente metoder, for å danne en heparinmatriks. Heparinet binder deretter ikke-kovalent heparin-bindende vekstfaktorer til proteinmatriks. Alternativt kan et fusjonsprotein konstrueres som inneholder en tverrbindingsregion så som en Faktor XIIIa substrat og den native proteinsekvens. Inkorporering av degraderbare koblinger mellom matriks og de bioaktive faktorer kan være spesielt nyttig når langtids legemiddellevering er ønskelig, f.eks. i tilfelle av nerveregenerering, hvor det er ønskelig å variere graden av legemiddelfrigjøring romlig som en funksjon av regenerering, f.eks. hurtig nær grensesnittet mot det levende vev og mer langsomt lenger inn i skadesonen. Ytterligere fordeler inkluderer den lavere totale legemiddeldose i leveringssystemet, en romlig regulering av frigjøring som tillater en større prosentandel av legemidlet å bli frigjort på den tid hvor det er størst cellulær aktivitet.

Description

Tittel: Fusjonspeptid som omfatter et første domene som omfatter paratyroidhormon (PTH) og et andre domene som omfatter et substratdomene, sett og matriks som omfatter fusjonspeptidet, og fremgangsmåte til å fremstille en matriks.

Oppfinnelsen angår fusjonspeptider som inneholder PTH og en aminosyresekvens som tillater bindingsinteraksjoner til matriser, sett og matrikser som omfatter fusjonspeptidet og fremgangsmåte for fremstilling av matriks med et matriksmateriale og fusjonspeptidene.

Paratyroidhormon (PTH) er et 84 aminosyrers peptid som er fremstilt og sekrert av paratyroidkjertelen. Hormonet spiller en hovedrolle ved kontroll av serumkalsiumnivåer gjennom dets virkning på forskjellige vev, inkludert ben. Undersøkelser på mennesker med forskjellige former av PTH har vist en anabolsk effekt på ben, som gjør dem interessante for behandling av osteoporose og beslektede benlidelser (US patent nr. 5 747 456 (Chorev et al.) og WO 00/10596 (Eli Lilly & Co.). Paratyroidhormonet virker på celler ved å bindes til en celleoverflatereseptor. Denne reseptoren er kjent for å finnes på osteoblaster, som er cellene ansvarlig for dannelse av nytt ben.

Det N-terminale 34 aminosyrers domene på det menneskelige hormon er blitt rapportert å være biologisk ekvivalent til full lengde hormon. PTH 1-34 og dens virkningsmåte er først blitt rapportert i US patent nr. 4 086 196. Siden forskning er blitt gjort på PTH 1-34 og andre trunkerte versjoner av den native humane PTH-form, så som f.eks. PTH1-25, PTH1-31 og PTH1-38 (se f.eks. Rixon RH, et al., J. Bone Miner. Res., 9 (8): 1179-89 (aug. 1994).

Mekanismen hvorved PTH har innflytelse på bengjennoppbygging er komplisert, noe som har ført til motstridende resultater og deretter et betydelig antall undersøkelser på de nøyaktige mekanismer involvert. Det er blitt vist at hvis PTH blir administrert systemisk på en kontinuerlig måte vil bentettheten reduseres. I motsetning til dette er det blitt rapportert at hvis samme molekyl blir administrert på pulsativ måte vil bentettheten øke (se f.eks. WO 99/31137 (Eli Lilly & Co.)). Denne tilsynelatende inkonsekvens kan forklares ved mekanismen hvorved PTH modulerer bengjenoppbygging og deretter de observerbare parametere for bentetthet. I modent ben har PTH-reseptoren bare blitt vist å være tilstede på overflaten til celler i osteoblastlinjen, men ikke på osteoklaster. Rollen som PTH spiller i bengjenoppbygging er rettet gjennom osteoblastene i motsetning til osteoklastene. Cellene på forskjellige stadier i osteoblastlinjen responderer imidlertid forskjellig når de bindes til PTH. Derfor kan de dramatiske forskjellene som er observert når PTH blir administrert ved å bruke forskjellige metoder forklares ved å forstå de forskjellige effektene som det samme molekyl har på forskjellige celler i osteoblastlinjen.

Når PTH bindes til en mesenchymal stamcelle blir cellen indusert til å differensieres i en preosteoblast. Således ved å tilsette PTH til systemet skjer en økning i preosteoblastpopulasjonen. Disse preosteoblastcellene har imidlertid også PTH-reseptoren og den påfølgende binding av PTH til reseptoren på disse cellene fører til en forskjellig reaksjon. Når PTH bindes til preosteoblaster resulterer det i to separate konsekvenser som fører til benresorpsjon. Først inhiberes den ytterligere differensiering av preosteoblaster i osteoblaster. Dernest øker den sekresjonen av interleukin 6 (IL-6) fra preosteoblastene. IL-6 både inhiberer preosteoblastdifferensiering så vel som å øke preosteoklastdifferensiering til osteoklaster. Denne dobbeltresponsen fra cellene i osteoblastlinjen er det som tilveiebringer den komplekse reaksjonen mellom bengjenoppbygging og PTH-eksponering. Hvis PTH blir dosert periodisk i korte tidsperioder blir mesenchymstamcellene indusert til å differensieres i osteoblaster. De korte doseringsperioder forhindrer derved de nylig dannede preosteoblaster til å danne IL-6 som forhindrer aktivering av osteoklastene. Derfor i løpet av doseringsintervallene kan disse nylig dannede preosteoblaster ytterligere differensieres til osteoblaster, som resulterer i bendannelse. Hvis en konstant dose av PTH blir applisert vil imidlertid preosteoblastene ha mulighet til å begynne å produsere IL-6, og således aktivere osteoklastene og inhibere seg selv, noe som gir den motsatte virkning benresorpsjon.

Ved vevsreparasjon eller regenerasjon må celler migrere inn i en sårseng, proliferere, uttrykke matrikskomponenter eller danne ekstracellulær matriks og danne en endelig vevsfasong. Cellepopulasjoner med flere celler må ofte delta i denne morfogenetiske responsen, som ofte inkluderer vaskulære celler og nerveceller. Matriser er blitt demonstrert i stor grad å øke, og i noen tilfelle er blitt funnet å være essensielle for at dette skal skje. Tilnærminger er blitt gjort ved å utvikle matriser fra naturlige eller syntetisk opprinnelse eller en blanding av begge. Naturlige celle-innvokste matriser blir utsatt for gjenoppbygning ved cellulær innflytelse, alt basert på proteolyse, dvs. ved plasmin (degradere fibrin) og matriksmetalloproteonaser (degradere kollagen, elastin, etc). Slik degradering er i stor grad lokalisert og skjer bare ved direkte kontakt med den migrerende celle. I tillegg er levering av spesifikke cellesignalproteiner så som vekstfaktorer meget godt regulert. I den naturlige modell er makroporøs celleinvoksende matriser ikke anvendt, men heller mikroporøse matriser som cellene kan degradere, lokale og ved behov, idet cellene migrerer inn i matriks. På grunn av vurderinger i forhold til immunogenisitet, kostbar produksjon, begrenset tilgjengelighet, porsjonsvariabilitet og rensing, har matriser basert på syntetiske forløpermolekyler, så som modifisert polyetylenglykol, blitt utviklet for vevsregenerasjon i og/eller på kroppen.

Mens mye arbeid er blitt gjort i å studere de systemiske virkninger av PTH har forskning ikke undersøkt lokal eller topisk administrering av PTH. Idet PTH har en direkte anabolsk virkning på osteoblastcellelinjen burde den ha et sterkt potensiale til å tilhele bendefekter i tillegg til å influere bentetthet hvis det presenteres på en egnet måte på det stedet hvor det er en defekt. Når defekten er blitt fylt med preosteoblaster kan, hvis PTH-signalet blir skrudd av de nylig dannede preosteoblaster deretter differensiert til osteoblaster og begynne å konvertere sårsengen, først inn i vevd benvev og deretter til en moden benstruktur.

Det er derfor en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe PTH i en form som kan bindes til en matriks for vevsreparasjon, regenerasjon og gjenoppbygging.

Det er en ytterligere hensikt å presentere PTH i en form som er egnet for topisk eller lokal administrering til en pasient for å tilhele bendefekter.

Fusjonspeptider som inneholder et paratyroidhormon (PTH) i ett domene og et substratdomene i stand til å bli kovalent tverrbundet til en matriks i et annet domene, og sett som inneholder slike fusjonsproteiner eller peptider er beskrevet heri. Fusjonsproteiner som bindes kovalent til naturlige eller syntetiske materialer for å danne matriser, som kan brukes til å tilhele bendefekter. Eventuelt blir alle komponentene for dannelse av matriks applisert til en bendefekt og matriks blir dannet på applikasjonsstedet. Fusjonspeptidet kan inkorporeres i matriks slik at enten blir fusjonspeptidet som en helhet eller bare den respektive PTH-sekvensen i det første domenet frigjort ved degradering av matriks, enzymatisk og/eller hydrolytisk virkning. Fusjonspeptidet kan også inneholde en degraderbar binding mellom det første og det andre domenet som inneholder hydrolytiske eller enzymatiske spaltingssteder. Særlig inneholder fusjonspeptidet PTH i ett domene, et substratdomene i stand til å bli kovalent tverrbundet til en matriks i et andre domene, og et degraderings sted mellom første og andre domene. Fortrinnsvis er PTH humant PTH, skjønt PTH fra andre kilder, så som bovint PTH kan være egnet. PTH kan være PTH 1-84 (nativt), PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 eller PTH 1-25 eller enhver modifisert eller allelisk versjon av PTH-utvisende egenskaper, dvs. bendannelse, lik til det foregående. Degraderingssetet tillater at leveringshastigheten kan varieres på forskjellige lokalisasjoner i matriks avhengig av cellulær aktivitet på det stedet og/eller i matriks. Ytterligere fordeler inkluderer den lavere totale legemiddeldose i leveringssystemet, og romlig regulering av frigjøring som tillater en større prosentandel av legemidlet å bli frigjort på den tiden hvor det er størst cellulær aktivitet.

Teknikkens stand er også beskrevet i US 5171670 A, US 6136564 og US 5840837.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et fluorescensdeteksjonskromatogram av plasmindegraderte peptidinneholdende fibringeler og fritt peptid. Størrelseseksklusjonskromatografi av en degradert fibringel med a.2PIi-7-ATIIIi2i-i34 peptidet inkorporert (-), med det samme peptid fritt tilsatt den degraderte fibringel som inneholder inkorporert peptid

(...), og fritt peptid alene (--), er vist. Det N-terminale leucinresidu ble dansylert (forkortet dL). Det frie peptid eluerte på lengre tider, tilsvarende en lavere molekylvekt, enn peptidet inkorporert i fibringelen under koagulering, noe som viser kovalent tilfesting til degradert fibrin og således kovalent inkorporering via virkningen av faktor XHIa-aktivitet. Fig. 2 er en kurve av inkorporeringen av dLNQEQVSPLRGD (SEKV. ID nr. 1) i fibringeler med eksogen faktor XIII tilsatt. Når 1 U/ml ble tilsatt øket inkorporeringsnivået slik at mer enn 25 mol peptid/mol fibrinogen kunne oppnås. Fig. 3 er en kurve av inkorporering av bidomenepeptidet, dLNQEQVSPLRGD (SEKV. ID nr. 1) inn i ufortynnet fibrinlim. Tre separate sett ble testet og i hvert tilfelle kunne et høyt nivå av inkorporering observeres, som nådde 25 mol peptid/mol fibrinogen. Konsentrasjonen av eksogent peptid som var nødvendig for maksimal inkorporasjon var minst 5 mM, sannsynligvis på grunn av diffusjonsbegrensninger i den meget tette fibrinmatriks som blir skapt. Inkorporeringsnivået var meget konsistent, hvor hvert sett tilveiebrakte en lignende inkorporeringsprofil.

Produkter og metoder for reparasjon av hardt vev, regenerasjon eller gjenoppbygging, særlig for benvekst, ved å bruke naturlige og syntetiske matriser som har PTH frigjørbart inkorporert deri, er beskrevet heri. De naturlige matrisene er biokompatible og biodegraderbare og kan dannes in vitro eller in vivo på implantasjonstidspunktet. PTH kan inkorporeres i matrisene og bibeholde dens fulle bioaktivitet. PTH kan frigjørbart inkorporeres, ved å bruke teknikk som tilveiebringer kontroll over hvordan og når og til hvilken grad PTH blir frigjort, slik at matriks kan brukes for vevsreparasjon direkte eller indirekte, ved å bruke matriks som en kontrollert frigjøringshærer.

Definisjoner

"Biomateriale" som generelt brukt heri refererer seg til et materiale ment å etablere et grensesnitt med biologiske systemer for å evaluere, behandle, forsterke eller erstatte ethvert vev, organ eller funksjon i kroppen avhengig av materialet enten permanent eller temporært. Betegnelsen "biomateriale" og "matriks" blir brukt synonymt heri og betyr et tverrbundet polymert nettverk som, avhengig av typen av matriks, kan svelles med vann men ikke oppløses i vann, dvs. danne en hydrogel som forblir i kroppen over en viss tidsperiode og oppfyller visse støttefunksjoner for traumatisert eller defekt hardt vev.

"PTH-fusjonspeptid" som generelt brukt heri refererer seg til et peptid som inneholder minst et første og et andre domene. Et domene inneholder en PTH (nativ eller trunkerte former, spesielt PTH 1-34) og det andre domenet inneholder et substratdomene som skal tverrbindes til en matriks. Et enzymatisk eller hydrolytisk degraderingssete kan også være tilstede mellom det første og det andre domenet.

"Sterk nukleofil" som generelt brukt heri betegner et molekyl som er i stand til å donere et elektronpar til en elektrofil i en polar bindingsdannende reaksjon. Fortrinnsvis er den sterke nukleofilen mer nukleofil enn vann ved fysiologisk pH. Eksempler på sterke nukleofiler er tioler og aminer.

"Konjugert umettet binding" som generelt brukt heri referer seg til alterneringen av karbon-karbon, karbon-heteroatom eller heteroatom-heteroatom multiple bindinger med enkle bindinger, eller koblingen av en funksjonell gruppe til et makromolekyl, så som en syntetisk polymer eller et protein. Slike bindinger kan gjennomgå tilsettingsreaksjoner.

"Konjugert umettet gruppe" som generelt brukt heri refererer seg til et molekyl eller en region av et molekyl som inneholder en alternering av karbon-karbon, karbon-heteroatom eller heteroatom-heteroatom multiple bindinger med enkle bindinger, som har en multippel binding som kan gjennomgå tilsettingsreaksjoner. Eksempler på konjugerte umettede grupper inkluderer men er ikke begrenset til vinylsulfoner, akrylater, akrylamider, kinoner og vinylpyridinium, f.eks. 2- eller 4-vinylpyridium og itakonater.

"Syntetiske forløpermolekyler" som generelt brukt heri betegner molekyler som ikke eksisterer i naturen.

"Naturlig forekommende forløperkomponenter eller polymerer" som generelt brukt heri betegner molekyler som kan finnes i naturen.

"Funksjonalisere" som generelt brukt heri betegner modifisering av et molekyl på en måte som resulterer i tilfesting av en funksjonell gruppe eller rest. F.eks. kan et molekyl funksjonaliseres ved innføring av et molekyl som gjør molekylet til en sterk nukleofil eller en konjugert umettethet. Fortrinnsvis blir et molekyl, f.eks. PEG, funksjonalisert til å bli en tiol, amin, akrylat eller kinon. Proteinet kan spesielt bli effektivt funksjonalisert ved delvis eller fullstendig reduksjon av disulfidbindinger for å danne fri tioler.

"Funksjonalitet" som generelt brukt heri betegner antall reaktive seter på et molekyl.

"Funksjonalitet av grenpunkter" som generelt brukt heri betegner antall armer som strekker seg fra ett punkt i molekylet.

"Adhesjonssete eller celletilfestingssete" som generelt brukt heri betegner en peptidsekvens til hvilke et molekyl, f.eks. en adhesjonspromoterende reseptor på overflaten til en celle bindes. Eksempler på adhesjonsseter inkluderer men er ikke begrenset til RGD-sekvens fra fibronektin, og YIGSR (SEKV. ID nr. 2) sekvens fra laminin. Fortrinnsvis blir adhesjonsseter inkorporert i biomaterialet ved å inkludere et substratdomene som er tverrbindbar til en matriks.

"Biologisk aktivitet" som generelt brukt heri betegner funksjonelle begivenheter mediert av et protein av interesse. I noen utforminger inkluderer dette hendelser assayet ved å måle interaksjonene til et polypeptid med et annet polypeptid. Det inkluderer også å assaye virkningen som proteinet av interesse har på cellevekst, differensiering, død, migrering, tilfesting, interaksjoner med andre proteiner, enzymatisk aktivitet, proteinfosforylering eller defosforylering, transkripsjon eller translasjon.

"Sensitivt biologisk molekyl" som generelt brukt heri betegner et molekyl som er funnet i en celle, eller i en kropp, eller som kan anvendes som et terapeutisk middel fra en celle eller en kropp, som kan reagere med andre molekyler i sitt nærvær. Eksempel på sensitive biologiske molekyler inkluderer men er ikke begrenset til peptider, proteiner, nukleinsyrer og legemidler. Biomaterialer kan fremstilles i nærvær av sensitive biologiske materialer, uten negativt å påvirke de sensitive biologiske materialene.

"Regenerere" som generelt brukt heri betyr å vokse tilbake en del eller alt av noe, så som hardt vev, særlig ben.

"Multifunksjonell" som generelt brukt heri betegner mer enn én elektrofil og/eller nukleofil funksjonell gruppe pr. molekyl (dvs. monomer, oligo- og polymer).

"Selvselektiv reaksjon" som generelt brukt heri betyr at den første forløperkomponent i en sammensetning reagerer mye hurtigere med den andre forløperkomponent i sammensetningen og vice versa enn med andre forbindelser tilstede i en blanding eller på reaksjonsstedet. Som brukt heri bindes nukleofilen fortrinnsvis til en elektrofil og en elektrofil bindes fortrinnsvis til en sterk nukleofil heller enn til andre biologiske forbindelser.

"Tverrbinding" som generelt brukt heri betyr dannelsen av kovalente bindinger. Den kan imidlertid også betegne dannelsen av ikke-kovalente bindinger, så som ioniske bindinger, eller kombinasjoner av kovalente og ikke-kovalente bindinger.

"Polymert nettverk" som generelt brukt heri betyr produktet av en fremgangsmåte i hvilken hovedsakelig alle monomerer, oligo- eller polymerer blir bundet ved intermolekylære kovalente bindinger gjennom deres tilgjengelige funksjonelle grupper for å resultere i et stort molekyl.

"Fysiologisk" som generelt brukt heri betyr tilstander slik som de som blir funnet i levende vertebrater. Særlig betegner fysiologiske tilstander tilstandene i det menneskelige legemet, så som temperatur, pH, etc. Fysiologiske temperaturer betyr særlig temperaturområdet mellom 35°C til 42°C, fortrinnsvis rundt 37°C.

"Tverrbindingstetthet" som generelt brukt heri betegner den gjennomsnittelige molekylvekt mellom to tverrbindinger (Mc) til de respektive molekyler.

"Ekvivalent vekt" som generelt brukt heri betegner mmol av funksjonell gruppe/g av stoffet.

"Svelling" som generelt brukt heri betegner økning i volum og masse ved opptak av vann av biomaterialet. Betegnelsen "vannopptak" og "svelling" blir brukt synonymt i foreliggende søknad.

"Likevektstilstand" som generelt brukt heri er den tilstanden i hvilken en hydrogel gjennomgår ingen masseøkning eller tap når det lagres under konstante betingelser i vann.

I. Matriser og PTH

A. Matriksmaterialer

Matriks blir dannet ved å tverrbinde ionisk, kovalent eller ved kombinasjoner derav forløpermolekyler til et polymert nettverk eller ved å svelle én eller flere polymere materialer, dvs. matriser, for å danne et polymert nettverk som har tilstrekkelig interpolymere rom til å tillate innvekst eller migrering inn i matriks av celler.

I én utforming blir matriks dannet av proteiner, fortrinnsvis proteiner som er naturlig tilstede i pasienten inn i hvilken matriks skal implanteres. Et spesielt foretrukket matriksprotein er fibrin, skjønt matriser laget av andre proteiner, så som kollagen og gelatin kan også anvendes. Polysakkarider og glykoproteiner kan også anvendes til å danne matriks. Det er også mulig å anvende syntetiske polymerer som er tverrbindbare ved ionisk eller kovalent binding.

Fibrinmatriser

Fibrin er et naturlig materiale som er blitt rapportert for flere biomedisinske anvendelser. Fibrin er blitt beskrevet som materialet for celleinnvekstmatriser i US patent nr. 6 331 422 (Hubbell et al.). Fibringeler er blitt brukt som forseglingsmidler på grunn av dets evne til å bindes til mange vev og dets naturlige rolle i sårheling. Noen spesifikke applikasjoner inkluderer anvendelse som et forseglingsmiddel for vaskulær transplantattilfesting, hjerteventiltilfesting, benposisjonering ved brudd og senereparasjon (Sierra, D.H., Journal of Biomaterials Applications, 7:309-352 (1993)). I tillegg er disse geler blitt brukt som legemiddelleveringsanordninger og for nevronal regenerering (Williams et al., Journal of Comparative Neurobiology, 264, 284-290 (1987)). Skjønt fibrin tilveiebringer en fast understøttelse for vevsregenerasjon og celleinnvekst er det noen aktive sekvenser i monomeren som direkte forsterker disse prosesser.

Fremgangsmåten med hvilke fibrinogen blir polymerisert til fibrin er også blittkarakterisert. Initielt spalter en protease det dimere fibrinogenmolekyl på to symmetriske seter. Det er flere mulige proteaser som kan spalte fibrinogen, inkludert trombin, reptilase og protease III, og hver av dem ødelegger proteinet på et forskjellig sete (Francis et al., Blood Cells, 19:291-307, 1993). Når fibrinogenet er spaltet skjer et cellepolymeriseringstrinn i hvilket fibrinogenmonomerene kommer sammen og danner en ikke-kovalent tverrbundet polymergel (Sierra, 1993). Denne selvmontasjen skjer fordi bindingsseter blir eksponert etter proteasespalting har skjedd. Når de er eksponert kan disse bindingsseter i senteret av molekylet bindes til andre seter på fibrogenkjedene, som er tilstede på endene av peptidkjedene (Stryer, L. In Biochemistry, W.H. Freeman & Company, NY, 1975). På denne måten blir et polymert nettverk dannet. Faktor XHIa, en transglutaminase aktivert fra faktor XIII ved trombinproteolyse kan deretter kovalent tverrbinde polymernettverket. Andre transglutaminaser eksisterer og kan også være involvert i kovalent tverrbinding og transplantering til fibrinnettverket.

Når en tverrbundet fibringel er dannet blir den påfølgende degradering tett kontrollert. En av nøkkelmolekylene i kontrollering av degradering av fibrin er a2-plasmininhibitor (Aoki, N., Progress in Cardiovascular Disease, 21: 267-286, 1979). Dette molekylet virker på tverrbinding til a-kjeden i fibrin gjennom virkning av faktor XHIa (Sakata, et al., Journal of Clinical Investigation, 65: 290-297, 1980). Ved å feste seg selv til gelen kan en høy konsentrasjon av inhibitor lokaliseres til gelen. Inhibitoren virker deretter ved å forhindre binding av plasminogen til fibrin (Aoki et al., Thrombosis and Haemostasis, 39:22-31, 1978) og inaktivere plasmin (Aoki, 1979). a2-plasmininhibitoren inneholder et glutaminsubstrat. Den eksakte sekvensen er blitt identifisert som NQEQVSPL (SEKV. ID nr. 12), hvor det første glutaminet er den aktive aminosyre for tverrbinding.

Det har blitt vist at bidomenepeptider, som inneholder en faktor XHIa substratsekvens og en bioaktiv peptidsekvens kan tverrbindes inn i fibringeler og at dette bioaktive peptidet bibeholder sin cellulære aktivitet in vitro (Schense, J.C., et al. (1999) Bioconj. Chem. 10:75-81).

Syntetiske matriser

Tverrbindingsreaksjoner for dannelse av syntetiske matriser for anvendelse i kroppen inkluderer (i) fri radikal polymerisering mellom to eller flere forløpere som inneholder umettede dobbeltbindinger, som beskrevet i Hern et al., J. Biomed. Mater. Res. 39:266-276 (1998), (ii) nukleofil substitusjonsreaksjon så som f.eks. mellom en forløper som inkluderer en amingruppe og en forløper som inkluderer en suksinimidylgruppe som beskrevet i US patent nr. 5 874 500 til Rhee et al., (iii) kondensasjons- og tilsettingsreaksjoner og (iv) Michael-type tilsetningsreaksjon mellom en sterk nukleofil og en konjugert umettet gruppe eller binding (som en sterk elektrofil). Særlig foretrukket er reaksjonen mellom et forløpermolekyl som har en tiol eller amingruppe som den nukleofile gruppe og et forløpermolekyl inkludert akrylat eller vinylsulfongruppe som elektrofile grupper. Mest foretrukket som den nukleofile gruppe er tiolgruppen. Michael-type tilsetningsreaksjoner er beskrevet i WO 00/44808 (Hubbell et al.). Michael-type tilsetningsreaksjoner tillater in situ tverrbinding av minst en første og en andre forløperkomponent under fysiologiske betingelser på en selvselekterende måte, selv i nærvær av sensitive biologiske materialer. Når én av forløperkomponentene har en funksjonalitet av minst to, og minst én av de andre forløperkomponentene har en funksjonalitet større enn 2, vil systemet selvselektivt reagere til å danne et tverrbundet tredimensjonalt biomateriale.

Fortrinnsvis er de konjugerte umettede gruppene eller konjugerte umettede bindingene akrylater, vinylsulfoner, metakrylater, akrylamider, metakrylamider, akrylonitriler, vinylsulfoner, 2- eller 4-vinylpyridinium, maleimider eller kinoner.

De nukleofile grupper er fortrinnsvis tiolgrupper, aminogrupper eller hydroksylgrupper. Tiolgrupper er hovedsakelig mer reaktive enn uprotonerte amingrupper. Som tidligere angitt er pH en viktig verdi i foreliggende vurdering: den deprotonerte tiol er hovedsakelig mer reaktiv enn den protonerte tiol. Derfor, tilsetningsreaksjoner som involverer en konjugert umettethet, så som et akrylat eller kinon, med en tiol for å konvertere to forløperkomponenter i en matriks vil ofte best utføres hurtigst og selvselekterende ved en pH på ca. 8. Ved pH på ca. 8 er de fleste tioler av interesse deprotonerte, (og således mer reaktive) og de fleste aminene av interesse er fremdeles protonerte (og således mindre reaktive). Når en tiol blir brukt som første forløpermolekyl er en konjugatstruktur som er selektiv i sin reaktivitet for tiolene relativt til aminer meget ønskverdig.

Egnede første og andre forløpermolekyler inkluderer proteiner, peptider, polyoksyalkylener, poly(vinylalkohol), poly(etylen-ko-vinylalkohol), poly(akrylsyre), poly(etylen-ko-akrylsyre), poly(etyloksazolin), poly(vinylpyrrolidon), poly(etylen-ko-vinylpyrrolidon), poly(maleinsyre), poly(etylen-ko-maleinsyre), poly(akrylamid), og poly(etylenoksid)-ko-poly(propylenoksid)-blokkopolymerer. Et spesielt foretrukket forløpermolekyl er polyetylenglykol.

Polyetylenglykol (PEG) tilveiebringer en egnet byggeblokk. Man kan lett kjøpe eller syntetisere lineære (med det menes med to ender) eller grenede (med det menes mer enn to ender) PEG og deretter funksjonalisere PEG-endegrupper til å innføre enten en sterk nukleofil, så som en tiol, eller en konjugert struktur, så som et akrylat eller et vinylsulfon. Når disse komponentene enten blandes med hverandre eller med en tilsvarende komponent i en lett basisk omgivelse, vil en matriks dannes ved reaksjon mellom første og andre forløperkomponent. En PEG-komponent som kan omsettes med en ikke-PEG-komponent, og molekylvekten eller hydrofilisiteten til hver forbindelse kan kontrolleres for å manipulere de mekaniske egenskaper, permeabilitet og vanninnhold til det resulterende biomaterialet.

Disse materialene er generelt nyttige i medisinske implantater, som beskrevet i mer detalj nedenfor. Ved dannelsen av matriser, spesielt matriser som er ønskelig å degraderes in vivo, tilveiebringer peptider en meget egnet byggeblokk. Det er enkelt å syntetisere peptider som inneholder to eller flere cysteinresiduer og denne komponent kan deretter lett tjene som den første forløperkomponent med nukleofile grupper. F.eks. vil et peptid med to fri cysteinresiduer lett danne en matriks når det blandes med en PEG-tri-vinylsulfon (en PEG som har tre armer med vinylsulfoner på hver av dets armer) ved fysiologisk eller lett høyere pH (f.eks. 8-9). Gelateringen kan også fortsette godt ved til og med høyere pH, men med den potensielle bekostning av selvselektivitet. Når de to flytende forløperkomponentene blandes sammen, reagerer de over en periode på noen minutter til å danne en elastisk gel, som består av et nettverk av PEG-kjeder, som bærer knutene til nettverket med peptidene som forbindende koblinger. Peptidene kan selekteres som proteasesubstrater, slik at det dannes et nettverk som er i stand til å bli infiltrert og degradert av celler, som det er gjort i et proteinbasert nettverk, så som i en fibrinmatriks. Fortrinnsvis er sekvensene i domenene substrater for enzymene som er involvert i cellemigrering (f.eks. som substratet for enzymer så som kollagenase, plasmin, metalloproteinase (MMP) eller elastase), skjønt egnede domener skal ikke være begrenset til disse sekvenser. En spesiell nyttig sekvens er et substrat for enzymet plasmin (se eksempler). Degraderingsegenskaper til gelene kan manipuleres ved å forandre detaljene i peptidet som tjener som tverrbindingsknuter. Man kan lage en gel som er degraderbar ved kollagenase, men ikke plasmin, eller ved plasmin men ikke kollagenase. Videre er det mulig å gjøre at gelen degraderer hurtigere eller langsommere i respons til et slikt enzym, ganske enkelt ved å forandre aminosyresekvensen slik at Km eller kcat, eller begge i den enzymatiske reaksjonen forandres. Man kan således lage et biomateriale som er biomimetisk, ved at det er i stand til å bli gjenoppbygd med de normale gjenoppbyggingsegenskapene til cellene. F.eks. viser et slikt studie substratsteder for den viktige proteaseplasmin. Gelatering av PEG med peptidet er selvselekterende.

Eventuelt kan biofunksjonelle midler inkorporeres i matriks for å tilveiebringe kjemisk binding til andre arter (f.eks. vevsoverflate). Å ha proteasesubstrater inkorporert i matriks er viktig når matriks blir dannet fra PEG-vinylsulfon. Utover matriser dannet fra reaksjonen av PEG-akrylater og PEG-tioler, inneholder matriser dannet fra PEG-vinylsulfoner og PEG-tioler ikke hydrolytisk degraderbare bindinger. Derfor tillater inkorporering av proteasesubstrater matriks å degradere i kroppen.

De syntetiske matriser er operasjonelt enkelt å danne. To flytende forløpere blir blandet; én forløper inneholder et forløpermolekyl med nukleofile grupper og den andre forløpermolekyl inneholder de elektrofile grupper. Fysiologisk saltoppløsning kan tjene som oppløsningsmiddel. Minimal varme blir dannet ved reaksjonen. Derfor kan gelateringen utføres in vivo eller in vitro, i direkte kontakt med vev, uten uheldig toksisitet. Således kan polymerer andre enn PEG anvendes, enten telegeletisk modifisert eller modifisert på sine sidegrupper.

For de fleste tilhelingsindikasjoner er hastigheten av celleinnvekst eller migrering av celler inn i matriks i kombinasjon med en tilpasset degraderingshastighet av matriks essensiell for den totale tilhelingsrespons. Potensialet til hydrolytiske ikke-degraderbare matriser til å bli invadert av celler er primært en funksjon av nettverkstetthet. Hvis det eksisterende rom mellom grenpunktene eller knutene er altfor små i forhold til størrelsen av cellene eller hvis hastigheten av matriksdegardering, som resulterer i at det dannes mer rom i matriks, er altfor langsom, vil en meget begrenset tilhelingsrespons observeres. Tilhelingsmatriser funnet i naturen, så som f.eks. fibrinmatriser, som blir dannet som en respons på skade i kroppen er kjent for å bestå av et meget løst nettverk som lett kan invaderes av celler. Infiltrasjonen blir promotert av ligander for celleadhesjon som er en integrert del av fibrinnettverket.

Matriser fremstilt fra syntetiske hydrofile forløpermolekyler, så som polyetylenglykol, sveller i vandige omgivelser etter dannelse av det polymere nettverk. For å oppnå en tilstrekkelig kort geleringstid (mellom 3 og 10 min. ved en pH på mellom 7 og 8 og en temperatur i området 36-38°C) og kvantitativ reaksjon under in situ dannelse av matriks i kroppen, må startkonsentrasjonen av forløpermolekylene være tilstrekkelig høy. Under slike betingelser vil svelling etter nettverksdannelse ikke finne sted, og de nødvendige utgangskonsentrasjoner ville føre til matriser som var altfor tette for celleinfiltrasjon når matriks ikke er degraderbar i vandige omgivelser. Således er svelling av det polymere nettverk viktig for å forstørre og utvide rommet mellom grenpunktene.

Uten hensyn til startkonsentrasjonene av forløpermolekylene sveller hydrogeler laget fra de samme syntetiske forløpermolekyler, så som en firearmet PEG-vinylsulfon og et peptid med SH-grupper, til samme vanninnhold i likevektstilstand. Dette betyr at desto høyere startkonsentrasjonen til forløpermolekylet er, jo høyere er endevolumet til hydrogelen når den når likevektstilstanden. Hvis rommet tilgjengelig i kroppen er altfor lite for å tillate tilstrekkelig svelling og spesielt hvis bindingen dannet fra forløperkomponentene ikke er hydrolytisk degraderbare, vil hastigheten av celleinfiltrasjon og tilhelingsresponsen reduseres. Som en konsekvens må det optimale mellom to motsatte krav for anvendelse i kroppen finnes. God celleinfiltrasjon og påfølgende tilhelende responser er blitt observert med et tredimensjonalt polymert nettverk dannet fra reaksjonen av en trifunksjonell forgrenet polymer med minst tre armer hovedsakelig like i molekylvekt og et andre forløpermolekyl som er minst et bifunksjonelt molekyl. Forholdet mellom ekvivalent vekt av de funksjonelle grupper til første og andre forløpermolekyler er mellom 0,9 og 1,1. Molekylvektene til armene i det første forløpermolekyl, molekylvekten til den andre forløpermolekyl og funksjonaliteten til forgreningspunktene er valgt slik at vanninnholdet i det resulterende polymere nettverk er mellom likevektprosent og 92 vekt% av den totale vekt av det polymere nettverk etter at vannopptaket er avsluttet. Avslutning av vannopptak kan oppnås enten når likevektskonsentrasjonen er nådd eller når rommet tilgjengelig i biomaterialet ikke tillater ytterligere volumøkning. Det er derfor foretrukket å velge startkonsentrasjoner for forløperkomponentene å være så lave som mulig. Dette er viktig for alle svellbare matriser men særlig for de matriser som gjennomgår cellemediert degradering og ikke inneholder hydrolytisk degraderbare koblinger i det polymere nettverk.

Balansen mellom geleringstid og lav startkonsentrasjon særlig for hydrolytisk ikke-degraderbare geler vil optimaliseres basert på strukturen av forløpermolekylene. Spesielt må molekylvekten til armene til første forløpermolekyl, molekylvekten til andre forløpermolekyl og graden av forgrening, dvs. funksjonaliteten til forgreningspunktene, justeres tilsvarende. Den virkelige reaksjonsmekanismen har liten innflytelse på dette mellomspill.

Hvis det første forløpermolekyl er en tre- eller firearmet polymer med en funksjonell gruppe i enden av hver arm og hvis det andre forløpermolekyl er et lineært bifunksjonelt molekyl, fortrinnsvis et peptid som inneholder minst to cysteingrupper, da er molekylvekten til armene til det første forløpermolekyl og molekylvekten til det andre forløpermolekyl fortrinnsvis valgt slik at koblingene mellom grenpunktene etter dannelse av nettverket har en molekylvekt i området på mellom 10 og 13 kD (under de betingelser at koblingene er lineære, ikke grenede), fortrinnsvis mellom 11 og 12 kD. Dette tillater en utgangskonsentrasjon på summen av første og andre forløpermolekyl et område på mellom 8-12 vekt%, fortrinnsvis mellom 9 og 10 vekt% av den totale vekten til første og andre forløpermolekyl i løsning (før nettverkdannelse). I tilfelle at forgreningsgraden til første forløpermolekyl blir øket til 8 og det andre forløpermolekyl fremdeles er et lineært bifunksjonelt molekyl, blir molekylvekten til bindingen mellom grenpunktene fortrinnsvis øket til en molekylvekt på mellom 18 og 24 kDa. I det tilfellet av forgreningsgraden til andre forløpermolekyl blir øket fra lineær til en tre- eller firearmet forløperkomponent øker molekylvekten, dvs. lengden av bindingene, tilsvarende. I en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse blir det valgt en sammensetning som inkluderer som det første forløpermolekyl en trifunksjonell trearmet 15 kD polymer, dvs. hver arm har en molekylvekt på 5 kD, og som det andre forløpermolekyl et bifunksjonelt lineært molekyl med en molekylvekt i området fra mellom 0,5-1,5 kD, mer fortrinnsvis rundt 1 kD. Fortrinnsvis er den første og den andre forløperkomponent et polyetylenglykol.

I en foretrukket utforming inkluderer første forløperkomponent som funksjonelle grupper konjugerte umettede grupper eller bindinger, mest foretrukket et akrylat eller en vinylsulfon og de funksjonelle grupper til andre forløpermolekyl inkluderer en nukleofil gruppe, fortrinnsvis en tiol eller aminogrupper. I en annen foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er første forløpermolekyl en firearmet 20 kD

(hver arm en molekylvekt på 5 kDa) polymer som har funksjonelle grupper ved avslutning av hver arm og det andre forløpermolekyl er et bifunksjonelt lineært molekyl med en molekylvekt i området fra mellom 1-3 kD, fortrinnsvis mellom 1,5 og 2 kD. Fortrinnsvis er første forløpermolekyl et polyetylenglykol som har vinylsulfongrupper og det andre forløpermolekyl er et peptid som har cysteingrupper. I begge foretrukne utforminger varierer startkonsentrasjonen av summen av første og andre forløpermolekyl fra 8-11 vekt%, fortrinnsvis mellom 9 og 10 vekt% av totalvekten av første og andre forløpermolekyl og vann (før dannelsen av polymere nettverk), fortrinnsvis mellom 5 og 8 vekt% for å oppnå en geleringstid på under 10 min. Disse sammensetningene har en geleringstid ved pH 8,0 og 37°C på ca. 3-10 min. etter blanding.

Når matriks inneholder hydrolytisk degraderbare koblinger, dannet f.eks. ved de foretrukne reaksjoner mellom akrylater og tioler, er nettverktstetthet med hensyn på celleinfiltrasjon spesielt viktig i begynnelsen, men i vandige omgivelser vil koblingene hydrolyseres og nettverket vil bli løsere, for å tillate celleinfiltrasjon. Med en økning i den totale forgreningsgrad til det polymere nettverk må molekylvekten til mellomkoblingene, dvs. lengden av koblingene øke.

B. Celletilfestingssteder

Celler interagerer med sine omgivelser gjennom protein-protein, protein-oligosakkarid og protein-polysakkaridinteraksjoner på celleoverflaten. Ekstracellulære matriksproteiner tilveiebringer en vert med bioaktive signaler til cellen. Dette tette nettverk er nødvendig for å undersøtte cellene; og mange proteiner i matriks er blitt vist å kontrollere celleadhesjon, spredning, migrering og differensiering (Carey, Annual Review of Physiology, 53:161-177, 1991). Noen av de spesifikke proteiner som har blitt vist å være spesielt aktive inkluderer laminin, vitronektin, fibronektin, fibrin, fibrinogen og kollagen (Lander, Journal of Trends in Neurological Science, 12:189-195, 1989). Mange studier av laminin er blitt utført og det er blitt vist at laminin spiller en vital rolle i utviklingen og regenerasjon av nerver in vivo og i nerveceller in vitro (Williams, Neurochemical Research, 12:851-869, 1987), så vel som i angiogenese.

Noen av de spesifikke sekvensene som direkte interagerer med cellulære reseptorer og forårsaker enten adhesjon, spredning eller signaltransduksjon er blitt identifisert.

Laminin, et stort multidomeneprotein (Martin, Annual Review of Cellular Biology, 3:57-85, 1987) er blitt vist å bestå av tre kjeder med flere reseptorbindende domener. Disse reseptorbindende domenene inkluderer YIGSR (SEKV. ID nr. 2) sekvensen til laminin Bl-kjede (Graf et al., Cell, 48:989-996, 1987; Kleineman et al., Archives of Biochemistry andBiophysics, 272:39-45, 1989; og Massia et al., J. of Biol. Chem., 268:8053-8059, 1993), LRGDN (SEKV. ID nr. 3) til laminin A-kjede (Ignatius et al.,./, of Cell Biology, 111:709-720, 1990) og PDGSR (SEKV. ID nr. 4) til laminin Bl-kjede (Kleinman et al., 1989). Flere andre gjenkjennelsessekvenser for celler er også blitt identifisert. Disse inkluderer IKVAV (SEKV. ID nr. 5) til laminin A-kjeden (Tashiro, et al., J. of Biol. Chem., 264:16174-16182, 1989) og sekvensen RNIAEIIKDI (SEKV. ID nr. 6) til laminin B2-kjeden (Liesi, et al., FEBS Letters, 244:141-148, 1989). Reseptorene som bindes til disse spesifikke sekvensene er også ofte blitt identifisert. Et undersett av cellulære reseptorer som har vist seg å være ansvarlig for mye av bindingen er integrinsuperfamilien (Rouslahti, E., J. of Clin. Investigation, 87:1-5, 1991). Integriner er protein heterodimerer som består av a- og P-underenheter. Tidligere arbeid har vist at tripeptidet RGD bindes til flere pi og P3 integriner (Hynes, R.O., Cell, 69:1-25, 1992; Yamada, KM., J. of Biol. Chem., 266:12809-12812, 1991), IKVAV (SEKV. ID nr. 5) bindes til en 110 kDa reseptor (Tashiro, et al., J. of Biol. Chem., 264: 16174-16182, 1989); Luckenbill-Edds, et al., Cell Tissue Research, 279:371-377, 1995), YIGSR (SEKV. ID nr. 2) bindes til en 67 kDa reseptor (Graf, et al., 1987) og DGEA (SEKV. ID nr. 7), en kollagensekvens bindes til a2, Pi integrin (Zutter & Santaro, Amer. J. ofPathology, 137:113-120, 1990). Reseptoren for RNIAEIIKDI (SEKV. ID nr. 6) sekvensen er ikke blitt rapportert.

I en ytterligere foretrukket utforming er peptidsetene for celleadhesjon inkorporert i matriks, nemlig peptidene som bindes til adhesjonspromoterende reseptorer på celleoverflatene i biomaterialene til foreliggende oppfinnelse. Slike adhesjonspromoterende peptider kan velges fra gruppen som beskrevet ovenfor. Særlig foretrukket er RGD-sekvensen fra fibronektin, YIGSR (SEKV. ID nr 2) sekvensen fra laminin. Inkorporering av celletilfestingsseter er en spesielt foretrukket utforming med syntetiske matriser, men kan også inkluderes med noen av de naturlige matrisene. Inkorporeringen kan foretas f.eks. enkelt ved å blande et cysteininneholdende celletilfestingspeptid med forløpermolekylet inkludert den konjugerte umettede gruppe, så som PEG-akrylat, PEG-akrylamid eller PEG-vinylsulfon noen minutter før blanding med den gjenværende forløperkomponent som inkluderer den nukleofile gruppe, så som en tiolinneholdende forløperkomponent. Hvis celletilfestingssetet ikke inkluderer et cystein kan det kjemisk syntetiseres til å inkludere et. Under dette første trinn vil det adhesjonspromoterende peptid bli inkorporert i én ende av forløperen flertalls funksjonalisert med en konjugert umettethet; når det gjenværende multitiol blir tilsatt systemet vil det dannes et tverrbundet nettverk. En annen viktig implikasjon av den måten som nettverket blir fremstilt her, er effektiviteten av inkorporering av pendante bioaktive ligander så som adhesjonssignaler. Dette trinn må være kvantitativt siden f.eks. ubundne ligander (f.eks. adhesjonsseter) kunne inhibere interaksjonen av celler med matriks. Som beskrevet senere er derivatisering av forløperen med slike pedante oligopeptider utført i et første trinn i støkiometrisk stort overskudd (minimum: 40-ganger) av flerarmede elektrofile forløpere over tioler og er derfor definitivt kvantitative. Bortsett fra å forhindre uønsket inhibisjon er denne gjennomføring biologisk enda mer signifikant: celleadferd er ekstremt sensitiv til små forandringer i ligandtettheter og presis kunnskap om inkorporerte ligander hjelper å konstruere og forstå cellematriksinteraksjoner. Som oppsummering har konsentrasjon av adhesjonsseter kovalent bundet i matriksen signifikant innflytelse på graden av celleinfiltrasjon. F.eks. for en gitt hydrogel kan et RGD-konsentrasjonsområde inkorporeres i matriks som understøtter celleinnvekst og cellemigrering på en optimal måte. Det optimale konsentrasjonsområdet for adhesjonsseter så som RGD er mellom 0,04 og 0,05 mM og enda mer fortrinnsvis 0,05 mM spesielt for en matriks som har et vanninnhold mellom likevektskonsentrasjon og 92 vekt% etter avslutning av vannopptak.

Utmerkede benhelingsresultater kan oppnås ved å holde graden av cellemigrering og graden av matriksdegradering konstant. Med hensyn på matrikskonstruksjon (spesielt PTH 1-34 kovalent bundet) gir en firearmet polyetylenglykol med en molekylvekt på ca. 20000 Da tverrbundet med et proteasedegraderingssete CGRPQGIWGQDRC (SEKV. ID nr. 8) og 0,050 mM GRGDSP (SEKV. ID nr. 9) spesielt gode celleinvekstresultater og tilheling av bendefekter. Startkonsentrasjonen for PEG og peptid under 10 vekt% av den totale vekt av molekylene og vann (før svelling). Gelene har en uforseglbar konsistens og tillater osteoblaster og forløperceller lett å infiltrere matriks.

Matriksmaterialet er fortrinnsvis biodegraderbart ved naturlig tilstedeværende enzymer. Hastigheten av degradering kan manipuleres ved graden av tverrbinding og inklusjon av proteaseinhibitorer i matriks.

C. Tverrbindbare substratdomener

PTH-fusjonspeptidet kan tverrbindes og kovalent bindes til matriser gjennom det tverrbindbare substratdomenet til PTH-fusjonspeptid. Typen av substratdomene er avhengig av typen av matriks. For inkorporering i fibrinmatriser er transglutaminasesubstratdomener spesielt foretrukket. Transglutaminasesubstratdomenet kan være et Faktor XHIa subtratdomene. Dette faktor XHIa substratdomenet kan inkludere GAKDV (SEKV. ID nr. 10), KKKK (SEKV. ID nr. 11), eller NQEQVSPL (SEKV. ID nr. 12). Koblingen mellom PTH og transglutaminasesubstratdomenet kan utføres ved kjemisk syntese.

Transglutaminasesubstratdomenet kan være et substrat for en transglutaminase utover Faktor XHIa. Det mest foretrukne Faktor XHIa substratdomenet har en aminosyre sekvens så som NQEQVSPL (SEKV. ID nr. 12) (heri referert til som "TG"). Andre proteiner som transglutaminase gjenkjenner, så som fibronektin, kunne kobles til transglutaminasesubstratpeptidet.

For inkorporering av PTH i en matriks dannet av syntetiske forløperkomponenter må PTH-fusjonspeptidet eller ethvert annet peptid som skal inkorporeres syntetiseres med minst én tilleggscysteingruppe (-SH) fortrinnsvis i N-terminus til PTH som det tverrbindbare substratdomenet. Cysteinet kan enten være direkte festet til PTH eller gjennom en koblingssekvens. Koblingssekvensen kan i tillegg inkludere en enzymatisk degraderbar aminosyresekvens, slik at PTH kan spaltes fra matriks ved enzymer i hovedsakelig nativ form. Den fri cysteingruppe reagerer med den konjugerte umettede gruppe til forløperkomponenten i en Michael-type tilsettingsreaksjon. I tilfelle av PTH 1-34 er bindingen til en syntetisk matriks for PTH 1-34 gjort mulig ved å feste en ytterligere aminosyresekvens til N-terminus i PTHi-34som inneholder minst ett cystein. Tiolgruppen til cysteinet kan reagere med en konjugert umettet binding på den syntetiske polymer for å danne en kovalent binding. I mulighet (a) er bare et cystein festet til peptidet, i mulighet (b) er en enzymatisk degraderbar, spesielt en plasmindegraderbar sekvens festet som en kobling mellom cysteinet og peptidet. Sekvensen GYKNR (SEKV. ID nr. 15) mellom det første domenet og det andre domenet, cysteinet, gjør koblingsplasminet degraderbart.

Således kan PTH-fusjonspeptider ytterligere modifiseres til å inneholde et degraderbart sete mellom tilfestingssetet, dvs. det andre domenet (dvs. Faktor XHIa substratdomenet eller cysteinet) og PTH, dvs. det første domenet. Disse setene kan være degraderbare enten ved ikke-spesifikk hydrolyse (dvs. en esterbinding) eller de kan være substrater for spesifikke enzymatiske (enten proteolytiske eller polysakkariddegraderende) degradering. Disse degraderbare setene tillater konstruksjon av mer spesifikk frigjøring av PTH fra matriser så som fibringeler. F.eks. tillater degradering basert på enzymatisk aktivitet frigjøringen av PTH å være kontrollert av en cellulær prosess heller enn ved diffusjon av faktoren gjennom gelen. Det degraderbare setet eller binding blir spaltet av enzymet frigjort fra cellene som invaderte matriks.

Degraderingssetene tillater PTH å frigjøres med lite eller ingen modifikasjon til den primære peptidsekvens, som kan resultere i høyere aktivitet til faktoren. I tillegg tillater frigjøringen av faktoren å bli kontrollert ved cellespesifikke prosesser, så som lokalisert proteolyse heller enn diffusjon fra noen porøse materialer. Dette tillater faktorer å frigjøres med forskjellige hastigheter i det samme materialet avhengig av plassering av celler i materialet. Dette reduserer også mengden av total PTH som er nødvendig, siden dets frigjøring blir kontrollert ved cellulære prosesser. Konservering av PTH og dens biotilgjengelighet er klare fordeler ved å utnytte celleproteolytisk aktivitet over anvendelse av diffusjonskontrollerte frigjøringsanordninger. I én mulig forklaring for den sterke tilheling av en bendefekt med PTH kovalent bundet til en matriks er det ansett viktig at PTH blir administrert lokalt over en utstrakt tidsperiode (ikke bare en enkel pulsert dose) men ikke på en kontinuerlig måte. Dette blir utført ved en langsom degradering, gjennom enten enzymatisk spaltning eller hydrolytisk spaltning av matriks. På denne måte blir molekylet levert gjennom en pseudopulsert virkning som skjer over en forlenget tidsperiode. Når en forløpercelle infiltrerer matriks vil den møte et PTH-molekyl og kan differensieres til en preosteoblast. Hvis den spesielle celle imidlertid ikke fortsetter å frigjøre bundet PTH fra matriks vil den effektivt konverteres til en osteoblast og begynne å produsere benmatriks. Endelig er de terapeutiske virkninger av peptider lokalisert til den defekte region og blir deretter forsterket.

Enzymer som kunne anvendes for proteolytisk degradering er tallrike. Proteolytiske degraderbare seter kunne inkludere substrater for kollagenase, plasmin, elastase, stromelysin eller plasminogenaktivatorer. Eksempel på substrater er opplistet nedenfor. P1-P5 angir aminosyrer 1-5 stillinger mot aminoterminus i proteinet fra det setet hvor proteolyse skjer. Pl'-P4' angir aminosyrer 1-4 stillinger mot karboksyterminus til proteinet fra det setet hvor proteolyse skjer.

I en annen foretrukket utforming kunne et oligo-esterdomene innskytes mellom det første og det andre domenet. Dette kunne utføres ved å bruke en oligoester så som oligomerer av melkesyre.

Ikke-enzymatisk degraderingssubstrater kan bestå av enhver binding som gjennomgår hydrolyse ved en syre- eller basekatalysert mekanisme. Disse substrater kan inkludere oligoestere så som oligomerer av melkesyre eller glykolsyre. Hastigheten av degradering av disse materialer kan kontrolleres gjennom valget av oligomer.

D. PTH

Betegnelsen "PTH" som brukt heri inkluderer den humane sekvensen til PTH 1-84 og alle trunkerte, modifiserte og alleliske versjoner av PTH som utviser bendannelsesegenskaper når de bindes kovalent til biodegraderbare naturlige eller syntetiske matriser. Foretrukne trunkerte versjoner av PTH er PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 eller PTH 1-25. Mest foretrukket er PTH 1-34. Fortrinnsvis er PTH human PTH, skjønt PTH fra andre kilder, så som bovint PTH kan være egnet.

Fremgangsmåter til inkorporering og/eller frigjøring av bioaktive faktorer

I én foretrukket utforming for inkorporering av et PTH i matriks, inkluderer matriks fibrin som er dannet fra fibrinogen, en kalsiumkilde og trombin og PTH-fusjonspeptid vil inkorporeres i fibrin under koagulering. PTH-fusjonspeptid er konstruert som fusjonspeptid som inkluderer to domener, et første og et andre, hvorav ett domene, det andre, er et substrat for et tverrbindingsenzym så som Faktor XHIa. Faktor XHIa er en transglutaminase som er aktiv under koagulering. Dette enzym, dannet naturlig fra faktor XIII ved avspaltning med trombin, funksjonerer slik at det fester fibrinkjeder til hverandre via amidbindinger, dannet mellom glutaminsidekjeder og lysinsidekjeder. Enzymet funksjonerer også ved å feste andre peptider til fibrin under koagulasjon, f.eks. celletilfestingsseter forutsatt at de inkluderer også en faktor XHIa. Spesifikt har sekvensen NQEQVSP (SEKV. ID nr. 16) blitt vist å funksjonere som et effektivt substrat for Faktor XHIa. Som beskrevet heri før er den enten direkte koblet til PTH eller den kan inkludere et degraderingssete mellom PTH (første domene) og NQEQVSP (SEKV. ID nr. 16) sekvensen (andre domene). Som sådan kan PTH-fusjonspeptid inkorporeres i fibrinet under koagulasjon via et Faktor XHIa substrat.

Konstruksjon av fusjonsproteiner for inkorporering

PTH-fusjonspeptid som inkluderer et første domene som inkluderer PTH, et andre domene som inkluderer et substratdomene for et tverrbindingsenzym og eventuelt et degraderingssete mellom det første og det andre domenet kan inkorporeres i fibringelene ved å bruke flere forskjellige skjemaer. Fortrinnsvis inkluderer det andre domenet et transglutaminasesubstratdomene og enda mer fortrinnsvis inkluderer det et Faktor XHIa substratdomene. Mest fortrinnsvis inkluderer Faktor XHIa substratdomenet NQEQVSP (SEKV. ID nr. 16). Når dette PTH-fusjonspeptid er tilstede under polymeriseringen av fibrinogen, dvs. under dannelsen av fibrinmatriks, blir den direkte inkorporert i matriks.

Degraderingssetet mellom det første og det andre domenet til PTH-fusjonspeptidet kan være et enzymatisk degraderingssete som beskrevet tidligere. Fortrinnsvis er degraderingssetet spaltbart med et enzym valgt fra gruppen som består av plasmin og matriksmetalloproteinase. Ved omhyggelig seleksjon av Km og kcat for dette enzymatiske degraderingssetet, kunne degradering kontrolleres for å skje enten før eller etter proteinmatriks og/eller ved å utnytte like eller ulike enzymer til å degradere matriks, med plassering av degraderingssetet skreddersydd for hver type av protein og applikasjon. Dette PTH-fusjonspeptid kunne være direkte tverrbundet inn i fibrinmatriks som beskrevet ovenfor. Inkorporering av et enzymatisk degraderingssete forandrer imidlertid frigjøringen av PTH under proteolyse. Når de celleavledede proteaser når det sekvenserte fusjonspeptid kan de spalte det konstruerte protein og det nylig dannede degraderingssetet. Det resulterende degraderingsprodukt vil inkludere det frigjorte PTH, som vil nå være nesten fri for enhver konstruert fusjonssekvens, så vel som ethvert degraderbart fibrin.

II. Fremgangsmåter til anvendelse

Matrisene kan brukes til reparasjon, regenerering eller gjenoppbygging av vev, og/eller frigjøring av PTH, før eller ved tidspunktet for implantasjon. I noen tilfeller vil det være ønskelig å indusere tverrbinding på administrasjonsstedet for å konformere matriks til vevet på implantasjonsstedet. I andre tilfeller vil det være egnet å fremstille matriks før implantasjon.

Celler kan også tilsettes matriks før eller på samme tidspunkt som implantasjon, eller til og med påfølgende implantasjon, enten ved eller påfølgende tverrbinding av polymeren for å danne matriks. Dette kan være i tillegg til eller istedenfor tverrbinding av matriks for å produsere interstitielle rom konstruert til å promotere celleproliferasjon eller innvekst.

Skjønt i de fleste tilfeller vil det være ønskelig å implantere matriks for å promotere cellevekst eller proliferasjon vil i noen tilfelle de bioaktive faktorer anvendes til å inhibere hastigheten av celleproliferasjon. En spesifikk applikasjon er å inhibere dannelsen av adhesjoner etter kirurgi.

III. Applikasjonsfremangsmåte

I den foretrukne utforming blir materialet gelert in situ i eller på kroppen. I en annen utforming kan matriks dannes utenfor kroppen og deretter appliseres i den predannede fasong. Matriksmaterialet kan fremstilles fra syntetiske eller naturlige forløperkomponenter. Uten hensyn til typen av forløperkomponent brukt bør forløperkomponentene adskilles før applikasjon av blandingen til kroppen for å hindre kombinasjon eller kontakt med hverandre under betingelser som tillater polymerisasjon eller gelering av komponentene. For å forhindre kontakt før administrering kan et sett som adskiller sammensetningene fra hverandre anvendes. Ved å blande under betingelser som tillater polymerisasjon danner sammensetningene en bioaktiv faktor supplementert tredimensjonalt nettverk. Avhengig av forløperkomponentene og deres konsentrasjoner kan gelering skje omtrent øyeblikkelig etter blanding. Slik hurtig gelering gjør injeksjon, dvs. å skvise det gelerte materialet gjennom en injeksjonsnål nesten umulig.

I én utførelsesform blir matriks dannet fra fibrinogen. Fibrinogen geleres til å danne en matriks gjennom en kaskade av forskjellige reaksjoner når det bringes i kontakt med trombin og en kalsiumkilde ved egnet temperatur og pH. De tre komponentene, fibrin, trombin og kalsiumkilden bør lagres separat. Så lenge minst én av de tre komponentene er holdt separat kan imidlertid de andre to komponentene kombineres før administrering.

I en første utforming blir fibrinogen oppløst (som kan inneholde ytterligere aprotinin for å øke stabiliteten) i en bufferoppløsning ved fysiologisk pH (i et område fra pH 6,5-8,0, fortrinnsvis fra pH 7,0-7,5) og lagret separat fra en oppløsning av trombin i en kalsiumkloridbuffer (f.eks. konsentrasjonsområdet fra 40-50 mM). Bufferoppløsningen for fibrinogen kan være en histidinbufferoppløsning ved en foretrukket konsentrasjon på 50 mM inkludert ytterligere NaCl ved en foretrukket konsentrasjon på 150 mM eller TRIS-buffersaltoppløsning (fortrinnsvis ved en konsentrasjon på 33 mM).

I en foretrukket utforming er det tilveiebrakt et sett som inneholder et fusjonsprotein, fibrinogen, trombin og en kalsiumkilde. Eventuelt kan settet inneholde et tverrbindingsenzym, så som Faktor XHIa. Fusjonsproteinet inneholder en bioaktiv faktor, et substratdomene for et tverrbindingsenzym og et degradasjonssted mellom substratdomenet og bioaktiv faktor. Fusjonsproteinet kan være tilstede i enten fibrinogen- eller trombinoppløsning. I en foretrukket utforming inneholder fibrinogenoppløsningen fusjonsproteinet.

Oppløsningene blir fortrinnsvis blandet ved hjelp av en toveis sprøyteanordning, i hvilken blanding skjer ved å presse innholdet av begge sprøytene gjennom et blandekammer og/eller nål og/eller statisk blandeanordning.

I en foretrukket utforming er både fibrinogen og trombin lagret separat i lyofilisert form. Hver av de to kan inneholde fusjonsproteinet. Før anvendelse blir tris- eller histidinbuffer tilsatt fibrinogenet, bufferen kan ytterligere inneholde aprotinin. Det lyofiliserte trombin blir oppløst i kalsiumkloridoppløsningen. Deretter blir fibrinogen- og trombinoppløsninger plassert i separate beholdere ampuller sprøytelegemer og blandet ved en toveis sammenkoblingsanordning, så som en toveis sprøyte. Eventuelt er beholderne/ampullene/sprøytelegemene todelte for således å ha to kammer adskilt ved en justerbar adskillelse som er perpendikulær til sprøytekroppveggen. Ett av kamrene inneholder det lyofiliserte fibrinogen eller trombin, mens det andre kammeret inneholder en egnet bufferoppløsning. Når stempelet blir presset ned beveger skillet seg og frigjør bufferen i fibrinogenkammeret for å oppløse fibrinogenet. Når både fibrinogen og trombin er oppløst blir begge todelte sprøytelegemene festet til en toveis sammenkoblingsanordning og innholdet blir blandet ved å presse dem gjennom injeksjonsnålen festet til koblingsanordningen. Eventuelt inneholder koblingsanordningen en statisk blande anordning for å forbedre blandingen av innholdene.

I en foretrukket utforming blir fibrinogen fortynnet åtte ganger og trombinet blir fortynnet tyve ganger før blanding. Dette forholdet resulterer i en geleringstid på ca.

1 min.

I en annen foretrukket utforming blir matriks dannet fra syntetiske forløperkomponenter som er i stand til å gjennomgå en Michael-tilsettingsreaksjon. Siden den nukleofile forløperkomponent (multitiol) bare reagerer med multiakseptorkomponenten (den konjugerte umettede gruppe) ved basisk pH, er de tre komponentene som må lagres separat før blanding: basen, den nukleofile komponent og multiakseptorkomponenten. Både multiakseptorkomponenten og multitiokomponenten er lagret som oppløsninger i buffere. Begge sammensetningene kan inkludere celletilfestingssetet og ytterligere det bioaktive molekylet. Således kan den første sammensetning i systemet f.eks. inkludere oppløsningen til den nukleofile komponent og den andre sammensetning til systemet kan inkludere oppløsningen til multiakseptorkomponenten. Enten én eller begge av de to sammensetninger kan inkludere basen. I en annen utforming kan multiakseptor og multitiol inkluderes som en oppløsning i første sammensetning og den andre sammensetning kan inkludere basen. Sammenkobling og blanding skjer på samme måte som tidligere beskrevet for fibrinogen. Den todelte sprøytekroppen er på samme måte egnet for de syntetiske forløperkomponentene. Istedenfor fibrinogen og trombin er multiakseptor- og multitiolkomponentene lagret i pulverisert form i ett av kamrene det andre kammer inneholder den basiske buffer.

Oppsummert vedrører foreliggende oppfinnelse dermed et fusjonspeptid som er kjennetegnet ved at det omfatter et første domene som omfatter paratyroidhormon

(PTH) og et andre domene som omfatter et substratdomene, som er kovalent tverrbindbart til et fibrinmatriksmateriale eller til et syntetisk matriksmateriale, slik at fusjonspeptidet kan bli koblet til matriksen gjennom det andre domenet.

Oppfinnelsen vedrører videre sett som omfatter fusjonspeptidet ifølge oppfinnelsen.

I tillegg gjelder oppfinnelsen en matriks som er egnet for cellulær vekst eller innvekst der denne omfatter fusjonspeptidet ifølge oppfinnelsen, hvori fusjonspeptidet er kovalent bundet til matriks.

Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte til å fremstille en matriks, der fremgangsmåten omfatter

å tilveiebringe minst ett matriksmateriale som er i stand til å danne en tverrbundet matriks, hvori matriksmaterialet er valgt fra gruppen som består av proteiner og syntetiske materialer,

å tilsette fusjonspeptidet som angitt i ethvert av kravene 1-10 til matriksmaterialet, og

tverrbinde matriksmaterialet, slik at fusjonspeptidet er koblet til matriks gjennom det andre domenet.

De følgende eksempler er inkludert for å vise foretrukne utforminger av oppfinnelsen.

Eksempel 1: Matriser som inneholder kovalent bundet TGPTH.

Syntese av TGPTH

PTH 1-34-mer peptid som viser lik aktivitet til hele proteinet, og proteiner av denne lengde kan syntetiseres ved standard faststoffpeptidsyntesemetoder.

Alle peptidene ble syntetisert på fast harpiks ved å bruke en automatisert peptidsynteseanordning som benytter standard 9-fluoroenylmetyloksykarbonylkjemi. Peptider ble renset ved cl8-kromatografi og analysert ved å bruke revers fasekromatografi via HPLC for å bestemme renhet så vel som massespektroskopi (MALDI) for å identifisere molekylvekten til hvert produkt. Ved å bruke denne metode, det følgende peptid (heretter referert til som "TGPTH") ble syntetisert: NH3-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-COOH (SEKV. ID nr. 17).

In vivo resultater

Aktiviteten til TGPTH for å forsterke benregenerasjon ble testet i en TISSUCOL<®>matriks i en boret hull defekt i en sau. Åtte mm hull som var 12 mm dype ble dannet i den proksimale og distale femur og humerus hos sau. Disse hullene ble fylt med en in situ polymeriseringsfibringel. Defektene ble etterlatt tomme, fylt med TISSUCOL<®>eller TGPTH tilsatt til TISSUCOL<®>fibrin ved 400 ug/ml før polymerisering. I hvert eksempel i hvilke TISSUCOL<®>ble brukt, ble den fortynnet fire ganger fra en tilgjengelig standardkonsentrasjon, og førte til en fibrinogenkonsentrasjon på 12,5 mg/ml.

Defektene ble tillatt å tilheles i 8 uker. Etter denne tilhelingsprosessen ble dyrene avlivet, benprøvene ble fjernet og analysert ved mikrodatamaskinassistert topografi (u.CT). Prosenten av defekt volum fylt med kalsifisert benvev ble deretter bestemt. Når defektene ble etterlatt tomme var det ingen dannelse av kalsifisert vev på innsiden av fibrinmatriks. Når bare en fibringel blir tilsatt var det praktisk talt ingen bentilheling. Imidlertid ved tilsetting av 400 u.g/ml av TGPTH øket tilhelingsnivået dramatisk hvor defekten var 35 % med kalsifisert ben.

Eksempel 2: Tilhelingsrespons med modifisert PTH 1-34 tilfestet en fibrinmatriks

Materialer

Den modifiserte versjon av PTH1-34som kan inkorporeres i en fibrinmatriks ble undersøkt for tilhelingsrespons i rottekraniedefekt med kritisk størrelse.

En fibringel ble fremstilt fra TISSUCOL<®>settet (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH) fibrinforseglingsforløperkomponenter. Fibrinogenet ble fortynnet i steril 0,03 M Tris-bufret oppløsning (TBS, pH 7,4) til å danne en ca. 8 mg/ml oppløsning og trombinet ble fortynnet i steril 50 mM CaCh oppløsning for å danne en 2 U/ml oppløsning. Den endelige konsentrasjon av fibrinogen var 1:8 opprinnelig TISSUCOL<®->formulering (ca. 100 mg/ml) og 1:160 opprinnelig TISSUCOL<®->trombinkonsentrasjon (ca. 500 IE/ml). En forutbestemt mengde av TG-pl-PTHi.34eller TGPTH1.34ble deretter tilsatt trombinet, og blandet for å danne en homogen konsentrasjon.

For å danne fibringelen ble de fortynnede forløpere blandet sammen ved å injisere fibrinogenet i røret som inneholder trombinet. I tilfelle av saueboredefekten (som beskrevet nedenfor) ble denne blanding deretter injisert øyeblikkelig inn i en boredefekt dannet i saueporøst ben, hvor en fibringel ble dannet innen 1-5 min. I den første serie av dyreeksperimenter ble effektiviteten til et fusjonsprotein som inneholder PTH1.34som den bioaktive faktor

(NQEQVSPL YKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF,

SEKV. ID nr. 18) ved tilheling av kortikalt ben testet i en smådyrmodell. Sekvensen YKNR (SEKV. ID nr. 19) gjør bindingsplasminet degraderbart ("TG-pl-PTHi.34). TG-pl-PTHi-34ble fremstilt ved kjemisk syntese. Rensing ble utført gjennom revers fase HPLC (C18-kolonne) ved å bruke en TFA som motion og som resulterte i et endelig produkt som var et TFA-salt. Renheten til TG-pl-PTHi.34ble bestemt til å være 95 %.

Tilhelingsresponsen ble undersøkt ved både korte (3 uker) og lange tilhelingstider (7 uker) for å bestemme om en forbedring i tilheling kunne observeres.

Rottekraniedefekt med kritisk størrelse

Rotter ble anestesert og kraniebenet ble eksponert. Periosteum på den ytre overflaten av kraniet ble trukket tilbake slik at det ikke ville spille noen rolle i tilhelingsprosessen, og en enkel 8 mm rund defekt ble dannet. Defektstørrelsen ble valgt idet det tidligere har blitt bestemt at defekter på 8 mm eller større ikke spontakt tilheles av seg selv, og er defekter med kritisk størrelse. Defekten ble deretter tilpasset med en predannet fibrinmatriks og dyret ble tillatt å tilheles i 3 og 7 uker. Defektregionen ble deretter eksplantert og analysert ved radiologi så vel som histologi.

Resultater

Når TG-pl-PTHi-34ble undersøkt på 3 ukers tidspunktet var tilhelingsnivået meget likt det observert med en fibrinmatriks alene. 3 ukers tidspunktet ble valgt som et tidlig tidspunkt idet andre kraftige morfogener, inkludert rhBMP-2 viste en sterk tilhelings virkning ved 3 uker. I kontrast var tilhelingsvirkningen for TG-pl-PTHi.34ikke observerbar på dette tidlige tidspunkt. Da det lange tidspunkt (7 uker) ble analysert ble imidlertid en moderat doseavhengig forbedring observert i tilheling i rottekraniedefekten med kritisk størrelse med tiletting av modifisert PTH1.34til fibrinmatrisene. Resultatet er vist i tabell 3. Når høye doser av modifisert PTH1.34ble anvendt øket tilhelingsresponsen med 65 %.

Disse resultatene viser at når PTH1.34er inkorporert i en fibrinmatriks bibeholder den noe aktivitet som vist ved den beskjedne økning i bendannelse.

Boredefekt i saueben

TG-pl-PTHi-34ble også testet i en defektmodell i lange ben for å teste virkningen av dette hormonet på tilheling av ben. I boredefektmodell hos sau ble 8 mm sylindriske boredefekter som var ca. 15 mm dype plassert i både den proksimale og distale region på femur og humurusben. Siden defekten var plassert i epifysen til de lange knoklene, var defekten omgitt av trabekulært ben med et tynt lag av kortikalt ben på kanten av defekten. Disse defekter ble deretter fylt med en in situ polymerisering fibrin (ca. 750 ul) som inneholdt forskjellige doser av TG-pl-PTHi-34eller TGPTH1-34. Dyrene ble tillatt å tilheles i 8 uker og ble deretter avlivet. Defekten ble analysert med u-CT og histologi.

I denne serien av eksperimenter ble tre typer av sammensetninger testet. Først ble TG-pl-PTHi-34testet over et stort konsentrasjonsområde. deretter, en annen modifisert PTHi_34, TGPTHi_34

nr. 17) ble anvendt som bare hadde en transglutaminasesekvens i aminoterminus uten et degraderingssete. Således kunne TGPTH1.34bare frigjøres ved degradering av fibrinmatriks i seg selv. TGPTH1-34ble fremstilt og renset på samme måte som TG-pl-PTHi-34. Renheten ble bestemt å være 95 %. TGPTH1.34ble testet ved flere

konsentrasjoner som var like konsentrasjonene til TG-pl-PTHi.34for å sammenligne effektiviteten. Avslutningsvis ble matriser fremstilt i nærvær av granulært materiale, med enten TGPTH1.34eller TG-pl-PTHi.34. Det granulære materialet var en standard trikalsiumfosfat/hydroksyapatittblanding som var innbakt i matriks under gelering.

Virkningen av å tilsette disse granuler på effektiviteten til PTH 1.34 ble undersøkt.

Resultater

Som en kontroll ble umodifisert fibrin testet. Når hver av de modifiserte PTH1.34molekyler ble plassert i defekten i de lange knokler, ble en signifikant forbedring i tilhelingsresponsen observert over anvendelse av fibrinmatriser (kontroll) alene. Anvendelse av fibrin alene resulterte i liten tilheling, bare 20 % av den opprinnelige defekten var fylt med nylig dannet ben.

TG-pl-PTHi-34ble testet i en konsentrasjonsserie fra 20-1000^g/ml. For hver testede dose ble en signifikant økning i tilhelingsresponsen observert. F.eks. når 100 u.g/ml TG-pl-PTHi-34ble brukt, ble tilhelingsgraden øket til nesten 60 %.

I en andre serie av eksperimenter ble TGPTH].34testet. Anvendelse av TGPTH].34øket også bentilheling. F.eks. forbedret anvendelse av 400 u.g/ml tilhelingsresponsen til 40 % og 1000^g/ml øket bentilhelingen til 65 %. Således resulterte tilsettingen av hver modifiserte PTHi-34-sekvens i en sterkere tilhelingsrespons enn kontrollen.

Endelig når hvert modifiserte PTHi-34-molekyl ble bundet til matriks og en granul-/matriksblanding ble anvendt ble effektiviteten til PTH].34opprettholdt. Dette ble testet for både TG-pl-PTHi.34(se tabell 4) så vel som for TGPTH1-34(se tabell 5). Histologisk evaluering viste høy infiltrasjon i den opprinnelige defekt av spindel-og osteoblastforløperceller understøttet på en ekstracellulær matriks. Aktive osteoider med store runde osteoblaster var vanlig og tegn på endokondrial bendannelse (kondrocytter) ble observert. Ved 8 uker kunne osteoklaster og friske tegn på redannelse finnes. Men ulik resultatene oppnådd fra kontinuerlig eksponering til systemisk PTH, ble ingen reaksjon fra osteoklaster observert og ny bendannelse var signifikant større enn absorpsjon i og rundt det defekte området. Ingen fremmedlegeme inflammatorisk reaksjon ble detektert (dvs. ingen gigantceller og bare mildt nærvær av monocytt). Granuler var fremdeles tilstede i prøver med tilsatte mineralpartikler.

Eksempel 3: Fremstilling av forløperkomponenter for syntetiske matriser Fremstilling av PEG-vinylsulfoner

Kommersielt tilgjengelige grenede PEG'er (4-arm PEG, molekylvekt 14800, 4-arm PEG, molvekt 10000 og 8-arm PEG, molvekt 20000; Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) ble funksjonalisert på OH-endene.

PEG-vinylsulfoner ble fremstilt under argonatmosfære ved å reagere en diklormetanoppløsning av forløperpolymerer (tidligere tørket over molekylærsikter) med NaH og deretter, etter hydrogenutvikling, med divinylsulfon (molare forhold: OH 1: NaH 5: divinylsulfon 50). Reaksjonen ble utført ved romtemperatur i 3 dager under argon med konstant omrøring. Etter nøytraliseringen av reaksjonsoppløsningen med konsentrert eddiksyre ble oppløsningen filtrert gjennom papir inntil den var klar. Den avledede polymer ble isolert ved utfelling i iskald dietyleter. Produktet ble gjenoppløst i diklormetan og gjenutfelt i dietyleter (med grundig vasking) to ganger for å fjerne alt overskudd av divinylsulfon. Endelig ble produktet tørket under vakuum. Avledningen ble konfirmert med<]>H NMR. Produktet viste karakteristiske vinylsulfontopper på 6,21 ppm (to hydrogener) og 6,97 ppm (ett hydrogen). Graden av endegruppekonversjon ble funnet å være 100 %.

Fremstilling av PEG-akrylater

PEG-akrylater ble fremstilt under argonatmosfære ved å reagere en azeotropisk tørket toluenoppløsning av forløperpolymerer med akryloylklorid, i nærvær av trietylamin (molare forhold: OH 1: akryloylklorid 2: trietylamin 2,2). Reaksjonen fortsatte under omrøring natten over i mørke ved romtemperatur. Den resulterende blekgule oppløsning ble filtrert gjennom en nøytral aluminaseng; etter inndamping av oppløsningsmidlet ble reaksjonsproduktet oppløst i diklormetan, vasket med vann, tørket over natriumsulfat og utfelt i kald dietyleter. Utnytte: 88 %; konversjon av OH til akrylat: 100 % (fra<!>H NMR analyse).

<]>H NMR (CDC13): 3,6 (341H (14800 4arm: 337H teor.), 230 (10000 4arm: 227H teor.), eller 210H (20000 8 arm: 227H teor.), PEG-kjedeprotoner), 4,3 (t, 2H, -CH2-CH^-0-CO-CH=CH2), 5,8 (dd, 1H, CH2=CH-COO-), 6,1 og 6,4 (dd, 1H, CH^CH-COO-) ppm.

FT-IR (film på ATR-plate): 2990-2790 (v C-H), 1724 (v C=0), 1460 (vsCH2), 1344, 1281, 1242, 1097 (vas C-O-C), 952, 842 (vsC-O-C) cm'<1.>

Peptidsyntese

Alle peptider ble syntetisert på fast harpiks ved å bruke en automatisert peptidsyntetiseringsanordning (9050 Pep Plus Synthesizer, Millipore, Framingham, USA) med standard 9-fluorenylmetyloksykarbonylkjemi. Hydrofobe "renovatører"

(scavengers) og spaltede beskyttende grupper ble fjernet ved utfelling av peptidet i kald dietyleter og oppløsning i deionisert vann. Etter lyofilisering ble peptidene gjenoppløst i 0,03 M Tris-bufret saltoppløsning (TBS, pH 7,0) og renset ved å bruke

HPLC (Waters; Milford, USA) på en størrelseseksklusjonskolonne med TBS, pH 7,0 som løpende buffer.

Matriksdannelse ved konjugattilsettingsreaksjoner

MMP-sensitive geler dannet ved konjugattilsetting med en peptidkoblet nukleofil og en PEG-koblet konjugert umettethet som tillater proteolytisk cellemigrasjon.

Syntesen av geler blir utført fullstendig gjennom Michael-type tilsettingsreaksjon av tiol-PEG på vinylsulfon-funksjonalisert PEG. I et første trinn ble adhesjonspeptider tilfestet pendant (f.eks. peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(SEKV. ID nr. 20)) til et flerarmet PEG-vinylsulfon og deretter ble denne forløper tverrbundet med et ditiolinneholdende peptid (f.eks. MMP-substratet Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH2(SEKV. ID nr. 21)). I en typisk gelfremstilling for tredimensjonal in vitro undersøkelser, ble 4arm-PEG-vinylsulfon (molvekt 15000) oppløst i en TEOA-buffer (0,3 M, pH 8,0) for å gi en 10 % (vekt/vekt) oppløsning. For å gjøre gelene celleklebende, ble det oppløste peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(SEKV. ID nr. 20) (samme buffer) tilsatt til denne oppløsning. Adhesjonspeptidet ble tillatt å reagere i 30 min. ved 37°C. Deretter ble tverrbinderpeptidet Ac-GCRDGPQGIQGQDRCG-NH2(SEKV. ID nr. 21) blandet med ovennevnte oppløsning og gelene ble syntetisert. Gelering skjedde innenfor noen minutter mens tverrbindingsreaksjonen imidlertid ble utført i 1 time ved 37°C for å garantere fullstendig reaksjon.

MMP- ikke-sensitive geler dannet ved konjugattilsetting med en PEG-koblet nukleofil og en PEG-koblet konjugat umettethet som tillater ikke-proteolytisk cellemigrering.

Syntesen av geler ble også fullført fullstendig gjennom Michael-type tilsettingsreaksjon av tiol-PEG på vinylsulfon-funksjonalisert PEG. I et første trinn ble adhesjonspeptider fremstilt pendant (f.eks. peptidet Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(SEKV. ID nr. 20)) til et flerarmet PEG-vinylsulfon og deretter ble denne forløper tverrbundet med en PEG-ditiol (m.v. 3,4 kD). I en typisk gelfremstilling for tredimensjonale in vitro undersøkelser ble 4arm-PEG-vinylsulfon (molvekt 15000) oppløst i en TEOA-buffer 0,3 M, pH 8,0) for å gi en 10 % (vekt/vekt) oppløsning. For å gjøre gelene celleklebende ble det oppløste peptid AC-GCGYGRGDSPG-NH2(SEKV. ID nr. 20) (i samme buffer) ble tilsatt denne oppløsning. Adhesjonspeptidet ble tillatt å reagere i 30 min. ved 37°C. Deretter ble PEG-ditiolforløperen blandet med overnevnte oppløsning og gelene ble syntetisert. Geleringen skjedde innenfor noen minutter, mens tverrbindingsreaksjonen imidlertid ble utført i 1 time ved 37°C for å garantere fullstendig reaksjon.

Matriksdannelse ved kondensasjonsreaksjon

MMP-sensitive geler dannet ved kondensasjonsreaksjoner med en peptid X-kobler som inneholder multiple aminer og en elektrofil aktiv PEG som tillater proteolytisk cellemigrering.

MMP-sensitive hydrogeler ble også dannet ved å utføre en kondensasjonsreaksjon mellom MMP-sensitivt oligopeptid som inneholder 2 MMP-substrater og 3 Lys (Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2(SEKV. ID nr. 22) og en kommersielt tilgjengelig (Shearwater polymers) difunksjonell dobbelester PEG-N-hydroksysuksinimid (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS). I et første trinn ble et adhesjonspeptid (f.eks. peptidet Ac-GCGYGRGDSPG-NH2) (SEKV. ID nr. 20) reagert med en liten fraksjon av NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS og deretter ble denne forløper tverrbundet til et nettverk ved å blandes med peptidet Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2(SEKV. ID nr. 22) som bærer tre e-aminer (og ett primært amin). I en typisk gelfremstilling for 3-dimensjonell in vitro undersøkelser, ble begge komponenter oppløst i 10 mM PBS ved pH 7,4 for å gi en 10 % (vekt/vekt) oppløsning og hydrogeler ble dannet på mindre enn én time.

I motsetning til de foreliggende hydrogeler dannet ved Michael-type reaksjon, er den ønskede selvselektivitet ved denne tilnærming ikke garantert siden aminer tilstede i biologiske materialer så som celler eller vev også ville reagere med difunksjonelt aktiverte doble estere. Dette er også riktig for andre PEG som bærer elektrofile funksjonaliteter så som PEG-oksykarbonylimidazol (CDI-PEG), eller PEG-nitrofenylkarbonat.

MMP- ikke-sensitive hydrogeler dannet ved kondensasjonsreaksjoner med en PEG-amin-tverrbinder og en elektrofilt aktiv PEG som tillater ikke-proteolytisk cellemigrering. Hydrogeler ble også dannet ved å utføre en kondensasjonsreaksjon mellom kommersielt tilgjengelige forgrenede PEG-aminer (Jeffaminer) og den samme di funksjonelle doble ester PEG-N-hydroksysuksinimid (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS). I et første trinn ble adhesjonspeptidene (f.eks. peptidet Ac-GCGYGRGDSPG-NH2) (SEKV. ID nr. 20) reagert med en liten fraksjon av NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS og deretter ble denne forløper tverrbundet til et nettverk ved blanding med det multiarmede PEG-amin. I en typisk gelfremstilling for tredimensjonale in vitro undersøkelser ble begge komponenter oppløst i 10 mM PBS ved pH 7,4 for å gi en 10 % (vekt/vekt) oppløsning og hydrogeler ble dannet på mindre enn 1 time.

Igjen i motsetning til de foreliggende hydrogeler dannet ved Michael-type reaksjon, er den ønskede selvselektivitet i denne tilnærming ikke garantert siden aminer tilstede i biologiske materialer så som celler eller vev også vil reagere med difunksjonelle aktuerte doble estere. Dette er også riktig for andre PEG som bærer elektrofile funksjonaliteter så som PEG-oksykarbonylimidazol (CDI-PEG), eller PEG-nitrofenylkarbonat.

Eksempel 4: Benregenerasjon med syntetiske enzymatisk degraderbare matriser

To forskjellige startkonsentrasjoner av de enzymatisk degraderbare geler ble anvendt. I hver av disse ble konsentrasjonen av RGD og den aktive faktor (CplPTH ved 100 fig/ml) holdt kontant. Det polymere nettverk ble dannet fra en 4-armet forgrenet PEG funksjonalisert med fire vinylsulfonendegrupper med molekylvekt o på 20 kD (molekylvekt for hver av armene 5 kD) og ditiolpeptid med følgende sekvens Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly (SEKV. ID nr. 21). Begge forløperkomponentene ble oppløst i 0,3 M trietanolamin. Startkonsentrasjonen til det funksjonaliserte PEG (første forløpermolekyl) og ditiolpeptidet (andre forløpermolekyl) ble variert. I ett tilfelle var konsentrasjonen 12,6 vekt% av den totale vekt av sammensetningen (første og andre forløperkomponent pluss trietanolaminoppløsning). 12,6 vekt% tilsvarer en 10 vekt% oppløsning beregnet på basis av bare den første forløperkomponent. (100 mg/ml første forløpermolekyl). Den andre startkonsentrasjonen var 9,5 vekt% av den totale vekt av sammensetningen (første og andre forløperkomponent + trietanolaminoppløsning) som tilsvarer 7,5 vekt% på basis av bare det første forløpermolekyl (75 mg/ml første forløpermolekyl) av total vekt. Dette har den følge at mengden av ditiolpeptid ble forandret slik at det molare forhold mellom vinylsulfoner og tioler ble opprettholdt.

Gelen som hadde utgangspunkt fra en startkonsentrasjon på 12,6 vekt% svellet til en konsentrasjon på 8,9 vekt% av den totale vekt av det polymere nettverk + vann, således hadde matriks et vanninnhold på 91,1. Gelen som hadde utgangspunkt i en startkonsentrasjon på 9,5 vekt% svellet til en avsluttende konsentrasjon på 7,4 vekt% av den totale vekt av det polymere nettverk pluss vann, og hadde således et vanninnhold på 92,6.

For å utforske virkningen av denne forandring ble disse materialene testet i saueboredefekten. Her ble 750 ul defekt plassert i det porøse ben til diafysene i sauefemur og humerus og fylt med en in situ relaterende enzymatisk gel. Følgende mengde av kalsinert vev ble oppnådd, bestemt ved hjelp av^CT, hvori hver gruppe var N=2:

Ved å gjøre gelene mindre tette og lettere for cellepenetrasjon var den resulterende tilhelingsreaksjon med tilsetting av en aktiv faktor sterkere. Virkningen av å ha avsluttende faste konsentrasjoner på under 8,5 vekt% er klart fra disse resultater. Det er derved klart at konstruksjonen av matriks er essensiell for å tillate tilheling av sårdefekter. Hver av disse hydrogelene var sammensatt av store kjeder av polyetylenglykol, endekoblet for å danne en matriks. Detaljene vedrørende hvordan de var koblet sammen, via enzymatiske degraderingsseter, tettheten til sammenkoblerne og flere andre variabler var imidlertid essensielt for å tillate en funksjonell tilhelingsrespons. Disse forskjellene meget klart observert i saueboredefektmodellen.

Eksempel 5: Bendannelse med syntetiske hydrolytisk degraderbare matriser PTH 1-34 fusjonspeptid ble testet i en syntetisk gel så vel som i saueboredefektmodellen nøyaktig som beskrevet for fibrinmatrisene. Et hydrogelnettverk ble dannet ved å blande sammen akrylert 4-arm polyetylenglykol, MV 15000 (Peg 4<*>15Acr) med en lineær polyetylenglykolditiol med MV 3500. Gjennom en Michael-type reaksjon, hvor de to komponentene blir blandet i en buffer på 0,3 M trietanolamin ved pH 8,0, de resulterende tiolater som blir dannet ved denne pH kan deretter reagere med konjugert umettethet til akrylatet for å danne en kovalent binding. Ved å blande sammen multifunksjonelle forløpere slik at den kombinerte multifunksjonaliteten er større eller lik 5, blir et hydrogel dannet. I tillegg kan bioaktive faktorer tilsettes til matriks gjennom et identisk reaksjonsskjema. I dette tilfellet kunne bioaktive faktorer, inkludert celleadhesjonsmotiver eller morfogene eller mitogene faktorer bindes til matriks ved tilsetting av et cystein, den tiolinneholdende aminosyre til sekvensen. Her har vi tilsatt et cystein til celleadhesjonssekvensen, RGD, og mer spesifikt, RGDSP (SEKV. ID nr. 23) så vel som til PTHi-34-sekvensen og begge ble bundet til matriks via akrylatene i tverrbinderen. Deretter vil disse nylig dannede hydrogeler ha tallrike estere nær en tiol som er blitt vist å være hydrolytisk ustabil. Denne ustabiliteten tillater gelene langsomt å degraderes og bli erstattet av nylig dannet vev.

Disse spesielle geler, hydrolytisk degraderbare med RGD og PTH kovalent bundet til matriks, ble testet i saueboredefekt modellen for å teste evnen til matriksbundet C-PTH1.34til å forsterke benvekst. For å bestemme mengden av forsterking ble 0, 100 og 400 ug/ml PTHi.34-fusjonspeptid tilsatt matriks. Når dette var gjort ble en økning i bendannelse observert med tilsetting av PTH 1.34.1 hver test ble tilhelingsreaksjonen målt ved samme tidspunkt på 8 uker. Dette ble sammenlignet med defekter som ble etterlatt tomme. Når den syntetisk graderbare matriks uten PTH-fusjonspeptid ble anvendt ble tilhelingsreaksjonen målt til ca. 40 %. Dette betyr at 40 % av det opprinnelige defekte volum ble fylt med nylig dannet benvev. Deretter når 400 u.g/ml modifisert PTHi-34-fusjonspeptid ble anvendt øket tilhelingsresponsen til ca. 60 %. I sammenligning når defektene ble etterlatt tomme ble ca. 10 % fylt med kalsinert vev. Disse data er vist i tabell 6 nedenfor.

I sammenligning til en som defekt hadde tilsetting av den hydrolytisk degraderbare PEG-gel alene en stor virkning på bentilheling, idet mengden av kalsinert vev økte med 300 %. Når PTH 1-34 ble koblet til denne matriks øket tilhelingen til og med ytterligere med nivået opptil 50 % høyere enn da matriks var anvendt alene og 500 % høyere enn det tilhelingsnivå oppnådd når defekten ble etterlatt tom.

Claims (19)

1. Fusjonspeptid, karakterisert vedat det omfatter et første domene som omfatter paratyroidhormon (PTH) og et andre domene som omfatter et substratdomene, som er kovalent tverrbindbart til et fibrinmatriksmateriale eller til et syntetisk matriksmateriale, slik at fusjonspeptidet kan bli koblet til matriksen gjennom det andre domenet.

2. Fusjonspeptid som angitt i krav 1, karakterisert vedat matriksen er fibrin og det andre domenet omfatter et transglutaminasesubstratdomene.

3. Fusjonspeptid som angitt i krav 2, karakterisert vedat det andre domenet omfatter et Faktor-XIIIa-substratdomene.

4. Fusjonspeptid som angitt i krav 3, karakterisert vedat Faktor-XIIIa-substratdomenet omfatter SEKV. ID. nr. 12.

5. Fusjonspeptid som angitt i krav 1, karakterisert vedat matriksen er en syntetisk matriks og det andre domenet omfatter minst ett cystein.

6. Fusjonspeptid som angitt i ethvert av kravene 1-5, karakterisert vedat PTH er valgt fra gruppen som består av PTH 1-84, PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 og PTH 1-25.

7. Fusjonspeptid som angitt i krav 6, karakterisert vedat PTH er PTH 1-34.

8. Fusjonspeptid som angitt i ethvert av kravene 1-7, karakterisert vedat det ytterligere omfatter et degraderingssete mellom det første og det andre domenet.

9. Fusjonspeptid som angitt i krav 8, karakterisert vedat degraderingssetet er et enzymatisk eller hydrolytisk degraderingssete.

10. Fusjonspeptid som angitt i krav 8, karakterisert vedat degraderingssetet er et enzymatisk degraderingssete, som blir spaltet av et enzym valgt fra gruppen som består av plasmin og matriksmetalloproteinase.

11. Sett, karakterisert vedat det omfatter fusjonspeptidet som angitt i ethvert av kravene 1-10.

12. Sett som angitt i krav 11, karakterisert vedat det ytterligere omfatter fibrinogen, trombin og en kalsiumkilde.

13. Sett som angitt i krav 11, karakterisert vedat settet ytterligere omfatter et tverrbindingsenzym.

14. Matriks egnet for cellulær vekst eller innvekst, karakterisert vedat det omfatter fusjonspeptidet som angitt i ethvert av kravene 1-10, hvori fusjonspeptidet er kovalent bundet til matriks.

15. Matriks som angitt i krav 14, karakterisert vedat matriksen er fibrin.

16. Matriks som angitt i krav 14, karakterisert vedat matriksen blir dannet ved en Michael-type tilsettingsreaksjon mellom et første forløpermolekyl som omfatter n nukleofile grupper og et andre forløpermolekyl som omfatter m elektrofile grupper hvori n og m er minst to og summen n+m er minst fem.

17. Matriks som angitt i krav 16, karakterisert vedat de elektrofile grupper er konjugerte umettede grupper og de nukleofile grupper er valgt fra gruppen som består av tioler og aminer.

18. Matriks som angitt i krav 14, karakterisert vedat den omfatter polyetylenglykol.

19. Fremgangsmåte til å fremstille en matriks, karakterisert vedat den omfatter å tilveiebringe minst ett matriksmateriale som er i stand til å danne en tverrbundet matriks, hvori matriksmaterialet er valgt fra gruppen som består av proteiner og syntetiske materialer, å tilsette fusjonspeptidet som angitt i ethvert av kravene 1-10 til matriksmaterialet, og tverrbinde matriksmaterialet, slik at fusjonspeptidet er koblet til matriks gjennom det andre domenet.