KR20070108868A - Ｂｍｐ 또는 ｐｔｈ 방출 매트릭스에 의한 골 결손의 국소치료 - Google Patents

Ｂｍｐ 또는 ｐｔｈ 방출 매트릭스에 의한 골 결손의 국소치료 Download PDF

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KR20070108868A
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제이슨 쉔스
존 왓슨
이사벨르 아르리히
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쿠로스 바이오서저리 아게
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Abstract

골다공증 또는 골낭종 등의 특정 골 결손의 국소 치료 방법은 PTH 또는 BMP 2 또는 BMP 7을 포함하는 제1 도메인과 공유결합성 가교 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인을 함유하는 융합 펩티드; 및 세포 성장 혹은 내부 성장에 적합한 생분해성 매트릭스를 형성하는 데 적합한 재료를 포함하는 제제를 국소 투여하는 단계로서, 여기서 상기 융합 펩티드는 상기 매트릭스에 공유 결합되어 있는 것인 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 매트릭스는 1종 이상의 조영제를 함유하고, 바람직하게는 성장 인자의 부재시 형성된다. 상기 매트릭스는 타로브씨 낭, 난소낭, 거미막낭종, 동맥류 골낭종 또는 간낭종 등의 유체-충전된 낭의 치료에 사용될 수 있다.
PTH, BMP, 융합 펩티드, 생활성 인자

Description

ＢＭＰ 또는 ＰＴＨ 방출 매트릭스에 의한 골 결손의 국소 치료{LOCAL TREATMENT OF BONE DEFECTS WITH MATRIX RELEASING BMP OR PTH}
본 발명은 골낭종의 국소 치료 방법 및 골다공증에 걸린 건강치 않은 뼈(혹은 골)의 영역의 예방적 국소 치료에 관한 것이다.
골다공증
골 손실은 남성 및 여성 모두에 있어서 40대 내지 50대 사이에서 평균적으로 시작되어 해마다 0.6 내지 1.2%의 속도로 골 중량이 손실되고 있는 노화의 자연스러운 부분이다. 여성 골 손실은 폐경기 이후 해마다 2 내지 3%로 가속된다. 그러나, 특히 폐경 후의 여성에 있어서, 골 손실 속도는 급격하게 증가될 수 있다. 이 감소 상태는 골다공증이라 불린다. 골다공증은 거의 2억명의 사람들이 걸려 있는 전세계적으로 주된 유의성이 있는 것이다. 현재, 미국에서 골다공증을 앓고 있는 사람 1000만명과 추가로 1800만명이 골감소증의 발병의 위험이 있다. 이 위험 모집단 중, 80%가 여성이다. 골다공증은 전체적인 골격에 전반적으로 영향을 주는 전신골격질환으로, 골의 전체적인 질량이 감소하여 골의 구조가 열화되어 골 다공성을 증가시킨다. 골 질량 및 구조의 이들 변화는 골의 전체적인 강도를 감소시켜 골절의 경향으로 이어진다.
골다공증은 전신 호르몬과 국소 인자 간의 복합 상호작용이며, 골다공증의 정확한 세포 기전은 앞으로 정의되어야 한다. 따라서, 현재의 치료는 병상의 원인과 직접 대항하는 것은 아니다. 예를 들어, 가장 통상적으로 사용되는 치료법의 유도체인 비스포스포네이트는 골절의 발생을 감소하는 데 있어 기껏해야 단지 50%의 효능을 보인다. 현재 사용이 승인된 비스포스포네이트로는 알렌드로네이트(FOSAMAX®), 에티드로네이트(DIDROCAL®) 및 리세드로네이트(ACTONEL®)를 들 수 있다. 정제 형태 또는 정맥내 주입형태의 비스포스포네이트는 골을 피복해서 파골세포 활성을 방지함으로써 골다공증을 예방하고 치료하는 데 이용되는 부류의 약물이다.
골낭종
골낭종은 명확히 정의된 좁은 골내막 경계(endosteal margin)를 가진 통상 장골의 근위단에 있는 양성 단방 용균 영역(unilocular lytic areas)이다. 다르게는 단순 골낭종으로도 알려진 단강의 골낭종은 압축된 섬유 조직으로 채워져 있는, 골내 유체충전 공동이며, 통상 성장 중인 어린의 장골, 특히 상완골의 상부(그 시기의 50 내지 60%) 또는 대퇴골의 상부(그 시기의 25 내지 30%)에서 일어난다. 그러나, 다른 뼈도 영향받을 수 있다. 이들 낭종은 통상 5세 내지 15세의 어린이에게 주로 영향을 미치지만, 좀더 나이 먹은 어린이나 성인도 영향받을 수 있다. 좀더 나이 먹은 어린이나 성인에 있어서는, 편평골(골반, 턱, 두개골 또는 흉곽 등) 또는 커다란 뒤꿈치 뼈(발꿈치뼈)에서 일어나는 경향이 있다.
단강의(unicameral) 골낭종은 양성으로 간주된다. 이들은 뼈를 넘어 전이(전 파)되지 않는다. 일부는 자발적으로 치유되지만, 나머지는 확대된다. 더욱 침식성의 낭종은 성장해서 골몸통끝(뼈의 몸통이 뼈의 단부와 연결되는 과도 부위)의 대부분을 채우고 병적 골절로서 알려진 것을 초래한다. 더욱 침식성의 낭종은 또한 뼈의 성장판을 파괴하여 뼈의 단축을 초래할 수도 있다. 이들 낭종은 때로는 "활성" 또는 "잠복성"으로 분류된다. 활성 낭종은 성장판에 인접하여 확대되어 전술한 문제를 초래하는 경향이 있다. 또, 잠복성 낭종은 성장 판이 낭종으로부터 떨어져서 이동하기 때문에 치료에 의해 치유되기 더욱 쉬운 경향이 있는 것이다.
현행의 치료는 재발 골절을 주로 예방하는 것을 목적으로 한다. 이하의 외과적 수술법이 현재 적용되고 있다: 소파술/골 이식(선단에 주걱(scoop), 루프(loop) 또는 고리를 가진 큐렛이라 불리는 특수 기구에 의해 낭종을 외과적 수술로 도려내는 것), 스테로이드 주입 또는 골수 주입.
연골하 낭종 병변(SCL: subchondral cystic lesion)이라고도 불리는 관절주위 연골하 골낭종은 어린 말에서 일어날 수 있고, 인간에 있어서는 단강의 골낭종과 유사한 임상적 단위(clinical entity)이다. 이들은 어린 말에서 절름발이를 초래할 경우도 있는 통상 인정된 병리 단위이다. SCL이 발병하게 되는 가장 공통적인 부위는 뒷무릎 관절(인간의 무릎에 상당함)이다. 구체적으로는, 골낭종은 뒷무릎 관절(중간 대퇴 관절 융기)의 주된 무게를 가진 측면에서, 그리고 드물게는 관절 내의 기타 위치(근위 가쪽 경골 및 가쪽 대퇴 관절융기)에서 발견된다. SCL은 그들의 발전 단계에 따라, 둘레 조직으로부터 공막 테두리(sclerotic rim)를 통해 잘 구별되고, 일반적으로 섬유질 결합 조직과 장액 유사 윤활액으로 채워진 골의 방사 선 투과 영역이다. 말에서, 중첩하는 관절 연골 표면에 대한 관절 접속은 사례들의 삼분의 일에서 발견될 수 있다. 내측 대퇴 낭종의 크기는 얕은 돔형상 결함(대략 8mm × 3mm)에서 커다란 난형 낭종(40mm × 30mm)까지 다양하다.
절름발이를 일으키는 SCL에 대한 치료법으로는 장기 휴식, 항관절염약 및 관절내 코르티코스테로이드 요법 및 외과적 수술을 들 수 있다. 9개월 내지 12개월의 방목 휴식(paddock rest)을 필요로 할 수 있는 보존적 치료 요법은 절름발이의 해결법과 관련되어 왔다. 불행하게도, 수의학 문헌에서 평가된 보존적 치료요법에 의해 관리된 말의 수는 매우 제한되지만, 성공률은 대략 50%이다.
수많은 외과적 수술 기법이 말의 골낭종의 치료에 사용되어 왔다. 현재 권장되고 있는 치료는 낭종 내용물, 낭종 라이닝 및 중첩하는 지지되지 않은 연골의 관절경 제거(소파)를 포함한다. 치유를 증진시켜 성과를 향상시키기 위한 시도에 이용되는 추가적인 기법은 골 천공술과 이식술을 포함하지만, 이들은 모두 현재 유익을 제공하지 못하는 것으로 여겨지고 있다. 게다가, 골낭종은 계속 확대되어, 최종적으로는 말의 관절에서 이차 골관절염을 초래한다.
지난 20년에 걸쳐, 골 조직의 재생에 영향을 미치는 몇몇 생활성 인자(bioactive factor)의 능력에 대해 연구되어왔다. 부갑상샘 호르몬(PTH: parathyroid hormone)은 부갑상샘에서 만들어져 분비되는 84 아미노산 펩티드이다. 이 호르몬은 뼈를 비롯한 각종 조직에 대한 그의 작용을 통해 혈청 칼슘 레벨을 조절하는 주된 역할을 한다. 다양한 형태의 부갑상샘 호르몬을 가진 인간에 있어서의 연구는 전신에 적용되었을 경우 골에 대한 동화 작용을 입증한 바 있다. 이것으로 인해 부갑상샘 호르몬이 골다공증 및 관련된 골 장애의 전신 치료에 대해 관심을 끌게 되었다(미국 특허 제5,747,456호(Chorev, et al.) 및 국제 특허 공개 공보 제00/10596호(Eli Lilly & Co.)). 부갑상샘 호르몬은 세포 표면 수용체에 결합함으로써 세포에 작용한다. 이 수용체는 골모세포 상에서 발견되는 것으로 알려져 있고, 이 세포는 새로운 골 형성을 책임지고 있다.
인간 부갑상샘 호르몬의 N-말단 34 아미노산 도메인은 전체 길이 부갑상샘 호르몬에 대해 생물학으로 동등한 것으로 보고된 바 있다. 부갑상샘 호르몬 1-34 및 그의 작용 모드는 먼저 미국 특허 제4,086,196호에 보고되어 있다. 연구는 부갑상샘 호르몬 1-34 및 선천적인 인간 부갑상샘 호르몬 형태의 기타 절두형(truncated) 버전, 예를 들어, 1 내지 25, 1 내지 31 및 1 내지 38에 대해 수행되었다(예를 들어, 문헌[Rixon RH, et al., J Bone Miner. Res., 9 (8): 1179-89 (Aug. 1994)] 참조).
PTH가 골의 재형성(remodeling)에 영향을 미치는 기전은 복잡하고, 이것은 모순되는 결과를 초래하며, 그 후속으로, 정확한 기전에 대한 상당히 많은 연구가 내포되어 있다. 이것은 PTH가 연속적인 방법으로 전신 투여된 경우 골밀도가 감소하는 것을 입증하고 있다. 이에 대해서, 동일 분자가 맥동 방식으로 전신 투여된 경우 골밀도가 증가할 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 공보 제99/31137호(Eli Lilly & Co.) 참조). 이 명백한 모순은 PTH가 골의 재형성, 이어서 주목할만한 골밀도 파라미터를 조절하는 기전에 의해 설명될 수 있다. 성숙한 골 내에서, PTH 수용체는 파골세포가 아니라, 오로지 골모세포 계열(lineage)의 세포 표면에 존재하는 것으로 나타났다. PTH가 골 재형성에 있어서 작용하는 역할은 파골 세포와는 반대로 골모 세포를 통해 명령하는 것이다. 그러나, 골모세포 계열의 상이한 단계들에서의 세포들은 부갑상샘 호르몬에 결합될 때 상이하게 응답한다. 따라서, PTH가 상이한 방법을 이용해서 투여된 경우 관찰되는 극적인 차이는 골모세포 계열 내의 상이한 세포에 대해 동일한 분자를 갖는 상이한 효과를 이해함으로써 설명될 수 있다.
PTH가 중간엽 줄기세포와 결합할 경우, 이 세포는 전골모세포(preosteoblast)로의 분화를 유발한다. 따라서, 이 시스템에 PTH를 첨가함으로써, 전골모세포 모집단에서 증가가 있다. 그러나, 이들 전골모세포는 PTH 수용체도 가지며, 이들 세포상의 수용체에 대한 PTH의 후속의 결합은 상이한 반응을 가져온다. PTH가 전골모세포에 결합할 경우, 골 흡수를 초래하는 2개의 다른 결과를 가져온다. 첫번째로, 전골모세포의 골모세포로의 추가의 분화를 억제한다. 두번째로, 전골모세포로부터 인터루킨 6(IL-6)의 분비를 증가시킨다. IL-6은 모두 전골모세포 분화를 억제할 뿐만 아니라 파골 전구세포의 파골세포로의 분화를 증가시킨다. 골모세포 계열 내의 세포로부터의 이 이중 반응은 골 재형성과 PTH 노출 간의 복합 반응을 제공하는 것이다. PTH가 짧은 시간 동안 주기적으로 투약되면, 중간엽 줄기세포는 골모세포로의 분화를 유발한다. 다음에, 짧은 주기의 투약은 새롭게 형성된 전골모세포가 IL-6을 생성하는 것을 방지하여 파골세포의 활성을 방지한다. 따라서, 투약 간격 동안, 이들 새롭게 형성된 전골모세포는 더욱 골모세포로 분화할 수 있고, 결과적으로 골 형성을 가져온다. 그러나, 일정한 용량의 PTH가 적용되면, 전골모세포는 IL-6을 생성하기 시작하는 기회를 가지므로, 파골세포를 활성화시켜 이들 자체를 억제하여, 역효과, 즉 골 재흡수를 가져온다.
조사된 다른 생활성 인자는 BMP(bone morphogenetic protein: 골 형태형성 인자) 및 TGF β(transforming growth factor: 전환성장인자)의 군이다. 적어도 20개의 구조적으로 그리고 기능적으로 관련된 BMP와 수개의 TGF β가 있으며, 이들은 TGF-베타 상과(superfamily)의 일원이다. BMP는 원래 연골 및 골 형성의 단백질 조정제로서 인정되어 있다. 이들은 또한 각종 조직 및 기관의 배아형성 및 형태형성에도 관여한다. BMP는 중간엽 세포, 상피 세포, 조혈 세포 및 신경 세포를 비롯한 각종 세포 유형의 성장, 분화, 화학주성 및 세포자멸사를 조절한다. 기타 TGF-베타족 단백질과 유사하게, BMP는 동물 종을 가로질러 고도로 보존된다.
골 형태형성 단백질 2 및 7(BMP 2 및 7)은 뼈 또는 연골 형성 용도에 있어서 특히 주목되고 있다. BMP 2는 연골과 뼈의 양쪽 모두의 형성을 유발한다. 단백질은 프레프로펩티드로서 합성된다. 전체 길이 인간 프레프로펩티드 BMP 2는 19 아미노산 신호 서열, 263 아미노산 프로 리전(proregion) 및 114 아미노산 성숙 분절로 이루어진 396개의 아미노산의 서열을 가진 글리코실화 폴리펩티드이다. 프로 리전의 분열(cleavage)은 분리 전에 일어난다. 성숙 형태는 7개의 시스테인 부분과 1개의 N-연결된 글리코실화 부위를 가진다. 단백질의 기능성 형태는 2개의 다이설파이드-연결된 성숙 사슬로 이루어진다. 이것은 아미노산 283 내지 396 등의 BMP 2의 성숙 아미노산 서열의 일부만으로 이루어진 BMP 2 변형체도 생활성을 발휘하는 것 으로 밝혀졌다.
인간 BMP 7 또는 골형성 단백질-1(Op-I)은 BMP 2와 마찬가지로 292 아미노산 프레프로리전 및 139 아미노산 성숙 분절로 분열된 49 kDa의 431 아미노산 프레프로단백질이다. 상기 성숙 분절은 3개의 잠재성 N-연결된 글리코실화 부위와 7개의 시스테인 잔기를 포함한다.
조직 복원 혹은 재생을 위해서, 세포는 상처 베드(wound bed)로 이동하여, 증식되어서, 매트릭스 성분을 나타내거나 세포외 매트릭스를 형성하고, 최종 조직 형상을 형성할 필요가 있다. 다수의 세포 모집단은 빈번하게는 혈관 세포 및 신경 세포를 비롯해서 이 형태형성 반응에 관여할 경우도 있다. 생활성 인자가 혼입된 매트릭스는 크게 증강된 것으로 입증된 바 있고, 어떤 경우에는 이것의 발생에 필수인 것으로 밝혀졌다. 천연 또는 합성 기원(origin) 혹은 이들 모두의 혼합물로부터 매트릭스를 발전시키는 접근법이 행해져 왔다. 천연 세포 내부 성장 매트릭스는 모두 단백질 분해에 의거한 세포 영향에 의해, 예를 들어 플라스민(피브린을 분해) 및 매트릭스 금속단백분해효소(콜라겐, 엘라스틴 등을 분해)에 의해 재형성처리를 받는다. 이러한 분해는 고도로 편재화되고, 이동하는 세포와 직접 접촉할 때에만 일어난다. 또한, 성장 인자와 같은 특정 세포 시그널링 단백질의 전달은 치밀하게 조정된다. 천연 모델에 있어서, 매크로다공질 세포 내부 성장 매트릭스는 사용되지 않고, 오히려 세포가 매트릭스로 이동함에 따라 세포가 국소적으로 필요에 따라 분해될 수 있는 마이크로다공성 매트릭스가 형성된다. 면역원성, 값비싼 생산, 제한된 이용성, 배취(batch) 변동성 및 정제에 대한 관계로 인해, 개질 폴리에틸렌 글 리콜과 같은 합성 전구체 분자를 기초로 한 매트릭스가 신체내 및/또는 신체상에서 조직 재생을 위해 발전되어 왔다.
전술한 바와 같이 PTH의 전신 효과의 연구는 많이 행해진 반면, PTH의 국소 혹은 국부 투여에 대한 연구는 거의 개척되어 있지 않다. 국제 특허 공개 공보 제03/052091호에 있어서, PTH를 국소 투여하는 방법이 기재되어 있다. 국제 특허 공개 공보 제03/052091호는 합성 매트릭스 및 천연 매트릭스, 특히 피브린 및 폴리에틸렌글리콜-매트릭스에 공유적으로 부착되어 있는 부갑상샘 호르몬을 기재하고 있다. 이와 같이 해서, 부갑상샘 호르몬은 조절된 형태로 필요한 부위에 국소 투여되어, 방출될 수 있다. 국제 특허 공개 공보 제03/052091호에는 이 시스템이 건강한 뼈에 있어서의 골 조직의 형성을 유발하는 것이 나타나 있다.
본 발명의 목적은 건강하지 않은 골, 즉, 골다공증에 걸린 골 또는, 예를 들어 골낭종 및 골 종양에 걸린 골의 영역의 국소 치료 방법을 제공하는 데 있다.
발명의 개요
놀랍게도, 건강하지 않은 골의 영역, 예를 들어 골다공증, 골낭종 또는 골 종양에 걸려 약해진 골 혹은 특정 골 영역이 생활성 인자의 국소 투여에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 PTH 및 BMP, 또는 제1 도메인에 PTH 또는 BMP, 그리고 제2 도메인에 공유결합성 가교 기질 도메인(covalently crosslinkable substrate domain)을 포함하는 융합 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 생활성 인자; 및 치료를 필요로 하는 골 부위에 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물을 포함하는 제제의, 건강하지 않은 골 영역을 국소 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에는 건강하지 않은 골의 영역의 국소 재생 또는 건강하지 않은 골의 영역에 있어서의 골밀도의 국소 증가에 적합한 생활성 인자를 함유하는 매트릭스("보충 매트릭스"(supplemented matrix)라고도 칭함) 및 상기 매트릭스를 제조하고 이용하는 방법이 개시되어 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 생활성 인자는 상기 매트릭스 내에 방출가능하게 혼입된다. 상기 매트릭스는 건강하지 않은 골 영역의 부위에서 적소에(in-situ) 형성될 수 있고, 또는 증상에 따라, 체외에서 형성되어 외과적 수술을 통해 형성된 예비 정형 형태로 신체에 적용될 수 있다. 상기 생활성 인자는 상기 매트릭스로부터 방출되고, 골 조직의 재생을 국소적으로 유발한다. 적합한 생활성 인자는 골 조직의 재생을 유발하는 능력을 가진 분자, 펩티드 및 단백질을 포함한다. 상기 생활성 인자는 바람직하게는 PTH 또는 BMP이다. 부갑상샘 호르몬은 PTH1-84(선천적), PTH1-38, PTH1-34, PTH1-31, PTH1-28 혹은 PTH1-25, 또는, 골 조직의 재생을 유발하는 능력을 가진 PTH의 어떠한 개질형 혹은 대립형 버전, 또는 BMP2 혹은 BMP7일 수 있다. 가장 바람직한 생활성 인자는 PTH1-34 또는 BMP2이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 생활성 인자는 융합 펩티드이다. 상기 융합 펩티드는 상기 생활성 인자, 바람직하게는 PTH 또는 BMP를 포함하는 제1 도메인, 및 가교 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인을 함유한다.
더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 생활성 인자는 영향받은 골에 있어서 필요한 부위에 보충 매트릭스를 형성하는 데 적합한 전구체 조성물의 부분을 형성한다. 상기 보충 매트릭스를 형성하기 위한 조성물은 바람직하게는 주입가능하고 액체(25℃에서) 전구체 성분(들)로부터 형성된다. 건강하지 않은 골의 영역에 및/또는 그 영역 속으로 상기 보충 매트릭스를 투여하는 하나의 방법은 생리적 온도에서 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 적어도 1종의 액체 전구체 성분 및 하나의 생활성 인자를 필요로 하고, 상기 전구체 성분 및 생활성 인자를 건강하지 않은 골에 및/또는 그 골 속으로 적용하는 것을 포함한다. 골 결손, 즉, 건강하지 않은 골의 영역은 일반적으로 골다공증, 골낭종 또는 골 종양에 걸린 영역이다. 골다공증 뼈의 경우, 이 치료는, 예를 들어, 대퇴골 경부 또는 경추일 수 있는 뼈의 골다공증 부분에 있어서의 골밀도의 국소 증가(따라서, 뼈 또는 뼈의 일부의 보다 낮은 골절률)를 가져온다. 그 점에 있어서, 본 출원에 기재된 바와 같은 보충 매트릭스에 의해 건강하지 않은 골 영역을 치료하는 방법은 특히 뼈 골절의 예방을 위한 예방 치료이다. 보충 매트릭스가 골 종양의 제거 후 또는 골낭종의 청정 공동(cavity) 속에 적용되거나 혹은 그 공동에 형성된 경우, 상기 보충 매트릭스는 구조적으로 또한 기능적으로 골의 일체성을 복원할 때 기능하는 상기 공동에 있어서 골 형성을 유발시킨다.
바람직하게는 매트릭스는 피브린 매트릭스 또는 폴리에틸렌글리콜을 기초로 한 매트릭스이다.
세포는 이식전 또는 이식 시, 또는 심지어 이식 후에, 중합체의 가교시 혹은 가교 후에 첨가되어 매트릭스를 형성하는 것도 가능하다. 이것은 매트릭스의 가교에 부가해서 또는 매트릭스의 가교 대신으로 되어 세포 증식 또는 내부 성장을 촉진하도록 설계된 사이질 공간(interstitial spacing)을 형성할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 매트릭스는 1종 이상의 조영제를 함유하고, 성장 인자의 부재시 형성될 수도 있다. 일반적으로, 조영제는 주입 및 겔화(gelation) 동안 제제의 위치 결정 및 분포의 영상화를 가능하게 한다. 상기 제제가 생활성 인자 없이 사용되면, 상기 매트릭스는 타로브씨 낭(Tarlov cyst), 난소낭, 거미막낭종, 동맥류 골낭종 또는 간낭종 등의 유체의 온도 등의 액체 충전된 낭종에 이용되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한
i) 생리적 조건하에 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물;
ii) PTH, BMP, 또는 PTH 또는 BMP를 포함하는 제1 도메인과, 가교성 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인의 적어도 2개의 도메인을 포함하는 융합 펩티드; 및
iii) 조영제
를 포함하는 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또 천연 또는 합성 매트릭스 재료, PTH 및 BMP로 이루어진 군으로부터 선택된 생활성 인자 및 조영제를 포함하는 보충 매트릭스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 피브리노겐; 트롬빈; 칼슘 공급원(calcium source); PTH 및 BMP로 이루어진 군으로부터 선택된 생활성 인자; 및 조영제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 PTH 변형체의 생활성을 나타낸 도면으로, PTH 수용체용의 프로모터에 연결된 정보제공 유전자에 의해 트랜스펙션(transfection)된 세포를 PTH1-34, TG-pl-PTH1-34(후술함) 또는 국제 84 아미노산 표준의 동일량으로 처리하고, 루시페라제 정보제공 유전자의 발현 억제를 측정하고, 용액 중 PTH에 노출되지 않은 트랜스펙션된 세포(대조군)와 비교한 도면이다.
도 2는 피브린 매트릭스로부터 PTH 방출 에세이(assay)의 결과를 표시한 도면이다.
발명에 관한 상세한 설명
건강하지 않은 골에서의 골 결손 및 구조(건강하지 않은 골의 개괄적 영역)의 국소 치료 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 바람직하게는 골다공증 뼈 및/또는 골낭종 및/또는 골 종양의 영역이 치료된다. 이 방법은 생활성 인자, 특히 매트릭스에 방출가능하게 혼입된 PTH 또는 BMP를 가진 천연 매트릭스 및 합성 매트릭스를 사용한다. 상기 보충 매트릭스는 주입가능성, 생체적합성 및 생분해성이고, 이식시 시험관내 혹은 생체내에 형성될 수 있다. 상기 생활성 인자는 상기 매트릭스에 혼입될 수 있고, 그의 전체 생활성을 유지한다. 특히 바람직한 생활성 인자인 PTH1-34, BMP 2 또는 BMP 7은 PTH 또는 BMP가 어떻게, 언제 그리고 어느 정도 방출되는지에 대한 제어를 제공하는 기법을 이용해서 상기 매트릭스와의 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 방출가능하게 혼입될 수 있고, 따라서, 상기 보충 매트릭스는 제어된 방출 비히클로서 보충 매트릭스를 이용해서 직접 혹은 간접적으로 조직 복원에 이용될 수 있다.
정의
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "유착 부위 또는 세포 부착 부위(adhesion site or cell attachment site)"란 분자, 예를 들어, 세포 표면상의 유착 촉진 수용체가 결합하는 펩티드 서열을 의미한다. 유착 부위의 예로는 섬유결합소로부터의 RGD 서열, 및 라미닌으로부터의 YIGSR(서열 번호: 1)을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 유착 부위는 피브린 매트릭스에 가교가능한 기질 도메인을 포함함으로써 매트릭스 속으로 임의적으로 혼입될 수 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "생활성(biological activity)"이란 대상으로 하는 단백질에 의해 매개된 기능적 성과를 의미한다. 일부의 실시형태에 있어서, 이것은 폴리펩티드의 다른 폴리펩티드와의 상호 작용을 계측함으로써 평가된 성과를 포함한다. 또한, 세포 성장, 분화, 사멸, 이동, 유착, 다른 단백질과의 상호작용, 효소 활성, 단백질 인산화 혹은 탈인산화, 전사 혹은 번역에 대해서 가지는 효과를 평가하는 것도 포함한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "컨쥬게이트화된 불포화 결합(conjugated unsaturated bond)"이란 탄소-탄소, 탄소-헤테로원자 또는 헤테로원자-헤테로원자 다중 결합의 단일 결합과의 교체, 또는 합성 중합체 또는 단백질 등의 매크로분자에의 작용기의 연결을 의미한다. 이러한 결합은 첨가 반응이 수행될 수 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "컨쥬게이트화된 불포화기(conjugatged unsaturated group)"란 탄소-탄소, 탄소-헤테로원자 또는 헤테로원자-헤테로원자 다중 결합의 단일 결합과의 교체를 포함하고, 부가반응이 수행될 수 있는 다중 결합을 가진 분자 또는 분자의 영역을 의미한다. 컨쥬게이트화된 불포화기의 예로는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 아크릴아마이드, 퀴논, 및 비닐피리디늄, 예를 들어, 2- 또는 4- 비닐피리디늄 및 이타코네이트를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "조영제(constast agent)"란 영상의 콘트라스트를 증가시켜, 신체 내에서의 물질 또는 분자의 모니터를 가능하게 하는 분자나 물질을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "가교(cross-linking)"란 공유 결합의 형성을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "가교 밀도(crosslink density)"란 각각의 분자의 두 가교(Mc) 사이의 평균 분자량을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "평형 상태(equilibrium state)"란 하이드로겔이 수중 일정 조건하에 보존될 경우 하등의 질량 증감을 받지 않는 상태를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "당량(equivalent weight)"이란 (작용기의 mmol)/(물질의 g)을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "피브린 매트릭스(fibrin matrix)"란 칼슘 공급원 및 인자 XIIIa의 존재 하에 전구체 성분인 피브리노겐 및 트롬빈의 모두가 실질적으로 가교되는 과정의 생성물을 의미한다. 용어 매트릭스, 겔, 및 3차원 네트워크 또는 중합체 네트워크(polymeric network)는 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "작용화하다(functionalize)"란 작용기 또는 부분(moiety)의 부착을 가져오는 방법으로 분자를 개질하는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 분자는 해당 분자를 강한 친핵체 또는 컨쥬게이트화된 불포화 분자로 만드는 분자의 도입에 의해 작용화될 수 있다. 바람직하게는, 분자, 예를 들어 PEG는 티올, 아민, 아크릴레이트 또는 퀴논이 되도록 작용화된다. 특히, 단백질은 유리 티올을 작성하기 위해 다이설파이드 결합의 부분적인 혹은 완전한 환원에 의해 효과적으로 작용화될 수도 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "작용기(functionality)"란 분자 상의 반응성 부위의 개수를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "분기점의 작용기(functionality of the branching point)"란 분자의 하나의 지점으로부터 확대되는 팔(arm)의 수를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "융합 펩티드 또는 단백질(fusion peptide or protein)"이란 적어도 제1 도메인과 제2 도메인을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 하나의 도메인은 생활성 인자, 바람직하게는 PTH1-34, BMP 2 또는 BMP 7을 함유하고, 다른 도메인은 그의 형성 동안 혹은 형성 후에 메트릭스에 가교가능한 기질 도메인을 함유한다. 효소적 혹은 가수분해적 분해 부위는 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 존재할 수도 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "매트릭스(matrix)"란 생물학적 시스템과 연계해서 영구적으로 혹은 일시적으로 재료에 따라 임의의 조직 또는 조직의 기능을 치료, 증가 또는 교체하도록 의도된 재료를 의미한다. 상기 매트릭스는 내부에 혼입된 생활성 인자용의 전달 장치로서 및/또는 세포-내부 성장 매트릭스로서 작용할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 매트릭스는 필요한 부위에서 신체내 골격을 형성할 수 있는 액체 전구체 성분으로부터 형성된다. 용어 "매트릭스" 및 "겔"은 본 명세서에서는 동의어로 사용된다. 용어 "매트릭스" 및 "겔"이란 전구체 성분이 함께 혼합된 후 형성된 조성물을 의미한다. 이와 같이 해서, 용어 "매트릭스" 및 "겔"은 부분적으로 혹은 완전히 가교된 중합체 네트워크를 망라한다. 이들은 액체, 페이스트와 같은 반고체, 또는 고체의 형태일 수 있다.
전구체 재료의 유형에 따라, 매트릭스는 물에 용해된 것이 아니라 물에 의해 팽윤되어 있을 수 있고, 예를 들어 소정 시간 동안 신체 내에 머무르는 하이드로겔을 형성할 수 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "다작용성(multifunctional)"이란 분자당(즉, 단량체, 올리고 및 중합체) 1개 이상의 친전자성 및/또는 친핵성 작용기를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "자연적으로 생성된 전구체 성분 또는 중합체(naturally occuring precursor component or polymer)"란 자연에서 발견될 수 있는 분자를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "건강하지 않은 골 또는 건강하지 않은 골의 영역(non-healthy bone or area of non-healthy bone)"이란 골다공증, 골낭종에서의 국소 염증 또는 암에서의 종양 성장에 의해 초래된 바와 같은 구조 혹은 유전적 악화를 원인으로 하는 질환을 가진 골 혹은 골의 부분, 예를 들어 질환의 종류에 관계없이 질환 상태의 골 구조를 의미한다. 골다공증 뼈에서의 뼈 골절은 본 발명의 견지에서 골 결손인 것으로 상정된다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "골다공증(osteoporosis)"이란 골 다공도 및 골절에 대한 민감성을 증가시키는, 낮은 골 질량 및 골 조직의 구조 악화를 특징으로 하는 전신성 골격 질환을 의미한다. 골 손실은 무증상이고, 일부의 사람들은 뼈 골절을 당할 때까지 골다공증을 갖고 있는 것을 알지 못할 수 있다. 일차 골다공증과 이차 골다공증의 2가지 주된 유형의 골다공증이 알려져 있다. 일차 골다공증은 폐경기의 시작이 가속된 골 손실을 초래한 여성이 걸리는 I형 골다공증과, 노화 과정이 골밀도의 감소를 초래한 사람들이 걸리는 II형 골다공증으로 더욱 나누어진다. 이차 골다공증은 소정 유형의 약물을 사용하는 사람이나 다른 질환에 대해 부차적인 골 손실을 경험한 사람에게서 일어난다. 손목, 경추 및 둔부는 골다공증 관련 골절에 주로 민감하다. I형 골다공증의 치료가 바람직하다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "폴리에틸렌글리콜 매트릭스(polyethyleneglycol matrix)"란 작용기를 가진 적어도 2개의 전구체 폴리에틸렌글리콜 성분이 서로 자체-선택적으로 가교되어 3차원 네트워크를 형성하는 과정의 생성물을 의미한다. 이들 시스템은 예를 들어 국제 특허 공개 공보 제03/052091호 등에 공지 및 기재되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "PTH"는 PTH1-84의 인간 서열 및 특히 피브린 매트릭스에 바람직하게는 공유 결합된 경우 골형성 특성을 발휘하는 PTH의 모든 절두형, 개질형 및 대립형 버전을 포함한다. 바람직한 PTH의 절두형 버전은 PTH1-38, PTH1-34, PTH1-31 또는 PTH1-25이다. 가장 바람직한 것은 PTH1-34이다. PTH는 소 PTH 등의 기타 공급원으로부터의 PTH가 적합할 수 있지만, 바람직하게는, 인간 PTH이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "골막(periosteum)"이란 전체 골 구조를 덮고, 외부 골조직을 강화하는 혈관계를 포함하고 있는 관절 구조를 형성하는 부분들을 제외하고, 치밀한 섬유질 층을 형성하는 뼈의 외부 층을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 이용되고 있는 바와 같은 "생리적(physiological)"이란 살아있는 척추 동물에서 발견될 수 있는 바와 같은 조건을 의미한다. 특히, 생리적 조건은 온도 및 pH 등의 인체 내 조건을 의미한다. 생리적 온도란 특히 35℃ 내지 42℃의 온도 범위, 바람직하게는 37℃ 부근을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "중합체 네트워크(polymeric network)"란 실질적으로 단량체, 올리고머 또는 중합체의 모두가 그들의 이용가능한 작용기를 통한 분자간 공유결합에 의해 결합되어 하나의 거대 분자로 되는 과정의 생성물을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "강력한 친핵체(strong nucleophile)"란 극성-결합 형성 반응에서 친전자체에 전자 쌍을 공여할 수 있는 분자를 의미한다. 바람직하게는, 강력한 친핵체는 생리적 pH에서 물보다 더욱 친핵성이다. 강력한 친핵체의 예는 티올류 및 아민류이다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "합성 전구체 분자(synthetic precursor molecule)"란 자연에 존재하지 않는 분자를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "자가-선택적 반응(self-selective reaction)"이란 조성물의 제1 전구체 성분이 혼합물에 혹은 반응 부위에서 존재하는 다른 화합물보다 조성물의 제2 전구체 성분과 더욱 신속하게 반응하거나 그 역인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 친핵체는 다른 생물학적 화합물보다 오히려 친전자체에 우선적으로 결합하고, 친전자체는 강력한 친핵체에 우선적으로 결합한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "팽윤(swelling)"이란 매트릭스에 의한 수분의 흡수에 의한 부피 및 질량의 증가를 의미한다. 용어 "수분의 흡수" 및 "팽윤"은 본 출원 전체에 있어 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "보충 매트릭스(supplemented matrix)"란 생활성 인자, 임의적으로 융합 펩티드가 그 안에 방출가능하게 혼입되어 있는 매트릭스를 의미한다. 상기 생활성 인자는 공유 또는 비공유 상호 작용을 통해 혼입된다.
I. 보충 매트릭스
A. 매트릭스 재료
매트릭스는, 세포의 매트릭스 속으로 내부 성장 또는 이동을 허용하는 충분한 중합체간 간격을 가진 중합체 네트워크를 형성하도록, 전구체 분자를 중합체 네트워크에 이온적으로, 공유적으로 혹은 이들의 조합에 의해 가교시키고/시키거나, 1개 이상의 중합체 재료, 즉, 매트릭스를 팽윤시킴으로써 형성된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 매트릭스는 단백질, 바람직하게는 매트릭스가 이식되게 될 환자에 자연적으로 존재하는 단백질로 형성된다. 기타 단백질, 예를 들어 콜라겐 및 젤라틴 등으로 이루어진 매트릭스도 사용될 수 있지만, 특히 바람직한 매트릭스 단백질은 피브린이다. 다당류 및 글라이코단백질도 매트릭스를 형성하는 데 이용될 수 있다. 또한, 이온 혹은 공유 결합에 의해 가교된 합성 중합체도 사용가능하다.
피브린 매트릭스
피브린은 몇몇 생물의학적 용도에 대해 보고된 바 있는 천연 재료이다. 피브린은 미국 특허 제6,331,422호(Hubbell et al.)에 있어서 세포 내부 성장 매트릭스용 재료로서 기재되어 있다. 피브린 겔은 상처 치유에 있어서의 그의 자연적인 역할 및 많은 조직에 결합하는 그의 능력 때문에 실란트(sealant)로서 이용되어 왔다. 일부의 특정 용도로는 혈관 이식편 부착, 심장 판막 부착, 골절 및 인장 복원시의 뼈 위치결정을 위한 실란트로서의 이용을 포함한다. 부가적으로, 이들 겔은 약물 전달 장치로서 그리고 신경세포 재생용으로 사용되어 왔다. 피브린이 조직 재생 및 세포 내부 성장을 위한 고체 지지체를 제공하지만, 이들 과정을 직접 향상시키는 단량체에 있어서 다소간의 활성 서열이 있다.
피브리노겐이 피브린으로 중합되는 과정도 특징화되어 있다. 최초에, 프로테아제는 두 대칭 부위에서 이량체 피브리노겐 분자를 분열시킨다. 트롬빈, 펩티다제 및 프로테아제 III을 비롯한, 피브리노겐을 분열시킬 수 있는 수개의 가능한 프로테아제가 있고, 이들 각각은 상이한 부위에서 단백질을 절단한다. 일단 피브리노겐이 분열되면, 피브리노겐 단량체가 함께 모여 비공유적 가교된 중합체 겔을 형성하는 자가-중합 반응 공정이 일어난다. 프로테아제 분열이 일어난 후 결합 부위가 노출되기 때문에 이 자가-조립이 일어난다. 이들이 일단 노출되면, 분자의 중앙에 있는 이들 결합 부위가, 펩티드 사슬의 단부에 존재하는 피브리노겐 사슬상의 다른 부위에 결합될 수 있다. 이와 같이 해서, 중합체 네트워크가 형성된다. 인자 XIII로부터 트롬빈 단백질 분해에 의해 활성화된 인자 XIIIa, 트랜스글루타미나제는 다음에 상기 중합체 네트워크를 공유 가교시킬 수 있다. 다른 트랜스글루타미나제가 존재하여, 또한, 피브린 네트워크에 대한 공유 가교 및 이식에 관련될 수 있다.
가교된 피브린 겔이 일단 형성되면, 후속의 분해가 치밀하게 제어된다. 피브린의 분해를 제어할 때 중요 분자의 하나는 α2-플라스민 저해제이다. 이 분자는 인자 XIIIa의 작용을 통해 피브린의 α사슬에 가교함으로써 작용한다. 그 자체가 겔에 부착됨으로써, 고농도의 저해제가 겔에 편재될 수 있다. 다음에, 이 저해제는 플라스미노겐의 피브린에의 결합을 방지하여 플라스민을 불활성화시키는 작용을 한다. 상기 α2-플라스민 저해제는 글루타민 기질을 함유한다. 정확한 서열은 NQEQVSPL(서열 번호: 2)로서 동정되어 있고, 제1 글루타민이 가교용의 활성 아미노산이다.
인자 XIIIa 기질 서열 및 생활성 펩티드 서열을 포함하고 있는 바이(bi)-도메인 펩티드는 피브린 매트릭스 속으로 가교될 수 있고, 이 생활성 펩티드가 시험관내에서 그의 세포 활성을 유지하는 것은 입증되어 있다.
증상 및 피브린 매트릭스에 혼합된 물질에 따라, 트롬빈의 농도는 다양할 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 피브린 매트릭스는 피브리노겐을 5 내지 65 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖), 더욱 바람직하게는 15 내지 60 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖), 더더욱 바람직하게는 25 내지 55 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖), 가장 바람직하게는 30 내지 45 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖)의 범위로 함유한다. 트롬빈은 0.5 내지 5 I.U./(피브린 매트릭스 ㎖)의 범위로, 더욱 바람직하게는 1.25 내지 3.25 I.U./(피브린 매트릭스 ㎖), 가장 바람직하게는 1.5 내지 2.5 I.U./(피브린 매트릭스 ㎖)의 범위로 존재한다. 부가적으로, 칼슘 이온 공급원은 피브린 매트릭스의 형성을 돕는다. 칼슘 이온 공급원은 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖), 더욱 바람직하게는 2 내지 3.5 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖), 가장 바람직하게는 2.5 내지 3 ㎎/(피브린 매트릭스 ㎖)의 농도의 CaCl2 * 2H2O이다. I.U.는 트롬빈의 하나의 국제단위(international unit)를 의미하며, 인간 트롬빈의 제1 국제표준 0.0853 ㎎에 함유된 활성으로서 정의된다. 이들 농도 범위로 존재하는 재료로부터 형성된 보충 피브린 매트릭스는 바람직하게는 골낭종 및 골 종양과 같이 조영제의 첨가를 필요로 하지 않는 모든 증상에 사용된다.
1종 이상의 조영제가 매트릭스에 존재할 경우, 피브린 매트릭스 중의 트롬빈의 양은 일반적으로 조영제의 부재시 동일한 피브린 매트릭스 중의 트롬빈의 양보다 크다. 조영제는 보충 매트릭스가 골다공증 뼈에 있어서의 골절을 예방하기 위한 예방 치료로서 사용될 경우 첨가, 즉, 경추 또는 대퇴골 경부 속으로 주입되는 것이 바람직하다. 이들 경우에 있어서, 피브린 매트릭스는 트롬빈을 전형적으로 트롬빈 7.5 내지 125 I.U./(피브린 매트릭스 ㎖), 바람직하게는 트롬빈 25 내지 50 I.U./(피브린 매트릭스 ㎖), 가장 바람직하게는 트롬빈 35 내지 40 I.U./(피브린 매트릭스 ㎖)의 농도 범위로 함유한다.
피브린 매트릭스를 형성하는 전구체 용액
바람직하게는 2종의 전구체 용액을 사용해서 피브린 매트릭스를 형성한다. 제1 전구체 용액은 피브리노겐을 함유하고, 바람직하게는 피브리노겐 10 내지 130 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 피브리노겐 30 내지 120 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 더더욱 바람직하게는 피브리노겐 50 내지 110 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 피브리노겐 60 내지 90 ㎎/(전구체 용액 ㎖)를 함유한다. 매트릭스를 형성하기 위해 트롬빈이 첨가될 필요가 있는 경우, 그리고, 그때 증상이 1개 이상의 조영제를 필요로 할 경우, 제2 전구체 용액은 트롬빈을 함유하고, 바람직하게는 트롬빈 15 내지 250 I.U./(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 트롬빈 50 내지 100 I.U./(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 트롬빈 70 내지 80 I.U./(전구체 용액 ㎖)를 함유한다. 부가적으로, 칼슘 이온 공급원이 전구체 용액의 적어도 하나에 존재할 수도 있다. 상기 칼슘 이온 공급원은 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 4 내지 7 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 5 내지 6 ㎎/(전구체 용액 ㎖)의 농도의 CaCl2*2H2O인 것이 바람직하다. 임의적으로, 매트릭스 형성을 촉매하는 능력을 가진 효소, 예를 들어 인자 XIIIa가 적어도 하나의 전구체 용액에 첨가된다. 바람직하게는 인자 XIIIa는 0.5 내지 100 I.U./(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 1 내지 60 I.U./(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 1 내지 10 I.U./(전구체 용액 ㎖)의 농도로 존재한다.
조영제의 존재가 불필요한 경우, 피브린 매트릭스는 바람직하게는 2종의 전구체 용액으로부터 형성되는 것이 바람직하다. 제1 전구체 용액은 전형적으로 피브리노겐을, 피브리노겐 10 내지 130 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 피브리노겐 30 내지 120 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 더더욱 바람직하게는 피브리노겐 50 내지 110 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 피브리노겐 60 내지 90 ㎎/(전구체 용액 ㎖)의 농도로 함유한다. 매트릭스를 형성하기 위해 트롬빈이 첨가될 필요가 있는 경우, 제2 전구체 용액은 트롬빈을, 바람직하게는 트롬빈 1 내지 10 I.U./(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 트롬빈 2.5 내지 6.5 I.U./(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 트롬빈 3 내지 5 I.U./(전구체 용액 ㎖)의 농도로 함유한다. 부가적으로, 칼슘 이온 공급원이 전구체 용액 중의 하나 중에 있다. 칼슘 이온 공급원은 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 4 내지 7 ㎎/(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 5 내지 6 ㎎/(전구체 용액 ㎖)의 농도의 CaCl2*2H2O이다. 임의적으로, 인자 XIIIa와 같은 매트릭스 형성을 촉매하는 능력을 가진 효소는 전구체 용액에 첨가된다. 바람직하게는, 인자 XIIIa는 0.5 내지 100 I.U./(전구체 용액 ㎖), 더욱 바람직하게는 1 내지 60 I.U./(전구체 용액 ㎖), 가장 바람직하게는 1 내지 10 I.U./(전구체 용액 ㎖)의 농도 범위로 존재한다.
합성 매트릭스 및 전구체 용액
신체에 적용하기 위한 합성 매트릭스를 형성하는 가교반응으로는 (i) 문헌[Hern et al., J. Biomed. Mater. Res. 39:266-276 (1998)]에 기재된 바와 같이 불포화 이중결합을 포함하는 2개 이상의 전구체 간의 자유라디칼 중합, (ii) 미국 특허 제5,874,500호(Rhee et al.)에 기재된 바와 같이 예를 들어 숙신이미딜기를 포함하는 전구체와 아민기를 포함하는 전구체 간의 반응과 같은 친핵성 치환 반응, (iii) 축합 및 첨가 반응 및 (iv) 강력한 친핵체와 컨쥬게이트화된 불포화기 또는 결합(강력한 친전자체로서)간의 마이클 유형 첨가 반응(Michael type addition reaction)을 들 수 있다. 친핵성 기로서 티올기 또는 아민기를 가진 전구체 분자와 친전자성 기로서 아크릴레이트 또는 비닐설폰기를 포함하는 전구체 분자 간의 반응이 특히 바람직하다. 가장 바람직한 친핵성 기는 티올기이다. 마이클 유형 첨가 반응은 국제 특허 공개 공보 제00/44808호(Hubbell et al.)에 개시되어 있다. 마이클 유형 첨가 반응은 자체-선택적인 방식으로, 심지어 민감성 생물학적 물질의 존재 중에서 생리적 조건하에, 적어도 제1 및 제2 전구체 성분의 적소 가교를 가능하게 한다. 전구체 성분 중의 하나가 적어도 2의 작용기를 갖고, 다른 전구체의 적어도 하나가 2 보다 많은 작용기를 갖는 경우, 상기 시스템은 자가-선택적 반응해서 가교된 3차원 매트릭스를 형성한다.
바람직하게는 상기 컨쥬게이트화된 불포화기 또는 컨쥬게이트화된 불포화 결합은 아크릴레이트류, 비닐설폰류, 메타크릴레이트류, 아크릴아마이드류, 메타크릴아마이드류, 아크릴로니트릴류, 비닐설폰류, 2- 또는 A-비닐피리디늄, 말레이미드 또는 퀴논류이다.
상기 친핵성 기는 바람직하게는 티올기, 아미노기 또는 하이드록실기이다. 티올기는 실질적으로 비프로톤화된 아민기보다 실질적으로 더욱 반응성이다. pH는 이것을 고려할 때 중요하며, 즉, 탈프로톤화된 티올은 프로톤화된 티올보다 실질적으로 더욱 반응성이다. 따라서, 2개의 전구체 성분을 매트릭스로 전환시키기 위해 아크릴레이트 또는 퀴논 등의 컨쥬게이트화된 불포화기와 티올과의 첨가 반응은, 대략 8의 pH에서 가장 신속하게 자체-선택적으로 최선으로 수행될 경우가 있다. 대략 8의 pH에서, 대상으로 하는 티올의 대부분은 탈프로톤화되고(따라서 더욱 반응성이 되고), 대상으로 하는 아민의 대부분은 여전히 프로톤화되어 있다(따라서, 반응성이 적다). 티올이 제1 전구체 분자로서 사용된 경우, 아민에 대해서 티올을 위한 그의 반응성에 있어서 선택성인 컨쥬게이트 구조가 고도로 바람직하다.
적절한 제1 및 제2 전구체 분자로는 단백질, 펩티드, 폴리옥시알킬렌, 폴리(비닐 알코올), 폴리(에틸렌-코-비닐 알코올), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-아크릴산), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(에틸렌-코-비닐 피롤리돈), 폴리(말레산), 폴리(에틸렌-코-말레산), 폴리(아크릴아마이드) 및 폴리(에틸렌 옥사이드)-코-폴리(프로필렌 옥사이드) 블록 공중합체를 들 수 있다. 특히 바람직한 전구체 분자는 폴리에틸렌 글리콜이다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 간편한 빌딩 블록을 제공한다. 사람들은 직쇄(2개의 단부를 갖는 것을 의미함) 또는 분기쇄(2개보다 많은 단부를 의미함) PEG를 용이하게 구입하거나 합성할 수 있고, 다음에, 그 PEG 말단기를 작용화시켜 티올 등의 강력한 친핵체, 또는 아크릴레이트 또는 비닐설폰 등의 컨쥬게이트화된 구조를 도입할 수 있다. 이들 성분이 약 염기성 환경에서 서로 또는 대응하는 성분과 함께 혼합될 경우, 매트릭스는 제1 전구체 성분과 제2 전구체 성분간의 반응에 의해 형성될 것이다. PEG 성분은 PEG가 아닌 성분과 반응될 수 있고, 어느 한쪽의 성분의 분자량 또는 친수성을 제어해서, 얻어지는 매트릭스의 기계적 특성, 투과성 및 수분함량을 조정할 수 있다.
매트릭스, 특히 생체내에서 분해될 것이 요망되는 매트릭스의 형성에 있어서, 펩티드는 매우 간편한 빌딩 블록을 제공한다. 2개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드를 합성하는 것은 직접적이며, 이 성분은 이어서 친핵성 기를 가진 제1 전구체 성분으로서 용이하게 제공될 수 있다. 예를 들어, 2개의 유리 시스테인 잔기를 가진 펩티드는 생리적 pH 또는 다소 높은 pH(예를 들어, 8 내지 9)에서 PEG 트라이-비닐설폰(비닐설폰을 가진 팔을 3개 구비한 PEG)과 혼합된 경우 매트릭스를 용이하게 형성할 것이다. 또, 겔화는 훨씬 높은 pH에서, 하지만, 자체-선택성의 잠재적인 희생 상태에서 양호하게 진행될 수 있다. 2개의 액체 전구체 성분이 함께 혼합된 경우, 이들은 잠시 동안 반응하여, 접속 링크로서의 펩티드와 함께 PEG 사슬의 네트워크로 이루어진 동시에 상기 네트워크의 마디를 갖고 있는 탄성 겔을 형성한다. 상기 펩티드는, 피브린 매트릭스 등에서 단백질계 네트워크에서 행해지는 바와 같이 팽윤되어 세포에 의해 분해될 수 있는 능력을 가진 네트워크를 만들기 위해, 프로테아제 기질로서 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 도메인 내의 서열은 세포 이동과 관련된 효소용의 기질(예를 들어, 콜라게나제, 플라스민, 금속단백분해효소(MMP) 또는 엘라스타제 등의 효소용의 기질)이지만, 단, 적절한 도메인은 이들 서열로 한정되지는 않는다. 하나의 특히 유용한 서열은 효소 플라스민용의 기질이다. 겔의 분해 특성은 가교 마디로서 작용하는 펩티드의 상세를 변경함으로써 조종될 수 있다. 플라스민이 아니라 콜라게나제에 의해, 또는 콜라게나제가 아니라 플라스민에 의해 분해가능한 겔을 만들 수 있다. 또한, 효소 반응의 Km 또는 kcat, 또는 이들 양쪽 모두를 변경하도록, 간단히 아미노산 서열을 변화시킴으로써 이러한 효소에 대한 반응에 있어서 겔이 신속하게 혹은 느리게 분해되게끔 하는 것이 가능하다. 이와 같이 해서, 세포의 정상 재형성 특성에 의해 재형성할 수 있는 점에 있어서 생체모방(biomimetic)인 매트릭스를 작성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 이러한 연구는 중요한 프로테아제 플라스민에 대한 기질 부위를 나타내고 있다. 펩티드와 함께 PEG의 겔화는 자체-선택적이다.
임의적으로, 생체 기능성 제제(biofunctional agent)가 매트릭스 속에 혼입되어 다른 종(예를 들어, 조직 표면)에 대한 화학결합을 제공할 수 있다. 매트릭스 속에 프로테아제 기질을 혼입시키는 것은 매트릭스가 PEG 비닐설폰으로 형성된 경우 중요하다. PEG 아크릴레이트와 PEG 티올의 반응으로부터 형성된 메트릭스 이외에, PEG 비닐설폰 및 PEG 티올로부터 형성된 매트릭스는 가수분해적으로 분해가능한 결합을 함유하지 않는다. 따라서, 프로테아제 기질의 혼입에 의해 매트릭스가 신체에서 분해되는 것이 가능하다.
상기 합성 매트릭스는 조작상 형성하기에 간단하다. 2개의 액체 전구체가 혼합되고, 이중 하나의 전구체는 친핵성 기를 가진 전구체 분자를 함유하고, 다른 전구체 분자는 친전자성 기를 함유한다. 생리 식염수는 용매로서 기능할 수 있다. 최소 열이 반응에 의해 발생된다. 따라서, 겔화는 바람직스럽지 못한 독성 없이 조직과 직접 접촉해서 생체내 혹은 시험관내에서 수행될 수 있다. 이와 같이 해서, PEG 이외의 중합체는 그들의 사이드 기 상에 텔레켈리컬리하게(telechelically) 개질되거나 혹은 개질되어 사용될 수 있다.
대부분의 치유 징후에 대해서는, 매트릭스의 적합화된 분해속도와 조합해서 세포 내부 성장 또는 세포의 매트릭스 속으로의 이동 속도는 전체 치유 반응에 대해 중요하다. 세포에 의해 침식되게 될 가수분해적으로 비분해성 매트릭스의 잠재성은 주로 네트워크 밀도의 함수이다. 분기점 혹은 마디 사이에 존재하는 공간이 세포의 크기와 관련해서 너무 작은 경우, 또는 매트릭스 내에 더 많은 공간의 형성을 초래하는 매트릭스의 분해 속도가 너무 느린 경우, 매우 제한된 치유 반응이 관찰될 것이다. 예를 들어, 신체의 손상에 반응해서 형성되는 피브린 매트릭스와 같이 자연에서 발견되는 치유 매트릭스는 세포에 의해 매우 용이하게 침입될 수 있는 매우 느슨한 네트워크로 구성되어 있는 것이 공지되어 있다. 침투는 피브린 네트워크의 일체부인 세포 유착용의 리간드에 의해 촉진된다.
폴리에틸렌 글리콜과 같이 합성 친수성 전구체 분자로 제조된 매트릭스는 상기 중합체 네트워크의 형성 후에 수성 환경에서 팽윤된다. 신체 내의 매트릭스의 적소 형성 동안 충분히 짧은 겔화 시간(pH 7 내지 8, 온도 36 내지 38℃ 범위에서 3분 내지 10분) 및 정량 반응을 달성하기 위해서, 전구체 분자의 출발 농도는 충분히 높을 필요가 있다. 이러한 조건 하에서, 네트워크 형성 후의 팽윤은 일어나지 않을 것이고, 필요한 출발 농도는 매트릭스가 수성 환경에서 분해되지 않을 경우 세포 침투를 하기에 매트릭스가 너무 치밀하게 되어 버린다. 따라서, 중합체 네트워크의 팽윤은 분기점 사이의 공간을 확대하여 넓히기 위해 중요하다.
전구체 분자의 출발 농도에 관계없이, SH기를 가진 펩티드 및 네 팔(four arm) PEG 비닐설폰 등의 동일한 합성 전구체 분자로부터 만들어진 하이드로겔은 평형 상태에서 동일 수분함량까지 팽윤된다. 이것은 전구체 분자의 출발 농도가 높을수록, 그의 평형 상태에 도달한 경우 하이드로겔의 말기 부피가 높아지는 것을 의미한다. 신체에서 이용가능한 공간이 너무 작아 충분한 팽윤이 불가능한 경우, 특히 전구체 성분으로부터 형성된 연쇄가 가수분해적으로 분해가능한 경우, 세포 침투 및 치유 반응이 감소할 것이다. 그 결과, 신체에 적용하기 위한 두 모순적인 요건 간의 최적 조건을 알아낼 필요가 있다. 양호한 세포 침투 및 후속의 치유 반응은 분자량이 실질적으로 유사한 적어도 3개의 팔을 가진 3작용성 분기 중합체와 적어도 2작용성 분자인 제2 전구체 분자의 반응으로부터 형성된 3차원 중합체 네트워크에 의해 관찰된 바 있다. 제1 및 제2 전구체 분자의 작용기의 당량비는 0.9 내지 1.1이다. 제1 전구체 분자의 팔의 분자량, 제2 전구체 분자의 분자량 및 분기점의 작용기는 얻어진 중합체 네트워크의 수분 함량이 수분 흡수 완료후 중합체 네트워크의 총 중량의 평형 중량% 내지 92 중량%가 되도록 선택된다. 바람직하게는, 수분 함량은 수분 흡수 완료후 중합체 네트워크와 물의 총 중량의 93 중량% 내지 95 중량%이다. 수분 흡수의 완료는 평형 농도에 도달한 경우 또는 매트릭스 내의 이용가능한 공간이 더욱 부피의 증가를 허용하지 않을 경우 달성될 수 있다. 따라서, 전구체 성분의 출발 농도를 가능한 한 낮게 선택하는 것이 바람직하다. 이것은 팽윤성 매트릭스, 특히 세포-매개 분해를 받지만 중합체 네트워크에 있어서 가수분해적으로 분해가능한 연쇄를 함유하지 않는 매트릭스에 대해서도 마찬가지이다.
가수분해적으로 비분해성 겔에 대한 겔화 시간과 낮은 출발 농도 간의 균형은 전구체 분자의 구조에 의거해서 최적화될 필요가 있다. 따라서, 특히, 제1 전구체 분자의 팔들의 분자량, 제2 전구체 분자의 분자량 및 분기도, 즉, 분기점의 작용기는 조절될 필요가 있다. 실제의 반응 기전은 이 상호 작용에 대한 최소 영향을 가진다.
제1 전구체 분자가 각 팔의 단부에 작용기를 가진 세 팔 혹은 네 팔 중합체이고, 제2 전구체 분자가 직쇄형 2작용성 분자, 바람직하게는 적어도 2개의 시스테인기를 함유하는 펩티드인 경우, 제1 전구체 분자의 팔들의 분자량 및 제2 전구체 분자의 분자량은, 네트워크 형성 후의 분기점간의 링크가 10 내지 13 kDa(상기 링크가 분기쇄가 아닌 직쇄인 조건하), 바람직하게는 11 내지 12 kDa 사이의 범위의 분자량을 가지도록 선택되는 것이 바람직하다. 이것은 제1 및 제2 전구체 분자의 합계의 출발 농도가 용액 중 제1 및 제2 전구체 분자의 총 중량(네트워크 형성 전)의 8 내지 12 중량%, 바람직하게는 9 내지 10 중량%의 범위로 되는 것을 가능하게 한다. 제1 전구체 성분의 분기도가 8로 증가하고, 제2 전구체 분자가 여전히 직쇄의 이작용성 분자인 경우, 분기점 간의 링크의 분자량은 바람직하게는 18 내지 24 kDa의 분자량까지 증가된다. 제2 전구체 분자의 분기도가 직쇄에서부터 세 팔 또는 네 팔의 전구체 성분으로 증가할 경우, 이에 따라, 분자량, 즉, 상기 링크의 길이가 증가한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 제1 전구체 분자로서 3작용성의 세 팔 15kD 중합체를 포함하는 조성물이 선택되고, 즉, 각 팔의 분자량이 5kD이고 제2 전구체 분자로서 2작용성의 직쇄 분자의 분자량은 0.5 내지 1.5kD, 더욱 바람직하게는 1kD 부근이다. 바람직하게는, 제1 및 제2 전구체 성분은 폴리에틸렌 글리콜이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 제1 전구체 성분으로는 작용기로서 컨쥬게이트화된 불포화기 또는 결합을 포함하고, 가장 바람직하게는 아크릴레이트 또는 비닐설폰이며, 제2 전구체 분자의 작용기로는 친핵성 기를 들 수 있고, 바람직하게는 티올기 또는 아미노기이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 제1 전구체 분자는 각 팔의 말단에 작용기를 가진 네 팔의 15 내지 20kD 중합체, 바람직하게는 15kD 중합체이고, 제2 전구체 분자는 3 내지 4 kDa 범위, 바람직하게는 3.4 kDa의 분자량의 2작용성 직쇄 분자이다. 바람직하게는, 제1 전구체 분자는 아크릴레이트기를 가진 폴리에틸렌 글리콜이고, 제2 전구체 분자는 티올기를 가진 폴리에틸렌글리콜이다. 상기 두 바람직한 실시형태 모두에 있어서, 제1 및 제2 전구체 분자의 합계의 출발 농도는, 10 분 이하의 겔화 시간을 얻기 위해서, 제1 및 제2 전구체 분자와 물(중합체 네트워크의 형성 전)의 총 중량의 8 내지 11 중량%, 바람직하게는 9 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 5 내지 8 중량%의 범위이다. 이들 조성물은 혼합 후 pH 8.0, 37℃에서 약 3 내지 10분의 겔화 시간을 가진다.
상기 매트릭스가 예를 들어 아크릴레이트와 티올 간의 바람직한 반응에 의해 형성된 가수분해적으로 분해가능한 연쇄를 함유할 경우, 세포 침투에 대한 네트워크 밀도는 특히 시작에 있어서 중요하지만, 수성 환경에서, 상기 연쇄는 가수분해되어, 네트워크가 느슨해지게 됨에 따라 세포가 침투가능하게 된다. 중합체 네트워크의 전체적인 분기도의 증가에 따라, 연결 고리의 분자량, 즉, 링크의 길이가 증가할 것임에 틀림없다.
B. 세포 부착 부위
세포는 세포 표면에서 단백질-단백질, 단백질-올리고당 및 단백질-다당류 상호작용을 통해서 그들의 환경과 상호작용한다. 세포외 매트릭스 단백질은 세포에 생활성 신호의 호스트를 제공한다. 이 치밀한 네트워크는 세포를 지지하는 데 필요로 되고, 매트릭스 내의 많은 단백질이 세포 유착, 확산, 이동 및 분화를 제어하는 것으로 밝혀졌다. 특히 활성인 것으로 밝혀진 특정 단백질의 일부로는 라미닌, 비트로넥틴, 섬유결합소, 피브린, 피브리노겐 및 콜라겐을 포함한다. 라미닌의 많은 연구가 행해져 있고, 라미닌이 시험관내에서의 신경 세포 및 체내 신경의 발전 및 전개에 있어서뿐만 아니라 혈관형성에 있어서 중추 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 세포 수용체와 직접 상호작용하여 유착, 확산 혹은 신호 전달을 일으키는 특정 서열의 몇몇은 동정되어 있다.
대형의 멀티도메인 단백질인 라미닌은 몇몇 수용체-결합 도메인을 가진 3개의 사슬로 이루어진 것으로 밝혀졌다. 이들 수용체-결합 도메인으로는 라미닌 B1 사슬의 YIGSR(서열 번호: 1) 서열, 라미닌 A 사슬의 LRGDN(서열 번호: 3) 및 라미닌 B1 사슬의 PDGSR(서열 번호: 4)을 들 수 있다. 세포에 대한 몇몇 다른 인식 서열이 동정되어 있다. 이들로는 라미닌 A 사슬의 IKVAV(서열 번호: 5) 및 라미닌 B2 사슬의 서열 RNIAEIIKDI(서열 번호: 6)를 들 수 있다. 특히 바람직하게는 섬유결합소로부터의 RGD 서열이다.
또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 세포 유착용의 펩티드 부위는 매트릭스 속에, 즉, 세포의 표면상의 유착-촉진 수용체에 결합하는 펩티드 내에 혼입된다. 이러한 유착-촉진 펩티드는 상기 설명한 것을 포함한다. 특히 바람직하게는, 섬유결합소로부터의 RGD 서열, 라미닌으로부터의 YIGSR(서열 번호: 1) 서열이다. 세포 부착 부위의 혼입은 합성 매트릭스와 함께 특히 바람직하다. 그러나, 세포 부착 부위도 천연 매트릭스의 일부와 함께 포함될 수도 있다. 상기 혼입은, 예를 들어 PEG 아크릴레이트, PEG 아크릴아마이드 또는 PEG 비닐설폰과 같이 컨쥬게이트화된 불포화기를 포함하는 전구체 분자와 시스테인-함유 세포 부착 펩티드를 혼합함으로써 얻을 수 있다. 이 단계는 티올-함유 전구체 성분 등과 같이 친핵성 기를 포함하는 전구체 성분의 나머지와 혼합하기 전에 짧게, 예를 들어 수분에 일어날 수 있다. 세포 유착 부위가 시스테인을 포함하지 않을 경우, 그것을 포함하도록 화학적으로 합성될 수 있다. 이 단계 동안, 유착-촉진 펩티드는 컨쥬게이트된 불포화기에 의해 다기능화된 전구체의 하나의 말단에 혼입되고, 나머지 멀티-티올이 이 시스템에 첨가되면 가교 네트워크가 형성될 것이다.
매트릭스에 공유 결합된 유착 부위의 농도는 세포 침투 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 주어진 하이드로겔에 대해서, RGD 농도 범위는 최적 방법으로 세포 내부 성장 및 세포 이동을 뒷받침하면서 매트릭스에 혼입될 수 있다. RGD와 같은 유착 부위의 최적 농도 범위는 특히 수분 흡수의 종결 후 평형 농도 내지 92 중량%의 수분 함량을 가진 매트릭스에 대해서 0.04 내지 0.05 mM, 더욱 바람직하게는 0.05 mM이다.
바람직한 실시형태는 생활성 인자, 프로테아제 분해 부위 GCRPQGIWGQDRC(서열 번호: 7)와 가교된 약 20,000 Da의 분자량을 가진 네 팔 폴리에틸렌 글리콜 및 0.050 mM RGD를 함유하는 보충 매트릭스이며; 이 매트릭스는 특히 양호한 세포 내부 성장 결과 및 골 결손의 치유를 나타낸다, 바람직하게는, 매트릭스는 해당 매트릭스에 공유 결합된 PTH1-34를 함유한다. PEG 및 펩티드의 출발 농도는 상기 분자 및 물의 총 중량(팽윤 전)의 10 중량% 이하이다. 겔은 유용한 일관성을 가지며, 골모세포 및 전구체 세포가 매트릭스를 용이하게 침투할 수 있다.
C. 생활성 인자
생활성 인자는 건강하지 않은 골, 예를 들어 골다공증이나 골낭종 등의 특정 골 결손 영역의 치료를 위한 활성 성분이다. 놀랍게도, 특정 생활성 인자, 즉, PTH 및 BMP, 특히 PTH1-34, BMP 2 및 BMP 7이 골낭종 영역 및 골 종양 영역뿐만 아니라 골다공증 뼈 및 골 영역의 국소 치료에 적합한 것으로 판명되어 있다. 과거에, 이들 골 인자가 전신 치료를 위해 조사된 바 있다. 그러나, 골 결손의 치료에 관한 한, 국소 적용된 제제의 유용한 활성 성분일 수 있는 것은 제안되어 있지 않았다. 이들 생활성 인자가 주입성 매트릭스 제제 속으로 혼입되고 건강하지 않은 골의 특정 골 결손 영역 속으로 주입된 경우, 이들은 그 골 영역에 있어서 골밀도를 증가시키는 것으로 판명되어 있다. 바람직하게는, 상기 생활성 인자는 전술한 매트릭스에 공유적으로 부착되므로, 생활성 인자의 제어된 방출을 확실하게 한다. 생활성 인자는 제1 도메인에 생활성 인자를 제2 도메인에 공유결합성 가교 기질 도메인을 포함하는 융합 펩티드의 형태일 수 있다. 임의적으로, 분해 부위는 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 위치되어 있다.
a. PTH
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "PTH"는 PTH1-84의 인간 서열, 및 생분해성 천연 또는 합성 매트릭스에 공유 결합된 경우 골형성 특성을 발휘하는 PTH의 모든 절두형, 개질형 및 대립형 버전을 포함한다. PTH의 바람직한 절두형 버전은 PTH1-38, PTH1-34, PTH1-31, PTH1-28 또는 PTH1-25이고, PTH1-34가 가장 바람직하다. PTH는 소 PTH 등의 기타 공급원으로부터의 PTH가 적합할 수 있지만, 바람직하게는, 인간 PTH이다.
b. BMP
골 형태형성 단백질은 공지된 BMP의 어느 것이나, 골 형성 특성을 발휘하는 BMP의 어떠한 개질형 혹은 대립형 버전일 수 있다. 특히 BMP 2 및 BMP 7이 바람직하다.
BMP 2
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "BMP 2"는 BMP 21-396의 인간 서열, 및 생분해성 천연 또는 합성 매트릭스에 공유 결합된 경우 유사한 생활성을 발휘하는 BMP 2의 모든 절두형, 개질형 및 대립형 버전을 포함한다. BMP 2의 바람직한 절두형 버전은 BMP 2283-396이다. BMP 2는 인간, 마우스 또는 래트로부터의 BMP 2의 아미노산 서열의 100% 동일성을 감안해서 다른 공급원으로부터, 특히 마우스 또는 래트로부터의 BMP 2가 적합할 수 있지만, 바람직하게는, 인간 BMP 2이다.
BMP 7
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "BMP 7"은 BMP 71-431의 인간 서열, 및 생분해성 천연 또는 합성 매트릭스에 공유 결합된 경우 유사한 생활성을 발휘하는 BMP 7의 모든 절두형, 개질형 및 대립형 버전을 포함한다. BMP 7의 바람직한 절두형 버전은 BMP 7293-431이다. BMP 7은 인간 및 마우스로부터의 BMP 7의 아미노산 서열의 98% 동일성을 감안해서 다른 공급원으로부터, 특히 마우스로부터의 BMP 7이 적합할 수 있지만, 바람직하게는, 인간 BMP 7이다.
c. 융합 펩티드
가교 기질 도메인
융합 펩티드는 적어도 2개의 도메인, 즉, 생활성 인자를 포함하는 제1 도메인 및 그의 형성 전, 형성 동안 또는 형성 후 매트릭스에 가교가능한 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인을 포함한다. 상기 기질 도메인은 효소용의 도메인, 바람직하게는 트랜스글루타미나제("트랜스글루타미나제 기질 도메인")용의 기질 도메인, 더욱 바람직하게는 조직 트랜스글루타미나제("조직 트랜스글루타미나제 기질 도메인")용의 기질 도메인, 가장 바람직하게는 인자 XIIIa("인자 XIIIa 기질 도메인")용의 기질 도메인이다.
트랜스글루타미나제는 단백질 결합된 글루타미닐 잔기의 감마-카복사미드기와 리신 잔기의 ε-아미노기와의 아실-전이 반응을 촉매하고, 그 결과 N-ε-(γ-글루타밀)리신 아이소펩티드 곁사슬 다리의 형성을 초래한다. 상기 융합 펩티드의 아미노산 서열은 효소적 또는 가수분해적 분열 부위를 더 포함하도록 설계될 수 있고, 따라서, 생활성 인자는 일차 구조로 거의 또는 전혀 개질되지 않고 방출될 수 있다. 트랜스글루타미나제 기질 도메인, 특히, 인자 XIIIa 기질 도메인은 융합 펩티드를 피브린 매트릭스에 연결할뿐만 아니라, 출원중인 일차 아미노산이 합성 분자에 존재할 경우에 있어서 합성 매트릭스에도 연결하는 데 적합하다. 피브린 매트릭스와 함께 사용된 경우, 융합 펩티드 내의 분해 부위는 바람직하게는 효소적으로 분해되므로, PTH의 방출은 국소화 단백질 분해 등의 세포 특이 프로세스에 의해 제어된다.
상기 가교 기질 도메인은 GAKDV(서열 번호: 8), KKKK(서열 번호: 9), YRGDTIGEGQQHHLGG(서열 번호: 10) 또는 NQEQVSPL(서열 번호: 2)을 포함할 수 있다.
가장 바람직한 인자 XIIIa 기질 도메인은 NQEQVSPL(서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 가지며, 본 명세서에서는 "TG" 및 TG-PTH로도 칭한다.
PTH 융합 펩티드는 재조합적으로 혹은 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. PTH1-34 융합 펩티드는 바람직하게는 화학 합성에 의해 합성된다. BMP 융합 펩티드는 바람직하게는 세균에 의한 처리에 의해 재조합적으로 생산된다.
PTH, BMP 2 또는 BMP 7의 합성 전구체 성분으로부터 형성된 매트릭스 속으로의 혼입을 위해서, PTH 또는 BMP 융합 펩티드 또는 기타 다른 펩티드는 가교 기질 도메인으로서 바람직하게는 PTH1-34, BMP 2 또는 BMP 7의 N 말단에서 적어도 하나의 추가의 시스테인기(-SH)에 의해 합성된 경우 혼입될 수도 있다. 상기 시스테인은 PTH1-34, BMP 2 또는 BMP 7에, 또는 링커 서열을 통해 직접 부착될 수 있다. 상기 링커 서열은 부가적으로 효소적 혹은 가수분해적 분해성 아미노산 서열을 포함하므로, PTH, BMP 2 또는 BMP 7은 실질적으로 선천적인 형태로 효소에 의해 매트릭스로부터 분열될 수 있다. 유리 시스테인기는 마이클 유형 첨가 반응에서 전구체 성분의 컨쥬게이트화된 불포화기와 반응한다. 시스테인의 티올기는 합성 중합체 상의 컨쥬게이트화된 불포화 결합과 반응해서 공유 결합을 형성할 수 있다.
이들 부위는 비특이 가수분해(예를 들어, 에스터 결합)에 의해 분해될 수 있거나, 또는 이들은 특정 효소(단백질 분해 또는 다당류 분해의 어느 한쪽) 분해용의 기질일 수 있다.
상기 분해 부위에 의해 PTH, BMP 2 또는 BMP 7이 일차 펩티드 서열에 대한 약간의 개질된 채 또는 하등의 개질 없이 방출될 수 있고, 결과적으로 상기 인자의 활성이 높아진다. 또한, 이것에 의하면, 상기 인자의 방출이 세포 특이 프로세스에 의해 제어될 수 있다. 이것으로 인해, 인자가 재료 내 세포의 위치에 따라 동일한 재료 내에서 상이한 속도로 방출될 수 있다. 이것은 또한 그의 방출이 세포 프로세스에 의해 제어되므로 필요로 하는 PTH1-34, BMP 2 또는 BMP 7의 총량을 감소시킨다. PTH가 혼입되고 바람직하게는 매트릭스에 결합된 전술한 골 결손의 강력한 치유를 위한 가능한 하나의 설명에 있어서, 연속적인 형식이 아니라 확대된 기간(즉, 단일의 펄스형태 용량이 아님)에 걸쳐서 PTH가 국소 투여되는 것이 중요한 것으로 여겨진다. 이것은 매트릭스의 효소적 분열 혹은 가수분해적 분열을 통한 느린 분해에 의해 달성된다. 이와 같이 해서, 상기 분자는 다음에 지속된 기간에 걸쳐 일어나는 유사-펄스 효과를 통해 전달된다. 전골모세포성 세포가 매트릭스를 침투할 경우, 새로운 골 형성에 중요한 다수의 성장 인자의 합성뿐만 아니라 전골모세포의 추가의 증식을 유발하는 PTH 분자를 조우하게 될 것이다. 그러나, 그 특정 세포가 매트릭스로부터 결합된 PTH를 계속 유리시키지 않을 경우, 인터루킨-6의 생성을 시작하지 않을 것이며, 이에 따라 파골세포 형성에 대한 추후의 단계의 이화작용을 피할 수 있게 된다. 다음에, 궁극적인 결과는 골 매트릭스의 더욱 높은 골 미네랄 밀도 및 궁극적인 형성을 가져온다. 최종적으로, 펩티드의 치료 효과는 결함 영역으로 편재화되고, 결과적으로 확대된다.
융합 펩티드의 분해 부위
효소적 혹은 가수분해적 분해 부위는 융합 펩티드의 제1 도메인과 제2 도멘 사이에 존재할 수 있다. 상기 분해 부위는 특정 효소 분해에 의해 분해될 수 있다. 바람직하게는 분해 부위는 플라스민 및 매트릭스 금속단백분해효소로 이루어진 군으로부터 선택된 효소에 의해 분열가능하다. 이 효소 분해 부위의 Km 및 kcat의 주의 깊은 선택에 의해, 분해는 매트릭스 형성 전후에 및/또는 매트릭스를 분해시키는 유사 혹은 유사하지 않은 효소를 이용함으로써 일어나도록 제어될 수 있었다. 이들 분해가능한 부위에 의해 공학은 매트릭스로부터 생활성 인자의 더욱 특이적인 방출을 가능하게 한다. 상기 분해가능한 부위는 매트릭스를 침입한 세포로부터 방출된 효소에 의해 분열될 수 있다. 상기 분해 부위에 의해 전달속도는 그 위치에서 및/또는 매트릭스 내에서 세포 활성에 따라 매트릭스 내의 상이 위치에서 변화될 수 있다. 추가의 유익으로는 전달 시스템 내의 더욱 낮은 총 약물 용량, 및 최대 세포 활성시 방출될 약물의 보다 큰 백분율을 허용하는 방출의 공간적인 조절을 포함한다. 분해 부위는 여기서 "pl"로서 약칭한다.
단백질 분해적으로 분해가능한 부위로는 콜라게나제, 플라스민, 엘라스타제, 스트로멜리신 또는 플라스미노겐 활성제용의 기질을 들 수 있다. 기질의 예는 이하에 열거되어 있다. N1-N5는 단백질 분해가 일어나는 부위로부터 단백질의 아미노 말단을 향한 아미노산 1-5 위치를 의미한다. N1'-N4'는 단백질 분해가 일어나는 부위로부터 단백질의 카복시 말단을 향한 아미노산 1-4 위치를 의미한다.
[단백분해효소용의 샘플 기질 서열]
단백분해효소 N5 N4 N3 N2 N1 N1' N2' N3' N4' 서열 번호
플라스민1 L I K M K P 서열 번호:
플라스민1 N F K S Q L 서열 번호:
스트로멜리신2 Ac G P L A L T A L 서열 번호:
스트로멜리신2 Ac P F E L R A NH2 서열 번호:
엘라스타제3 Z- A A F A NH2 서열 번호:
콜라게나제4 G P L G I A G P
t-PA5 P H Y G R S G G 서열 번호:
u-PA5 P G S G R S A S G 서열 번호:
참고문헌: 1. Takagi and Doolittle, (1975) Biochem. 14:5149-5156. 2. Smith et al., (1995). J. Biol. Chem. 270:6440-6449. 3. Besson et al., (1996), Analytical Biochemistry 237:216-223. 4. Netzel-Arnett et al., (1991), J. Biol. Chem. 266:6747-6755. 5. Coombs et al., 1998. J. Biol. Chem. 273:4323-4328
바람직한 실시형태에 있어서, 서열 YKNR(서열 번호: 11)은 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 위치하며 연쇄 플라스민을 분해성으로 만든다.
특히 바람직한 PTH 융합 펩티드는 TGplPTH이다:
NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(서열 번호: 12).
단백질 분해에 사용될 수 있었던 효소는 매우 많다. 단백질 분해적으로 분해가능한 부위는 콜라겐, 플라스민, 엘라스타제, 스트로멜리신 또는 플라스미노겐 활성제용의 기질을 포함할 수 있었다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 올리고-에스터 도메인은 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 삽입될 수 있었다. 이것은 락트산의 올리고머 등과 같은 올리고-에스터를 이용해서 달성될 수 있다.
혼입용의 융합 단백질의 설계
바람직한 융합 단백질로는 다음과 같은 것을 들 수 있다:
TG-PTH1-34: 이것은 TG(트랜스글루타미나제) 기질 도메인뿐만 아니라 선천적 PTH의 아미노산 1-34를 포함하는 PTH의 개질 형태이다:
NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(서열 번호: 13).
TG-pl-PTH1-34: 이 형태는 TG 서열과 PTH1-34 사이의 플라스민분해성 서열(pl)을 부가적으로 함유하는 것을 제외하고는 TG-PTH에 상당한다:
NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(서열 번호: 12).
TG-BMP 2283-396: 이것은 TG(트랜스글루타미나제) 기질 도메인뿐만 아니라 선천적 PTH의 아미노산 283-396을 포함하는 BMP 2의 개질 형태이다:
Met-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Pro-Val-Glu-Leu-Pro-Leu-Ile-Lys-Met-Lys-Pro-His-BMP 2283-396(서열 번호: 14).
매트릭스 또는 전구체 성분과 생활성 인자의 배합
바람직한 실시형태에 있어서, 보충 합성 또는 피브린 매트릭스(각각 그의 전구체 용액)는 매트릭스 및 PTH 또는 PTH 융합 펩티드를, 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.01 내지 2 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖), 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.02 내지 1.0 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖), 더욱 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.03 내지 0.5 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖), 가장 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.05 내지 0.2 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖)의 농도 범위로 포함한다. 환자의 연령에 따라, PTH 농도 또는 PTH 융합 펩티드 농도의 임의의 하위 범위가 바람직하다. 상기 보충 매트릭스가 어린이의 골낭종을 치료하기 위해 적용된 경우, PTH 또는 PTH 융합 펩티드의 농도는 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.01 내지 0.35 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖), 가장 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.05 내지 0.15 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖)의 범위이다. 상기 제제가 성인의 골다공증의 골밀도를 국소적으로 증가시키기 위해 적용된 경우, PTH 또는 PTH 융합 펩티드의 바람직한 농도는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.5 내지 2 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖), 더욱 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.7 내지 1.5 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖), 가장 바람직하게는 PTH 또는 PTH 융합 펩티드 0.9 내지 1.1 ㎎/(매트릭스 또는 상기 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 ㎖)의 범위이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 매트릭스는 피브린 매트릭스이다.
II. 생활성 인자의 혼입 및/또는 방출 방법
PTH 또는 BMP 혹은 융합 펩티드와 같은 생활성 인자의 매트릭스 내로의 혼입에 대한 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 생활성 인자는 그의 겔화 동안 매트릭스 내에 물리적으로 혹은 화학적으로 혼입될 것이다. 피브린 매트릭스의 경우, 인자 XIIIa는 피브린로의 응고 동안 활성인 트랜스글루타미나제이다. 보다 높은 농도가 요구되는 경우, 피브린 전구체 용액에 부가적으로 첨가되거나 트롬빈에 의한 분열에 의해 인자 XIII로부터 자연적으로 생성된 이 효소는 글루타민 곁사슬과 리신 곁사슬 사이에 형성된 아마이드 연쇄를 통해 서로 피브린 사슬을 부착하는 기능을 한다. 또, 효소는 응고 동안 다른 펩티드를 피브린에 부착시키는 기능도 한다. 구체적으로는, 서열 NQEQVSPL(서열 번호: 2)은 인자 XIIIa에 대한 유효 기질로서 기능하는 것이 입증되어 있다. 합성 매트릭스의 경우, 융합 펩티드는 신체 내 생리적 조건 하에 합성 매트릭스를 형성하는 전구체 성분의 작용기와 반응할 수 있는 작용기일 필요가 있다. 예를 들어, 전구체 분자가 아크릴레이트기를 함유한 경우, 상기 융합 펩티드는 마이클 유형 첨가 반응시 상기 아크릴레이트기와 반응하는 유리 티올기를 함유할 필요가 있다. 생활성 인자의 성질에 따라, 매트릭스로부터의 서방성을 달성하기 위해 비개질 인자의 혼합도 가능하다.
III. 적용 방법
보충 매트릭스는 분리된 전구체 성분의 주입 시 원하는 위치에서 적소에 형성될 수 있거나, 또는, 상기 원하는 위치 속으로 수행된 후 이식될 수 있다. 증상에 따라서는, 상기 보충 매트릭스는 겔화의 상이한 단계에서 적용되거나 주입된다. 상기 매트릭스가 골낭종 속으로 주입되는 경우, 바람직하게는 전구체 용액의 혼합 후에, 즉 여전히 액체 상태에서 적용된다. 상기 보충 매트릭스가 골다공증에 걸린 건강하지 않은 골 영역에 주입된 경우, 이들은 바람직하게는 예비 겔화 상태에서 주입된다. 상기 전구체 용액은 혼합되고, 겔화 후(통상, 약 30초 내지 2분 후), 그 겔은 골 속의 상기 골다공증에 걸린 영역으로 두꺼운 바늘을 통해 주입된다. 이것은 여전히 액체인 매트릭스가 혈액 순환 속으로 누설되는 것을 방지하기 위해 수행된다.
일부 증상에 대해서는, 주사 동안 적용되는 골 영역에 있어서 상기 재료의 분포를 보는 것이 요망될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, X선 조영제, 바람직하게는 상기 매트릭스 재료에 가용성인 것이 상기 매트릭스 전구체 재료에 첨가된다.
일반적으로, 조영제는 이온성 조영제와 비이온성 조영제로서 분류된다. 이온성 조영제도 사용될 수 있지만, 비이온성 조영제가 바람직하다. 또한, 요오드 함유 X-선 조영제가 바람직하다.
바람직한 비이온성 조영제로는 이오딕사놀, 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로마이드, 이오네프롤(iorneprol), 이오시마이드, 이오타설(iotasul), 이오트롤란(iotrolan), 이오베르솔(ioversol), 이옥실란(ioxilan) 및 메트라자미드(metrizamide)를 들 수 있다. 가장 바람직한 비이온성 조영제는 이오헥솔(CAS No. 66108-95-0)이다. 이오헥솔이 첨가되어 투시검사 또는 X선 하에 겔을 시각화할 경우, 상기 매트릭스는 바람직하게는 매트릭스 또는 해당 매트릭스를 형성하는 전구체 용액의 ㎖당 100 내지 600 ㎎, 더욱 바람직하게는 매트릭스 또는 해당 매트릭스를 형성하는 전구체 용액의 ㎖당 250 내지 500 ㎎, 가장 바람직하게는 매트릭스 또는 해당 매트릭스를 형성하는 전구체 용액의 ㎖당 300 내지 450 ㎎ 함유한다.
바람직한 이온성 조영제로는 다이아트라이조에이트, 이오벤즈아메이트(iobenzamate), 이오카메이트(iocarmate), 이오세타메이트(iocetamate), 이오다미드(iodamide), 이오다이파미드(iodipamide), 이오독사메이트(iodoxamate), 이오글리케이트(ioglicate), 이오글리카메이트(ioglycamate), 이오파노에이트(iopanoate), 이오펜딜레이트(iophendylate), 이오프로네이트(iopronate), 이오세레이트(ioserate), 이오탈라메이트(iothalamate), 이오트록세이트(iotroxate), 이옥사글레이트(ioxaglate), 이옥시탈라메이트(ioxithalamate) 및 메트리조에이트(metrizoate)를 들 수 있다.
조영제는 시판품을 입수하거나, 또는 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이 용이하게 합성될 수 있다.
조영제의 모니터링은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법으로, 예를 들어 X선, 자기공명영상(MRI: magnetic resonance imaging) 또는 초음파 영상에 의해 수행될 수 있다. 조영제는 이들이 분포되어 있는 신체 부위의 X선 흡수 특성을 변경하거나, 워터 프로톤(water proton)의 완화 횟수를 변경함으로써 자기공명영상을 통해 관찰될 수 있거나, 또는 이들이 분포된 신체 부위의 음속 혹은 밀도를 변경함으로써 기능하는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명에 따르면, X선 영상에 의해 모니터될 수 있는 조영제를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 겔화의 상이한 단계에서 신체에 투입되는 보충 매트릭스 제제는 신체 내 또는 신체상의 적소에서 겔화될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 보충 매트릭스는 신체 밖에서 형성되고, 이어서, 미리 형성된 형상으로 적용될 수 있다. 사용된 전구체 성분의 종류에 관계없이, 상기 전구체 성분은 상기 성분들의 중합 또는 겔화를 허용하는 조건하에서 서로 배합 혹은 접촉되는 것을 방지하도록 신체에 상기 혼합물의 적용 전에 분리될 필요가 있다. 투여 전에 접촉을 방지하기 위해, 상기 조성물을 서로 분리시키는 키트가 사용될 수 있다. 중합을 허용하는 조건하에서 혼합 시, 상기 조성물은 생활성 인자가 보충된 3차원 네트워크를 형성한다. 전구체 성분 및 그들의 농도에 따라, 혼합 후 겔화가 준즉석으로(quasi-instantaneously) 일어날 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 상기 매트릭스는 피브리노겐으로부터 형성된다. 피브리노겐은, 트롬빈 및 칼슘 공급원과 적절한 온도 및 pH에서 접촉할 경우, 각종 반응의 캐스케이드를 통해 겔화되어 매트릭스를 형성한다. 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 공급원의 세 성분은 개별적으로 보존될 필요가 있다. 그러나, 상기 세 성분 중 적어도 한 성분이 분리되어 유지되는 한, 다른 두 성분은 투여 전에 배합될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 피브리노겐은 생리적 pH(pH 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 7.5의 범위)에서 완충 용액 중에 용해되어(안정성을 증가시키기 위해 추가적으로 아프로티닌을 함유할 수 있음) 제1 전구체 용액을 형성하고, 염화 칼슘 완충액 중의 트롬빈 용액(예를 들어, 40 내지 50 mM의 농도 범위)과는 별도로 보존된다. 피브리노겐용의 완충 용액은 150 mM의 바람직한 농도에서 부가적으로 NaCl을 포함하는 50 mM의 바람직한 농도의 히스티딘 완충 용액 또는 트리스 완충 식염수(바람직하게는, 33mM의 농도)일 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 키트는 융합 단백질, 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 공급원을 수용한다. 임의적으로, 상기 키트는 인자 XIIIa와 같은 가교 효소를 수용할 수도 있다. 상기 융합 단백질은 생활성 인자, 가교 효소용의 기질 도메인 및 임의적으로, 기질 도메인과 생활성 인자 사이의 분해 부위를 함유한다. 상기 융합 단백질은 피브리노겐 또는 트롬빈 전구체 용액의 어느 한쪽에 존재할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 피브리노겐 전구체 용액은 융합 단백질을 함유한다.
상기 용액들은 바람직하게는 투-웨이 주사기 장치에 의해 혼합되며, 여기서, 혼합실 및/또는 바늘 및/또는 정적 믹서를 통한 두 주사기의 내용물을 압착함으로써 혼합이 일어난다.
바람직한 실시형태에 있어서, 피브리노겐 및 트롬빈의 양쪽 모두는 개별적으로 동결건조된 형태로 보존된다. 이들 두 성분의 어느 쪽도 생활성 인자, 바람직하게는 융합 단백질을 함유한다. 사용 전에, 트리스 또는 히스티딘 완충액이 상기 피브리노겐에 첨가되고, 상기 완충액은 추가적으로 아프로티닌을 함유할 수 있다. 상기 동결건조된 트롬빈은 염화 칼슘 용액 중에 용해된다. 이어서, 상기 피브리노겐 용액 및 상기 트롬빈 용액은 개별의 용기/유리병(vial)/주사기 본체에 놓이고, 투-웨이 주사기(two-way syringe) 등의 투-웨이 접속 장치에 의해 혼합된다. 임의적으로, 상기 용기/유리병/주사기 본체는 두 부분으로 나뉘어 주사기 본체벽과 수직인 조정가능한 칸막이에 의해 분리된 2개의 챔버를 가진다. 하나의 챔버는 상기 동결건조된 피브리노겐 또는 트롬빈을 수용하는 한편, 다른 하나의 챔버는 적절한 완충용액을 수용한다. 플런저(plunger)가 아래쪽으로 가압되면, 상기 칸막이가 이동하여, 상기 피브리노겐 챔버 속으로 완충액을 방충하여 상기 피브리노겐을 용해시킨다. 일단 피브리노겐 및 트롬빈의 양쪽 모두가 용해되면, 두 부분으로 분리된 주사기 본체의 양쪽 모두는 투-웨이 접속 장치에 부착되고, 내용물은 상기 접속장치에 부착된 주사바늘을 통해서 압착됨으로써 혼합된다. 임의적으로, 상기 접속 장치는 정적 믹서를 수용하여 내용물의 혼합을 향상시킨다.
바람직한 실시형태에 있어서, 상기 피브리노겐은 혼합 전에 8배 희석되고, 트롬빈은 20배 희석된다. 이 비의 결과 겔화 시간은 대략 1분이다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 보충 매트릭스는 마이클 첨가 반응을 수행하는 능력을 가진 합성 전구체 성분으로부터 형성된다. 상기 친핵성 전구체 성분(멀티-티올) 만이 염기성 pH에서 멀티-수용체 성분(컨쥬게이트화된 불포화기)과 반응하므로, 염기, 친핵성 성분 및 멀티-수용체 성분의 세 성분은 혼합 전에 분리해서 보존되어야 한다. 상기 멀티-수용체와 상기 멀티-티올 성분의 양쪽 모두는 완충액 중에 용액으로서 보존된다. 조성물들의 양쪽 모두는 세포 부착 부위, 그리고 부가적으로 생활성 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 시스템의 제1 조성물은 예를 들어 상기 친핵성 성분의 용액을 포함할 수 있고, 상기 시스템의 제2 조성물은 상기 멀티-수용체 성분의 용액을 포함할 수 있다. 두 조성물의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두는 염기를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 멀티-수용체 및 상기 멀티-티올이 제1 조성물 중에 용액으로서 포함될 수 있고, 제2 조성물은 염기를 포함할 수 있다. 접속 및 혼합은 피브리노겐에 대해 이전에 설명한 바와 같은 방식으로 일어난다. 둘로 나누어진 주사기 본체는 합성 전구체 성분에 대해 균등하게 적합하다. 피브리노겐 및 트롬빈 대신에, 한쪽 챔버에는 멀티-수용체 및 멀티-티올 성분이 분체 형태로 보존되고, 다른 쪽 챔버에는 염기성 완충액을 수용한다.
부가적으로, 전술한 성분 외의 다른 성분이 본 발명의 시스템에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 미네랄을 함유하는 재료, 즉, 하이드록시아파타이트 등의 칼슘을 함유하는 자연적으로 생성된 균질 물질이 이용될 수 있다.
상기 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태의 견지에서 설명하였지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어나는 일없이, 본 명세서에 기재된 조성물, 방법 및 단계들 또는 상기 방법의 단계들의 서열에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백해질 것이다.
실시예 1 : PTH 1-34 및 TGplPTH 1-34 의 생활성
전체 길이 PTH1-84와 유사한 활성을 보이는 PTH1-34-펩티드 및 이 길이의 단백질은 표준 고체 상태 펩티드 합성법에 의해 합성될 수 있다.
모든 펩티드는 표준 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 화학을 이용하는 자동화 펩티드 합성기를 이용해서 고체 수지상에 합성되었다. 펩티드는 c18 크로마토그래피에 의해 정제하고, HPLC를 통한 역상 크로마토그래피를 이용해서 분석하여 순도를 결정하고, 또한 질량 분광측정법(MALDI)에 의해 각 생성물의 분자량을 동정하였다. 이 방법을 이용해서, TG-pl-PTH1- 34(NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(서열 번호: 12)) 및 TGPTH1-34(NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(서열 번호: 13))뿐만 아니라 PTH1-34가 합성되었다. TGplPTH1-34 및 TGPTH1-34는, TGplPTH1-34의 경우, 그리고 직접적으로 TGPTH1-34의 경우 플라스민 분해성 pl-서열 YKNR(서열 번호: 15)을 통해서 PTH1-34에 연결된 인자 XIIIa 기질 도메인을 부가적으로 포함하는 점에서 PTH1-34와는 다르다.
PTH 융합 펩티드의 생활성을 연구하기 위해서, 정보제공 유전자 에세이가 확립되었다. 이 에세이에 있어서, 부갑상샘 호르몬 수용체용의 프로모터에 연결된 루시페라제 정보제공 유전자를 함유하는 플라스미드가 세포 속에 트랜스펙션된다. 다음에, 상기 세포가 PTH에 노출되고, 그 PTH가 이어서 세포 상의 그의 수용체에 결합되면, 상승된 cAMP 레벨을 통해 유도된 신호전달체계가 개시된다. 자연 피드백 조절을 통해, 이것은 이어서 PTH 수용체 레벨의 감소를 초래한다. 상기 감소가 프로모터를 통해 유도됨에 따라, 다음에, 연결된 정보제공 유전자 생산의 저하도 초래한다. 이 에세이를 이용해서, TG-pl-PTH1-34뿐만 아니라 선천적 PTH1-34의 양쪽 모두의 활성이 조사되어, 국제 표준과 비교되었다. 이들 분자의 양쪽 모두는 이들 모두에 대한 정보제공 유전자 발현의 감소가 동일함에 따라 유사한 레벨의 활성을 나타내고, 이 활성 레벨은 국제 표준에 대한 것과 동일한 것으로 관찰되었다. 이 결과는 도 1에 나타나 있다.
실시예 2: 피브린 매트릭스로부터의 PTH 방출
피브린 매트릭스는 TISSEEL® 키트(체하-8604 볼케츠빌(Volketswil)/ZH에 소재한 박스터 아게(Boxter AG)사 제품) 피브린 전구체 성분으로 제조되었다. 이 조성물은 표 2에 표시되어 있다. 다음에, 0.1 ㎍/㎖의 PTH1-34 또는 TGPTH1-34의 존재에 있어서 트롬빈에 부가되고 혼합되어서 균질 농도를 형성하였다. TGPTH1-34만이 분해 부위 없이 아미노 말단에 트랜스글루타미나제 서열을 가진다. 이와 같이 해서, TGPTH1-34는 상기 피브린 매트릭스 자체의 분해에 의해 오직 유리될 수 있다. 이 펩티드는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 합성되었다.
제1 방출 에세이를 위해서, 피브린 매트릭스 ㎖당 PTH 또는 TGPTH를 0.1 ㎎ 가진 피브린 매트릭스 50 ㎕를 완충액 10 ㎖ 중 37℃에서 배양하였다. 따라서, 전체 방출의 경우 상기 완충액 중의 PTH 또는 TGPTH의 농도는 0.5 ㎍ PTH 또는 TGPTH/(피브린 매트릭스 ㎖)로 되었다. 상기 에세이 동안 PTH 또는 TGPTH의 안정성을 비교하기 위해서, PTH 또는 TGPTH의 샘플은 완충액 중에 직접 0.5 ㎍ PTH 또는 TGPTH/(피브린 매트릭스 ㎖)의 농도까지 희석되었다. 상이한 완충액, 즉 증류수, 인산 완충 식염수, 트리스 완충 식염수를 테스트하였다.
0, 1, 2, 4 및 6일째에 분획을 취하여 직접 ELISA에 의해 분석하였다. 이 결과, PTH는 어떠한 완충액 중에서도 2일 이상 안정하지 않은 것을 나타내었다. 따라서, 상기 방출 데이터에 대해 어떠한 결론도 내릴 수 없었다. PTH 안정성은 그의 낮은 농도 및 최적이 아닌 완충액에 의해 확실히 영향받았다.
10mM 아세트산 나트륨 완충액 중 50mM 만니톨을 함유하는 안정화 완충액을 이용해서 방출 실험을 반복하였다. 또한, 상기 완충액은 펩티드의 어떠한 열화도 방지하기 위해 2일마다 교환하였다. PTH 또는 TGPTH의 농도는 100 ㎕ 피브린 매트릭스 중 1 ㎎ PTH 또는 TGPTH/(피브린 매트릭스 ㎖)까지 증가되었고, 배양은 1 ㎖ 완충액 중에서 이루었다. 전체 방출의 경우 완충액 중의 PTH 또는 TGPTH의 농도는 100 ㎍/(피브린 매트릭스 ㎖)(이전보다 200 배 이상)로 되었다. 제1 실험에서처럼, 스파이크를 박은 샘플들(spiked samples)(대조군으로서 동일량의 PTH 또는 TGPTH가 완충액 중에 용해됨)을 준비하여 실험(100 ㎍/㎖) 동안 PTH 또는 TGPTH의 안정성을 평가하였다. 샘플을 2주 동안 2 내지 4일마다 회수하고(완충액을 변화시키면서), 직접 ELISA에 의해 분석하였다. 스파이크를 박은 샘플들도 2주마다 회수하였다. 이 결과, 이들 조건 하에 PTH 및 TGPTH는 2주에 걸쳐 안정적인 것을 알 수 있었다.
도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 피브린 매트릭스로부터의 주된 방출은 3일 내에 달성되었다. PTH의 거의 60% 및 TGPTH의 13%가 3일 후 방출되었다. 이들 데이터는 피브린 매트릭스 내 PTH의 체류가 TG 서열의 부가에 의해 고도로 향상된 것을 입증하고 있다.
실시예 3: PTH 융합 펩티드를 포함하는 보충 피브린 매트릭스의 합성
피브린 매트릭스는 4 ㎖ 피브린 매트릭스를 부여하는 TISSEEL® 키트(체하-8604 볼케츠빌/ZH에 소재한 박스터 아게사 제품)로부터 시작해서 형성되었다. TISSEEL®은 인간 유래 혼주 혈장으로부터 생산되었고, 활성 성분의 함량은 미리 규정된 범위 내에서 로트마다 변화시킬 수 있다. 표 2는 사용된 최종 조성물의 목록 을 나타내고 있다.
[TISSEEL® 및 활성 성분을 포함하는 최종 조성물]
성분 겔 2㎖당의 용량
주사기 1
활성 성분: PTH1-34 융합 펩티드(TGplPTH1-34) 0.2 내지 20 ㎎
응고제 피브리노겐 기타 단백질 아프로티닌(소) 인간 알부민 완충액 성분 니아신아마이드 L-히스티딘 구연산 나트륨 폴리소르베이트 80 주사용수 66 내지 100 ㎎ 2046 내지 3409 KIE 9.1 내지 18.2 ㎎ 2.7 내지 8.2 ㎎ 9.1 내지 22.7 ㎎ 4.4 내지 8.8 ㎎ 0.6 내지 1.7 ㎎ 1 ㎖까지
주사기 2
응고제 트롬빈(인간) 완충액 성분 염화 칼슘 염화 나트륨 단백질(인간 혈청 알부민) 주사용수 2.5 내지 6.5 I.U. 5.88±0.6 ㎎ 3.5 내지 5.5 ㎎ 45 내지 55 ㎎ 1 ㎖까지
피브리노겐은 섬유 용해의 감소를 도와 피브린 매트릭스의 일체성을 유지하는 세린 단백분해효소 저해제인 아프로티닌을 가진 용액 중에 현탁시켰다. 이 용액은 투-웨이 주사기의 제1 챔버(주사기 1)에 삽입하였다. 트롬빈은 상기 투-웨이 주사기의 제2 챔버(주사기 2)에 염화 칼슘 용액 중에 별도로 준비하였다. 피브린 실란트는 혈장 섬유결합소, 인자 XIII, 플라스미노겐 및 인간 알부민 등의 피브린 골격의 기타 성분도 함유하였다. TGpl-PTH1-34는 매트릭스 중의 최종 농도가 0.1 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖(매트릭스 중)가 되도록 피브리노겐 성분 속에 배합되었다. 사용된 정확한 조성물은 표 2에 부여되어있다.
피브리노겐 및 트롬빈 성분이 동일 부피로 혼합된 경우, 응고 과정이 일어나 피브린인 천연의 세포외 매트릭스를 형성하였다. 겔화 과정 동안, TGpl-PTH1-34는 매트릭스에 가교되었다. 응고 과정은 45 내지 60초에 걸쳐서 일어나, 믹서 선단을 통해 결함부로 액체의 동시 주입을 허용하여 겔이 고형화되었다.
실시예 4: 주입가능한 피브린 매트릭스에 가교된 PTH 1-34 를 이용해서 말의 연골하 낭종 병변의 치료
말에서의 연골하 골낭종은 인간에서의 단강의 골낭종과 유사한 임상적 단위이므로, 피브린 매트릭스에 가교된 PTH1-34의 치유 잠재력을 평가하는 모델로서 사용하였다.
12 마리의 말(12개의 낭종)에 외과적 수술을 행함으로써 낭종 내용물을 배농 소파(drainage curettage)에 의해 제거하였다. 낭종은 뒷다리뿐만 아니라 앞다리의 각종 관절에 위치되었다.
동일 부피의 피브리노겐 및 트롬빈을 함유하는 실시예 3의 조성물을 최종 농도 10, 1 및 0.4 ㎎/㎖에서 TGplPTH1-34와 함께 SCL에 주입하고, 그 자리에서 중합체화하였다. 평균 부피 2 ㎖의 보충 매트릭스를 이용해서 상기 결함에 채우고, 이때의 부피는 보충 매트릭스 0.2 내지 5 ㎖의 범위였다. 말의 연령은 2개월 내지 11년의 범위였다. 추적검사는 임상적 치유뿐만 아니라 방사선 조사를 수술 후 2, 4, 6 및 12개월에 수행하였다.
병변내 투여는 SCL의 매우 양호한 치유를 가져왔다. 모든 말들을 분석한 바, 임상적 및 방사선 치유에서 유의한 진전을 보였다. 방사선 치유는 보다 높은 밀도의 낭종 내용물 및 낭종 크기의 감소에 의해 반영되어, 수술 후 2 내지 6개월에 보다 낮은 농도의 PTH1-34에서 신속하게 치유되는 경향을 보였다. 거의 모든 말들이 단지 수술후 2 내지 4개월 후 임상적으로 치유되어, 더 이상 절름발이는 보이지 않았다.
이들 결과는 골 재생에 대해 특히 나쁜 예후를 갖는 것으로 알려진 3년 이상의 나이를 먹은 성인 말에서 성공적인 치유를 달성하였으므로 특히 고무적이었다.
0.4 내지 10 ㎎/㎖의 농도는 보다 낮은 농도에서 더욱 양호한 치유 경향을 가지는 데 효과적인 것으로 나타났다.
보다 낮은 용량의 TGplPTH1-34(0.1 ㎎/㎖)를 함유하는 보충 매트릭스에 의한 치료도 SCL의 치유를 촉진시키는 것으로 나타났다.
[일반적인 환자 정보 및 SCL의 위치]
시험 번호 혈통 성별 연령 SCL의 위치
1 인랜더 암말 1년 첫째 발가락뼈/발목 관절, 왼쪽 앞쪽
2 인랜더 암말 10년 정강이뼈/구절(fetlock joint), 오른쪽 앞쪽
3 뷔르템베르게르 암말 11년 요골, 오른쪽
5 핀토 암말 3년 무릎뼈/말후 무릎관절, 오른쪽
7 볼블루트 암말 3년 종자뼈/구절, 오른쪽 앞쪽
12 올덴버거 암말 3년 종자뼈/구절, 왼쪽 앞쪽
13 인랜더 암말 3년 대퇴골/말후 무릎관절, 오른쪽
15 인랜더 암말 2개월 골수염 대퇴골/말후 무릎관절, 오른쪽
16 인랜더 거세한 말 2개월 골수염 대퇴골/말후 무릎관절, 오른쪽
18 아라버 거세한 말 5년 정강이뼈/말후 무릎관절, 왼쪽 앞쪽
19 인랜더 종마 3년 정강이뼈/말후 무릎관절, 오른쪽 앞쪽
20 인랜더 거세한 말 9년 발꿈치뼈, 뒷다리 복사뼈 관절, 오른쪽
[치료 전 및 치료 동안의 절름발이 등급]
시험 번호 피브린 매트릭스 중 TGplPTH1-34[㎎/㎖] 임상적 치유(절름발이 등급)
치료전 2개월 4개월 6개월 12개월
2 10 3 2 치유됨 치유됨 치유됨
1 1 3-4 1 치유됨 - 치유됨
3 1 2 치유됨 치유됨 - -
5 1 3 치유됨 - 치유됨
7 1 2 1 치유됨 -
19 1 1 치유됨 치유됨
12 0.4 3 치유됨 치유됨 -
13 0.4 2 치유됨 -
15 0.4 5 2 - 치유됨
16 0.4 4 1
18 0.4 1 치유됨
20 0.4 3 - 1
치유됨 = 절름발이가 존재하지 않음 - = 대조군이 없음
절름발이는 표 5에 기재된 기준을 이용해서 등급을 매겼다.
[절름발이 등급 및 대응하는 기준]
절름발이 등급 기준
1-경증, 불명료 절름발이가 일관되게 명백하지 않음: 보행에 의한 절름발이가 아님, 단지 구보에 의한 불규칙
2-경증, 명료 절름발이가 일관되게 특수 환경 하에 명백함: 보행에 의한 절름발이가 아님, 구보에 의한 각 스텝에서 절름발이
3-중급 절름발이가 일관되게 명백함: 보행 및 구보에 의해 명확한 절름발이
4-높은 등급의 절름발이 중증 절름발이
5-최고 등급의 절름발이 더 이상 적재 불가능
실시예 5: 토끼의 섬유주 골 모델
섬유주 골의 골내 비대화를 유발하는 피브린-TGplPTH에 대한 잠재력을 연구하기 위해, 토끼 모델을 확립하였다. 피브린 내 TGplPTH의 150 ㎕의 수회의 용량을 뉴질랜드 화이트 토끼의 원위 대퇴골에 주입하였다. 토끼를 마취시키고, 대퇴 관절융기를 노출시켰다. 피질 골을 통해 상기 관절융기의 측면 속으로 작은 구멍을 뚫고, 상기 재료를 1 ㎖ 주사기에 접속된 22G 바늘을 통해 골 속에 도입하였다. 시험된 용량은 0, 0.1, 0.4 및 1.0 ㎎ TGplPTH1-34/(피브린 매트릭스의 ㎖)이었고, 각 토끼의 반대쪽 다리는 미치료 대조군으로 하였다. 8주후 동물을 희생시키고, 상기 대퇴 관절융기에 μCT를 행하여 치료 후의 골밀도를 평가하였다. 골밀도는 1 ㎎ TGplPTH1-34/(피브린 매트릭스의 ㎖)로 치료한 후 대략 10% 증가하였다.
실시예 6: 양의 골에 주입된 방사선 비투과성 피브린의 시각화, 모니터링 및 취급성 시험
형광투시검사 및 X선 하에 골 내 피브린 매트릭스의 흐름을 시각화하기 위해, 요오드계 조영제인 이오헥솔을 피브린 매트릭스 속에 혼입시켰다. 이오헥솔 600-800 ㎎을 트롬빈 전구체 용액 속에 용해시켜 최종 농도 300 내지 400 ㎎/(피브린 매트릭스 당 이오헥솔 ㎖)를 얻었다. 트롬빈 전구체 조성물 중의 트롬빈의 범위(4 내지 10 U/㎖)가 시험되었다. 피브린 매트릭스의 다른 성분은 표 2에 표시되어 있다.
겔화 시험은 높다 높은 농도의 트롬빈이 겔을 형성하는 데 필요한 것을 나타내고 있다. 두 성분은 골 속에 놓인 이중 주사기와 바늘을 통해서 양의 척추골 및 원위 대퇴골 속으로 동시에 액체로서 주입되어, 적소에 중합체화되었다. 상기 겔은 X선 및 형광투시검사를 이용해서 명백하게 시각화될 수 있었다.
실시예 7: 양의 골 속으로 주입된 예비 중합체화된 피브린, 시각화 및 취급성 시험
형광투시검사 및 X선 하에 골 내 예비중합체화된 피브린 매트릭스를 시각화하여 취급성 시험하기 위해, 요오드계 조영제인 이오헥솔을 겔 속에 혼입시켰다. 이오헥솔 600-800 ㎎을 트롬빈 희석 완충액 속에 용해시켜 최종 농도 300-400 ㎎/(피브린 매트릭스 내 이오헥솔 ㎖)를 얻었다. 트롬빈 전구체는 75U/(완충 용액 ㎖)의 농도로 완충액-이오헥솔 용액에 첨가되었다. 피브린 매트릭스의 다른 성분은 표 2에 표시되어 있다.
겔화 시험은 트롬빈 성분 및 피브리노겐 성분을 포함하는 전구체 성분을 혼합할 때 매트릭스의 신속한 형성이 있었던 것을 나타내었다. 두 전구체 용액은 모두 나사 줄을 가진 제3 주사기 속으로 동시에 액체로서 주입되어 충분히 중합체화되었다. 매트릭스를 함유하는 조영제는 골에 위치된 커다란 바늘을 통해 양의 척추골 속으로 도입되었다. 상기 겔은 X선 및 형광투시검사를 이용해서 명백하게 시각화될 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> SCHENSE , JASON WATSON, JOHN ARRIGHI, ISABELLE <120> Local Treatment of Bone Defects <130> KUROS 132 <150> US 60/641,830 <151> 2005-01-06 <150> US 60/642,848 <151> 2005-01-10 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Arg Gly Asp Asn 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Asp Gly Ser Arg 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Cys Arg Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Asp Arg Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Ala Lys Asp Val 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Tyr Arg Gly Asp Thr Ile Gly Glu Gly Gln Gln His His Leu Gly Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Homo spaiens <400> 11 Leu Ile Lys Met Lys Pro 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Phe Lys Ser Gln Leu 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Acetylated <222> (1)..(1) <400> 13 Gly Pro Leu Ala Leu Thr Ala Leu 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Acetylated <222> (1)..(1) <400> 14 Pro Phe Glu Leu Arg Ala 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapines <400> 15 Glx Ala Ala Phe Ala 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Pro His Tyr Gly Arg Ser Gly Gly 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Pro Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Tyr Lys Asn Arg 1 <210> 20 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified Parathyroid hormone (PHT), comprisig amino acids 1-34 of native PTH as well as a transglutaminase substrate domain and a plasmin-degradable sequence <400> 20 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Ser Val Ser Glu 1 5 10 15 Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg 20 25 30 Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe 35 40 45 <210> 21 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified Parathyroid hormone (PHT), comprisig amino acids 1-34 of native PTH as well as a transglutaminase substrate domain <400> 21 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met 1 5 10 15 His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu 20 25 30 Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe 35 40 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fusion protein comprising amino acids 283-396 of native Parathyroid hormone and a Transglutaminase substrate domain <400> 22 Met Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Pro Val Glu Leu Pro Leu Ile 1 5 10 15 Lys Met Lys Pro His 20

Claims (34)

  1. PTH 및 BMP 또는 제1 도메인에 PTH 또는 BMP 및 제2 도메인에 공유결합성 가교 기질 도메인(covalently crosslinkable substrate domain)을 포함하는 융합 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 생활성 인자(bioactive factor); 및 치료를 필요로 하는 골 부위에 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물을 포함하는 제제의, 건강하지 않은 골 영역을 국소 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 매트릭스 형성 동안 매트릭스에 공유 결합되는 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물은 주사가능한 것인 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건강하지 않은 골 영역은 골다공증, 골낭종 및 골 종양에 걸린 골 영역들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 제1 도메인과 제2 도메인 사이의 분해 부위를 더 포함하는 것인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PTH는 PTH1 -84, PTH1 -28, PTH1-34, PTH1 -31 및 PTH1 -25로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PTH가 PTH1 -34인 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, BMP가 BMP 2 또는 BMP 7인 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 펩티드의 제2 도메인은 트랜스글루타미나제 기질 도메인을 포함하는 것인 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 트랜스글루타미나제 기질 도메인이 인자 XIIIa 기질 도메인인 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물은 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 공급원(calcium source)을 포함하는 것인 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스는 n개의 친핵성 기를 포함하는 제1 전구체 분자와 m개의 친전자성 기를 포함하는 제2 전구체 분자 간의 마이클 유형 첨가 반응(Michael type addition reaction)에 의해 형성되고, 여기서 n 및 m은 적어도 2이고, n+m의 합은 적어도 5인 것인 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 친전자성 기는 컨쥬게이트화된 불포화기이고, 상기 친핵성 기는 티올류 및 아민류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  14. 제12항에 있어서, 상기 전구체 성분이 작용화된 폴리에틸렌 글리콜인 용도.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 펩티드의 제2 도메인은 적어도 하나의 시스테인을 포함하는 것인 용도.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물은 하나 이상의 성분을 포함하고, 상기 제제는 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물의 성분 중 적어도 하나가 상기 조성물의 다른 성분과 별도로 저장된 키트 내에 제공되는 것인 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 키트는 가교 효소를 추가로 포함하는 것인 용도.
  18. i) 생리적 조건하에 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물;
    ii) PTH, BMP, 또는 PTH 또는 BMP를 포함하는 제1 도메인과 가교성 기질 도메인을 포함하는 제2 도메인인 적어도 2개의 도메인을 포함하는 융합 펩티드; 및
    iii) 조영제
    를 포함하는 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PTH가 PTH1-34인 제제.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물은 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 공급원을 포함하는 것인 제제.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물은 n개의 친핵성 기를 포함하는 제1 전구체 분자 및 m개의 친전자성 기를 포함하는 제2 전구체 분자를 포함하고, 여기서 n 및 m은 적어도 2이고, n+m의 합은 적어도 5인 것인 제제.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조영제는 이오딕사놀, 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로마이드, 이오네프롤(iorneprol), 이오시마이드, 이오타설(iotasul), 이오트롤란(iotrolan), 이오베르솔(ioversol), 이옥실란(ioxilan) 및 메트라자미드(metrizamide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조영제가 이오헥솔인 제제.
  24. 제18항 또는 제23항에 있어서, 상기 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물은 하나 이상의 성분을 포함하고, 상기 제제는 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물의 성분 중 적어도 하나가 상기 조성물의 다른 성분과 별도로 저장된 키트 내에 제공되는 것인 제제.
  25. 천연 또는 합성 매트릭스 재료; PTH 및 BMP로 이루어진 군으로부터 선택된 생활성 인자; 및 조영제를 포함하는 보충 매트릭스.
  26. 제25항에 있어서, 보충 매트릭스는 매트릭스를 형성하는 능력을 가진 조성물; 및 제1 도메인에 생활성 인자 및 제2 도메인에 공유결합성 가교 기질 도메인을 포함하는 융합 펩티드로부터 형성되는 것인 보충 매트릭스.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 PTH는 PTH1-84, PTH1-28, PTH1-34, PTH1-31 및 PTH1-25로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 보충 매트릭스.
  28. 제27항에 있어서, 상기 PTH가 PTH1-34인 보충 매트릭스.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP가 BMP 2 또는 BMP 7인 보충 매트릭스.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 펩티드의 제2 도메인은 트랜스글루타미나제 기질 도메인을 포함하는 것인 보충 매트릭스.
  31. 제30항에 있어서, 상기 트랜스글루타미나제 기질 도메인이 인자 XIIIa 기질 도메인인 보충 매트릭스.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스 재료는 피브린을 포함하는 것인 보충 매트릭스.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스 재료는 n개의 친핵성 기를 포함하는 제1 전구체 분자와 m개의 친전자성 기를 포함하는 제2 전구체 분자 간의 마이클 유형 첨가 반응에 의해 형성되고, 여기서 n 및 m은 적어도 2이고, n+m의 합은 적어도 5인 것인 보충 매트릭스.
  34. 피브리노겐; 트롬빈; 칼슘 공급원; PTH 및 BMP로 이루어진 군으로부터 선택된 생활성 인자; 및 조영제를 포함하는 키트.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8575101B2 (en) 2005-01-06 2013-11-05 Kuros Biosurgery Ag Supplemented matrices for the repair of bone fractures
EP1833522B1 (en) * 2005-01-06 2016-06-22 Kuros Biosurgery AG Supplemented matrices for the repair of bone fractures
BRPI0712910B8 (pt) 2006-05-26 2021-05-25 Baxter Int sistema de múltiplos componentes para uma composição de aumento ósseo injetável, e, composição de aumento ósseo injetável
EP2021043B1 (en) * 2006-05-26 2011-01-12 Baxter International Inc. Injectable bone void filler
AU2014200027B2 (en) * 2007-03-26 2015-10-29 Baxter Healthcare Sa Injectable void filler for soft tissue augmentation
US20080241072A1 (en) 2007-03-26 2008-10-02 Baxter International Inc. Injectable void filler for soft tissue augmentation
EP2155874B1 (en) 2007-04-09 2016-05-11 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone
MX2009011005A (es) 2007-04-13 2009-11-02 Kuros Biosurgery Ag Sellador polimerico para tejido.
US8062364B1 (en) 2007-04-27 2011-11-22 Knee Creations, Llc Osteoarthritis treatment and device
WO2009047361A2 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Kuros Biosurgery Ag Injectable fibrin compositions for tissue augmentation comprising strontium salt
WO2009083544A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
EP2279021B1 (en) 2008-04-18 2013-02-13 Kuros Biosurgery AG Dispensing device, kit containing the device, and method of operating the device
CN101868245B (zh) * 2008-05-16 2013-10-23 全南大学校产学协力团 含有用于刺激成骨细胞分化的骨形成肽1（bfp1）的合成肽及含有上述合成肽的药物组合物
US8025872B2 (en) 2008-05-16 2011-09-27 Industry Foundation Of Chonnam National University Osteogenic synthetic peptides, pharmaceutical compositions comprising the same, and medium containing the same
WO2009154330A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 Industry Foundation Of Chonnam National University An synthetic peptide containing bone forming peptide 2(bfp 2) for stimulating osteoblast differentiation, and pharmaceutical composition comprising the synthetic peptide
EP2311482A1 (en) * 2009-10-12 2011-04-20 Industry Foundation Of Chonnam National University Osteogenic synthetic BMP-7 peptides, pharmaceutical compositions cell culture medium containing same
US9717779B2 (en) * 2011-01-31 2017-08-01 Warsaw Orthopedic, Inc. Implantable matrix having optimum ligand concentrations
WO2012123028A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Kuros Biosurgery Ag Pharmaceutical formulation for use in spinal fusion
WO2013120060A1 (en) 2012-02-09 2013-08-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein
CA2859412C (en) 2011-12-14 2021-05-25 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Delivery of therapeutic agents using bacterial collagen-binding polypeptide segments
US9550012B2 (en) 2013-08-05 2017-01-24 University Of Notre Dame Du Lac Tissue scaffolds having bone growth factors
US20180214572A1 (en) * 2014-11-10 2018-08-02 Ethris Gmbh Induction of osteogenesis by delivering bmp encoding rna
GB2545880A (en) * 2015-10-20 2017-07-05 Glide Pharmaceutical Tech Ltd Solid formulation
AU2017204355B2 (en) 2016-07-08 2021-09-09 Mako Surgical Corp. Scaffold for alloprosthetic composite implant
JP7397440B2 (ja) 2017-02-10 2023-12-13 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー コラーゲン結合薬剤組成物およびその使用方法
EP3536353A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-11 Kuros Biosurgery AG Method and kits for producing a fibrin matrix

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4086196A (en) * 1975-03-28 1978-04-25 Armour Pharmaceutical Company Parathyroid hormone
SE8200751L (sv) * 1982-02-09 1983-08-10 Olle Larm Forfarande for kovalent koppling for framstellning av konjugat och hervid erhallna produkter
DE3433210C1 (de) * 1984-09-10 1986-06-05 Hans Dr.med. Dr.med.dent. 8000 München Scheicher Mittel zur Fuellung von Knochen- und Zahndefekten,zum Knochenaufbau,fuer Knochenkontaktschichten und fuer Knochen- und Zahnwurzelersatz und Verwendung von Carbonatapatit fuer diesen Zweck
IL74617A (en) * 1985-03-15 1988-11-15 Yeda Res & Dev Compositions comprising a vitamin d derivative and method for the local treatment of bone fractures in animals
WO1989000051A1 (en) 1987-07-07 1989-01-12 Cytrx Biopool Ltd. Fibrin-binding compound and method
US5504001A (en) * 1987-11-25 1996-04-02 Zymogenetics, Inc. Hybrid plasminogen activator
US5582862A (en) * 1988-04-04 1996-12-10 General Hospital Corporation Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin
US5100668A (en) * 1988-06-14 1992-03-31 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release systems containing heparin and growth factors
US5137819A (en) * 1988-07-08 1992-08-11 University Of British Columbia Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides
DE68928532T2 (de) 1988-11-09 1998-05-28 Protein Polymer Tech Inc Funktionelles, durch ein rekombinantes verfahren hergestelltes synthetisches proteinpolymer
US5171670A (en) * 1989-05-12 1992-12-15 The General Hospital Corporation Recombinant dna method for production of parathyroid hormone
US5169764A (en) 1990-08-08 1992-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors, and nucleic acids and plasmids encoding the chimeras
ATE212554T1 (de) 1990-11-27 2002-02-15 American Nat Red Cross Gewebeabdeckung und wachstumsfaktor enthaltende verbindungen zur förderung beschleunigter wundheilung
US6054122A (en) * 1990-11-27 2000-04-25 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US6117425A (en) * 1990-11-27 2000-09-12 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, method of their production and use
US6559119B1 (en) * 1990-11-27 2003-05-06 Loyola University Of Chicago Method of preparing a tissue sealant-treated biomedical material
US6197325B1 (en) * 1990-11-27 2001-03-06 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
SE9101853D0 (sv) 1991-06-17 1991-06-17 Jonas Wadstroem Improved tissue ashesive
AU675051B2 (en) * 1991-09-05 1997-01-23 Baxter International Inc. Topical fibrinogen complex
SE470006B (sv) * 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5814603A (en) * 1992-06-12 1998-09-29 Affymax Technologies N.V. Compounds with PTH activity
US5589452A (en) * 1992-07-14 1996-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis
US5310538A (en) * 1993-03-11 1994-05-10 Sterling Winthrop Inc. Compositions of iodophenoxy alkylene ethers in film-forming materials for visualization of the gastrointestinal tract
WO1994020133A1 (en) 1993-03-12 1994-09-15 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
TW303299B (ko) * 1993-07-22 1997-04-21 Lilly Co Eli
US5428014A (en) * 1993-08-13 1995-06-27 Zymogenetics, Inc. Transglutaminase cross-linkable polypeptides and methods relating thereto
US5773577A (en) 1994-03-03 1998-06-30 Protein Polymer Technologies Products comprising substrates capable of enzymatic cross-linking
WO1996006181A1 (fr) 1994-08-23 1996-02-29 Drug Delivery System Institute, Ltd. Procede de modification de proteine
AU717906B2 (en) 1994-12-07 2000-04-06 American National Red Cross, The Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US5747456A (en) * 1994-12-19 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Continuous low-dose administration of parathyroid hormone or its agonist
US5693341A (en) * 1995-03-16 1997-12-02 Collagen Corporation Affinity bound collagen matrices for the delivery of biologically active agents
US5561982A (en) * 1995-05-02 1996-10-08 Universal Vortex, Inc. Method for energy separation and utilization in a vortex tube which operates with pressure not exceeding atmospheric pressure
JP2000500019A (ja) * 1995-11-16 2000-01-11 ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法
US7026292B1 (en) * 1995-12-12 2006-04-11 Stryker Corporation Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors
CA2239775C (en) * 1995-12-18 2008-07-15 Collagen Corporation Crosslinked polymer compositions and methods for their use
US5874308A (en) * 1996-01-16 1999-02-23 University Of British Columbia Compositions and methods for modulating cell proliferation using growth factor-polysaccharide binding fusion proteins
US6221854B1 (en) * 1996-03-05 2001-04-24 Orquest, Inc. Method of promoting bone growth with hyaluronic acid and growth factors
US6026957A (en) * 1996-03-27 2000-02-22 The Procter & Gamble Company Flexible paper covered package and process for producing same
US5877153A (en) * 1996-06-11 1999-03-02 Commonwealth Biotechnologies Inc. Heparin-binding peptides
EP0950665A4 (en) 1996-09-26 2004-05-06 Ajinomoto Kk PHYSIOLOGICALLY ACTIVE MODIFIED PROTEINS AND DRUG COMPOSITIONS CONTAINING THEM
WO1998043686A1 (en) * 1997-04-03 1998-10-08 California Institute Of Technology Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering
AU748271B2 (en) 1997-12-18 2002-05-30 Eli Lilly And Company Crystalline teriparatide
US5958874A (en) * 1998-02-18 1999-09-28 The Research Foundation Of State University Of New York Recombinant fibronectin-based extracellular matrix for wound healing
DE19816858A1 (de) 1998-04-16 1999-10-21 Merck Patent Gmbh Tricalciumphosphathaltige Biozementpasten mit Kohäsionspromotoren
AR033639A1 (es) * 1998-08-19 2004-01-07 Lilly Co Eli Uso de hormonas paratiroideas para preparar medicamentos para reducir el riesgo de fracturas oseas vertebrales o no vertebrales en seres humanos con riesgo de padecer o que padecen osteoporosis
US7601685B2 (en) * 1998-08-27 2009-10-13 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US6894022B1 (en) * 1998-08-27 2005-05-17 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
EP2311895B1 (en) 1999-02-01 2017-04-12 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Biomaterials formed by nucleophilic addition reaction to conjugated unsaturated groups
AU3438199A (en) 1999-04-22 2000-11-10 Eth Zurich Controlled release of growth factors from heparin containing matrices
WO2001000792A1 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Marchosky J Alexander Compositions and methods for forming and strengthening bone
US7052856B2 (en) * 1999-10-05 2006-05-30 The Regents Of The University Of California NELL-1 enhanced bone mineralization
DE20010297U1 (de) 2000-06-08 2000-08-31 Eth Zuerich Zuerich Enzymvermittelte Modifizierung von Fibrin zur Gewebemanipulation: Fibrin-Formulierungen mit Peptiden
US6949251B2 (en) * 2001-03-02 2005-09-27 Stryker Corporation Porous β-tricalcium phosphate granules for regeneration of bone tissue
CA2367636C (en) * 2001-04-12 2010-05-04 Lisa Mckerracher Fusion proteins
ATE420670T1 (de) 2001-04-25 2009-01-15 Eidgenoess Tech Hochschule Arzneimittel freisetzende matrizen zur förderung der wundheilung
WO2003040235A1 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Universität Zürich Synthetic matrix for controlled cell ingrowth and tissue regeneration
US7247609B2 (en) * 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
JP4560291B2 (ja) * 2001-12-18 2010-10-13 イジュノシッヒ テクニッヒ ホッフシューラ チューリッヒ 組織操作のための成長因子改変タンパク質マトリクス
AU2002361860A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-15 Richard J. Lagow Calcium phosphate bone replacement materials and methods of use thereof
AU2003226688B2 (en) * 2002-03-22 2009-08-13 Kuros Biosurgery Ag Composition for hard tissue augmentation
AU2003225212A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-17 Gel-Del Technologies, Inc. Biomatrix structural containment and fixation systems and methods of use thereof
US20040002770A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-01 King Richard S. Polymer-bioceramic composite for orthopaedic applications and method of manufacture thereof
WO2004071543A1 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 Synthes Ag Chur Injectable bone-replacement mixture
US20050208095A1 (en) * 2003-11-20 2005-09-22 Angiotech International Ag Polymer compositions and methods for their use
DE10355992A1 (de) * 2003-11-27 2005-06-30 Curasan Ag Bioresorbierbares Kompositmaterial
WO2006067221A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Kuros Biosurgery Ag Michael-type addition reaction functionalised peg hydrogels with factor xiiia incorporated biofactors

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