SE470006B - Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet - Google Patents

Description

470 lO 15 20 25 30 35 006 tillstànd, har man därför sedan en längre tid tillbaka in- riktat sig på att i stället försöka uppnå den önskade koa- gulationshindrande effekten genom att modifiera det kropps- främmande material som blodet kommer i kontakt med genom ytbindning av heparin. Avgörande faktorer, som stimulerat denna utveckling, har varit att heparinets struktur-aktivi- tetssamband klarlagts, och att heparinliknande aktivitet påvisats på den naturliga kärlväggen. Således har det under de senaste åren publicerats flera rapporter om framgångsrik extrakorporeal behandling med system som försetts med ytbundet heparin.

Ytmodifiering med heparin har dock inte inskränkt sig till de ovan angivna sammanhangen med extrakorporeal blod- cirkulation, utan har kommit att betraktas som en mer gene- rell lösning på problemet att uppnå biokompatibilitet hos olika hjälpmedel inom sjukvården som kommer i kontakt med blod och andra kroppsvävnader. Exempelvis har man även an- vänt sig av ytheparinisering av intraokulära linser för att öka deras biokompatibilitet.

De hittills använda tekniska lösningarna pà problemet att immobilisera heparin kan indelas i två huvudprinciper, jonbundet och kovalent bundet heparin, vilka beskrivs när- mare i det följande. För att uppnå en yta som uppvisar den eftersökta biokompatibiliteten baserat på immobiliserat heparin är det viktigt att heparin immobiliseras så att den biologiska aktiviteten bibehålls. Som inledningsvis nämnts återfinns heparinets biologiska aktivitet i en specifik antitrombinbindande pentasackaridstruktur, som måste förbli intakt efter immobiliseringen på ytan för att kunna växel- verka med blodets beståndsdelar. I flertalet vetenskapliga artiklar och patent som berör immobilisering av heparin, i synnerhet sådana som publicerats tidigare än 1980, har denna aspekt ej tillgodosetts, och än mindre har resultat redovisats, som möjliggör en bedömning om framställningsme- toden resulterar i en fullgod biokompatibel yta. I det följande ges en översikt av tidigare kända metoder att im- mobilisera heparin. 10 15 20 25 30 35 470 006 I. JONBUNDET HEPARIN Eftersom heparin innehåller ett stort antal negativt laddade grupper kan heparinmolekylen binda relativt starkt till katjonytor enbart via elektrostatisk interaktion. Ett vanligt utföringssätt är att fälla ut heparin från en vattenlösning med en katjontensid, för att sedan lösa upp den torkade utfällningen med ett organiskt lösningsmedel.

Den senare lösningen utnyttjas sedan för ett s.k. "dip- dry"-förfarande. Olika grenade tensider har prövats i syfte att fördröja utlösningshastigheten. Andra förfaranden bygger på adsorption av heparin till kvaternära ammoniumgrupper. En stor nackdel, som de jonbundna hepa- rinytorna har gemensamt, är att deras stabilitet med av- seende på utlösning av heparin i kontakt med blod är otill- räcklig.

O. Larm et al. beskriver i Biomat., Med. Dev., Art.

Org., ll (1983) 161-173 bl.a. ett sätt att preparera en stabil jonbunden yta. Det bundna heparinet rapporterades dock ha förlorat sin biologiska aktivitet, vilket kan sättas i samband med förhållandet att varje enskild hepa- rinmolekyl bundits upp alltför starkt, så att den anti- trombinbindande sekvensen ej kunde växelverka med cirkule- rande komponenter i blod.

Stabiliseringsbehandling av ett jonbundet heparinkom- plex med glutaraldehyd har beskrivits i US-A-3,810,78l och US-A-4,1l8,485. Som framgår av vetenskapliga rapporter med- för dessa framställningsalternativ ej helt stabila ytor.

Således frisätts heparin och sannolikt olika reaktionspro- dukter med glutaraldehyd till blodbanan under den initiala kontaktfasen.

II. KOVALENT BUNDET HEPARIN Från en renodlat kemisk synvinkel finns det ett fler- tal olika sätt att immobilisera heparin med kovalenta bind- ningar. Med bromcyan, karbodiimid och liknade allmänt ut- nyttjade kopplingsreagens finns det dock en uppenbar risk att varje heparinmolekyl blir uppbunden av flera bindningar inklusive bindningar i den aktiva sekvensen, och att hepa- rinet därigenom förlorar sin biologiska aktivitet. Kova- 470 10 15 20 25 30 35 006 lenta kopplingsreagens är dessutom alltid i sig toxiska och bör därför inte komma i kontakt med slutprodukten.

US-A-4,6l3,665 beskriver emellertid ett sätt att kop- pla heparin och andra polysackarider via en enda reaktiv aldehydgrupp terminalt placerad i heparinmolekylen. Härige- nom kan heparin bindas kovalent utan att den antitrombin- bindande sekvensen blir involverad i koppling. Dock förut- sätter metoden att heparin partiellt degraderas och att det starkt toxiska ämnet cyanoborhydrid finns närvarande i det slutliga preparationssteget.

EP-A-351 314 beskriver ett sätt att koppla heparin till substratytor innehållande fria aminogrupper (genom be- handling av ytan med t.ex. polyetylenimin eller kitosan) genom att utnyttja fria aminogrupper hos heparin som genom- gått N-desulfatering. Tvärbindning sker sedan med polyfunk- tionella aldehyder som t.ex. glutaraldehyd. Reaktionssteget med glutaraldehyd kan dock ej styras med säkerhet för att undvika att den aktiva sekvensen blir involverad, och meto- den som sådan är relativt komplicerad att utföra ur teknisk synpunkt.

US-A-4,239,664 beskriver en PVP-heparinpolymer som framställts via modifiering av PVP så att denna polymer in- nehàller imidoyljoner som sedan får reagera med hydroxylgrupper på heparin. Metoden ger med nödvändighet multipla ospecifika bindningar till heparin, vilket menligt inverkar på den biologiska aktivitetenl'PVP-heparinpolyme- ren anges följdriktigt ha làg antikoagulansaktivitet.

Som framgått av det ovanstående är således de hittills kända metoderna för ytheparinisering behäftade med mer el- ler mindre allvarliga nackdelar. Det finns därför ett behov av en metod för ytheparinisering som är enkel att utföra och ger en stabil hepariniserad yta fri från toxiska substanser och med bibehållen biologisk aktivitet hos hepa- rinet. Även heparinets användning som terapeutiskt medel har begränsningar genom heparinets korta halveringstid och/eller affinitet. Detta gäller inte minst dess använd- ning som antikoagulationsmedel, men även exempelvis dess 10 15 20 25 30 35 470 005 studerade användning som tillväxthämmare av glatta muskel- celler vid kärlskador (hyperplasi), som antiinflammatoriskt medel vid t.ex. reumatoid artrit, och som medel för att reglera nybildningen av blodkärl (angiogenes). En översikt över heparinets olika egenskaper återfinns i "Heparinz Cli- nical and biological properties. Clinical applications." Eds: Lane and Lindahl, Edward Arnold, London, 1989. Det finns därför ett behov av heparinpreparationer med förlängd halveringstid och ökad affinitet.

Enligt föreliggande uppfinning föreslås ett nytt bio- logiskt aktivt konjugat baserat på sulfaterade glykosamino- glykaner, medelst vilket de senares egenskaper kan utnytt- jas betydligt effektivare än med de enskilda substanserna.

Ett sådant konjugat kan bland annat enkelt fås att bindas stabilt till en substratyta med affinitet till konjugatet och kan därmed i exempelvis fallet med heparin användas för enklare och effektivare ytheparinisering än med tidigare metoder. Vidare kan ett sådant konjugat ge glykosaminoglykanpreparationer med längre halveringstid och förbättrad affinitet än preparationer baserade på de rena substanserna.

Som redan nämnts för heparin förekommer de sulfaterade glykosaminoglykanerna naturligt bundna till proteiner. Sá- ledes är exempelvis i heparinfallet ca 15 heparinkedjor bundna till ett protein på ca 25 aminosyrarester, medan en proteoglykan innehållande heparansulfat har färre och be- tydligt glesare anordnade heparansulfatkedjor. De naturliga konjugaten är mycket besvärliga att framställa i ren form och har så vitt vi vet inte föreslagits för terapeutisk el- ler liknande användning. Uppfinningen baserar sig på tanken att åstadkomma ett halv- eller helsyntetiskt konjugat mel- lan sulfaterade glykosaminoglykaner och en polymer bärare, vilket, bland annat genom att de innehåller fler molekyler av glykosaminoglykanen ifråga, har förbättrade egenskaper i förhållande till såväl de enskilda glykosaminoglykanerna som de naturliga konjugaten och som vidare har den bety- dande fördelen att den relativa sammansättningen kan A 7Û 10 15 20 25 30 35 006 varieras på ett kontrollerbart sätt för att passa olika tillämpningar.

I sin bredaste omfattning avser således föreliggande uppfinning ett biologiskt aktivt konjugat mellan en polymer bärare och ett flertal sulfaterade glykosaminoglykanmolekyler, vilket kännetecknas av att bäraren är en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan, via vilka åtminstone cirka 20 molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner förankrats genom kovalenta bindningar till bildning av ett vattenlösligt konjugat, varvid varje glykosaminoglykanmolekyl väsentligen är bunden till polymerstamkedjan via endast en bindning, företrädesvis terminalt.

Ett sådant konjugat kan begreppsmässigt beskrivas som en syntetisk proteoglykan, vars relativa sammansättning kan varieras på ett kontrollerbart sätt och anpassas till av- sedd applikation.

Uttrycket "sulfaterade glykosaminoglykaner" avses här omfatta inte bara de substanser som normalt innefattas i begreppet, som t.ex. heparin, heparansulfat, dermatansulfat och chondroitin, utan även för ändamålet fungerande frag- ment och derivat av dessa substanser.

Den i huvudsak linjära polymerkedja som skall fungera som bärare för glykosaminoglykanresterna bör givetvis vara väsentligen biologiskt inert efter kopplingen av glykosaminoglykanen eller -glykanerna ifråga, i den me- ningen att den skall sakna åtminstone störande biologisk aktivitet. Som lätt inses bör den för att medge koppling av ett flertal glykosaminoglykanrester vara försedd med ett antal funktionella grupper, som t.ex. amino-, hydroxyl- el- ler karboxylgrupper, fördelade utefter kedjan och kapabla att, efter eventuell modifiering, koppla till glykosamino- glykanen, antingen direkt eller via en kopplingssekvens.

Det bör i detta sammanhang påpekas att glykosaminoglykanen ifrága, beroende pà dess framställning, kan ha kvar en ter- minal rest fràn sitt naturliga konjugatprotein, och att 'b 10 15 20 25 30 35 470 006 bindningen då med fördel givetvis kan ske via t.ex. en aminosyra i en sådan rest.

Bärarpolymeren bör vidare helst ha god löslighet i vatten. Åtminstone skall den i enlighet med vad som tidi- gare sagts om konjugatet efter påkopplingen av glykosamino- glykangrupperna vara åtminstone väsentligen vattenlöslig.

Specifika polymerkedjor som kan vara lämpliga för uppfin- ningens ändamål blir utan vidare uppenbara för fackmannen efter att ha tagit del av det allmänna uppfinningskoncep- tet. Detta gäller givetvis även den grad av förgrening pà polymerkedjan som kan tillåtas inom ramen för uttrycket "i huvudsak linjär".

Företrädesvis är dock polymerkedjan en naturlig eller syntetisk polypeptid, polysackarid eller alifatisk polymer.

Som speciella exempel kan nämnas polylysin, polyornitin, kitosan, polyimin och polyallylamin.

Med hänsyn till att det vanligtvis är önskvärt att glykosaminoglykanen bibehåller sin biologiska aktivitet efter bindningen till den polymera bäraren, är det föredra- get att varje glykosaminoglykanmolekyl binds terminalt till bärarpolymeren. Lämpligtvis binds glykosaminoglykanen via en aminosyra, och då företrädesvis en terminal sådan, men även fria aminogrupper i glykosaminenheten kan utnyttjas.

De senare kan förekomma fria som sådana eller ha frigjorts genom desulfatering.

Antalet glykosaminoglykanrester per polymerstamkedja är som ovan nämnts minst cirka 20, men företrädesvis betyd- ligt fler, särskilt minst 30, helst minst 60 och vanligtvis fler än 100, såsom kommer att framgå av de längre fram re- dovisade utföringsexemplen. Den övre gränsen beror på om- ständigheterna och sätts bl.a. av löslighetsegenskaperna hos den valda bärarpolymeren, hur hög viskositet som kan tillåtas etc. Det optimala antalet glykosaminoglykanenheter beror, förutom på den avsedda användningen av det speciella konjugatet, även på bärarpolymeren, och då inte minst dess storlek. I fallet med elektrostatisk bindning av konjugatet till en substratyta, vilket kommer att diskuteras närmare nedan, kommer givetvis även substratytans laddningstäthet 4-70 10 15 20 25 30 35 006 in i bilden. Således skall glykosaminoglykanresterna inte sitta så tätt att de stör varandra men de bör inte heller sitta för glest. Som exempel kan nämnas att t.ex. polylysin som bärarpolymer bör ha en molekylvikt större än ca 50.000.

Lämpligt antal glykosaminoglykanrester för varje speciell bärarpolymer resp. användning torde dock lätt kunna fast- ställas av fackmannen.

Särskilt i det fall att en aminofunktionell polymer utnyttjas som bärare, kan det i vissa fall, i synnerhet då polymerstamkedjan är glest substituerad med glykosaminogly- kan, vara gynnsamt att blockera kvarvarande fria amino- grupper, vilket t.ex. kan ske med acetylering.

Som redan antytts tidigare kan det nya konjugatet en- ligt uppfinningen bindas till en yta som har affinitet till konjugatet (vanligtvis men inte nödvändigtvis till glykosaminoglykanresterna) för att på så sätt förläna ytan önskad biologisk aktivitet. Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen åstadkommas en sålunda preparerad yta genom att man under lämpliga betingelser helt enkelt för ett åtminstone väsentligen vattenlösligt biologiskt aktivt konjugat innefattande en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan, via vilka ett flertal molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner förankrats genom kovalenta bindningar, i kontakt med en yta som har affinitet till konjugatet, så att konjugatet binds väsentligen irreversibelt därtill. Ännu en aspekt av uppfinningen avser en preparerad substratyta innefattande ett till ytan bundet biologiskt aktivt konjugat, vilken kännetecknas av att konjugatet är väsentligen vattenlösligt och innefattar en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan, via vilka ett C flertal molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner förankrats genom kovalenta bindningar, varvid varje glykosaminoglykanmolekyl väsentligen är bunden till polymerstamkedjan via endast en bindning, företrädesvis terminalt, och att konjugatet vidare är 10 15 20 25 30 35 affinitetsbundet till ytan, företrädesvis genom elektro- statisk interaktion mellan konjugatet och substratytan.

En föredragen form av affinitet mellan konjugatet och substratytan är sådan av elektrostatisk natur, och närmare bestämt att bindning sker genom elektrostatisk interaktion mellan glykosaminoglykanresterna och substratytan, såsom kommer att belysas närmare i det följande.

Eftersom glykosaminoglykanmolekylerna i ett konjugat enligt uppfinningen föreligger i stort överskott i förhål- lande till bärarpolymeren, kan konjugatet betraktas som en "makromolekylär glykosaminoglykan". Antalet anjongrupper per konjugat kommer därvid att vida överskrida det antal som finns per glykosaminoglykanmolekyl, vilket medför att konjugatet, i kraft av sin storlek, genom jonisk interak- tion kan bindas irreversibelt till en katjonyta. För att konjugatet skall frigöras från ytan måste ju alla glykosaminoglykanrester släppa från ytan samtidigt, vilket till skillnad från frigöring av "fria" glykosaminoglykanmolekyler kräver en betydande energitillförsel.

Med undantag av vissa situationer som kommer att beskrivas längre fram är det vanligtvis avsett att konjugatets biologiska aktivitet skall härröra från glykosaminoglykanresterna. I sådant fall måste antalet glykosaminoglykanrester vara tillräckligt för att en viss andel av dessa per bärarpolymerkedja tillsammans skall kunna förmedla en stark, irreversibel bindning till en yta som försetts med katjongrupper, medan återstående glykosaminoglykankedjor fritt kan utöva sin biologiska aktivitet genom att växelverka med den aktuella omgivningen, t.ex. blodets beståndsdelar.

Ytpreparering med en glykosaminoglykan enligt ovan bygger således på en kombination av kovalent bindning och joninteraktion. En betydande fördel är härvid att konjuga- tet framställs som en mellanprodukt, vilket medför att all kopplingskemi kan göras separerat från slutprodukten. Vi- dare blir den slutliga ytmodifieringsprocessen mycket enkel och kan genomföras på ett reproducerbart sätt. Exempelvis 10 15 20 25 30 35 C- CI) Qx 10 erbjuder därför, som redan nämnts, ytheparinisering med ett heparinkonjugat enligt uppfinningen en i förhållande till nuvarande ythepariniseringsmetoder avsevärt förenklad metod för effektiv heparinisering.

Ett konjugat för användning enligt denna speciella as- pekt av uppfinningen har således en elektrostatisk netto- laddning som är tillräcklig för att medge väsentligen irre- versibel bindning till en motsatt laddad substratyta.

Det substratmaterial som skall ytprepareras, t.ex. yt- hepariniseras, enligt uppfinningen kan i princip vara vil- ket material som helst som man önskar göra biokompatibelt, förutsatt att dess yta är eller kan göras katjonisk. Det kan här som beskrivits tidigare vara frågan om ett kropps- främmande material som olika polymerer, metaller och kera- mer. Det kan emellertid även vara frågan om ett kroppseget material, dvs en vävnadsyta som uppvisar affinitet för glu- kosaminen ifråga. I detta sammanhang är det av intresse att notera att den friska naturliga kärlväggen i sin yttersta struktur mot blodet innehåller sulfaterade glykosaminogly- kaner med antitrombinbindande pentasackaridsekvenser.

Olika metoder för att göra en substratyta katjonisk är välkända. En lämplig metod har visat sig vara behandling med polyimin, men även andra polyaminer som t.ex. poly- lysin, kitosan eller polyallylamin, kan utnyttjas, såsom beskrivs i utföringsexemplen nedan.

Det nya glykosaminoglykankonjugatet kan inom ramen för uppfinningen även innehålla kedjor av en eller flera andra substanser bundna till bärarpolymeren förutom glykosamino- glykankedjorna, t.ex. med någon annan biologiskt aktiv sub- stans. En sådan annan biologiskt aktiv substans kan härvid vara avsedd att verka samtidigt med glykosaminoglykan- aktiviteten. I andra fall är man endast intresserad av den kompletterande substansens biologiska aktivitet, varvid glykosaminoglykanerna enbart utnyttjas för affinitetsbind- ningen till substratytan. Konjugatet enligt uppfinningen kan således även enbart fungera som bärare för önskade biologiskt aktiva substanser som man vill binda till en yta. Exempel på substanser som förutom glykosamino- 10 15 20 25 30 35 470 006 11 glykanerna kan bindas till polymerstamkedjan är till- växtfaktorer, enzymer, antikroppar, matrixproteiner, ste- roider etc. Det bör i detta sammanhang även noteras att ett konjugat med mycket specifika adsorptionsegenskaper exem- pelvis kan åstadkommas med monoklonala antikroppar som kom- plement till glykosaminoglykanenheterna.

Eventuellt kan det vid sådana kombinerade konjugat vara önskvärt att undertrycka glykosaminoglykanens egen biologiska aktivitet, vilket exempelvis i fallet med hepa- rinets koagulationshämmande aktivitet kan ske genom desul- fatering. I ett sådant fall är sålunda konjugatets biologiska aktivitet helt knuten till denna eller dessa kompletterande substanser som är bundna till polymerstam- kedjan. Även om det i många fall är den ytbindande effekten hos konjugatet som är väsentlig, för att inte säga nödvän- dig, är den dock i vissa fall av mindre intresse, och det kan till och med för vissa applikationer vara önskvärt att undertrycka den mer eller mindre fullständigt. På samma sätt kan det som ovan nämnts för de kombinerade konjugaten även i fallet med ett rent glykosaminoglykankonjugat vara önskvärt att eliminera eller åtminstone reducera glykosaminoglykanernas biologiska aktivitet. I en del fall, som t.ex. för heparin, kan glykosaminoglykanen ha flera olika biologiska effekter, och beroende på den tilltänkta applikationen kan då en biologisk aktivitet undertryckas till förmån för en annan. Exempelvis kan för heparin enligt ovan antikoagulationseffekten inhiberas genom desulfatering, medan annan biologisk aktivitet som inte är knuten till den tidigare nämnda pentasackaridenheten förblir opåverkad.

Som framgår av det ovanstående kan således sammansätt- ningen hos det nya konjugatet varieras inom vida gränser för att anpassas till olika användningsområden.

En ytterligare aspekt av uppfinningen avser framställ- ning av det beskrivna konjugatet genom att man tillhanda- håller en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett an- tal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan 470 10 15 20 25 30 35 CD CD 0\ 12 och till dessa funktionella grupper, eventuellt via ett kopplingsreagens, kovalent binder ett flertal molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner, så att ett åtminstone väsentligen vattenlösligt konjugat bildas, varvid varje glykosaminoglykanmolekyl väsentligen binds till polymerstamkedjan via endast en bindning, företrädesvis terminalt. Detta kan inom ramen för uppfinningen ske på flera olika sätt.

Således kan glykosaminoglykanen t.ex. bindas direkt till en aminofunktionell polymerkedja under utnyttjande av nitritdegraderad glykosaminoglykan med en terminalt pla- cerad aldehydgrupp framställd enligt den metod som beskrivs i US-A-4,613,665. Denna metod innebär dock en begränsning till partiellt degraderad glykosaminoglykan, och substitu- tionsgraden är svår att kontrollera. Dessutom uppstår prak- tiska svårigheter genom att polymeren lätt fälls ut av glykosaminoglykanen om inte högt pH (>9) eller hög jonstyrka (>3 M) föreligger, vilka betingelser är ogynnsamma för kopplingsreaktionen.

Enligt en föredragen metod binds istället glykosamino- glykanen till polymerkedjan med hjälp av ett kopplingsrea- gens, och företrädesvis ett heterobifunktionellt sådant.

Det kan anmärkas att bifunktionella kopplingsreagens för t.ex. hydroxyl- eller aminogrupper dock generellt sett inte kan utnyttjas, eftersom dessa kommer att leda till såväl intra- som intermolekylär tvärbindning med blockering res- pektive aggregering som följd.

Som exempel på hur ett konjugat enligt uppfinningen kan framställas kommer i det följande koppling av heparin till polylysin att kort beskrivas. Genom att välja ett po- lylysin med molekylvikt över 400.000 kan en syntetisk pro- teoglykan med upptill 500 heparinkedjor per bärarmolekyl framställas. Ett härför lämpligt heterobifunktionellt kopp- lingsreagens, N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionate (SPDP), kopplas till aminogrupper på polylysin, varefter det SPDP-substituerade polylysinet renas kromatografiskt. I ett separat kopplingsteg kopplas även ÉPDP till aminogrup- per på heparin, som antingen finns i terminala aminosyra- f) 'a 10 15 20 25 30 35 470 Gßó 13 rester eller som fri glykosamin (den senare halten kan sty- ras via N-desulfatering eller N-deacetylering). SPDP-grup- perna reduceras till tiol-funktion, varefter det SH-substi- tuerade heparinet renas kromatografiskt. Halten av SPDP- grupper hos polylysin respektive SH-grupper hos heparin be- stäms spektrofotometriskt, och heparin blandas med poly- lysin i ekvimolär mängd med avseende på SPDP och SH, varvid heparin binds kovalent till polylysin via disulfidutbyte, vars reaktionshastighet kan följas spektrofotometriskt. Det har överraskande visat sig att fällningsreaktionen mellan polylysin och heparin uteblir, då polylysin försetts med SPDP-grupper, även om endast en viss andel av polylysinets aminogrupper substituerats. Icke desto mindre har praktiska experiment visat att disulfidutbytet sker snabbare och gär till fullständighet först vid hög salthalt (lämpligen 3 M NaCl). Dä reaktionen gått till fullständighet renas konju- gatet kromatografiskt, varvid fritt heparin och làgmo- lekylära reaktionsprodukter avskiljs.

Beträffande det på så sätt framställda heparinkonjuga- tets stabilitet i olika miljöer har det överraskande visat sig att de erhållna disulfidbryggorna som kopplar heparin till polymerstamkedjan inte kan spjälkas med glutation utan endast med lågmolekylära icke-fysiologiska tiolreagens, som t.ex. merkaptoetanol.

Det förtjänar vidare att nämnas att en icke oväsentlig fördel med heparinisering med ett heparinkonjugat enligt uppfinningen ligger i att man kan utgå från en mindre upp- arbetad heparinråvara än vid de konventionella förfaran- dena.

Uppfinningen belyses närmare i de följande utfö- ringsexemplen.

EXEMPEL 1 Preparering av konjugat och test av ytbunden biologisk aktivitet Två olika batcher av heparin (Heparin, Kabi Pharmacia AB, Sverige, molekylvikt ca 12.000) användes._Inneháll av aminosyror och relativ förekomst av fria primära aminogrup- per analyserades, varvid följande resultat erhölls. 470 10 15 20 25 30 35 086 14 Aminosyrakväve Totalkväve Primär amin (pg/ml) (pg/ml) (rel. skala) Heparin A 0,36 5,38 5000 Heparin B 0,08 5,37 340 Eftersom heparin B uppvisade mycket låg halt av fri amin, utfördes N-desulfatering enligt den metod som beskri- vits av Yuko Inone et al, Carbohydrate Research, 46 (1976) 87-95. Efter utförd N-desulfatering erhölls värdet 18.000 på den relativa skalan för primär amin.

Heparin A och heparin B (desulfaterat) löstes i fosfatbuffert, pH 7,5, (200 mg/4 ml), vartill tillsattes 1 ml SPDP (10 mg/ml MeOH) under omrörning, och reaktionen fick fortgå tjugo minuter. Det sålunda SPDP-substituerade heparinet renades på_SephadexC)G-25 (Pharmacia LKB Biotechnologv AB, Sverige). Till 100 ul av det erhållna provet tillsattes 900 pl ditiotreitol (DTT, 10 mg/ml), och den erhållna absorbansen mättes spektrofotometriskt vid 343 nm. Substitutionsgraden blev för heparin A 0,21 och för heparin B (desulf.) 0,17. SPDP kopplat till heparin redu- cerades till SH genom tillsats av DTT och efterföljande kromatografisk rening.

Polylysin med en molekylvikt av 450.000 löstes i vat- ten (20 mg/3 ml), vartill tillsattes 2 ml SPDP (10 mg/ml MeOH), och reaktionen fick fortgå under omskakning i tjugo minuter. Rening utfördes på Sephadexqg G-25 med 0,15 M NaCl som eluent. Voidfraktionen testades med DTT, varvid substi- tutionsgraden fastställdes till 158 SPDP-grupper per mo- lekyl polylysin.

De ovan framställda lösningarna av heparin-SH resp. polylysin-SPDP justerades till 3 M NaCl och blandades i sådana proportioner att man fick tio procent överskott av SH-grupper i förhållande till SPDP-grupper, och reaktionen fick fortgå över natten. Båda preparationerna (heparin A och heparin B (desulf.)) hade då gått till fullständighet, vilket konstaterades genom spektrofotometrisk mätning av frisättningen av tiopyridon vid 343 nm. Preparationerna re- nades på Sephacrylc) S-500 med 0,5 M NaCl som eluent, varvid heparin-polylysinkonjugaten kom ut som en voidtopp «\ 10 15 20 25 30 470 006 15 med baslinjeseparation till fritt heparin. Halten av heparin bestämdes med den Orcinol-assay som beskrivs i Larsson, R., et al., Biomaterials lg (1989) 511-516.

De respektive heparinkonjugaten späddes sedan till 50 pg heparin/ml i citratbuffert, pH 3,8, med tillsats av 0,5 M NaCl. Slangar av polyeten (PE) ythepariniserades genom behandling enligt följande: 1) Ammoniumpersulfat (l%, 60° C, 120 min.) 2) Polyetylenimin (0,3 mg/ml, RT, 15 min.) 3) Heparinkonjugatlösning enligt ovan (RT, 120 min.) Slangarna sköljdes slutligen med boratbuffert, pH 9, 2 x 10 min., och vatten.

De ythepariniserade slangarna testades med avseende pà inhiberingskapacitet av trombin enligt följande metod.

Slangarna roterades först med human plasma under 90 minu- ter, varefter de sköljdes med koksaltlösning. Därefter in- kuberades slangarna med en lösning av trombin (15 E/ml, 10 min., RT, under rotering) och sköljdes med koksaltlösning.

Hälften av slangarna inkuberades sedan med defibrinogenerad plasma under 60 sekunder. Ytbunden trombinaktivitet mättes genom inkubering av slangarna med ett kromogent substrat för trombin under 60 sekunder, varefter reaktionen avbröts genom tillsats av citronsyra. Den erhållna adsorbansen mät- tes vid 405 nm. Följande värden erhölls.

Konjugat med Konjugat med Heparin A Heparin B (desulf.) Upptag av trombin (före defib. av 0,639 i 0,050 0,611 i 0,156 plasma) Restmängd trombin (efter defib. av 0,006 2 0,001 0,003 1 0,001 plasma) Resultaten visar att båda preparationerna gav fullgod effekt med avseende på upptag och inhibering av trombin. 470 G06 10 15 20 25 30 35 16 EXEMPEL 2 Preparation av konjugat med olika substitutionsgrad och test av ytbunden biologisk aktivitet Ett konjugat, kallat konjugat I, framställdes som be- skrivits i Exempel 1. Den slutliga substitutionsgraden av heparin per polylysin blev 240:1.

Därefter framställdes ytterligare ett konjugat, kallat konjugat II. Man utgick här från ett polylysin med högre substitutionsgrad av SPDP, vilket framställdes genom uppjustering av pH till 8 i polylysinlösningen före tillsatsen av SPDP. Substitutionsgraden fastställdes till 633 SPDP-grupper per polylysinmolekyl.

Heparin-SH framställdes som i Exempel 1 och fick rea- gera med det ovan erhållna högsubstituerade polylysinet.

Reaktionen gick till 77% omsättning, varför substitutions- graden av heparin per polylysin blev 490:1. Slangar av polyeten (PE) preparerades och testades som beskrivits i Exempel 1, varvid följande resultat erhölls.

Koníuqat I Koníugat II Upptag av trombin 0.516 i 0.021 0.526 i 0.031 (före defib. plasma) Restmängd trombin 0.011 i 0.001 0.008 i 0.001 (efter defib. plasma) Resultaten visar att båda konjugaten gav tillfreds- ställande resultat.

EXEMPEL 3 Test av ythepariniserat extrakorporealt system Man använde ett extrakorporealt system sammansatt av följande komponenter: Dränagekateter (PVC), artärkanyl (PVC + stål), slangset (PVC), pumpblåsa (etylbutylakrylat), ven- I“\_ tiler (PP + PE), oxygenator (polykarbonat + hålfiber av PP).

Samtliga komponenter ythepariniserades genom behand- ling i tre steg: 1) Ammoniumpersulfat (1%, 60° C, 120 min.) 2) Polyetylenimin (0,3 mg/ml, boratbuffert, pH 9, RT, 15 min.) 10 15 20 25 30 35 470 006 17 3) Heparin-polylysinkonjugat, framställt enligt Exempel 1, späddes till 30 pg/ml i citratbuffert, pH 3,8, med 0.5 M NaCl, och behandlades vid rumstemperatur i 120 minuter.

Komponenterna sköljdes slutligen 2 x 15 minuter med borat- buffert, pH 9, och vatten. Efter torkning skedde sterili- sering med etylenoxid.

Det extrakorporeala systemet kopplades in på en sövd gris, som ej erhållit någon antikoagulansterapi för par- tiell by-pass mellan höger förmak och aorta. Det externa systemet pumpade kontinuerligt cirka tre liter per minut under tjugofyra timmar utan några problem med igensättning på grund av koagulation. Koagulationstiden låg hela tiden vid ett konstant värde, vilket visar att det ej skedde nå- gon frisättning av heparin till blodbanan.

Resultaten visar att ett komplett system för extrakor- poreal stödcirkulation enkelt kan ythepariniseras med hepa- rin-konjugatet för att erhålla en stabil väl fungerande heparinyta, som kan steriliseras med etylenoxid.

EXEMPEL 4 Test av biologisk aktivitet hos olika heparin-konjugat i lösning Heparin-polylysinkonjugat med olika substitutions- grader framställdes enligt Exempel 1 och 2. Konjugatens biologiska aktivitet bestämdes med avseende på deras för- måga att inhibera faktor Xa och trombin i buffertlösning innehållande antitrombin eller i plasma. De erhållna resul- taten jämfördes med motsvarande standardkurvor erhållna ge- nom tillsats av kända mängder av heparin med känd specifik biologisk aktivitet (180 I.E./mg). Följande resultat er- hölls.

Biologisk aktivitet I.E./md heparin Konjugat Heparin/ Xa/AT Xa/Plasm. Tr./AT Tr./Plasm. polylysin I 235 116 95 48 45 II 490 61 29 10 20 III 550 10 43 18 25 A 70 10 15 20 25 30 35 006 18 Resultaten visar att det beskrivna förfarandet kan ut- nyttjas för att framställa konjugat med såväl hög som låg biologisk aktivitet.

EXEMPEL 5 Effekt av olika storlek på polylysin Fem olika batcher av polylysin med de respektive mo- lekylvikterna 13.000, 64.000, 98.000, 249.000 samt 464.000 modifierades med SPDP i enlighet med Exempel 1, varvid följande substitutionsgrader (SPDP-grupper per molekyl polylysin) erhölls: Qrgy Molekylvikt Subst.grad I 13.000 6 II 64.000 31 III 64.000 45 IV 98.000 35 V 249.000 87 VI 464.000 158 Heparin, som hade värdet 7.000 på den relativa skalan för primär amin, modifierades med SPDP för införande av fria tiolgrupper enligt Exempel 1, varvid substitutions- grader pâ 0,2 - 0,3 erhölls. Respektive konjugat framställ- des enligt Exempel 1. Separation skedde pà kolonn med Sephacryl® S-300 eller Sephacryl® S-400 som separationsme- dium. Konjugat I kunde inte separeras från fritt heparin.

För övriga konjugat erhölls~tillfredsställande separation, och de erhållna konjugaten kunde användas för att ythepari- nisera slangar enligt Exempel 1. Testning med avseende pà upptag och inhibering av trombin (enligt Exempel 1) gav följande resultat: Konjuqat Upptag av trombin Restmängd trombin (före def. plasma) (efter def. plasma) I - - - - - - - - - - - - - - - - -- II 0,012 i 0,006 0 III 0,086 i 0,047 0 IV 0,494 1 0,009 0,003 V 0,532 i 0,043 0,005 VI 0,490 i 0,004 0,004 10 15 20 25 30 35 _470 oss 19 Resultaten visar att konjugaten II - VI är användbara enligt uppfinningen för att framställa ytor med heparinak- tivitet. Dock ger konjugat IV - VI bäst resultat.

EXEMPEL 6 Framställning av konjugat med kitosan som bärarsubstans Kitosan (SeaCure l10L, viskositet < 20 mPas, molekyl- vikt ca 120.000, Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norge) löstes till 10 mg/ml i vatten med 1% ättiksyra. Till 1,5 ml lösning sattes 1,0 ml SPDP (10 mg/ml MeOH) under omrörning vid 50° C, och reaktionen fick fortgå under en timme. Pro- vet satsades på en PD-10-kolonn (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Sverige) och eluerades med 0,5 M NaCl med 1% ättiksyra. Voidfraktionen uppsamlades och analyserades för förekomst av SPDP. Halten SPDP fastställdes till 0,972 umol/ml, vilket motsvarar ca 40 SPDP-grupper per kitosanmo- lekyl.

Heparin preparerades med fria tiolgrupper enligt Exem- pel 1. Till den erhållna heparinlösningen sattes sedan kok- salt till en slutkoncentration av 3,5 M. Heparinlösningen tillsattes därefter till den först framställda kitosan- SPDP-lösningen under kraftig omrörning, och reaktionen fick fortgå vid rumstemperatur över natten. Spektrofotometrisk kontroll visade att reaktionen gått till 100%. Lösningen fraktionerades på Sephacryl® S-300 och voidfraktionen upp- ' samlades. Slangar av Pebax® (polyeterblockamid från Atochemie, Frankrike) preparerades för trombintest enligt Exempel 1. Följande resultat erhölls: Upptag av trombin Restmängd trombin (före def. plasma) (efter def. plasma) 0,491 i 0,016 0,002 Resultaten visar att en yta preparerad med kitosan- heparinkonjugat ger fullgod effekt.

EXEMPEL 7 Preparering av konjugat med polyallylamin Polyallylamin-hydroklorid (Aldrich, molekylvikt ca 50.000), 10 mg, löstes i 1,5 ml boratbuffert, pH 9, vartill 1,0 ml SPDP (10 mg/ml MeOH) tillsattes under omrörning och fick reagera under 30 minuter. Lösningen satsades på en PD- 470 10 15 20 25 30 CD CD ON. 20 10-kolonn, som eluerades med O,9%-ig NaCl. Voidfraktionen uppsamlades, och analys visade att den innehöll 8,46 pmol/ml SPDP, vilket motsvarar ca 192 SPDP-grupper per mo- lekyl polyallylamin. Denna produkt användes nedan för fram- ställning av konjugat I.

Ytterligare 10 mg polyallylamin-hydroklorid, löst i vatten istället för boratbuffert, SPDP-substituerades på samma sätt som ovan. Voidfraktionen innehöll då 1,56 umol SPDP/ml, vilket motsvarade 32 SPDP-grupper per molekyl polyallylamin. Denna produkt användes sedan för framställ- ning av konjugat II nedan.

Heparin preparerades med fria tiolgrupper enligt Exem- pel 1, varefter det resulterande heparin-SH blandades med de respektive polyallylamin-SPDP-produkterna i ekvimolärt förhållande med avseende på SH- och SPDP-grupper. Efter en timmes reaktion höjdes salthalten till 3 M, och reaktionen fick fortgå över natten vid rumstemperatur. Reaktionsutby- tet blev mer än 95% för bägge reaktionerna. De respektive reaktionslösningarna justerades med 10 M natriumhydroxid till pH 10, varefter man tillsatte 100 ul ättiksyraanhydrid under kraftig omrörning för att acetylera kvarvarande ami- nogrupper. De erhållna heparinkonjugaten, konjugat I resp. konjugat II, renades pà en Sephacrylq S-400-kolonn, varvid konjugaten erhölls i voidfraktionen.

Slangar av polyeten preparerades med de bägge erhållna heparinkonjugaten för trombintest enligt Exempel 1, varvid följande resultat erhölls.

Upptag av trombin (före defib. plasma) 0,437 i 0,008 0,0 0,445 i 0,020 0,0 Resultaten visar att båda konjugaten ger fullgod effekt.

Restmängd trombin (efter defib. plasma) Konjugat I Konjugat II /41 10 15 20 25 30 35 470 086 21 EXEMPEL 8 Preparering av ytor med olika aminofunktionella substratytor Slangar av polyeten hepariniserades enligt följande, varvid tilläggen A, B, C resp. D anger alternativa amino- funktionaliseringsbehandlingar av slangytan: 1. Ammoniumpersulfat (1%, 60°C, 60 min.) 2A. Polyetylenimin (0,3 mg/ml, borat pH 9, RT, 15 min.) 2B. Polyallylamin (10 mg/ml, borat pH 9, RT, 15 min.) 2C. Kitosan (10 mg/ml, 1% HAc, RT, 15 min.) 2D. Polylysin (5 mg/ml i vatten, RT, 15 min.) 3. Heparin-polylysinkonjugat framställt enligt Exempel 1 (50 pg/ml i citratbuffert, 0,5 M NaCl, pH 3,8, RT, 120 min.).

De sålunda preparerade ytorna sköljdes omsorgsfullt med boratbuffert, pH 9, Polyetenslangar hepariniserade enligt ovanstående fyra samt vatten. alternativ testades med avseende på upptag och inhibering av trombin, såsom beskrivits i Exempel 1, varvid samtliga alternativ uppvisade fullgod effekt.

EXEMPEL 9 Ytheparinisering av lins (PMMA) och test av trombocytadhesion Intraokulära linser av polymetyl(metakrylat) (PMMA) hepariniserades enligt Exempel 1 och testades därefter med avseende på adhesion av trombocyter.

Icke-modifierade respektive ythepariniserade linser inkuberades i färskt humant citrerat helblod under konstant rörelse i 60 minuter. Man sköljde därefter linserna uppre- pade gånger i koksaltlösning för att avlägsna allt vidhäf- tande blod. Slutligen extraherades adenosintrifosfat (ATP) fràn eventuella trombocyter som adhererat till linsytan, och den erhållna halten ATP bestämdes med bioluminiscens.

Trombocytadhesionen till de hepariniserade linserna var re- ducerad med 98% jämfört med de obehandlade kontrollinserna. 470 10 15 20 25 30 35 006 22 EXEMPEL 10 Adsorption av heparinkonjugat till "biologisk yta" I avsikt att undersöka om ett heparinkonjugat fram- ställt enligt föreliggande uppfinning kan adsorberas irre- versibelt till en yta som beklätts med trombotiserat biolo- giskt material genomfördes följande försök: Icke ytmodifierade slangar av polyeten fylldes till hälften med citrerat helblod och fick rotera under 60 mi- nuter. Slangarna dränerades därefter på blod och sköljdes omsorgsfullt med koksaltlösning. Härigenom blev slangarna belagda med trombotiskt material bestående av plasmaprotei- ner och trombocyter i olika aktiveringsstadier. Heparin- polylysinkonjugat framställt enligt Exempel 1 späddes till en sluthalt av 100 pg/ml i koksalt, vilken lösning sedan fick rotera i slangarna under 60 minuter. Slangarna skölj- des slutligen noggrant med boratbuffert, pH 9, och vatten.

De sàlunda hepariniserade slangarna testades med av- seende på upptag och inhibering av trombin enligt Exempel 1, varvid testslangarna uppvisade fullgod effekt.

EXEMPEL 11 Kombinationspreparat med ureas Polylysin (10 mg, molekylvikt 464.000) löstes i 1,5 ml vatten, vartill tillsattes 1,0 ml SPDP (10 mg/ml MeOH) under omskakning, varefter reaktionen fick fortgå i 30 minuter. Provet satsades pá en PD-10-kolonn och eluerades med 0,9%-ig NaCl. Voidfraktionen uppsamlades, och analys visade att halten SPDP var 1,053 umol/ml.

Ureas (U-1500, från "jackbean", Sigma, USA) löstes till 10 mg/ml i fosfatbuffert, pH 7,5, och filtrerades ge- nom ett 0,22 pm filter. Halten fria SH-grupper fastställdes till 0,161 umol/ml.

Polylysin-SPDP med 3 M NaCl blandades med ett under- skott av ureas, så att ca 10% av tillgängliga SPDP-grupper skulle kunna genomgå disulfidutbyte med SH-grupper i ureas.

Spektrofotometrisk mätning vid 343 nm bekräftade att så skett. Därefter tillsattes heparin som modifierats med fria SH-grupper enligt Exempel 1, varvid mängden tillsatt hepa- rin-SH motsvarade resterande 90% av tillgängliga SPDP- 4-70 Oßá 23 grupper. Reaktionen gick till fullständighet. Det erhållna konjugatet renades slutligen på en Sephacrylqë S-400- kolonn, varvid konjugatet erhölls i voidfraktionen.

Testning av det erhållna konjugatet visade, att såväl heparinaktivitet som ureasaktivitet kunde påvisas.

Claims (16)

-70 10 15 20 25 30 35 G96 24 PATENTKRAV

1. Biologiskt aktivt konjugat mellan en polymer bärare och ett flertal sulfaterade glykosaminoglykanmolekyler, kännetecknat av att bäraren är en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan, via vilka åtminstone cirka 20 molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner förankrats genom kovalenta bindningar till bildning av ett vattenlösligt konjugat, varvid varje glykosaminoglykanmolekyl väsentligen är bunden till polymerstamkedjan via endast en bindning, företrädesvis terminalt.

2. Konjugat enligt patentkravet 1, kännetecknat av att nämnda polymer härrör från en naturlig eller syntetisk polypeptid, polysackarid eller alifatisk polymer.

3. Konjugat enligt patentkravet 2, kännetecknat av att nämnda polymer härrör från polylysin, polyornitin, kitosan, polyimin eller polyallylamin.

4. Konjugat enligt något av patentkraven 1 till 3, kännetecknat av att glykosaminoglykanerna är bundna till polymerstamkedjan via en till dessa associerad aminogrupp.

5. Konjugat enligt något av patentkraven 1 till 4, kännetecknat av att det på grund av glykosaminoglykanerna har tillräcklig polyanjonkaraktär vid upplösning i vatten för att genom elektrostatisk interaktion kunna bindas väsentligen irreversibelt längs i huvudsak hela sin längd till en positivt laddad substratyta.

6. Konjugat enligt något av patentkraven 1 till 5, kännetecknat av att det uppvisar minst 30, företrädesvis minst 100 glykosaminoglykanrester. 10 15 20 25 30 35 006 25

7. Konjugat enligt något av patentkraven 1 till 6, kännetecknat av att nämnda glykosaminoglykan är heparin eller ett fragment eller derivat därav.

8. Konjugat enligt något av patentkraven 1 till 7, kännetecknat av att glykosaminoglykanresterna är bundna till polymerstamkedjan via en kopplingssekvens.

9. Konjugat enligt patentkravet 8, kännetecknat av att nämnda kopplingssekvens härrör från ett heterobifunktionellt kopplingsreagens.

10. Konjugat enligt något av patentkraven 1 till 9, kännetecknat av att polymerstamkedjan förutom glykosaminoglykaner uppbär rester av minst en ytterligare, biologiskt aktiv substans.

11. Preparerad substratyta innefattande ett till ytan bundet biologiskt aktivt konjugat, kännetecknad av att konjugatet är väsentligen vattenlösligt och innefattar en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan, via vilka ett flertal molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner förankrats genom kovalenta bindningar, varvid varje glykosaminoglykanmolekyl väsentligen är bunden till polymerstamkedjan via endast en bindning, företrädesvis terminalt, och att konjugatet vidare är affinitetsbundet till ytan, företrädesvis genom elektrostatisk interaktion mellan konjugatet och substratytan.

12. Preparerad substratyta enligt patentkravet 11, kännetecknad av att det biologiskt aktiva konjugatet är ett konjugat enligt något av patentkraven 1 till 10. 470 10 15 20 25 006 26

13. Förfarande för framställning av ett biologiskt aktivt konjugat, kännetecknat av att man tillhandahåller en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funk- tionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan och till dessa funktionella grupper, eventuellt via ett kopplings- reagens, kovalent binder ett flertal molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner så att ett åtminstone väsentligen vattenlösligt konjugat bildas, varvid varje glykosaminoglykanmolekyl väsentligen binds till polymerstamkedjan via endast en bindning, företrädesvis terminalt.

14. Förfarande för preparering av en yta med sulfaterade glykosaminoglykaner, kännetecknat av att man för ett åtminstone väsentligen vattenlösligt konjugat innefattande en i huvudsak rakkedjig organisk polymer med ett antal funktionella grupper fördelade utmed polymerstamkedjan, via vilka ett flertal molekyler ur gruppen sulfaterade glykosaminoglykaner förankrats genom kovalenta bindningar, i kontakt med en substratyta som har affinitet till konjugatet, så att konjugatet binds väsentligen irreversibelt därtill.

15. Förfarande enligt patentkravet 14, kännetecknat av att konjugatet har polyanjonkaraktär och substratytan är katjonisk.

16. Biologiskt aktivt konjugat enligt nágot av patentkraven l till 10 för användning som terapeutiskt medel. I;