JPH06510783A - 新規接合体、その調製および使用ならびにその接合体を用いて調製された基体 - Google Patents

新規接合体、その調製および使用ならびにその接合体を用いて調製された基体

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規接合体、その調製および使用ならびにその接合体を用いて調製された基体 本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンに基づ（新規な生物学的に活性な接合体 、その接合体の調製方法、その表面がかかる接合体を用いて調製されている基体 、およびその接合体を用いた表面調製方法に関する。
硫酸化グリコサミノグリカン類は、多くの内生硫酸化ムコ多糖、例えばヘパリン 、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸など多くの様々な生物学 的性質を示すものの普通名称である。
本発明は硫酸化グリコサミノグリカン類一般に関するものであるが、以下におい ては、これまで医学的に最も用いられているグリコサミノグリカン、すなわちヘ パリンに関する記載が大部分である。
ヘパリンは様々な哺乳動物組織、例えば腸、肝臓および肺臓のほかマスト細胞中 で、タンパク質に複雑に結合した形で天然に存在しそのうえ１００．０００まで に及ぶ分子量を有しているが、市販の調製物は、給源および測定方法に応じて約 ６．０００〜２０．０００の範囲で変動する分子量を有している。そ第１は交互 に存在するグルクロン酸およびグルコサミン単位より成り、またその抗凝固作用 は抗トロンビン結合特性を有する分子の特定の三糖単位に結合していることが示 されている。
ｌ＼バリンは通常ブタ腸粘膜から調製されるが、その抗凝固作用の故に、血栓を 溶解するための多分就中血栓形成を防止するための、剤として用いられている。
後者は、とりわけ例えば血液が生体にとって異物である各種物質と接触すること になる体の外の循環系、いわゆる体外循環（例えば人工腎臓、人工心肺装置、酸 素供給器）における患者血液の処理を伴うような手順、例えば腎疾患治療、関心 術および集中治療などにおける手順の場合に用いられる。
このような系における血液の凝固能を除去し、またそれによって血餅による凝固 を避けるためには高用量のヘパリンを血液に添加する必要がある。それに伴って 出血の危険が実質的に高まり、またそれは最悪の場合には生命を脅かす状態を招 きかねないことから過去長い間、そのかわりにヘパリンを表面結合することによ り血液が接触する生体にとって異物である物質を変性させて所望の凝固防止作用 を達成させようとする努力が払われてきている。この開発を刺激した決定的要因 は、ヘパリンの構造−活性相関が解明されたこと、および、ヘパリン様活性が天 然の血管壁上に検出されたことである。
すなわち、この数年の間に、表面結合ヘパリンを備えた系による体外治療の成功 に関する報告がいくつか発表されている。
しかしながら、ヘパリンによる表面変性は前述の体外血液循環に関する文脈に限 定されるものではな（、血液および他の生体組織と接触する匡療における様々な デバイスのバイオコンパチビリティ−を達成するという課題に対するより一般的 な解決策として考えられるようになってきている。例えば、表面ヘパリン化は眼 内レンズのバイオコンパチビリティ−を向上させるためにも用いられている。
ヘパリンの固定という課題に対して従来から用いられている解決策は二つの主な 原理、イオン的に結合したヘパリンと共有結合的に結合したヘパリンに分けるこ とができるところ、これを以下詳述する。固定化ヘパリンに基づく所望のバイオ コンパチビリティ−を示す表面を得るにはヘパリンがその生物学的活性が保たれ るように固定されることが重要である。導入部に記したとおり、ヘパリンの生物 学的活性は特定の抗トロンビン−結合性三糖構造にあり、血液の諸成分との相互 作用が可能となるにはその構造が表面に固定された後も完全な形で残っていなけ ればならない。ヘパリンの固定化に関する大部分の学術論文および特許、特に１ ９８０より前に発表されたものでは、この点で鳩尾のいくものはなく、また、そ の調製方法が完全なバイオコンパチブル表面を与えるかどうかの判断を可能にす る結果となるとはるかに少ない。以下に、既知のヘパリン固定化方法を総括する 。
■　イオン的に結合したヘパリン ヘパリンは極めて多数の負荷電基を含んでいるので、ヘパリン分子は静電相互作 用だけを通して陽イオン性表面に比較的強く結合することができる。慣用される 手順の一つは、ヘパリンをその水性溶液から陽イオン界面活性剤で沈殿された後 、乾燥沈殿を有機溶媒で溶解することより成る。後者の溶媒は、次いでいわゆる 浸漬−乾燥（ｄｉｐ−ｄｒｙ）法に用いられる。遊離速度を減じるために様々な 分枝界面活性剤が試験されている。その他の方法は第四級アンモニウム基へのヘ パリンの吸着に基づいている。イオン的に結合したヘパリン表面が共通して持つ 大きな短所の一つは、血液と接触しているヘパリンの遊離に関する安定性が不十 分な点である。
０、　Ｌａｒｍらは、Ｂｉｏｍａｔ、、　Ｍｅｄ、　Ｄｅｖ、、＾ｒｔ、　Ｄｒ ｇ、、旦（１９８３）１６１−１７３で特に、安定なイオン的に結合した表面の 調製方法を記載している。
しかしながら結合型ヘパリンはその生物学的活性を失うと報告されているが、こ のことは、各個ヘパリン分子があまりに強固に結合されているために抗トロンビ ン結合配列が血中循環成分と相互作用し得ないということと関係しているかもし れない。
イオン的に結合したヘパリン複合体のゲルタールアルデヒドによる安定化処理が ＵＳ−八−３，８１０，７８１およびＵＳ−＾−４，１１８，４８５に記載され ている。学術報告にみるように、これらの調製選択肢によっては完全に安定な表 面は得られない。従って、ヘパリンそして多分ゲルタールアルデヒドとの様々な 反応生成物も初期の接触期中に血液経路に遊離してしまう。
■　共有結合的に結合したヘパリン 純化学的見地からは共有結合によるヘパリン固定化方法には多くの様々なものが ある。しかしながら、臭化シアン、カルボジイミドおよび同様の一般的に用いら れる結合試薬を用いる場合には、各ヘパリン分子が活性配列中の結合を含むいく つかの結合により結合される。またそのためにヘパリンがその生物学的活性を失 うという明らかな危険が存在する。共有結合結合試薬はそれ以外に、常にそれ自 体有毒であり、従って最終生成物と接触させるべきでない。
しかしながら、ＵＳ−＾−４，６１３，６６５は、ヘパリンおよび他の多糖体を ヘパリン分子中末端に局在する単一の反応性アルデヒド基を介して結合する方法 を記載している。この場合、ヘパリンは抗トロンビン結合性配列を結合に関与さ せることな（共有結合的に結合させることは可能である。しかしながら、この方 法では、ヘパリンを部分的に分解すること、そして強毒性物質であるシアンボロ ヒドリドを最終調製工程に存在させることが必要となる。
ＥＰ−＾−３５１，３１４は、Ｎ−脱硫酸化に付されたヘパリンの遊離アミノ基 を利用することによりヘパリンを遊離アミノ基含有基体表面に（例えばポリエチ レンイミンまたはキトサンによる表面処理を通じて）結合する方法を記載してい る。次に多官能性アルデヒド、例えばゲルタールアルデヒドを用いて架橋が行わ れる。しかしながら、ゲルタールアルデヒドとの反応工程は、活性配列が関与し ないように確実にコントロールすることができず、また方法自体が、技術的観点 からして、実施上相当複雑である。
ＵＳ−＾−４，２３９，６６４は、ＰＶＰを該ポリマーが次いでヘパリン上の水 酸基と反応するイミドイルイオンを含有するように変性することにより調製され たＰＶＰ−ヘパリンポリマーを記載している。この方法は、必然的にヘパリンに 対し多重の非特異的結合を与え、その生物学的活性に悪影響を及ぼす。そのＰｖ Ｐ−ヘパリンポリマーは終始一貫して低い抗凝固活性を有しているとされている 。
ＥＰ〜＾−２９４，９０５はヘパリンのような抗凝固剤をポリ酸を介して結合し たポリマー基体を開示している。この基体は、ポリ酸をポリマー表面上の少数の 反応性基に共有結合的に結合することによって利用可能な表面反応性基の数を増 加させることにより調製される。
次に抗凝固剤を具体的には既にその欠点について記した前記ＵＳ−八一４．６１ ３．６６５に記載の方法によって、ポリ酸のカルボキシルまたはアミノ基に共有 結合的に結合する。
ＵＳ−＾−４，４１５，４９０は、ヘパリンが各結合部位において唯一のアセタ ールまたはへミアセタール結合を通して各種ポリマーに結合した非血栓原性材料 を開示している。−態様においては、アルデヒド基をセルロースなどのポリマー に導入した後、そのアルデヒド基をヘパリン中の水酸基と反応させる。このプロ セスには各ヘパリン分子の複数の水酸基が関与し、またヘパリンの生物学的に活 性な配列（この配列は当該特許の出願日には実際上文献に知られたり記載された りしていなかった）において水酸基が利用できることから、その活性配列中の水 酸基も関与し、その結果最終生成物が不活性になるという明らかな危険がある。
もう一つの選択肢としての態様においては、代りにアルデヒド基を過ヨウ素酸処 理によりヘパリンに導入する。この態様も特異性を欠き、従って結合は活性配列 を含むヘパリン鎖においてランダムに生じる このように、以上から明らかなように表面−ヘパリン化についてこれまで知られ た方法は、多かれ少かれ重大な欠点を伴っている。
従って簡単に実施でき、また有毒物質を含まずかつヘパリンの生物学的活性が保 持された安定なヘパリン化表面を与える表面−ヘパリン叱方法が必要とされてい る。
ヘパリンの治療剤としての用途にもヘパリンの短半減期および／またはアフィニ ティーの故に制約がある。ヘパリンを抗凝固剤として用いる場合だけでなく、例 えば血管損傷（過形成）の場合の平滑筋細胞の増殖阻害剤として、例えば慢性関 節リウマチなどのための抗炎症剤として、および血管形成（脈管形成）調節剤と しての研究された用途に用いる場合に、特にそうである。ヘパリンの様々な性質 の総括は”１ｌｅｐａｒｉｎ　：　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓＣｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ″ ＬａｎｅおよびＬｉｎｄａｈ１編、Ｅｄｗａｒｄ　Ａｒｎｏｌｄ。
ロンドン、１９８９年にみることができる。従って長い半減期と増大したアフィ ニティーを有するヘパリン調製物が必要とされている。
本発明によれば硫酸化グリコサミノグリカン類に基づく生物学的に活性な接合体 が提案され、その接合体によって硫酸化グリコサミノグリカン類の性質を個々の 物質よりもはるかに効率的に利用することができる。かかる接合体はとりわけ、 接合体にアフィニティーを有する基体表面に安定的に結合させることができ、そ してそれによって例えばヘパリンの場合には、従来方法によるより簡単かつ効率 的に表面−ヘパリン化を行うのに用いることができる。さらに、かかる接合体は 純物質に基づく調製物よりも長い半減期および向上したアフィニティーを有する グリコサミノグリカン調製物を与えることができる。
ヘパリンについて記述したように、硫酸化グリコサミノグリカン類は天然にはタ ンパク質に結合した形で存在する。すなわち、例えばヘパリンの場合には、約１ ５ヘパリン鎖が約２５アミノ酸残基のタンパク質に結合し、一方、ヘパラン硫酸 を含むプロテオグリカンに配置されたヘパラン硫酸鎖の方はほとんどなくはるか にまばらである。
天然接合体は純粋な形で調製することが極めて困難であり、また状状の知る限り 治療または同様の用途には提案されていない。本発明は、硫酸化グリコサミノグ リカンとポリマー担体との間で半または全合成接合体を作るという思想に基づい ている。この接合体は、とりわけより多くの分子の当該グリコサミノグリカンを 含むことにより、個々のグリコサミノグリカン類および天然接合体よりも改善さ れた性質を有し、またさらに相対的組成を様々な用途に適するよう調節可能に変 えることができるという重要な長所を有する。
すなわち本発明はそのも最も広い範囲において、多数の官能基をポリマー主鎖に 沿って分布させた実質的に直鎖状の有機ホモまたはヘテロポリマーであって、そ れら官能基を介してその非活性部分中の硫酸化グリコサミノグリカン類（ＧＡＧ ）群からの少なくとも約２０分子が共有結合を通して結合されているものより成 る、好ましくは、実質的に純粋な形の、少なくとも実質的に水溶性の生物学的に 活性な接合体（巨大分子）を与える。
かかる接合体は概念的に合成プロテオグリカンと表わすことができ、その相対的 組成は、調節可能に変えることができまた意図する用途に適合させることができ る。
本明細書における“硫酸化グリコサミノグリカン類”という表現は、その用語に 通常含まれる物質、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸およびコン ドロイチン硫酸などのみならず、目的にかなった機能を果すこれらの物質の断片 および誘導体をも包含することを意味する。
グリコサミノグリカン残基の担体として機能する実質的に鎖状のポリマー鎖はも ちろんのことながら、当該−個または二個以上のグリコサミノグリカンの結合後 は、少なくとも干渉性の生物活性を欠くべきであるという意味において、実質的 に生物学的に不活性であるべきである。容易に理解されるように、複数のグリコ サミノグリカン残基の結合を可能とするために、そのポリマー鎖は該鎖に沿って 分布され、そして任意に行われる変性後は直接または結合配列を介してグリコサ ミノグリカンに結合され得る多くの官能基例えばアミノ、ヒドロキシルまたはカ ルボキシル基などを有すべきである。
ここで注意すべきは、当該グリコサミノグリカンがその調製方法によっては、依 然として、その天然接合体タンパク質のそれに結合した末端残基を有している可 能性があり、その場合結合はもちろんのことながら有利なことにがかる残基中の 例えばアミノ酸を介して行われる点である。
さらに、坦体ポリマーは好ましくは良好な水溶性を有するべきである。少なくと もそれは、接合体について既述されたところに従７て、グリコサミノグリカン基 の結合後、少なくとも実質的に水溶性であるべきである。本発明の目的に適する 特定のポリマー鎖は一般的発明概念により当業者には容易に明らかとなろう。も ちろんのことながら、“実質的に鎖状の“という表現の範囲内で許容され得るポ リマー鏡上の分枝についてもこのことがいえる。
しかしながら、好ましくは、ポリマー鎖は天然または合成のポリペプチド、多糖 体または脂肪族ポリマーである。特定の例としてはポリリジン、ポリオルニチン 、キトサン、ポリイミンおよびポリアリルアミンが挙げられる。
グリコサミノグリカンがポリマー担体に結合した後もその生物学的活性を維持す ることが通常望ましいという点については、各グリコサミノグリカン分子を末端 で、そして単結合のみにより担体ポリマーに結合することが望ましい。適切には 、グリコサミノグリカンはアミノ酸、好ましくは末端アミノ酸を介して結合され るが、グリコサミン単位の遊離アミノ基を用いてもよい。後者は、それ自体遊離 状態で存在していてもよく、あるいは脱硫酸または脱アセチル化を遊離させても よい。
ポリマー主鎖１個あたりのグリコサミノグリカン残基数は、前述のとおり少なく とも２０であるが、好ましくはそれより多く、通常は少なくとも３０である。以 後に示す実施例から明らかなように、使用ポリマー主鎖によっては、ポリマー主 鎖１個あたりのグリコサミノグリカン残基数は少なくとも６０および１００以上 であってさえも好ましい場合がある。上限は状況に依存し、そして、特に、選定 された担体ポリマーの溶解特性、許容され得る粘度の高さなどによって設定され る。グリコサミノグリカン単位の至適数は、特定の接合体の意図される用途に加 え、担体ポリマーは、特にそのサイズにも依存する。後で詳述される、接合体の 基体表面への静電結合の場合には、もちろん、基体表面の電荷密度も考慮しなけ ればならない。従って、それらグリコサミノグリカン残基は、相互に干渉しあう ほどに接近した位置にあるべきではなく、さりとて、それらの間のギャップを広 すぎないようにすべきである。−例として、例えば担体ポリマーとしてのポリリ ジンが約５０．０００より高い分子量を有する例が挙げられる。しかしながら、 各々の特定の担体ポリマーおよび用途それぞれに適したグリコサミノグリカン残 基数は当業者により容昌に決定されよう。
特にアミノ−官能性ポリマーを担体として用いる場合、場合によっては特にポリ マー主鎖がグリコサミノグリカン類によってまばらにしか置換されない場合には 、残った遊離アミノ基をブロックするのが好ましいことがあり、そしてこれは例 えばアセチル化によって行われ得る。別の選択肢としてのアプローチとして、所 望数のアミノ基を例えばメチル基で置換してからグリコサミノグリカン類を結合 させることも可能である。
既に示したとおり、本発明による新規接合体は、接合体に対する（通常はそうで あるが、必ずしもグリコサミノグリカン残基に対してではない）アフィニティー を有する表面に結合してよく、それによって表面に所望の生物学的活性を付与す ることができる。本発明の更なる観点によれば、このような調製表面は、多数の 官能基をポリマー主鎖に沿って分布させた実質的に鎖状の有機ポリマーであって 、それら官能基を介して硫酸化グリコサミノグリカン類群からの多数の分子が共 有結合により結合されているものより成る生物学的に活性な接合体を適当な条件 下に、接合体に対するアフィニティーを有する表面と単に接触させることによっ て完成される。
本発明のもう一つの観点は、多数の官能基をポリマー主鎖に沿って分布させた実 質的に鎖状の有機ポリマーであって、それら官能基を介して硫酸化グリコサミノ グリカン類群からの多数の分子が共有結合により結合されているものより成る生 物学的に活性な接合体を提供する。
接合体と基体表面の間の好ましい形のアフィニティーは静電的性質を有するもの であり、そしてより詳細にはその結合は後でより詳しく例説されるように、グリ コサミノグリカン残基と基体表面の間の静電的相互作用によって生起する。
本発明による接合体のグリコサミノグリカン分子は担体ポリマーに対し大過剰な ので、この接合体は“巨大分子グリコサミノグリカン”と考えてよい。そのため 、接合体１個あたりの陰イオン基数は、グリコサミノグリカン１分子あたり存在 する数をはるかに上回り、その結果、接合体はそのサイズの故に、イオン性相互 作用を通して陽イオン性表面に不可逆的に結合することができる。接合体を表面 から遊離させるには、もちろんすべてのグリコサミノグリカン残基を同時に表面 から遊離させる必要があるが、それには、“遊離“グリコサミノグリカン分子の 遊離に比べて相当なエネルギー供給が必要となる。
後述するある種の状況を除けば、接合体の生物学的活性はグリコサミノグリカン 残基によるものと、一般的に考えられる。このような場合には、グリコサミノグ リカンの数は、１担体ポリマー鎖あたりのこれらの残基の一部が協働的に陽イオ ン基が付与されている表面に対する強固で不可逆的な結合を仲介する一方、残り のグリコサミノグリカン鎖が生物学的組織、例えば血液の成分と相互作用するこ とによりその生物学的活性を自由には発揮できるようにするのに十分なものとす べきである。
前記によるグリコサミノグリカンを用いた表面調製は、従って、共有結合とイオ ン性相互作用の組合せに基づくもので、このことは接合体が中間生成物として調 製される（このことはすべての結合化学操作を最終生成物とは別個に行うことが できることを意味している）点で非常に有利である。更に、最終的な表面変性プ ロセスが極めて簡単となり、また再現性よく行うことができる。従って例えば本 発明によるヘパリン接合体を用いた表面ヘパリン化は、前述したとおり、従来か らの表面−ヘパリン他方法に比べ相当に簡易化された効率的ヘパリン化方法を提 供する。以上の記載にかかわらず、もちろん、接合体を基体表面にアフィニティ ー吸着させた後で架橋工程を所望により行ってヘパリン化表面の安定性をなお一 段と向上させることもできる。
従って本発明のこの特定の観点に従って用いるための接合体は、反対荷電基体表 面への実質的に不可逆的な結合を可能にするのに十分な静電実効電荷を有するこ とになる。
前記に従って表面−調製、例えば表面−ヘパリン化すべき基体材料は、その表面 が陽イオン性であるが陽イオン性にすることができる限り、基本的にバイオコン パチブル化が所望されるいずれの材料であってもよい。前述のとおり、本発明は 生体にとって異物である材料、例えば各種ポリマー、金属およびセラミックスな どに適用することができる。しかしなかに、本発明は内生材料、すなわち当該グ リコサミノグリカンに対するアフィニティーを示す組織表面に適用することもで きる。これに関連して、血液に対して最外部構造の健常天然血管壁が抗トロンビ ン結合性三糖配列を有する硫酸化グリコサミノグリカン類を含んでいる点に注目 すると興味深い。
基体表面を陽イオン性にするための各種方法がよく知られている。
後述する実施例に記すように、ポリイミンによる処理が適切な方法であることが 判明しているが、他のポリアミン、例えばポリリジン、キトサンまたはポリアリ ルアミンなどを用いてもよい。
新規なグリコサミノグリカン接合体は、本発明の範囲内において、グリコサミノ グリカン鎖のほかに−またはそれ以上の他の物質、例えば別の生物学的に活性な 物質の鎖を担体ポリマーに結合して含有してもよい。その場合、そのような他の 生物学的に活性な物質は、グリコサミノグリカン活性と同時にあるいは別々に作 用するようにしてもよい。後者の場合には、相補物質の生物学的活性だけが興味 対象となり、グリコサミノグリカン類だけが基体表面に対するアフィニティー結 合に利用される。従って、本発明による接合体は表面に結合させたい所望の生物 学的に活性な物質のための担体としても機能し得る。グリコサミノグリカンに加 えてポリマー主鎖に結合し得る物質例は、成長因子、酵素、抗体、マトリックス 、タンパク質、ステロイドなどである。この文脈においても、極めて特異的な吸 着特性を有する接合体を、例えばグリコサミノグリカン単位に対する相補体（ｃ ｏＩｌｐｌｅＩ＋Ｉｅｎｔ）としてのモノクローナル抗体を用いて得ることがで きる点に注目すべきである。
所望により、かかる組合せ接合体の場合には、グリコサミノグリカンそれ自体の 生物学的活性を抑制したい場合があるが、これは例えばヘパリンの凝固阻害活性 の場合には脱硫酸化により行うことができる。従って、このような場合、接合体 の生物学的活性は、ポリマー主鎖に結合される相補物質の活性に完全に結合する ことになろう。
多くの場合に、必要とはいわないまでも重要なのは接合体の表面−結合作用であ るが、この作用は場合によってはさほど重要でなく、用途によってはそれを多か れ少なかれ完全に抑制したい場合でさえあり得る。同様にして、組合せ接合体に ついて前記したように、純粋なグリコサミノグリカン接合体の場合にもグリコサ ミノグリカン類の生物学的活性を除去するかまたは少なくとも低下させたい場合 があり得る。場合によっては、例えばヘパリンについては、グリコサミノグリカ ンがいくつかの異なる生物学的作用を有することがあり、そして會図する用途に 応じて一方の生物学的活性を他方を優先させるべく抑制することができる。例え ばヘパリンの場合に、その抗凝固作用を前述の如く脱硫酸化により阻害する一方 、前述の三糖単位に結合されていない他方の生物学的活性は影響されずに保たれ るようにすることができる。
従って、以上より明らかなように、新規接合体の組成は、様々な応用分野に適合 させるべく広い範囲にわたり変化させることができる。
本発明のもう一つの観点は、多数の官能基をポリマー主鎖に沿って分布させた実 質的に鎖状の有機ポリマーを提供し、それら官能基に所望により結合剤によりそ の非活性部分の硫酸化グリコサミノグリカン類群からの多数の分子を共有結合的 に結合させることによる前記接合体の製造に関する。これは本発明の範囲内にお いていくつかの異なる方法によって行うことができる。
すなわち、グリコサミノグリカンは、例えば、ＵＳ−＾−４，６１３，６６５に 記載の方法により調製された末端に位置するアルデヒド基を有する亜硝酸分解グ リコサミノグリカンを用いてアミノ−官能性ポリマー鎖に直接結合させることが できる。しかしながら、この方法は部分分解グリコサミノグリカンに限定され、 また置換度の調節が困難である。さらにまた、ポリマーがグリコサミノグリカン によって沈殿しやすいことから実施上の問題も生じる。
好ましい方法によれば、代わりにグリコサミノグリカン結合剤、好ましくはへテ ロニ官能性のものによりポリマー鎖に結合する。しかしながら、例えばヒドロキ シルまたはアミノ基に対する二官能性結合剤は、それぞれ分子内および分子間架 橋を招く結果ブロッキングや凝集を伴うので、一般的に使用し得ない点に注意す る必要があろう。
ここで、本発明による接合体をどのようにしたら調製できるかについての一例と して、ポリリジンへのヘパリンの結合を簡単に説明する。４００．０００を超え る分子量を有するポリリジンを選択することにより１担体分子あたり５００個ま でのヘパリン鎖を有する合成プロテオグリカンを調製することができる。この目 的に適したヘテロ−二官能性結合剤であるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピ リジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）をポリリジンとのアミノ基に結合 し次にその５ＰＤＰ　−ｆｆ換ポリリジンをクロマトグラフィーにより精製する 。別の結合工程で５ＰＤＰは、末端アミノ酸残基中にあるいは遊離グルコサミン として存在するヘパリントのアミノ基（後者の含量はＮ−＆硫酸またはＮ−説ア セチル化により調節することができる）にも結合される。５ＰＤＰ−基をチオー ル官能基に還元後、５Ｒ−１ｉ１換ヘパリンをクロマトグラフィーにより精製す る。ポリリジン中の５ＰＤＰ基およびヘパリン中の５）ｌ−基の含量はそれぞれ 分光光度法により測定され、そしてヘパリンとポリリジンとを５ＰＤＰおよびＳ Ｈに関し等モル量を用いて混合し、ヘパリンはジスルフィド交換を介してポリリ ジンに共有結合的に結合されるが、その反応速度は、分光光度法により追跡する ことができる。驚（べきことに、ポリリジンに５ＰＤＰ基が付与されている場合 には、ポリリジンのアミノ基のほんの一部しか置換されていな（でも、ポリリジ ンとヘパリンの間の沈殿反応が起こらないということがわかった。にもかかわら ず、実際の実験は、ジスルフィド交換が高温濃度（適切には３　Ｍ　ＮａＣ／） においてのみ、より迅速でありそして完了まで進行することを示している。反応 完了後、接合体をクロマトグラフィーにより精製して遊離ヘパリンおよび低分子 反応生成物を除去する。
様々な環境でこのように調製されたヘパリン接合体の安定性に関し、驚くべきこ とに、ヘパリンをポリマー主鎖に結合する得られたジスルフィド橋は、グルタチ オンで切断できず、低分子非生理学的チオール試薬、例えばメルカプトエタノー ルなどでのみ切断し得ることがわかった。
更に、本発明によるヘパリン接合体でヘパリン化することの実質的長所は従来方 法よりも加工度の低いヘパリン原料から出発できることにある点に注目すべきで ある。
本発明を更に以下の実施例で例説する。
実施例１ 接合体の調製および表面−結合生物学的活性試験二つの異なるバッチのヘパリン （ヘパリン、にａｂｉ　Ｐｈａｒ■ａｃｉａ　Ａ８社、スエーデン、分子量約１ ２，０００）を用いた。アミノ酸含量および遊離第一級アミノ基の相対的存在を 分析し、次の結果を得た。
ヘパリンＡ　Ｏ，３６５，３８５，０００ヘパリンＢ　Ｏ，０８５，３７３４０ ヘパリンＢの示す遊離アミン含量が極めて低いことから、Ｙｕｋ。
１ｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 　４６（１９７６）８７−９５に記載の方法によるＮ−脱硫酸化を行った。Ｎ− 脱硫酸化実施後、第一級アミン相対的目盛りで１８．０００という値が得られた 。
ヘパリンＡとヘパリンＢ（脱硫酸化物）をリン酸緩衝液、ｐｉ（７，５に溶解し く２００＋＋ｖ／　４　宵ｅ）、それに１ｍｌの５ＰＤＰ（１０＋＋ｖ／＋＋１ ＭｅＯＲ）を攪拌下に添加し、そして反応を２０分間進行させた。このようにし て得られた５ＰＤＰ−置換ヘパリンを５ｅｐｈａｄｅｘ＠Ｇ−２５（Ｐｈａｔｖ ａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ社、スエーデン）で精製し た。１００＊／の得られた試料に９００ｔ／のジチオトレイトール（ＤＴＴ、　 １０１１ｇ／＊／）を添加し、そして得られる吸光度を３４３ｎｗで分光光度法 により測定した。ヘパリンＡについての置換度は０．２１であり、またヘパリン Ｂ（脱硫酸化物）については０．１７であった。ヘパリンに結合した５ＰＤＰは ＤＴＴを添加後クロマトグラフィーにより精製することによりＳＨまで還元した 。
４５０、０００の分子量を有するポリリジンを水に溶解しく２０１Ｆ／　３１１ ）、そこに２ｍｅの５ＰＤＰ（１０＠９／　ｗ／　ｌ１ｅＯ１１）を添加し、そ して反応を振盪しながら２０分間進行さぜた。精製は５ｅｐｈａｄｅｘＯＧ−２ ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ社、スエー デン）で溶出剤として０．１５Ｍ　ＮａＣｌを用いて行った。空隙（ｖｏｉｄ） 画分をＤＴＴで試験し、置換度はポリリジン１分子あたり１５８５ＰＤＰ基を測 定された。
以上において調製されたそれぞれヘパリン−３Ｒおよびポリリジン−５ＰＤＰの 溶液を３ＭＮａＣ／に調節し、そして５ＰＤＰ基に対しＳＲ基が１０％過剰とな るような割合で混合し、そして反応を一夜進行させた。
その際画調製物（ヘパリンＡおよびヘパリンＢ（脱硫酸化物））は完了するまで 進行していたが、これはチオピリドンの遊離を３４３ｎ−で分光光度法により測 定された。それら調製物を５ｅｐｈａｃｒｙｌ［Ｆ］Ｓ−５００５−５００（Ｐ ｈａｒ　ＬＫＢ　Ｂｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ社、スエーデン）で０．５ Ｍ　ＮａＣ１を溶出液として用いて精製したところ、ヘパリン−ポリリジン接合 体は遊離ヘパリンに対するベースライン分離を有する空隙ピークとして現われる 。ヘパリン含量はＬａｒｓｓｏｎ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｍａｔｅｒ ｉｃａｌｓｌｏ　（＋９８９）　５１１−５１６に記載のオルミノールアッセイ 法により測定しｔこ。
次にそれぞれのヘパリン接合体を０．５Ｍ　ＮａＣ１を添加したクエン酸１１Ｍ 液、ｐＨ３，８中で５０ｐ９ヘパリン／ｍｌまで希釈した。ポリエチレン（ＰＥ ）チューブを次のような処理により表面−ヘパリン化した；ｌ）過硫酸アンモニ ウム（１％、６０℃、１２０分間）２）ポリエチレンイミン（０，３ｓ＋ｖ／麿 ｌ、室温、１５分間）３）前述の如き接合体溶液（室温、１２０分間）。
それらデユープを最後に、ホウ酸緩衝液、ｐＨ９で２×１０分間および水で洗浄 した。
表面−ヘパリン化チューブを次の方法に従ってトロンビンの阻害能に関して試験 した。それらチューブはまずヒト血漿と共に回転させた後、それらを塩化ナトリ ウム溶液で洗浄した。次にそれらチューブをトロンビンの溶液と共にインキュベ ートしく１５Ｕ／菖／、１０分間、室温、回転下）そして塩化すトリウム溶液で 洗浄した。次にそれらチューブの半分をフィブリノーゲン除去した血漿と共に６ ０秒間インキュベートした。表面−結合ｌ・ロンビン活性は、それらチューブを トロンビンの色原性基質と共に６０秒間インキュベート後反応をクエン酸添加に より止めることにより測定した。得られる吸光度を４０５ｎｗで測定した。次の 値が得られた。
除去血漿不使用） この結果は、いずれの調製物もトロンビンの捕捉および阻害に関し完全に満足で きる効果を与えることを示している。
実施例２ 各種置換度を有する接合体および表面結合生物学的活性試験接合体Ｉと称される 接合体を実施例１の記載と同様にして調製した。ポリリジン１個あたりのヘパリ ンの最終置換度は２４０：１であった。
次に接合体■と称される別の接合体を調製した。この場合の出発材料は、５ＰＤ Ｐ添加の前にポリリジン溶液中のｐＨを８に調整することにより調製された、よ り高い５ＰＤＰ置換度のポリリジンであった。その置換度は１ポリリジン分子あ たり６３３５ＰＤＰ基と測定された。
ヘパリン−３Ｉ＋を実施例１と同様にして調製し、そして前記において得られた 高置換度のポリリジンと反応させた。反応は７７％転化まで進行し、従って、ポ リリジン１ｉ！］あたりのヘパリンの置換度は４９０１であった。ポリエチレン （ＰＥ）のチューブを実施例１の記載と同様に調製し、試験して、次の結果が得 られた。
除去血漿不使用） 除去血漿使用） これらの結果はいずれの接合体も満足できる結果を与えることを表面−ヘパリン 化体外システムの試験 次の成分で構成される体外システムを用いた：排液（ドレナージ）カテーテル（ ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ））動脈カニユーレ（ＰＶＣ＋スチール）、チュービン グセント（ｐｖｃ）、ポンプ膀胱（エチルブチルアクリレート）、弁（ポリプロ ピレン（ＰＰ）　＋　ｐＥ）、酸素供給器（ポリカーボネート十ＰＩ’の中空繊 維）。
そｔｌらすべての構成分を三工程処理により表面−ヘパリン化した。
ｌ）過硫酸アンモニウム（１％、６０℃、１２０分間）２）ポリエチレンイミン （０，３ｕ／冨ｌ、ホウ酸緩衝液、ｐＨ９、室温、１５分間） ３）実施例１に従って調製されたヘパリン−ポリリジン接合体を、０．５Ｍ　Ｎ ａＣＪ含有クエン酸緩衝液、ｐＨ３，８中、３（ｈｅ／ｍｌまで希釈し、そして 室温で１２０分間処理した。前記構成分を最後に、ホウ酸緩衝液、ｐｌ＋９およ び水で２×１５分間洗浄した。乾燥後、エチレンオキサイドによる滅菌を行った 。
この体外システムを右心房と大動脈の間の部分バイパスに対し抗−凝固剤療法を 受けていない麻酔ブタに接続した。この外部システムは、２４時間にわたり連続 的に約３ｅ１分をポンプ給送したが凝固による凝血の問題は全くなかった。凝固 時間は常に一定値であったが、このことは血液経路へのヘパリン遊離はなかった ことを示している。
これらの結果は、体外サポート循環用の完全システムをヘパリン接合体で表面− ヘパリン化することにより、エチレンオキサイドで滅菌できる、安定で十分機能 するヘパリン表面を得ることができることを実証している。
実施例４ 溶液中の各種ヘパリン−接合体の生物学的活性の試験様々な置換度を有するヘパ リン−ポリリジン接合体を実施例１および２に従って調製した。接合体の生物学 的活性を、抗トロンビン含有緩衝液中または血漿中における第Ｘａ因子およびト ロンビン阻害能について測定した。得られた結果を既知の比生物学的活性（１８ ０Ｉ、　１１．　／　ｗｇ）を有する既知量のヘパリンを添加することにより得 られる対応Ｉ準グラフと比較した。次の結果が得られた。
生物学的活性１．　Ｕ、　／■９ヘパリンＩ　２３５　１１６　９５　４８　４ ５ｎ　４９０　６１　２９　１０　２０ ＤＩ　５５０　１０　４３　１８　２５それらの結果は、記載のプロセスが高い 生物学的活性および低い生物学的活性を有する接合体の調製に用いることができ ることを示様々なポリリジンのサイズの効果 それぞれ１３．０００．６４．０００．９８．０００．２４９．０００および４ ６４．０００の分子量を有す異なる５バツチのポリリジンを実施例１に従って５ ＰＤＰで変性して、次の置換度（ポリリジン１分子あたり５ＰＤＰ−基数）が得 られた。
鍼ｕ　外チ鷹　１鼻！ １　１３．０００　６ ＩＴ　６４．０００　３１ １Ｉ＋　６４．０００　４５ ＴＶ　９８．０００　３５ Ｖ　２４９．０００　８７ Ｖｌ　４６４．０００　１５ｇ 第一級アミンのための相対的目盛りで７．０００の値を有するヘノくリンを実施 例１に従って、遊離チオール基を導入するために５ＰＤＰで変性して、０．２〜 ０．３の置換度を得た。それぞれの接合体は実施例１１こ従ッテ調製した。分離 は、５ｅｐｈａｒｙｉ　Ｓ−３００または５ｅｐｈａｃｒｙｌ＠Ｓ−４００５− ４００（Ｐｈａｒ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ社、スエーデン ）を分離媒体とするカラムで行った。接合体■は遊離ヘパリンから分離し得なか った。他の接合体については、満足できる分離が得られ、また得られた接合体は 、実施例１に従ってチューブを表面−ヘパリン化するために用いることができる 。（実施例１に従った）トロンビンの捕捉および阻害に関する試験は次の結果を 与えた：ｎ　Ｏ，０１２±０．００６　０ ｍ　０．０８６±０．０４７　０ ＩＶ　Ｏ，４９４±０．００９　０．００３Ｖ　Ｏ，５３２±０．０４３　０． ００５Ｖｌ　Ｏ，４９０±０．００４　０．００４これらの結果は、接合体■〜 ■が本発明に従ってヘパリン活性を有する表面の調製に使用できることを示して いる。しかしながら接合体■〜■が最良の結果を与えた。
実施例６ キトサンを担体物質とする接合体の調製キトサン（ＳｅａＣｕｒｅ　１１０　Ｌ 、粘度＜　２０ｍＰａ５．分子量約１２０．０００、Ｐｒｏｔａｎ　Ｂｉｏｐｏ ｌｙｍｅｒ＾／Ｓ社、ドラメン（Ｄｒａ−ｗ６ｎ）、ノルウェイ）を、１％酢酸 含有水に１０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解した。１．５１１の溶液に１．０＊／の ５ＰＤＰ　（１０＋＊ｖ／＋＋／　ｌ１ｅＯＨ）を５０℃で撹拌しながら添加し 、そして反応を１時間進行させた。試料をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒ■ａｃｉ ａ　ＩＪＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ社、スエーデン）にかけ、そして １％酢酸含有０．５Ｍ　ＮａＣ／で溶出した。空隙画分を集め、そして５ＰＤＰ の存在について分析した。５ＰＤＰの含量は、キトサン１分子あたり約４０３Ｐ ＤＰ基に相当する０、　９７２ａ■ｏｌｅ／窮ｌと測定された。
遊離チオール基を有するヘパリンを実施例１に従つて調製した。
得られたヘパリン溶液に次に塩化ナトリウムを３．５Ｍの最終濃度となるように 添加した。次にそのヘパリン溶液を最初に調製したキトサン−３ＰＩ）Ｐ溶液に 激しく撹拌しながら添加し、そして反応を室温で一夜進行させた。分光光魔法制 御は反応が１００％まで進行したことを示していた。その溶液を５ｅｐｈａｃｒ ｙｌ■Ｓ−３００（Ｐｈａｒｓａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 ＡＢ社、スエーデン）で分画し、そして空隙分画を集めた。Ｉ”ｅｂａｘＯ（Ａ ｔｏｃｈｅｍｉｅ社（フランス）のポリエーテルブロックアミド）のチューブを 実施例１によるトロンビン試験のために調製した。次の結果が得られた； ０．４９１±０．０１６　０．００２ これらの結果は、キトサン−ヘパリン接合体を用いて調製された表面が完全に満 足できる効果を与えることを実証している。
実施例７ ポリアリルアミンとの接合体の調製 １０■９のポリアリルアミン塩酸塩（ＡＩｄｒｉｃｈ社、分子量約５０．０００ ）を１、５ｗｉ！のホウ酸緩衝液、ｐＨ９１：溶解し、それｉニー１．（ｂ／（ ７）ＳＰＤＰ　（１０ｍｖ／ｙｓｌ　１ＩｅＯＨ）を撹拌しながら添加し、そし て３０分間反応させた。その溶液をＰＤ−１０カラムにかけ、それを０．９％Ｎ ａＣ／で溶出した。空隙画分を集め、そして分析したところポリアリルアミン１ 分子あたり約１９２ＳＰＤＰ基に相当する８、　４６ｎｍｏＬｅ／＋＋ｌの５Ｐ ＤＰを含有していることが示された。この生成物を以下において接合体Ｉの調製 に用いた。
別の１０１１ｇのポリアリルアミン塩酸塩をホウ酸緩衝液ではなくて水に溶解し 、前記と同様にして５ＰＤＰ置換した。その場合、空隙画分は、ポリアリルアミ ン１分子あたり３．２５ＰＤＰ基に相当する１、　５６ａ謹ｏ１ｅＳＰＤＰ／ｍ ／を含有していた。次いで、この生成物を以下の接合体■の調製に用いた。
もう一つの調製例では、ｐｉを３．５に調節した７＊／の水に溶解した２βｍｏ ｌｅのポリアリルアミンを１６１０　ａ園ｏｌｅのシアノポロヒドリドの存在下 に８６１　ｊｍｏｌｅのホルムアルデヒドと反応させることにより部分的にメチ ル化しであるポリアリルアミン塩酸塩が用いられた。
−後反応させた後、変性ポリアリルアミンを５ｅｐｈａｄｅｘ＠　Ｇ−２５（Ｐ ｈａｒｗ＋ａｃｔａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＨ社、スエーデ ン）で精製した。
１０１９の変性ポリアリルアミン塩酸塩をホウ酸緩衝液、ｐＨ８に溶解し、そし て前述と同様に５ＰＤＰで置換した。その場合、空隙画分はポリアリルアミン１ 分子あたり約５０３ＰＤＰ基に相当する１、　５ｊｗｏｌｅ／ｍ／を含有した。
次にこの生成物を以下の接合体■の調製に用いた。
遊離チオール基を有するヘパリンを実施例１に従って調製後、得られたヘパリン −３Ｈをそれぞれのポリアリルアミン−８ＰＤＰ生成物とＳＨ−およびＳＰ［ｌ Ｐ−基に関し等モル関係で混合した。１時間反応後、塩含量を３Ｍまで高め、そ して反応を室温で一夜進行させた。反応収率は三つのすべての反応について９５ ％を超えていた。接合体Ｉおよび■のそれぞれの反応溶液を１０Ｍ水酸化ナトリ ウムでｐＨｌＯに調節し、次いで１．０Ｏｔｒｌの無水酢酸を激しく撹拌しなが ら添加して残留アミノ基をアセチル化した。得られたヘパリン接合体、接合体！ 、接合体■および接合体■をそれぞれ５ｅｐｈａｃｒｙｌ＠　Ｓ−４００カラム （Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ社、スエ ーデン）で精製したところ、接合体は空隙画分中に得られた。
得られた三種類のヘパリン接合体を用いて、実施例１によるトロンビン試験のた めにポリエチレンチューブを調製し、次の結果を得た。
接合体１　０．４３７＋０．００８　０．００７＋０．００２接合体ｎ　０．４ ４５＋０．０２０　０．００３±ｏ、ｏｏｉ接合体ｍ　０．５０１±０．０３２ 　０．００５±０．００２これらの結果は、三種類の接合体のすべてが完全に満 足できる効果を与えることを実証している。
実施例８ 様々なアミノ官能性基質表面を有する表面の調製ポリエチレンチューブを次のよ うにしてヘパリン化した（付された印Ａ、ＢＳＣおよびＤはそれぞれチューブ表 面の別の選択肢としてのアミノ官能基化処理を示している）：■、過硫酸アンモ ニウム（１％、６０℃、６０分間）２＾　ポリエチレンイミン（０，３ｗｖ／厘 ｌ、ボレートｐＨ９、室温、１５分間） ２Ｂ、ポリアリルアミン（１，０ｍｇ／真１１ポレートｐＨ９、室温、１５分間 ）２Ｃキトサン（１０ｍｑ／　ｍｅ、　１％■＾ｃ１室温、１５分間）２Ｄ　ポ リリジン（水中５　ｍｙ／　ｍｌ、室温、１５分間）３、実施例１に従って調製 されたヘパリン−ポリリジン接合体（クエン酸緩衝液中５０ｇｑ／ｍｌ、０．５ Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ３，８、室温、１２０分間）このようにして調製された表面 をホウ酸緩衝液、ｐＨ９および水で十分洗浄した。
前述の四つの選択肢に従ってヘパリン化されたポリエチレンチューブを実施例１ に記載された如く、トロンビンの捕捉および阻害について試験したところ、すべ ての選択肢が完全に満足できる効果をレンズ（ＰＭＩ＾）の表面−ヘパリン化お よび血小板付着試験ポリメチルメタクリレ−）　（ＰＩＮ＾）の眼内レンズを実 施例１に従ってヘパリン化した後、血小板付着について試験した。
無変性レンズおよび表面−ヘパリン化レンズをそれぞれ、新鮮ヒトクエン酸加全 血中で一定の動きを与えながら６０分間インキュベートした。それらレンズを次 に塩化ナトリウム溶液中でくり返し洗浄してすべての付着血液を除去した。最後 にアデノシン三リン酸（＾ＴＰ）をレンズ表面に付着したすべての血小板から抽 出し、そして得られた＾ＴＰの含量をバイオルミネセンスにより測定した。ヘパ リン化レンズへの血小板付着は未処理対照レンズに比べ９８％低下した。
実施例１０ “生物学的表面”へのヘパリン接合体の吸着本発明により調製されたヘパリン接 合体が血栓症性生物学的材料で被覆された表面に不可逆的に吸着され得るかどう かを調べるために次の実験を行った： ポリエチレンの非表面変性チューブをクエン酸加全血で半分部たしそして６０分 間回転させた。次にそれらチューブから血液を排しそして塩化ナトリウム溶液で 十分洗浄した。ここで前記チューブを様々な活性段階の血小板および血漿タンパ ク質より成る血栓症性材料で被覆した。実施例１に従って調製されたヘパリン− ポリリジン接合体を塩化ナトリウム溶液中で１０Ｏｎ／＋＋４の最終濃度となる ように希釈し、次にその溶液をそれらチューブ内で６０分間回転させた。それら チューブを最後に、ホウ酸緩衝液、ｐＨ９および水で十分洗浄した。
このようにしてヘパリン化されたチューブを実施例１に従ってトロンビンの捕捉 および阻害について試験したところ、供試チューブは完全に満足できる効果を示 した。
実施例１１ ウレアーゼとの組合せ調製 ポリリジン（１０籾、分子量４６４．０００）を１．５ｍｌの水に溶解し、それ に１．０１／の５ＰＤＰ　（ｌｏｍｇ／ｍ１ＭｅＯＨ）を振盪しながら添加し、 次に反応を３０分間進行させた。その試料をＰＤ−１０カラムにかけ、そして０ ．９％ＮａＣ１で溶出した。空隙画分を集め、そして分析したところ５ＰＤＰ含 量が１．０５３ａ■ｏｌｅ／＋＋／であることが示された。
ウレアーゼ（Ｕ−１５００、タチナタマメ由来、３１２層８社、米国）をリン酸 １１Ｊｌｉ液、ｐＨ７、５に１（ｈｇ／ｍｌとなるように溶解し、そして０．２ ２ｕフイルターを通して濾過した。遊離Ｓｔ（基金量は０．１６１＊■ａｌｅ／ ｍ／と測定された。
３ＭＮａ（Ｊに溶解したポリリジン−３ＰＤＰをウレアーゼと、利用可能な５Ｐ ＤＰ基の約ｌＯ％がウレアーゼのＳ■基とのジスルフィド交換を受け得るように 混合した。３４３ｎｍｌこおける分光光変法測定によりこれが生起したことが確 認された。次に実施例１に従って遊離Ｓｌｌ基で変性されたヘパリンを添加した （ヘパリン−３Ｒ添加量は利用可能な５ＰＤＰ基の残る９０％に相当するものと した）。反応は完了するまで進行した。得られた接合体を最後に５ｅｐｈａｃｒ ｙｌ■Ｓ−４００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　ＡＢ社、スエーデン）で精製したところ、接合体は空隙画分中に得られ た。得られた接合体を試験したところヘパリン活性およびウレアーゼ活性が検出 され得ることが示された。
補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年３月２５日

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. １．多数の官能基をポリマー主鎖に沿って分布させた実質的に鎖状の有機ポリマ ーであって、それら官能基を介してその非活性部分の硫酸化グリコサミノグリカ ン類群からの少なくとも約２０分子が共有結合を通して結合されているものより 成る実質的に水溶性の生物学的に活性な接合体。
  2. ２．前記ポリマーが天然または合成のポリペプチド、多糖体または脂肪族ポリマ ーに由来する請求項１記載の接合体。
  3. ３．前記ポリマー鎖がポリリジン、ポリオルニチン、キトサン、ポリイミンまた はポリアリルアミンに由来する請求項２記載の接合体。
  4. ４．グリコサミノグリカン類が実質的に単結合を介して、好ましくは末端でポリ マー主鎖に結合されている請求項１、２または３記載の接合体。
  5. ５．グリコサミノグリカン類が該グリコサミノグリカン類に結合したアミノ基を 介したポリマー主鎖に結合されている請求項１〜４のいずれかに記載の接合体。
  6. ６．接合体がそのグリコサミノグリカン類の故に、水に溶解された場合に実質的 にその全長に沿って正荷電基体表面に静電的相互作用により実質的に不可逆的に 結合され得るのに十分なポリ陰イオン特性を有することを特徴とする請求項１〜 ５のいずれかに記載の接合体。
  7. ７．少なくとも３０グリコサミノグリカン残基を有する請求項１〜６のいずれか に記載の接合体。
  8. ８．少なくとも１００グリコサミノグリカン残基を有する請求項７記載の接合体 。
  9. ９．前記グリコサミノグリカンがヘパリンまたはその断片または誘導体である請 求項１〜８のいずれかに記載の接合体。
  10. １０．グリコサミノグリカン残基が結合配列を介してポリマー主鎖に結合される 請求項１〜９のいずれかに記載の接合体。
  11. １１．前記結合配列がヘテロ−二官能性結合試薬に由来する請求項１０記載の接 合体。
  12. １２．ポリマー主鎖がグリコサミノグリカン類のほかに少なくとも一つの付加的 な生物学的に活性な物質の残基を担持する請求項１〜１１のいずれかに記載の接 合体。
  13. １３．接合体が多数の官能基をポリマー主鎖に沿って分布させた実質的に直鎖状 の有機ポリマーであって、それら官能基を介して硫酸化グリコサミノグリカン類 群からの多数の分子が共有結合を通して結合されているものより成り、該接合体 は好ましくは該接合体と基体表面との間の静電的相互作用により表面に結合され ていることを特徴とする、表面にアフィニティー結合された生物学的に活性な接 合体より成る調製された基体表面。
  14. １４．生物学的に活性な接合体が請求項１〜１１のいずれかに記載の接合体であ る請求項１３記載の調製された基体表面。
  15. １５．多数の官能基をポリマー一主鎖に沿って分布させた実質的に直鎖状の有機 ポリマーを準備し、そしてこれら官能基に、所望により結合剤を介して、その非 活性部分の硫酸化グリコサミノグリカン類群からの多数の分子を共有結合的に結 合させることより成ることを特徴とする、硫酸アグリコサミノグリカン類群から の多数の分子を担持する実質的に直鎖状の有機ポリマーより成る生物学的に活性 な接合体の調製方法。
  16. １６．多数の官能基をポリマー主鎖に沿って分布された実質的に鎖状の有機ポリ マーであって、それら官能基を介して硫酸化グリコサミノグリカン類群からの多 数の分子が共有結合を通して結合されているものより成る接合体を該接合体に対 するアフィニティーを有する基体表面と、接合体がそこに実質的に不可逆的に結 合されるように接触させることを特徴とする、硫酸化グリコサミノグリカン類に よる表面の調製方法。
  17. １７．接合体がポリ陰イオン特性を有し、基体表面が陽イオン性である請求項１ ６記載の方法。
  18. １８．治療剤として用いるための請求項１〜１２のいずれかに記載の生物学的に 活性な接合体。
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